Dirofilaria immitis infestation in imported police (K-9) dogs in Iraq: clinicopathological and molecular investigations study / Infecção por Dirofilaria immitis em cães policiais importados no Iraque: estudo clínico-patológico e de investigações moleculares

Dirofilaria immitis, the cause of heartworm infestation (HWI) or dirofilariasis, affects members of the Canidae and remains a worldwide clinical problem. In Iraq, dirofilariasis was believed absent until 2009, when the Karbala Governorate was reported as an endemic area for canine dirofilariasis. Consequently, this study intended to investigate the occurrence of Dirofilaria immitis in police dogs in one police academy in Iraq and to study the gross and histopathological changes in 5 dead dogs, as well as to identify the species of the causative parasite using PCR technique. Thirty-nine police dogs, aged between 6 months and 12 years were included in this study. For the microfilariae investigation, 5 ml blood samples were collected from all dogs in EDTA tubes and examined by Knott's method. The systemic necropsy performed in five dead dogs showed severe clinical signs of dirofilariasis and tissue specimens were sent for routine histopathological processing. For the molecular analysis, adult worms of the detected Dirofilaria spp. were used for DNA extraction and amplification of the cox1 gene. Fifteen of 39 (38.46%) dogs were diagnosed with moderate to severe microfilariasis. The dead dogs revealed typical severe clinical signs of dirofilariasis. Moreover, typical gross and histopathological changes were also seen, accompanied by generalized thromboembolic lesions, suggesting the occurrence of the caval syndrome. The PCR investigation confirmed that D. immitis was the species present in Iraq. In conclusion, this study establishes that Iraq is a newly reported endemic area for dirofilariasis. Moreover, the infestation occurring in these cases most probably happened inside Iraq. The authors recommend doing further epidemiological studies concerning the occurrence of D. immitis in local dogs as well as in the imported dogs in all Iraqi governorates to better understand the epidemiological map of this disease and to introduce an active treatment and preventive program. Awareness and education regarding this disease should be provided to the veterinarians, dog guiders and people in direct contact with dogs, as this disease is one of the important zoonotic diseases.(AU)

A Dirofilaria immitis, causadora da infestação pelo verme do coração (IVC) ou dirofilariose afeta os membros da família Canidae e ainda é um problema clínico mundial. Até o ano de 2009, acreditava-se que o Iraque fosse livre da dirofilariose, porém nessa ocasião a governadoria de Kerbala foi relatada como uma área endêmica de dirofilariose. Assim, o presente trabalho foi realizado para investigar a ocorrência da Dirofilaria immitis em cães policiais em uma academia de polícia do Iraque, estudar as alterações macroscópicas e histopatológicas em cinco cães mortos, bem como, identificar as espécies do parasita causador com o emprego da técnida de PCR. Trinta e nove cães policiais com 6 meses a 12 anos de idade foram incluídos no estudo. Amostras de sangue de cinco mililitros foram colhidas por animal, em tubos com EDTA e foram examinadas pelo método de Knott. A necropsia sistêmica foi realizada em cinco cães que haviam apresentado sinais clínicos severos de dirofilariose e espécimens dos seus tecidos foram enviados para o processamento histopatológico de rotina. Para a análise molecular dos vermes adultos de Dirofilaria spp, foi empregada a extração do DNA e a amplificação do gene cox1. Quinze de 39(38,46%) cães foram diagnosticados com uma microfilariase variável de moderada para severa. As alterações macroscópicas e histopatológicas foram acompanhadas por lesões generalizadas tromboembólicas sugestivas da ocorrência da síndrome da veia cava. A investigação de PCR confirmou que a D.immitisera a espécie presente no Iraque. A conclusão do estudo estabeleceu que o Iraque deve passar a ser considerado como uma nova área endêmica da dirofilariose. Além da infestação registrada nos casos descritos é provável que ela também esteja presente em outras regiões do Iraque. Os autores recomendam a realização de estudos epidemiológicos para investigar a ocorrência de D.immitis tanto nos cães locais bem como em cães importados em todas as governadorias do Iraque, para ser construído o mapa epidemiológico da distribuição da doença e implantadas as ações de tratamento e de um progrma preventivo. Ações de educação em saúde sobre a doença deverão ser dirigidas para os veterinários, tratadores de cães e para pessoas em geral que tenham contato com os cães, pois esta doença é uma importante zoonose.(AU)

Dirofilaria immitis infestation in imported police (K-9) dogs in Iraq: / Infecção por Dirofilaria immitis em cães policiais importados no Iraque:

Dirofilaria immitis, the cause of heartworm infestation (HWI) or dirofilariasis, affects members of the Canidae and remains a worldwide clinical problem. In Iraq, dirofilariasis was believed absent until 2009, when the Karbala Governorate was reported as an endemic area for canine dirofilariasis. Consequently, this study intended to investigate the occurrence of Dirofilaria immitis in police dogs in one police academy in Iraq and to study the gross and histopathological changes in 5 dead dogs, as well as to identify the species of the causative parasite using PCR technique. Thirty-nine police dogs, aged between 6 months and 12 years were included in this study. For the microfilariae investigation, 5 ml blood samples were collected from all dogs in EDTA tubes and examined by Knotts method. The systemic necropsy performed in five dead dogs showed severe clinical signs of dirofilariasis and tissue specimens were sent for routine histopathological processing. For the molecular analysis, adult worms of the detected Dirofilaria spp. were used for DNA extraction andamplification of the cox1 gene. Fifteen of 39 (38.46%) dogs were diagnosed with moderate to severe microfilariasis. The dead dogs revealed typical severe clinical signs of dirofilariasis. Moreover, typical gross and histopathological changes were also seen, accompanied by generalized thromboembolic lesions, suggesting the

A Dirofilaria immitis, causadora da infestação pelo verme do coração (IVC) ou dirofilariose afeta os membros da família Canidae e ainda é um problema clínico mundial. Até o ano de 2009, acreditava-se que o Iraque fosse livre da dirofilariose, porém nessa ocasião a governadoria de Kerbala foi relatada como uma área endêmica de dirofilariose. Assim, o presente trabalho foi realizado para investigar a ocorrência da Dirofilaria immitis em cães policiais em uma academia de polícia do Iraque, estudar as alterações macroscópicas e histopatológicas em cinco cães mortos, bem como, identificar as espécies do parasita causador com o emprego da técnida de PCR. Trinta e nove cães policiais com 6 meses a 12 anos de idade foram incluídos no estudo. Amostras de sangue de cinco mililitros foram colhidas por animal, em tubos com EDTA e foram examinadas pelo método de Knott. A necropsia sistêmica foi realizada em cinco cães que haviamapresentado sinais clínicos severos de dirofilariose e espécimens dos seus tecidos foram enviados para o processamento histopatológico de rotina. Para a análise molecular dos vermes adultos de Dirofilaria spp, foi empregada a extração do DNA e a amplificação do gene cox1. Quinze de 39(38,46%) cães foram diagnosticados com uma microfilariase variável de moderada para severa. As alterações macroscópicas e histopatológicas foram acompanhadas por lesões generalizadas tro

PESQUISA MOLECULAR DE FILARÍDEOS EM CANINOS NO MUNICÍPIO DE CAMPO GRANDE, MATO GROSSO DO SUL, BRASIL

Filarídeos em caninos incluem espécies cujo microfilárias circulam na corrente sanguínea (ex., Dirofilaria immitis e Acantocheilonema reconditum) ou habitam no tecido subcutâneo (ex, Cercopithifilaria spp. e Onchocerca spp.) O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de filarídeos em cães e seus potenciais hospedeiros artrópodes do município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. Esta dissertação é composta por quatro artigos. Artigo 1- Objetivou investigar a ocorrência de infecções filariais em cães residentes em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. As amostras de sangue e pele de cães domiciliados (n = 80) foram microscopicamente (teste de Knott modificado e exame de sedimento de fragmento de pele) e molecularmente (PCR do gene 12S rRNA PCR) avaliados. Informações epidemiológicas foram obtidas por exame físico e questionário com os proprietários dos cães. O exame microscópico e molecular de amostras de sangue revelou que 5,0% (4/80) foram positivos para D. immitis em ambos os testes. Amostras de microfilárias dérmicas (todas identificadas como Cercopithifilaria sp.) foram detectadas em 42,5% (34/80) das amostras, considerando pelo menos um teste realizado. Cercopithifilaria sp. teve associação significativa com presença de carrapatos (Rhipicephalus sanguineus), acesso à rua e pequenos nódulos dérmicos. Foi observado excelente nível de concordância (Kappa = 0,759) entre os dois métodos de diagnóstico (exame microscópico e PCR). O sequenciamento de DNA confirmou a identificação de D. immitis e C. bainae circulando no Mato Grosso do Sul. A PCR mostrou maior sensibilidade e serve para detectar e classificar espécies de microfilárias, mas a análise microscópica deve ser considerada como teste de triagem para detecção do gênero de filarídeos em cães. Considerando que, na área de estudo, Rhipicephalus sanguineus e mosquitos são prevalentes ao longo do ano, medidas preventivas devem ser adotadas para evitar a infestação por artrópodes e a infecção por filarioides. Artigo 2- O objetivo do presente estudo foi detectar Cercopithifilaria bainae e outros patógenos transmitidos por carrapatos e realizar a caracterização molecular do carrapato Rhipicephalus sanguineus s.l. coletado em cães. Carrapatos (n= 432, incluindo 8 larvas, 59 ninfas e 365 adultos) foram amostrados de cães domiciliados (n= 73) residentes no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul (centro-oeste do Brasil). Todos os carrapatos foram identificados morfologicamente como R. sanguineus. O DNA genômico foi extraído em pools (três a cinco carrapatos por animal), seguido pela definição de haplótipos (com base no gene 16S rRNA) e pela investigação de patógenos (Cercopithifilaria sp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Hepatozoon canis, Babesia vogeli e Rickettsia spp.). Os espécimes coletados foram identificados como haplótipos A e B de R. sanguineus. Foram detectados DNA de Cercopithifilaria bainae (43,83%; 32/73), Ehrlichia canis (24,65%; 18/73), Anaplasma platys (19,17%; 14/73) e Hepatozoon canis (5,47%; 4/73). A identidade dos patógenos foi confirmada por análise de sequência de DNA. O presente estudo confirma a circulação dos haplótipos A e B de R. sanguineus no estado de Mato Grosso do Sul e sua importância como vetor de vários patógenos de interesse veterinário. Finalmente, este é o primeiro relato de C. bainae em carrapatos na região centro-oeste do Brasil. Artigo 3- O Objetivo do presente estudo é relatar um caso de cisto cutâneo gigante em um cão infectado por Cercopithifilaria bainae. Um cão sem raça definida, 9 anos, macho, deu entrada em uma clínica veterinária de Dourados, Mato Grosso do Sul (Centro-Oeste do Brasil) com uma massa na região lombossacral. No exame clínico, observou-se que a massa tinha aproximadamente 15 cm de diâmetro, com consistência flutuante e presença de fluido viscoso; a lesão, no entanto, era não ulcerada e não aderente. O exame citológico revelou presença de celularidade linfocitária moderada e macrófagos espumosos, eritrofagocitose e presença de numerosas microfilárias. Após análise morfológica e molecular do gene rRNA 12S, as microfilárias foram identificadas como C. bainae, exibindo 99-100% de identidade com as seqüências de DNA disponíveis no 46 Genbank. A cirurgia foi recomendada e após a ressecção do cisto gigante, o cão foi tratado com ivermectina por duas semanas e o quadro clínico foi completamente resolvido. Com base na presença de microfilárias no líquido do cisto, o papel desse filarideo no determinismo da lesão foi discutido. Artigo 4- O presente trabalho tem por objetivo relatar o primeiro caso de dirofilariose canina em Campo Grande, Mato Grosso do Sul. No dia 6 de setembro de 2018, um canino, fêmea, poodle, de 14 anos de idade, foi atendido numa clínica veterinária particular de Campo Grande- MS, apresentando hipertensão arterial e eosinofilia. O animal foi medicado e após nove dias, retornou com piora do quadro clínico (emese, melena, taquicardia, taquipneia). Mais exames laboratoriais foram solicitados, em que observou-se alterações cardiacas, hepáticas, renais e pancreáticas, além da presença de microfilárias, identificadas morfologicamente como D. imittis e confirmada espécie por teste sorológico e molecular. O animal foi internado, mas veio a óbito no quinto dia. Apesar de Campo Grande tratar-se de uma área não endêmica, o animal possui relato de viagem para região litorânea, sem realização de tratamento profilático. Portanto, representa um caso alóctone de dirofilariose na região.

Canine filarioids include microfilariae species that circulate in bloodstream (e.g., Dirofilaria immitis and Acantocheilonema reconditum) or dwell into the subcutaneous tissue (e.g., Cercopithifilaria spp. and Onchocerca spp.). The aim of this dissertation was to evaluate the occurrence of filarids in dogs and their potential arthropod hosts from municipality of Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil. This dissertation consists of four articles. Article 1- The aim of this study was to investigate the occurence of filarial infections in dogs from Campo Grande, State of Mato Grosso do Sul, Brazil. Blood and skin samples of domiciled dogs (n = 80) were microscopically (modified Knotts test and skin fragment sediment examination) and molecularly (12S rRNA gene PCR) evaluated. Epidemiological information was obtained by physical examination and questionnaire with dogs owner. Microscopic and molecular examination of blood samples revealed that 5.0% 74 (4/80) were positive for D. immitis in both tests. Specimens of dermal microfilariae (all identified as Cercopithifilaria sp.) were detected in 42.5% (34/80) of samples considering at least one test performed. Cercopithifilaria had sinificative association with tick presence (Rhipicephalus sanguineus), street access and small subcutaneous nodule. Good concordance level (Kappa= 0.759) between the two diagnostic methods (microscopic examination and PCR) was observed. DNA sequencing confirmed identification of D. immitis and C. bainae circulating in Mato Grosso do Sul. PCR showed more sensitivity and serves to detect and classify microfilaria species, but the microscopic analysis should be considered as screening test for detection of filarids genus in dogs. Considering that in the area of study Rhipicephalus sanguineus and mosquitoes are prevalent throughout the year, preventive measures should be disposed in order to avoid arthropds infestation and filarioids infection. Article 2- The aim of the present study was to detect Cercopithifilaria bainae and other tick-borne pathogens and to perform molecular characterization of the tick Rhipicephalus sanguineus s.l. collected from dogs. Ticks (n= 432, including 8 larvae, 59 nymphs, and 365 adults) were sampled from domiciled dogs (n= 73) living in Campo Grande, Mato Grosso do Sul (Midwest Brazil). All ticks were morphologically identified as R. sanguineus. Genomic DNA was extracted in pools (three to five ticks per animal) and was used for definition of R. sanguineus haplotypes (based on 16S rRNA analysis) and pathogen identification (Cercopithifilaria sp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Hepatozoon canis, Babesia vogeli and Rickettsia spp.). Rhipicephalus sanguineus specimens were identified as haplotypes A and B. DNA of Cercopithifilaria bainae (43.83%; 32/73), Ehrlichia canis (24.65%; 18/73), Anaplasma platys (19.17%; 14/73), and Hepatozoon canis (5.47%; 4/73) was detected. The identity of pathogens was confirmed by DNA sequence analysis. The present study confirms the presence of haplotypes A and B of R. sanguineus in the state of Mato Grosso do Sul and its importance as a vector of several pathogens of veterinary concern. Finally, this is the first report to identify C. bainae in ticks in the Midwestern region of Brazil. Article 3- The aim of this study was describe a case of giant cutaneous cyst in a dog infected by Cercopithifilaria bainae. A 9-year-old male mixed-breed dog presented to a veterinary facility in Dourados, Mato Grosso do Sul (Midwest Brazil) with a mass in the lumbosacral region. On clinical examination, the mass was observed to be approximately 15 cm in diameter with a floating consistency and conspicuous presence of viscous fluid; the lesion, however, was non-ulcerated and non-adherent. Cytological examination revealed the presence of moderate lymphocyte cellularity and spumous macrophages, erythrophagocytosis and the presence of numerous microfilariae. After morphological and molecular analysis of the 12S ribosomal RNA gene, the microfilariae were identified as C. bainae, exhibiting 99-100% identity with DNA sequences available from Genbank. Surgery was recommended and after resection of the giant cyst, the dog was treated with ivermectin for two weeks and the clinical condition was completely resolved. Based on the presence of microfilariae in the cyst fluid the role of this filarioid in the determinism of the lesion has been discussed. Article 4- The present study aims to report the first case of canine heartworm disease in Campo Grande, Mato Grosso do Sul. On September 6, 2018, a 14-year-old female canine, poodle, was seen at a private veterinary clinic in Campo Grande- MS, with arterial hypertension and eosinophilia. The animal was medicated and, after nine days, returned with a worsening of the clinical condition (emesis, melena, tachycardia, tachypnea). Further laboratory tests were requested, in which cardiac, hepatic, renal and pancreatic changes were observed, in addition to the presence of microfilariae, morphologically identified as D. imittis and a species confirmed by serological and molecular testing. The animal was hospitalized, but died on the fifth day. Although Campo Grande is a non-endemic area, the animal has reports of travel to the coastal region, without prophylactic treatment. Therefore, it represents an allochthonous case of heartworm disease in the region.

Dirofilaria immitis infestation in imported police (K-9) dogs in Iraq: / Infecção por Dirofilaria immitis em cães policiais importados no Iraque:

Dirofilaria immitis, the cause of heartworm infestation (HWI) or dirofilariasis, affects members of the Canidae and remains a worldwide clinical problem. In Iraq, dirofilariasis was believed absent until 2009, when the Karbala Governorate was reported as an endemic area for canine dirofilariasis. Consequently, this study intended to investigate the occurrence of Dirofilaria immitis in police dogs in one police academy in Iraq and to study the gross and histopathological changes in 5 dead dogs, as well as to identify the species of the causative parasite using PCR technique. Thirty-nine police dogs, aged between 6 months and 12 years were included in this study. For the microfilariae investigation, 5 ml blood samples were collected from all dogs in EDTA tubes and examined by Knotts method. The systemic necropsy performed in five dead dogs showed severe clinical signs of dirofilariasis and tissue specimens were sent for routine histopathological processing. For the molecular analysis, adult worms of the detected Dirofilaria spp. were used for DNA extraction andamplification of the cox1 gene. Fifteen of 39 (38.46%) dogs were diagnosed with moderate to severe microfilariasis. The dead dogs revealed typical severe clinical signs of dirofilariasis. Moreover, typical gross and histopathological changes were also seen, accompanied by generalized thromboembolic lesions, suggesting the

A Dirofilaria immitis, causadora da infestação pelo verme do coração (IVC) ou dirofilariose afeta os membros da família Canidae e ainda é um problema clínico mundial. Até o ano de 2009, acreditava-se que o Iraque fosse livre da dirofilariose, porém nessa ocasião a governadoria de Kerbala foi relatada como uma área endêmica de dirofilariose. Assim, o presente trabalho foi realizado para investigar a ocorrência da Dirofilaria immitis em cães policiais em uma academia de polícia do Iraque, estudar as alterações macroscópicas e histopatológicas em cinco cães mortos, bem como, identificar as espécies do parasita causador com o emprego da técnida de PCR. Trinta e nove cães policiais com 6 meses a 12 anos de idade foram incluídos no estudo. Amostras de sangue de cinco mililitros foram colhidas por animal, em tubos com EDTA e foram examinadas pelo método de Knott. A necropsia sistêmica foi realizada em cinco cães que haviamapresentado sinais clínicos severos de dirofilariose e espécimens dos seus tecidos foram enviados para o processamento histopatológico de rotina. Para a análise molecular dos vermes adultos de Dirofilaria spp, foi empregada a extração do DNA e a amplificação do gene cox1. Quinze de 39(38,46%) cães foram diagnosticados com uma microfilariase variável de moderada para severa. As alterações macroscópicas e histopatológicas foram acompanhadas por lesões generalizadas tro