Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores / /Comparative sensivity for Pasteurella pneumotropica detection of rodents by bacterial culture and PCR techniques

Objetivo: Realizar uma comparação, em relação a sensibilidade, das técnicas de cultura bacteriana e PCR para detecção de Pasteurella pneumotropica, em colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss; ratos Wistar e Hamster Golden. Materiais e Métodos: 230 amostras de traquéia foram coletadas e divididas em partes iguais: uma parte foi encaminhada para a cultura bacteriana, onde foram realizadas provas bioquímicas manuais e semi-automatizadas. A outra parte foi submetida à reação de PCR, onde os oligonucleotídeos iniciadores foram F; 5’ ACCTACTCTTGACATCCAGA 3’ e R; 5’ CGCTCCACATCGCTGCTT 3’ que amplificam em 296 pb. Os produtos obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose. A visualização e fotodocumentação foram realizadas sob luz ultravioleta. Resultados e conclusão: Os resultados obtidos através da cultura bacteriana foram de 1,75% de casos positivos e 98,25% de negativos. Em relação ao PCR observamos o resultado de 63% de positivos e 37% de casos negativos. Concluindo, nossos resultados demonstram que a técnica de PCR oferece significativamente maior sensibilidade para detecção de P. pneumotropica quando comparado a cultura bacteriana. CEUA nº 251/11.

OBJECTIVE: To conduct a comparative study of the sensitivity by bacterial culture and PCR detection of Pasteurella pneumotropica in conventional colonies of inbred mice strains C57BL/6, BALB/c and Swiss outbred; Golden Hamster and Wistar rats. MATERIALS AND METHODS: 230 samples of the trachea were collected and divided into equal parts: one part was sent for culture, where biochemical tests were performed manually and semi-automated, after bacterial isolation. The other part was subjected to PCR, used primers F, 5 ‘ACCTACTCTTGACATCCAGA 3’ and R, 5 ‘CGCTCCACATCGCTGCTT 3’ which amplifies at 296 bp. The products obtained were separated by electrophoresis in agarose gel. Visualization and photodocumentation were performed under ultraviolet light. RESULTS AND CONCLUSION: The results obtained by bacterial culture were 1.75% of positive cases and negative in 98.25%; 63% and 37% of cases positive and negative, respectively, by PCR. These results point to the greater sensitivity of PCR (x2 = 0.10, 0.80 < p <0.50) when compared to bacterial culture. CEUA nº 251/11

Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores / /Comparative sensivity for Pasteurella pneumotropica detection of rodents by bacterial culture and PCR techniques

Objetivo: Realizar uma comparação, em relação a sensibilidade, das técnicas de cultura bacteriana e PCR para detecção de Pasteurella pneumotropica, em colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss; ratos Wistar e Hamster Golden. Materiais e Métodos: 230 amostras de traquéia foram coletadas e divididas em partes iguais: uma parte foi encaminhada para a cultura bacteriana, onde foram realizadas provas bioquímicas manuais e semi-automatizadas. A outra parte foi submetida à reação de PCR, onde os oligonucleotídeos iniciadores foram F; 5 ACCTACTCTTGACATCCAGA 3 e R; 5 CGCTCCACATCGCTGCTT 3 que amplificam em 296 pb. Os produtos obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose. A visualização e fotodocumentação foram realizadas sob luz ultravioleta. Resultados e conclusão: Os resultados obtidos através da cultura bacteriana foram de 1,75% de casos positivos e 98,25% de negativos. Em relação ao PCR observamos o resultado de 63% de positivos e 37% de casos negativos. Concluindo, nossos resultados demonstram que a técnica de PCR oferece significativamente maior sensibilidade para detecção de P. pneumotropica quando comparado a cultura bacteriana. CEUA nº 251/11.(AU)

OBJECTIVE: To conduct a comparative study of the sensitivity by bacterial culture and PCR detection of Pasteurella pneumotropica in conventional colonies of inbred mice strains C57BL/6, BALB/c and Swiss outbred; Golden Hamster and Wistar rats. MATERIALS AND METHODS: 230 samples of the trachea were collected and divided into equal parts: one part was sent for culture, where biochemical tests were performed manually and semi-automated, after bacterial isolation. The other part was subjected to PCR, used primers F, 5 ‘ACCTACTCTTGACATCCAGA 3 and R, 5 ‘CGCTCCACATCGCTGCTT 3 which amplifies at 296 bp. The products obtained were separated by electrophoresis in agarose gel. Visualization and photodocumentation were performed under ultraviolet light. RESULTS AND CONCLUSION: The results obtained by bacterial culture were 1.75% of positive cases and negative in 98.25%; 63% and 37% of cases positive and negative, respectively, by PCR. These results point to the greater sensitivity of PCR (x2 = 0.10, 0.80 < p <0.50) when compared to bacterial culture. CEUA nº 251/11(AU)

Diagnóstico bacteriológico, citológico e histopatológico da endometrite equina

A endometrite é uma das principais causas de infertilidade equina, com considerável impacto econômico. Porém, não existeconsenso sobre o método ideal de diagnóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar os achados bacteriológicos, citológicose histopatológicos de 21 éguas com histórico de infertilidade. Escherichia coli (10 cepas), estreptococos do grupo C [(EGC),Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (4) e Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (3)], Enterococcus sp. (3) eStaphylococcus aureus (2) foram isolados de secreção uterina de 13 animais. Em oito animais foram isoladas espécies nãopatogênicas. Resistência à cefalotina, clindamicina, eritromicina, penicilina e tetraciclina foi observada entre as espécies.Esfregaços contendo células da parede uterina foram classificados quanto ao grau de inflamação em leve (6), moderada ouintensa (12) e ausência de inflamação (3). Infiltrados celulares foram observados em todos os fragmentos de biópsia, comgrau de intensidade variando entre moderado e intenso. O isolamento de E. coli foi significativamente associado à inflamaçãointensa, enquanto a presença de espécies não patogênicas foi significativamente relacionada com a ausência de processoinflamatório.

LEPTOSPIROSE BOVINA: SOROVAR HARDJO GENÓTIPOS HARDJOBOVIS E HARDJOPRAJITNO

A leptospirose bovina é uma doença endêmica nos rebanhos brasileiros, sendo os bovinos considerados hospedeiros de manutenção do sorovar Hardjo e as principais manifestações clínicas nesta espécie estão relacionadas à diminuição do desempenho reprodutivo. Esse sorovar possui dois genótipos: Hardjobovis e Hardjoprajitno. O genótipo Hardjobovis pertence à espécie Leptospira borgpetersenii e o genótipo Hardjoprajitno à espécie Leptospira interrogans. Apesar de ambos causarem problemas reprodutivos nos rebanhos bovinos de todo o mundo, existem diferenças epidemiológicas entre eles. A infecção causada pelo genótipo Hardjobovis é caracterizada pela forma subclínica, ocasionando principalmente aborto; enquanto que o genótipo Hardjoprajitno, caracteriza-se por ser mais patogênica ocasionando problemas reprodutivos e também queda da produção de leite. Apesar de não corresponder com a classificação sorológica, atualmente os melhores métodos de diagnóstico para a leptospirose são aqueles que utilizam ferramentas moleculares. O isolamento bacteriológico, a correta caracterização e identificação genética são extremamente importantes para a compreensão da etiologia, epidemiologia e patogênese das diferentes espécies e genótipos de leptospiras. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar características moleculares através do Multilocus variable-number tandem-repeat (VNTR) analysis (MLVA) e o sequenciamento parcial do gene sec Y de duas cepas isoladas de Leptospira em amostras de urina de bovinos naturalmente infectados de rebanhos leiteiros. Foram selecionadas quinze vacas leiteiras reagentes no teste de soroaglutinação microscópica (SAM) com títulos entre 400 e 800 para o sorovar Hardjo e histórico de falha reprodutiva, tais como aborto e infertilidade. As amostras de urina obtidas de cada animal foram imediatamente semeadas em tubos contendo meio de cultura Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). Das 15 amostras de urina avaliadas, duas leptospiras foram isoladas e nomeadas Londrina 49 e Londrina 54. O perfil MLVA e o sequenciamento parcial do gene sec Y caracterizaram os isolados como L. borgpetersenii sorovar Hardjo genótipo Hardjobovis diferenciando-os da cepa de referência Hardjoprajitno. Este é o primeiro isolamento da L. borgpetersenii sorovar Hardjo genótipo Hardjobovis obtido no Brasil e na América Latina. Portanto, mais estudos são necessários incluindo o isolamento e caracterização molecular de cepas regionais para obter um melhor conhecimento sobre a epidemiologia do sorovar Hardjo em bovinos o que podem ajudar em futuras estratégias de prevenção e controle da leptospirose bovina.

Bovine leptospirosis is an endemic disease in bovine Brazilian herds, and the cattle are considered the serovar Hardjo maintenance hosts and the clinical manifestations in this species are related to decreased reproductive performance. This serovar has two genotypes: Hardjobovis and Hardjoprajitno. The genotype Hardjobovis belongs to the specie Leptospira borgpetersenii and Hardjoprajitno genotype to the specie Leptospira interrogans. Although both cause reproductive failure in cattle herds around the world, there are epidemiological differences between them. The infection caused by Hardjobovis genotype is characterized by subclinical form, especially causing abortion; while Hardjoprajitno genotype, is more pathogenic causing reproductive problems and also decreased milk production. Although not correspond with the serological classification, currently the best diagnostic methods for leptospirosis are those using molecular tools. The bacterial isolation, the correct characterization and genetic identification are important for understanding the etiology, epidemiology and pathogenesis of the different specie and genotype of Leptospira. The objective of this study was to isolate and identify molecular characteristics through Multilocus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA) and sequencing of the sec Y partial gene of two isolated strains of Leptospira in urine samples from bovine naturally infected of dairy herds. Fifteen dairy cows reagents in the microscopic agglutination test (MAT) with titles between 100 and 800 for the serovar Hardjo and history of reproductive failure were selected, such as abortion and infertility. The urine samples obtained from each animal were immediately seeded in tubes containing culture medium Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). The identification of the isolates was performed by Multilocus variable-number tandem-repeat (VNTR) analysis (MLVA) technique and phylogenetic analysis of partial sequence of gene sec Y. From the 15 urine samples evaluated, two leptospiras were isolated and named Londrina 49 and Londrina 54 strains. The MLVA profile and partial sequencing of gene sec Y characterized the isolates as L. borgpetersenii serovar Hardjo genotype Hardjobovis differing them from Hardjoprajitno reference strain. Therefore, more studies are needed including isolation and molecular characterization from regional strains to obtain a better knowledge about epidemiology of serovar Hardjo in bovine which may assist in future strategies of prevention and control of bovine leptospirosis

Avaliação da influência dos diferentes estádios de lesão de tuberculose bovina na capacidade da Reação em Cadeia da Polimerase em detectar Mycobacterium bovis

A tuberculose bovina é uma doença crônica de grande importância sanitária e econômica. O diagnóstico definitivo depende da cultura e identificação do Mycobacterium por método bacteriológico. Porém, a busca por métodos de diagnóstico que sejam de rápida execução e que possibilitem exatidão, como a reação em cadeia da polimerase, é necessária. O objetivo desse estudo foi avaliar se o estádio de lesão histopatológica de tuberculose interfere na capacidade da PCR em detectar DNA de Mycobacterium bovis em amostras de bovinos. Material e Métodos: Foram avaliadas 120 amostras de pulmão e linfonodos de bovinos recebidas no Laboratório de Histopatologia do Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor. As amostras foram submetidas à cultura bacteriana, PCR convencional específica para detecção de DNA de M. bovis e histopatologia. Na histopatologia, as amostras foram classificadas conforme a presença e estádio de desenvolvimento do granuloma: em estádio inicial (I e II) granuloma com acúmulo de células epitelioides sem necrose e fibrose, e em avançado (III e IV) granuloma multicêntrico irregular com múltiplos núcleos de calcificação, presença de células epitelioides e gigantes envolto por uma camada de fibrose. Os cortes histológicos foram submetidos à coloração de Ziehl Neelsen para quantificação do bacilo e do Tricrômico de Masson para evidenciar a extensão da fibrose. A possível associação entre o grau da lesão com a extensão da fibrose, positividade na PCR e isolamento bacteriano foi realizada com emprego do Teste Exato de Fischer. Posteriormente, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e a concordância entre os métodos foram avaliados. Resultados: Foram avaliadas 120 amostras e destas 39,2% (n=47) foram positivas no isolamento, 40,8% (n=49) apresentavam lesões sugestivas na histopatologia e em 30,9% (n=37) o DNA de M. bovis foi detectado pela PCR. Entre as amostras positivas (n=49) na histopatologia 16,3% (n=8) estavam no estádio inicial e 84,7% (n=41) no estádio avançado. Na coloração de Ziehl Neelsen, a proporção de casos positivos para BAAR não diferiu nos estádio inicial e avançado. Na coloração do Tricrômico de Masson, a proporção dos casos com fibrose acima da média foi maior no estádio avançado. Entre as 47 amostras positivas na cultura, 31 foram também positivas na PCR e 37 na histopatologia. Entre as negativas no isolamento (n=73), 67 foram também negativas na PCR e 61 na histopatologia. A PCR apresentou sensibilidade de 65,9% e especificidade de 91,8% quando comparada a cultura bacteriana. O valor preditivo positivo e negativo foi 83,8% e 80,7%, respectivamente. Conclusão: Quando as amostras apresentavam granulomas em estádio tardio o desempenho da PCR para M. bovis em relação à cultura bacteriana foi inferior ao encontrado quando as amostras continham lesões em estádio inicial. Sugere-se que, quando possível, sejam remetidas para diagnóstico, amostras que contenham lesões em diferentes estádios de desenvolvimento para que possa ser feita uma melhor seleção da amostra a ser utilizada para PCR para M. bovis.

Bovine tuberculosis is a chronic disease of great economic lost and health importance. Definitive diagnosis depends on isolation and identification of Mycobacterium by bacteriological method. However, the search for diagnostic methods with faster execution and accuracy, such as polymerase chain reaction, is necessary. The aim of this study was to evaluate if the lesions stage interfere with PCR capability to detect DNA of Mycobacterium bovis in bovine samples. Material and Methods: The 120 samples of lung and linph nodes of catle were submitted to the Histopathology Laboratory of Veterinary Research Institute Desiderio Finamor were evaluated. The samples were subjected to bacterial isolation, conventional PCR specific for DNA detection of M. bovis and histopathology. Histopathology samples were classified according to the presence and stage of development of the granuloma: in early stage (I and II) granuloma with accumulation of epithelioid cells without necrosis and fibrosis, and advanced (III and IV) irregular multicenter granuloma multicore calcification, presence of epithelioid cells and giant surrounded by a fibrous layer. The histological sections were subjected to Ziehl Neelsen method for the bacillus quantification and Masson's Trichrome to show the extent of fibrosis. The association between the degree of injury with extent of fibrosis, PCR positivity and bacterial isolation was performed with Fisher exact test. Subsequently, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values and correlation between the methods were evaluated. Results: 120 samples were evaluated, including 39.2% (n=47) were positive in isolation, 40.8% (n = 49) had suggestive lesion in histopathology and 30.9% (n=37) M. bovis DNA was detected by PCR. Among the positive histopathology 6.7% (n = 8) were in early stage and 34.2% (n = 41) in advanced stage. In Ziehl Neelsen stain, the proportion of positive cases did not differ in early and advanced stage. In Masson Trichrome, the proportion of cases with above average fibrosis was higher in advanced stage. A PCR performance had a sensitivity of 65,9% and specificity of 91,8% when compared to bacterial culture. The positive and negative predictive value was 83,8% and 80,7%, respectively. Conclusion: When the samples showed granulomas in late stage performance of PCR for M. bovis in relation to the bacterial culture was lower than found when the samples contained lesions in early stage. It is suggested that, when possible, are sent to diagnostic samples containing lesions in different stages of development so that there can be a better selection of sample to be used for PCR for M. bovis.

Diagnóstico bacteriológico, citológico e histopatológico da endometrite equina

A endometrite é uma das principais causas de infertilidade equina, com considerável impacto econômico. Porém, não existeconsenso sobre o método ideal de diagnóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar os achados bacteriológicos, citológicose histopatológicos de 21 éguas com histórico de infertilidade. Escherichia coli (10 cepas), estreptococos do grupo C [(EGC),Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (4) e Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (3)], Enterococcus sp. (3) eStaphylococcus aureus (2) foram isolados de secreção uterina de 13 animais. Em oito animais foram isoladas espécies nãopatogênicas. Resistência à cefalotina, clindamicina, eritromicina, penicilina e tetraciclina foi observada entre as espécies.Esfregaços contendo células da parede uterina foram classificados quanto ao grau de inflamação em leve (6), moderada ouintensa (12) e ausência de inflamação (3). Infiltrados celulares foram observados em todos os fragmentos de biópsia, comgrau de intensidade variando entre moderado e intenso. O isolamento de E. coli foi significativamente associado à inflamaçãointensa, enquanto a presença de espécies não patogênicas foi significativamente relacionada com a ausência de processoinflamatório.