Resumo
A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa natural dos bovinos causada pelo vírus da leucemia bovina (BLV). Esta doença tem distribuição mundial e a prevalência sorológica é alta nos rebanhos bovinos brasileiros, sendo considerada uma doença de importância econômica. A identificação e isolamento de animais positivos são necessários para controlar a disseminação do vírus e exames sorológicos são utilizados para esse fim. A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi considerada por muitos anos o teste de eleição. Entretanto, ensaios imunoenzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos e quando comparados ao IDGA apresentam sensibilidade mais elevada, leitura mais rápida e objetiva, além de possibilitarem o processamento de um grande número de amostras simultaneamente. A importação de kits de ELISA é um processo dispendioso e demorado, por isso a ferramenta mais utilizada no país ainda é o IDGA. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da LEB. A linhagem celular Tb1Lu infectada pelo BLV e livre de BVDV foi utilizada para a produção do antígeno. Setenta e três amostras de soro de bezerros coletadas antes e após a colostragem foram classificadas como negativas ou positivas pelo IDGA (referência). Para padronização do iELISA, diferentes concentrações do antígeno, soros controle positivo, negativo e conjugado foram avaliadas. Posteriormente, os resultados foram comparados com aqueles obtidos pelo IDGA e pelo ELISA comercial Chekit Leucose-Serum (IDEXX Laboratories, EUA). O protocolo final do teste foi definido nas seguintes condições: 1,0g de antígeno bruto por poço, soro teste na diluição de 1:25 e conjugado diluído a 1:5000. A sensibilidade e especificidade relativas ao IDGA foram 94,44% e 75,68%, respectivamente, e encontrou-se VPP=79,1% e VPN=93,3%. A concordância entre os testes foi de 84% e o índice Kappa foi 0,699. O iELISA apresentou sensibilidade de 92,6% e especificidade de 87,09% em relação ao ELISA Chekit. A concordância entre os testes foi de 90,27% e o índice Kappa 0,801. Nove amostras foram negativas para o IDGA e positivas no iELISA. Quando comparado ao ELISA Chekit, o iELISA apresentou maior sensibilidade e classificou como positiva uma amostra com resultado indeterminado pelo teste comercial, demonstrando que o ensaio desenvolvido pode ser utilizado alternativamente ao ELISA Chekit. O iELISA desenvolvido constitui-se, portanto, em uma ferramenta diagnóstica complementar ao IDGA para o controle da LEB no Brasil.
Enzootic bovine leukosis (EBL) is a natural infectious bovine disease caused by bovine leukemia virus (BLV). This disease has a worldwide distribution and the serological prevalence is high in the Brazilian cattle herds, with an important economic impact. The identification and isolation of positive animals are necessary to control the spread of the virus and serological tests have been used for this purpose. Agar gel Immunodifusion (AGID) was considered for many years the test of choice. However, immunoenzymatic assays (ELISA) have been developed and, when compared to the AGID, have higher sensitivity, faster and more objective reading, and also allow the processing of a large number of samples simultaneously. The importing of ELISA kits from other countries is an expensive and time consuming process. Because of this, the most used diagnostic tool in Brazil is still the AGID. Thus, the objective of this study was to standardize an indirect ELISA (iELISA) for diagnosis of EBL. The BLV-infected and BVDVfree Tb1Lu cell line was used for antigen production. Seventy-three serum samples from calves collected before and after colostrum feeding were classified as negative or positive by AGID (reference). For iELISA standardization, different antigen concentrations, positive and negative control sera and conjugates dilutions were evaluated. Subsequently, the results were compared with those obtained by the AGID and by the Chekit Leucose-Serum commercial ELISA (IDEXX Laboratories, USA). The final protocol for the iELISA was defined under the following conditions: 1.0g of crude antigen per well, serum test at 1:25 dilution and conjugate diluted 1: 5000. The sensitivity and specificity related to the AGID were 94.44% and 75.68%, respectively, and PPV = 79.1% and NPV = 93.3%. The agreement between the tests was 84% and the Kappa index was 0.699. The iELISA showed sensitivity of 92.6% and specificity of 87.09% in comparison to Chekit ELISA. The concordance between the tests was 90.27% and the Kappa index 0.801. Nine samples were negative for AGID and positive for iELISA. When compared to the Chekit ELISA, the iELISA showed higher sensitivity once classified as positive one sample with undetermined result in the commercial test, demonstrating that the assay developed can be used alternatively to the Chekit ELISA. The iELISA developed in this work is, therefore, a diagnostic tool complementary to the AGID for the control of EBL in Brazil.
Resumo
This research verified the variation of the occurrence of herpesvirus bovine type 1 (BoHV-1) by its association with two viral infections: bovine viral diarrhea (BVD) and enzootic bovine leukosis (EBL). The following methodologies were used: virus neutralization test (VNT) for both BoHV-1 and BVD diagnosis, and agar gel immunodiffusion (IDGA) for EBL. Five cattle herds were selected in the states of São Paulo and Minas Gerais, three of them were dairy cattle herds, one beef cattle and one crossbred. Every herd had a number of animals seropositive for BoHV-1. From 278 analyzed samples, 54.68% (152/278) were responsive to BoHV-1, 69.70% (194/278) to BVDV-1, and 34.33% (97/278) to EBLV. The statistical analysis showed significant difference (a = 0.01) in infection occurrence according to the type of herd and animal age. Dairy cattle were more sensitive to BoHV-1 (81.31%) and to EBLV (49.53%), while in beef cattle the most frequent was BVDV-1 (94.74%). Age was a risk factor only for BoHV-1 and EBLV, the results showed that the older animals were more susceptible. The association analysis also indicated that among BVDV-1 and/or EBLV infected herds the probability of finding BoHV-1 is higher than among herds where these two infections do not occur.
Esta pesquisa verificou a variação da ocorrência do herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) pela associação com duas doenças virais: diarréia viral bovina (BVD) e leucose enzoótica bovina (LEB). Como metodologias foram utilizados o teste de virusneutralização para detecção de BoHV-1 e BVD, e imunodifusão em gel de ágar para LEB. Foram selecionados cinco rebanhos bovinos, de propriedades localizadas em municípios dos Estados de São Paulo e Minas Gerais, sendo três de exploração leiteira, um de corte e um misto, todos com parte dos animais soropositivos ao BoHV-1. Das 278 amostras analisadas, 54,68% (152/278) foram positivas ao BoHV-1, 69,70% (194/278) ao BVDV-1 e 34,33% (96/278) ao VLEB. Na análise estatística, ao relacionar cada enfermidade com o tipo de exploração do rebanho e a idade dos animais, houve diferença significativa (a=0.01). Os rebanhos leiteiros foram mais suscetíveis ao BoHV-1 (81,31%) e a LEB (49,53%), enquanto o gado de corte teve como maior ocorrência o BVDV-1 (94,74%). A idade foi fator de risco apenas para o BoHV-1 e a LEB, sendo os animais mais velhos os mais suscetíveis. As análises associativas também indicaram que em rebanhos infectados por BVDV-1 e/ou LEB, a probabilidade de se encontrar o BoHV-1 é maior do que nas isentas dessas duas enfermidades.