Isolation, cultivation and immunofluorescence characterization of lamellar keratinocytes from equine hoof by using explants / Isolamento, cultivo e caracterização por imunofluorescência de queratinócitos lamelares de casco equino utilizando explantes

The importance of the hoof to the horse health is clear, and the current knowledge regarding the cellular aspects of hoof keratinocytes is poor. Studies on equine keratinocyte culture are scarce. Developing keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods have already been established, such as those for skin keratinocyte culture. However, few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The objective of this study was to standardize the equine hoof keratinocyte isolation and cultivation, and then characterize the cell immunophenotype. For this, the primary culture method used was through explants obtained from three regions of the equine hoof (medial dorsal, dorsal, and lateral dorsal). After the cell isolation and cultivation, the cell culture and its explants were stained with anti-pan cytokeratin (pan-CK) (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4), and Ki-67 (MIB-1) antibodies. Cells were grown to third passage, were positive for pan-CK, p63 and Ki-67, and few cells had vimentin positive expression. As for the explants, the epidermal laminae were not stained for vimentin or Ki-67. However, some cells presented positive pan-CK and p63 expression. This study demonstrated the viability of lamellar explants of equine hooves as a form of isolating keratinocytes in primary cultures, as well as characterized the proliferation ability of such keratinocytes in monolayers.(AU)

É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenientes de casco equino visando futuramente associar ao estudo da medicina regenerativa para assim estabelecer um modelo experimental in vitro e indicar o uso criterioso de terapias regenerativas para a laminite equina. Desta forma, o cultivo em monocamada e a caracterização de queratinócitos lamelares foram realizados. Para isso, o método de cultura primária utilizado foi através de explantes obtidos de três regiões do casco (dorso-medial, dorsal e dorso-lateral). As células foram caracterizadas para os marcadores anti pan-cytokeratin (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4) e Ki-67 (MIB-1) nos cultivos e nos explantes. As células foram cultivadas até terceira passagem, tendo marcação positiva para pan-CK, p63 e Ki-67 e fraca marcação para vimentina. Já as lâminas epidermais não tiveram marcação de vimentin e Ki-67, porém marcaram acentuadamente para pan-CK e p63. Este estudo demonstrou a exiquibilidade do uso de explantes lamelares do casco de equinos, como forma de isolamento de queratinócitos em cultivos primários, bem como caracterizou a habilidade de proliferação desses queratinócitos em monocamada.(AU)

Isolation, cultivation and immunofluorescence characterization of lamellar keratinocytes from equine hoof by using explants / Isolamento, cultivo e caracterização por imunofluorescência de queratinócitos lamelares de casco equino utilizando explantes

The importance of the hoof to the horse health is clear, and the current knowledge regarding the cellular aspects of hoof keratinocytes is poor. Studies on equine keratinocyte culture are scarce. Developing keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods have already been established, such as those for skin keratinocyte culture. However, few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The objective of this study was to standardize the equine hoof keratinocyte isolation and cultivation, and then characterize the cell immunophenotype. For this, the primary culture method used was through explants obtained from three regions of the equine hoof (medial dorsal, dorsal, and lateral dorsal). After the cell isolation and cultivation, the cell culture and its explants were stained with anti-pan cytokeratin (pan-CK) (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4), and Ki-67 (MIB-1) antibodies. Cells were grown to third passage, were positive for pan-CK, p63 and Ki-67, and few cells had vimentin positive expression. As for the explants, the epidermal laminae were not stained for vimentin or Ki-67. However, some cells presented positive pan-CK and p63 expression. This study demonstrated the viability of lamellar explants of equine hooves as a form of isolating keratinocytes in primary cultures, as well as characterized the proliferation ability of such keratinocytes in monolayers.(AU)

É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenientes de casco equino visando futuramente associar ao estudo da medicina regenerativa para assim estabelecer um modelo experimental in vitro e indicar o uso criterioso de terapias regenerativas para a laminite equina. Desta forma, o cultivo em monocamada e a caracterização de queratinócitos lamelares foram realizados. Para isso, o método de cultura primária utilizado foi através de explantes obtidos de três regiões do casco (dorso-medial, dorsal e dorso-lateral). As células foram caracterizadas para os marcadores anti pan-cytokeratin (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4) e Ki-67 (MIB-1) nos cultivos e nos explantes. As células foram cultivadas até terceira passagem, tendo marcação positiva para pan-CK, p63 e Ki-67 e fraca marcação para vimentina. Já as lâminas epidermais não tiveram marcação de vimentin e Ki-67, porém marcaram acentuadamente para pan-CK e p63. Este estudo demonstrou a exiquibilidade do uso de explantes lamelares do casco de equinos, como forma de isolamento de queratinócitos em cultivos primários, bem como caracterizou a habilidade de proliferação desses queratinócitos em monocamada.(AU)

ESTUDO COMPARATIVO DA CAPACIDADE DE DIFERENCIAÇÃO TENOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE DIFERENTES FONTES TECIDUAIS EM CULTIVO 3D

As lesões tendíneas são causas importantes de claudicação e afastamento do esporte em equinos e no homem. A incidência de lesões é variada de acordo com a modalidade e intensidade atlética, compreendendo cerca de 30% das lesões musculoesqueléticas de ambas as espécies. Os tratamentos convencionais são pouco eficazes em reparar com qualidade a matriz extracelular (MEC), o que determina o elevado índice de recidivas. As células-tronco mesenquimais (CTM) ganharam destaque no tratamento das tendinopatias e demonstram resultados favoráveis nas características histológicas e mecânicas teciduais, bem como redução do tempo de reparação tendínea. Estas caracteristicas terapeuticas das CTM são atribuidas à sua habilidade de imunomodulação, característica anti-inflamatória, promotora da reorganização tecidual e capacidade de diferenciação em linhagens mesodermais. Já é conhecida a possibilidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro das CTM, no entanto a diferenciação tenogênica ainda não possui uma metodologia padronizada e eficaz. A modalidade de cultivo tridimensional (3D) de CTM em materiais sintéticos ou biológicos é capaz de estimular a diferenciação celular de acordo com a composição do arcabouço, além de oferecer proteção e potencializar o desempenho terapêutico. Objetivo: Determinar qual melhor fonte de CTM equinas dentre: tecido adiposo (CTMad); medula óssea (CTMmo); e tendão obtidos por isolamento (CTMtd ISO) ou explante (CTMtd EXPL), que possui a melhor capacidade de proliferação in vitro, diferenciação tenogênia em cultura 3D em hidrogel de MEC tendinea equina (HgMECTdEq) e cultivo 2D em membrana Transwell® revestida de colágeno I e III (1:1). Objetivamos também avaliar a eficácia de uma nova metodologia de diferenciação tenogênica. Métodos: As quatro diferentes fontes de CTM foram obtidas de um mesmo equino com 10 meses de idade. As amostras foram processadas e as CTM, isoladas e cultivadas. As células foram caracterizadas através de sua morfologia fibroblastóide, aderência ao plástico, expansão clonal, expressão de receptores de superficie CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- e diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. A capacidade de proliferação in vitro de cada origem foi avaliada pelos testes de Taxa de Proliferação Celular (TPC) e Tempo de Cuplicação da População Celular (TDPC), cultavas por 72 horas em três diferentes concentrações iniciais (1x104, 3x104 e 1x105). Foi avaliada a habilidade de diferenciação tenogênica de cada origem celular através da produção de colágeno pela coloração de Picrosirius Red quando cultivadas em membrana Transwell® revestida com COL1:COL3 e meio de diferenciação tenogênica (50 ng/ml de Proteína Óssea Morfogenética-12 (BMP-12), 50 g/ml de Ácido Ascórbico e 5 g/ml de ITS). O HgMECTdEq foi produzido de acordo com protocolo desenvolvido pelo Laboratório de Terapias Regenerativas da FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Posteriormente 2x105 CTM de cada origem foram adicionadas em cultivo 3D imersas em 0,5 mL de hidrogel e cultivadas por 7 dias em meio de cultivo padrão e de diferenciação tenogênica. Foi determinada a concentração de metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) pelo ensaio de zimografia e em análise quantitativa por PCR a expressão gênica dos marcadores de tenogênese Scleraxis, Mohawk, Biglicana, Decorin, Tenascina C, Colágeno I e Colágeno III, além do fator osteogênico RunX2 do cultivo 3D em HgMECTdEq e em cultivo 2D em membrana COL1:COL3, com meio padrão e de diferenciação tenogênica. Resultados: Todas as células apresentaram características similares quanto à morfologia fibroblastoide, aderência ao plástico e expansão clonal. Houve baixa expressão dos receptores de superfície CD105 para CTMtd ISO e CD44 para as CTMad e positiva expressão de MHC-II para as CTMtd EXPL. Superior habilidade de proliferação in vitro foi identificada para a CTMad e inferior capacidade de diferenciação adipogênica e condrogênica foi observada para as CTMtd EXPL. A nova metodologia de diferenciação tenogênica foi capaz de produzir a diferenciação tenogênica das quatro origens de CTM, com inferior produção de colágeno para as CTMmo. O meio de diferenciação tenogênico foi capaz de aumentar a concentração de MMP-2 e MMP-9 e também aumentar a expressão dos marcadores tenogênicos Sclerax, Mohawk, Biglicana, Decorin, COL1, COL3, Tenascina C e o fator esteogênico Runx2. Conclusão: A nova metodologia de diferenciação tenogênica proposta pelo estudo foi eficaz em induzir a tenogênese de todas as fontes de CTM avaliadas. De acordo com nossos resultados a melhor fonte em capacidade de proliferação, diferenciação tenogênica in vitro e seguridade para aplicações clínicas são as CTMad. As CTMtd ISO e EXPL, apesar de sua evidente capacidade de tenogênese, apresentam população heterogênia em cultivo e resultados de caracterização que desencorajam sua aplicação clínica, especialmente de forma alogênica.

Tendon injuries are important causes of lameness and withdrawal from sport in horses and men. The incidence of injuries varies according to the sport and athletic intensity, comprising about 30% of musculoskeletal injuries of both species. Conventional treatments are ineffective in repairing the extracellular matrix (ECM) with quality, which contributes to the high rate of recurrence. Mesenchymal stem cells (MSC) gained prominence in the treatment of tendinopathies and showed favorable results in the histological and mechanical tissue characteristics, as well as a reduction in the tendon repair time. These therapeutic characteristics of MSCs are attributed to their ability to immunomodulate, anti-inflammatory, promote tissue reorganization and differentiate into mesodermal lineages. The possibility of osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation in vitro of MSCs is already known, however tenogenic differentiation still does not have a standardized and effective methodology. The modality of three-dimensional (3D) culture of MSC in synthetic or biological materials is capable of stimulating cell differentiation according to the composition of the framework, in addition to offering protection and enhancing therapeutic performance. Objective: To determine the best source of equine MSCs among adipose tissue (MSCad), bone marrow (MSCmo) and tendon obtained by isolation (MSCtd ISO) or tendon explant (MSCtd EXPL), for in vitro proliferation and tenogenic differentiation under two different conditions: 3D hydrogel cultivation of equine tendon ECM (HgMECTdEq); and 2D cultivation on a type I and III collagen-coated membrane. We also aim to evaluate the effectiveness of a new formulation of a means inducing tenogenic differentiation. Methods: The four different sources of MSC were obtained from the same 10-month-old horse. Samples were processed and MSCs isolated and cultivated. The cells were characterized by their fibroblastoid morphology, plastic adherence, clonal expansion, expression of CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- surface receptors and osteogenic, adipogenic and differentiation. chondrogenic. The in vitro proliferation capacity of each source was evaluated by the Cell Proliferation Rate (CPT) and Population Doubling Time (PDT) tests, grown for 72 hours at three different initial concentrations (1x104, 3x104 and 1x105). The tenogenic differentiation ability of each cell origin was evaluated through the production of collagen by Picrosirius Red staining when cultivated on a Transwell® membrane coated with COL1:COL3 and tenogenic differentiation medium (50 ng/ml of Morphogenetic Bone Protein-12 (BMP) -12), 50 g/ml Ascorbic Acid and 5 g/ml ITS). The HgMECTdEq was produced according to a protocol developed by the Laboratory of Regenerative Therapies at FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Afterwards, 2x105 CTM of each origin were added in 3D culture immersed in 0.5 mL of hydrogel and cultivated for 7 days in standard culture medium and tenogenic differentiation. The concentration of matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) was determined by zymography assay and in quantitative analysis by PCR the gene expression of tenogenesis markers Scleraxis, Mohawk, Biglican, Decorin, Tenascin C, Collagen I and Collagen III, in addition to the osteogenic factor RunX2 from 3D culture in HgMECTdEq and in 2D culture in COL1:COL3 membrane, with standard culture medium and tenogenic differentiation. Results: All cells showed similar characteristics regarding fibroblastoid morphology, plastic adherence and clonal expansion. There was low expression of surface receptors CD105 for CTMtd ISO and CD44 for CTMad and positive expression of MHC-II for CTMtd EXPL. Superior in vitro proliferation ability was identified for MSCad and inferior capacity for adipogenic and chondrogenic differentiation was observed for MSCtd EXPL. The new tenogenic differentiation methodology demonstrated efficacy in the four MSC origins, with lower collagen production for MSCmo. The tenogenic differentiation medium was able to increase the concentration of MMP-2 and MMP-9 and also increase the expression of tenogenic markers Sclerax, Mohawk, Biglican, Decorin, COL1, COL3, Tenascin C and the osteogenic factor Runx2. Conclusion: According to our results, we determined that the best source of proliferation capacity and tenogenic differentiation in vitro are MSCad. MSCtd ISO showed an evident in vitro tenogenesis capacity, being a promising source of CTM. The new tenogenic differentiation methodology proposed by the study was effective in inducing tenogenesis of all MSC sources evaluated.

POTENCIAL DE IMUNOMODULAÇÃO E REPARAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DA MEMBRANA SINOVIAL E ENCAPSULADAS EM HIDROGEL DE ALGINATO EM LESÕES ARTICULARES INDUZIDAS EXPERIMENTALMENTE EM EQUINOS

A alta casuística e os desafios encontrado no tratamento da osteoartrite (OA) em equinos, tem impulsionado a comunidade científica na busca do tratamento mais efetivo. As células tronco mesenquimais derivadas de membrana sinovial (CTMMS) tem apresentado resultados promissores no tratamento de lesões articulares, especialmente por seu potencial de imunomodulação e reparação, mas que necessita de melhor compreensão. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as características da imunomodulação e reparação após a aplicação intra-articular das CTMMS livres e encapsuladas em hidrogel de alginato em lesões articulares induzidas em equinos. Lesões condrais foram realizadas na tróclea medial do talus em quinze cavalos. No dia da indução os animais foram divididos em três grupos. Os grupos foram divididos em CTMMS encapsulada, CTMMS livres e controle. Foram realizadas avaliações clínicas, análise citológica, química e dosagem de citocinas no líquido sinovial (IL-1, IL-10, IL-6, INF-, TNF , Substância P, amilóide sérica A, TGF, IGF e PGE2), antes do defeito e 24, 48, 96, 168 e 336 horas. Após 150 dias da instituição dos tratamentos, foram realizadas avaliação in situ através da cirurgia artroscópica utilizando os escores ICRS e coletamos material para análise histológica escore de ODriscoll e imunohistoquímica para colágeno tipo II. O tratamento com CTMMS seja ela livre ou encapsulada reduziu o processo inflamatório articular. O grupo CTMMS encapsulada apresentou maior processo inflamatório inicial comparado com os demais grupos, em função do elevado número de neutrófilos, macrófagos, IL-6, IL-10, TNF e INF-. Na avaliação in situ da reparação da cartilagem, foi observado diferença estatística na avaliação global de reparo no CTMMS encapsulada. Na análise macroscópica coradas com hematoxilina-eosina e azul de toluidina, o CTMMS encapsulada e CTMMS livre, demonstraram diferentes graus da formação de fibrocartilagem, maior quantidade no CTMMS livre, no entanto as características morfológicas foram semelhantes a cartilagem nativa. As CTMMS encapsuladas em hidrogel de alginato demonstram ter maior potencial de imunomodulação por reduzir a contagem de linfócitos e macrófagos, aumentar a IL-10 e IL-6 no líquido sinovial, o que contribuiu de forma mais eficaz para o controle da inflamação e na reparação quando comparado ao grupo de CTMMS livres, provavelmente devido ao maior tempo de permanência das células encapsuladas dentro da articulação.

The high casuistry and the challenges encountered in the treatment of osteoarthritis (OA) in horses has driven the scientific community in the search for the most effective treatment. Mesenchymal stem cells derived from synovial membrane (MSCSM) have shown promising results in the treatment of joint lesions, especially for their potential for immunomodulation and repair, but need better understanding. Therefore, the objective of this work was to evaluate the characteristics of immunomodulation and repair after the intra-articular application of free and encapsulated MSCSM in alginate hydrogel in equine induced joint lesions. Chondral lesions were performed in the medial trochlea of the talus in fifteen horses. On the day of induction the animals were divided into three groups. The groups were divided into encapsulated MSCSM, free MSCSM and control. Clinical evaluations, cytological analysis, chemistry and cytokine dosage in the synovial fluid (IL-1, IL-10, IL-6, INF-, TNF , Substance P, amyloid serum A, TGF, IGF and PGE2) were performed before the defect and 24, 48, 96, 168 and 336 hours. After 150 days from the institution of treatment, in situ evaluation was performed through arthroscopic surgery using the ICRS scores and we collected material for histological analysis O'Driscoll score and immunohistochemistry for collagen type II. The treatment with MSCSM, either free or encapsulated, reduced the joint inflammatory process. The encapsulated MSCSM group presented a greater initial inflammatory process compared to the other groups, due to the high number of neutrophils, macrophages, IL-6, IL-10, TNF and INF-. In the in situ evaluation of the cartilage repair, a statistical difference was observed in the global evaluation of the encapsulated MSCSM repair. In the macroscopic analysis stained with hematoxylin-eosin and toluidine blue, the encapsulated MSCSM and free MSCSM demonstrated different degrees of fibrocartilage formation, greater amount in free MSCSM, however the morphological characteristics were similar to native cartilage. The MSCSM encapsulated in alginate hydrogel showed higher immunomodulation potential by reducing the lymphocyte and macrophage counts, increasing the IL-10 and IL-6 in the synovial fluid, which contributed more effectively to the control of inflammation and repair when compared to the group of free MSCSM, probably due to the longer stay of the encapsulated cells inside the joint

DEVELOPMENT OF A TISSUE ENGINEERING PLATFORM USING BOVINE SPECIES AS A MODEL: PLACENTAL SCAFFOLDS SEEDED WITH BOVINE ADIPOSE-DERIVED CELLS

A tecnologia de células-tronco e as ciências de biomateriais obtiveram um grande avanço nas últimas décadas e se tornaram mais populares em todo o mundo. Pesquisadores buscam investigar e avaliar diferentes fontes de células e de biomateriais que, em combinação, possam fornecer uma plataforma de engenharia tecidual de baixo custo e produzida em larga escala, para serem utilizadas em testes de drogas, terapias celulares e transplantes, com objetivo de fornecer suporte terapêutico à lesões e regeneração de tecidos danificados. Em geral, os três componentes mais importantes da engenharia de tecidos são: a escolha do tipo de célula, a fonte do biomaterial (scaffold), criação e manutenção de um ambiente propício à formação tecidual. Quando esses três componentes são gerenciados com sucesso, o microambiente celular in vitro é mais semelhante ao que a célula está exposta in vivo, permitindo que o crescimento e diferenciação celular ocorra de maneira mais fidedigna e eficiente. A placenta bovina descelularizada demonstrou ter uma rica matriz extracelular, vasos bem desenvolvidos, sendo um biomaterial com alta disponibilidade e baixo custo. No entanto, não há informação sobre o potencial dos scaffolds placentários em serem repovoados com células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas do tecido adiposo, processo chamado recelularização. Ainda, também não há informação sobre a capacidade dos scaffolds placentários, de após recelularização, oferecer um ambiente adequado para diferenciação dessas células em diferentes linhagens. Assim, a fim de fornecer informações sobre a capacidade do complexo MSC - scaffold placentário em ser usado com sucesso na engenharia tecidual, os objetivos desta tese foram: estudar o potencial dos scaffolds placentários bovinos em oferecer suporte para recelularização por células-tronco derivadas do tecido adiposo bovino, bem como avaliar a capacidade de diferenciação celular em linhagens osteogênica e condrogênica. O primeiro artigo desta tese trata-se de uma revisão de literatura, que discute a natureza das células-tronco mesenquimais, suas aplicações na medicina regenerativa, a importância da tecnologia com células- tronco na indústria pecuária e o uso da espécie bovina na medicina translacional. O segundo artigo consiste na avaliação da recelularização e da diferenciação celular. As placentas bovinas foram decelularizadas por perfusão de SDS do vaso umbilical e as linhas celulares estabelecidas após digestão enzimática do tecido adiposo de seisxiv vacas e seleção por adesão rápida à placa de cultivo. Em seguida, as células foram cultivadas com os scaffolds em um sistema de agitação 2D por 21 dias em meio de diferenciação ou manutenção. Quando cultivadas na placa de cultivo, as células isoladas exibiram morfologia semelhante ao fibroblasto, expressão de CD90, CD73 e CD105, enquanto não expressaram os marcadores CD34 e CD45. Além disso, as células foram capazes de se diferenciar em linhagens condrogênicas e osteogênicas, fornecendo evidências de sua natureza mesenquimal. Posteriormente, quando cultivadas com os scaffolds, as células aderiram-se aos mesmos por projeções celulares, estabeleceram comunicação célula-scaffold e se proliferaram, fato evidenciado por análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (SEM). Em seguida, o potencial das células em se diferenciarem em linhagem osteogênica quando cultivadas com scaffold foi avaliado. Durante um período de cultivo de 21 dias no meio osteogênico, as células se proliferaram e diferenciaram de maneira dependente do tempo, ou seja, a cada semana pode ser observado maior abundância de células, evidenciada pela coloração dos núcleos celulares e aumento da intensidade da coloração para COLAGENO 1 (COL1), que também foi expresso por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). O mesmo padrão foi observado pela análise histológica; acúmulos generalizados de cálcio também foram mais abundantes nos scaffolds na terceira semana de cultivo, evidenciado pela coloração de Von Kossa. A análise SEM revelou que as células secretaram estruturas globulares quando cultivadas sob condições de indução osteogênica, condizente com a secreção observada pela análise histológica. Em relação à diferenciação condrogênica, os corantes Safranina e Fast Green revelaram sucesso na diferenciação, através da coloração de proteoglicanos, células semelhantes aos condrócitos e colágeno tipo II. A análise SEM mostrou que as células mudaram sua morfologia de fibroblastos para globulares quando cultivadas com meio de indução condrogênica por 21 dias. Além disso, os complexos célulasscaffold expressaram um marcador de linhagem cartilaginosa, COLAGENO 2 (COL2), que são condizentes com as observações histológicas e SEM. Considerando os resultados, este estudo demonstrou que os scaffolds placentários bovinos cultivados com células-tronco derivadas de tecido adiposo bovino possuem potencial para serem utilizados na engenharia de tecidos ósseos e cartilaginosos.

Stem cell technologies and biomaterial sciences have advanced and grown more popular all over the world. The researchers aim to investigate and evaluate different sources of cells and biomaterials that, in combination, could provide a low cost, highly scalable tissue engineering platform that could be used in drug tests, cell therapies and cell transplantation. The three most important components of tissue engineering systems in general are cell source, biomaterial source (scaffolding system), and the creation and maintenance of an environment that is conducive to tissue formation. When these three components are successfully managed, the tissue engineering treatment achieves a faithful imitation of the in vivo environment, allowing for the differentiation of cells into the desirable cell types. Decellularized bovine placenta has been demonstrated to be rich in extracellular matrix (ECM) and to have well-developed vasculature, representing a highly available, low cost, practically scalable biomaterial. However, it is not known if placental scaffolds have the potential to support recellularization with adipose-derived cells and their subsequent differentiation into different lineages. Thus, in order to provide information on the ability of the mesenchymal stem cell (MSC) - placental scaffold complex to be used in tissue engineering approaches, the objectives of this thesis were: to study the potential of bovine placental scaffolds to support adipose-derived cell recellularization and their differentiation into osteogenic and chondrogenic lineages. The first article of this thesis is a literature review that discusses the nature of mesenchymal stem cells, their applications in regenerative medicine, the importance of stem cell technologies to the livestock industry and the use of bovine species for translational medicine. The second article consists of an evaluation of scaffold recellularization and the differentiation of cells on the scaffolds. The bovine placentae were decellularized by umbilical vessel sodium dodecyl sulfate (SDS) perfusion and cell lines were established after the enzymatic digestion of adipose tissue from six cows and cell selection by rapid adherence to the culture plate. Then, cells were seeded onto the scaffolds and cultured in a 2D rocker system for 21 days in either differentiation or maintenance medium. The isolated cells, when cultured in the plastic dish, exhibited fibroblast-like morphology, CD90, CD73 and CD105 expression, and lacked CD34 and CD45 expression. Moreover, the cells were able to undergo differentiation into chondrogenic and osteogenic lineages, providing evidence of their mesenchymalxii nature. Subsequently, the cells adhered to the scaffolds by cell projections, established cell-scaffold communication, and proliferated while maintaining cell-cell communication, which was evidenced by histological and scanning electron microscopy (SEM) assays. Throughout a 21-day culture period in the osteogenic medium, the cells exhibited proliferation and differentiation in a time-dependent manner, which can be observed by the greater abundance of cells in later periods, evidenced by cell nuclei staining (4,6-diamidino-2-phenylindole - DAPI) and increased intensity of staining for COLLAGEN 1 (COL1) in the immunohistochemical assay, and by its expression as measured by real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). This same pattern was observed by histological analysis. Widespread calcium accumulations were also more abundant on the scaffolds as time progressed, as evidenced by Von Kossa staining. The SEM analysis revealed that cells secreted globular/round structures when seeded under osteogenic induction conditions, in accordance with histological findings. Regarding chondrogenic differentiation, Safranin O and Fast Green staining revealed successful differentiation through staining of proteoglycans, chondrocyte-like cells and type II collagen on the scaffold. The SEM analysis showed that the cells changed morphology from fibroblast-like to globular when cultured with chondrogenic induction medium for 21 days. Additionally, cellscaffold complexes expressed a cartilage marker, COLLAGEN 2 (COL2), which is conducive to the histological and SEM observations. Considering the results as a whole, this study demonstrated that placental scaffolds seeded with adipose-derived cells have the potential to be used in bone and cartilage tissue-engineering applications.

Tratamento de Lesões de Cartilagem Articular de Coelhos Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus) com Células Progenitoras Associadas ou Não Associadas a Membrana de Colágeno São Paulo 2020

A osteoartrite é uma das doenças mais comuns presentes nas articulações sinoviais, ela é responsável por incapacitar milhares de pessoas, jovens, adultos e idosos ao redor do mundo, gerando perdas economicas importântes a sociedade pois o indivíduo com problemas articulares, por muitas vezes não consegue gerar um saldo positivo à econômia, mas sim gastos com saúde pública. As lesões presentes na cartilagem articular podem ter graduação variada, sendo que as mais brandas permitem uma recuperação completa e retorno funcional adequado da articulação, enquanto as lesões mais graves fazem com que a matriz extracelular presente nas articulações seja incapaz de absorver e dissipar as forças atuantes presentes nas articulações, além de perder a sua superfície lisa responsável por reduzir o atrito durante sua movimentação. Os tratamentos para as lesões de cartilagem articular podem ser medicamentosos ou através de procedimentos cirúrgicos, sendo que o primeiro deles é responsável por reduzir a dor do paciente, e evitar ou prorrogar a evolução da doença. Já os tratamentos cirúrgicos visam à reparação tecidual local e uma função articular mais próxima possível do tecido saudável. Apesar disso, nenhum tratamento até hoje conseguiu reestabelecer essas funções adequadamente, mas com o avanço da engranharia tecidual, a associação entre células progenitoras e scaffolds biológicos têm se tornado uma importante opção na pesquisa e tratamento dessas lesões. Para isso, tais ensaios são comumente realizados em modelos animais grandes o suficiente para realização da lesão, aplicação de tratamentos e avaliações macro e microscópicas, sendo que o coelho se encaixa em todos esses requisitos, além de apoiar a maior parte do seu peso nos membros pélvicos, sendo então, semelhante aos humanos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi isolar, cultivar e caracterização as células progenitoras provenientes da cartilagem articular de coelhos Nova Zelândia (Oryctolagus cuninculus), como células progenitoras com características mesenquimais, e verificar seu potencial de aderência em um scaffold biológico de colágeno tipo I/III de suíno, e fazer o seu uso autólogo, associado e não associado a membrana de colágeno, em lesões de cartilagem realizadas cirúrgicamente, para que, após um período de cicatrização de 100 dias fosse realizado a eutanásia destes animais e avaliação comparativa macro e microscópica dos tratamento realizados, e por estes resultados concluimos que as células progenitoras têm um papel e potencial importante na reparação da cartilagem articular junto à engenharia tecidual.

Osteoarthritis is one of the most common diseases present in synovial joints, it is responsible for incapacitating thousands of young, adults and elderly people around the world, generating important economic losses to society because the individual with joint problems, often cannot generate a positive balance for the economy, and keep spending on public health. The lesions present in the articular cartilage can have varying degrees, the milder ones allow a complete recovery and adequate functional return of the joint. However, the most serious injuries cause the extracellular matrix present in the joints inability to absorb and dissipate the acting forces present in the joints, in addition to losing its flat surface responsible for reducing friction during its movement. Treatments for articular cartilage injuries can be through medication or surgical procedures, the first one is responsible for reducing the patient's pain and preventing or prolonging the disease's progress. Surgical treatments aim at local tissue repair and a joint function as close as possible to healthy tissue. Despite this, no treatment to date has managed to reestablish these functions properly, but with the advancement of tissue engineering, the association between progenitor cells and biological scaffolds has become an important option for research and treatment of these lesions. Such tests are commonly performed on animal models large enough to perform the lesion, apply treatments and gross and microscopic evaluations. Thus, the rabbit fits in all these requirements, and in addition it support most of its weight on the pelvic limbs, like humans. And so, the objective of this study was to carry out the culture and characterization of progenitor cells from the articular cartilage of New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) as progenitor cells with mesenchymal characteristics, to verify their adherence potential in a biological collagen type I/III scaffold of swine and do the autologous use these cells, with and without scaffold as treatment on cartilage lesions surgically performed. And then, after a healing period of 100 days, the euthanasia of these animals was performed the comparative evaluation, gross and microscopic, of these treatments, and thereby we concluded that the progenitor cells have an important role and potential in the repair of articular cartilage along with tissue engineering.

Caracterização morfológica do aparelho tegumentar e diferenciação de células pluripotentes induzidas em queratinócitos de equinos pertencentes ao grupamento racial Baixadeiro

O cavalo Baixadeiro é um ecotipo rústico e com potencial de resistência ao clima tipico da Baixada Maranhense, mais especificamente aos campos alagados desta região. Dessa forma, este trabalho teve diferentes objetivos e por isso foi dividido em quatro capítulos. No capitulo I propôs-se descrever a arquitetura e a estrutura do aparelho tegumentar; no capítulo II objetivou-se isolar e caracterizar fibroblastos para a conservação genética; o intuito do capítulo III foi estabelecer um protocolo de descelularização de pele que mantenha a arquitetura da matriz extracelular; finalmente no capítulo IV propôs-se diferenciar células tronco em queratinócitos. Como resultado do capítulo I, constatou-se que os embriões apresentavam diferenças na formação de epiderme ao longo das regiões corpóreas com a marcação da citoqueratina 18 no citoplasma do tecido epidermal em formação, proteína GFAP demonstrando a presença de receptores sensoriais durante o desenvolvimento da derme e colágeno tipo I na matriz extracelular. Como resultado do capítulo II, os fibroblastos apresentaram citoplasma alongado e núcleo esférico centralizado com alta capacidade de proliferação e com marcação para células tronco mesenquimais. Teve-se como resultado do capítulo III que os componentes da matriz extracelular como proteoglicanos, fibras colágenas, fibronectina e laminina permaneceram após o uso de detergentes, indicando uma descelularização eficiente. Além disso, foi comprovado que os scaffolds permitiram o crescimento de fibroblastos fetais. No capítulo IV foi induzida a diferenciação de células tronco (células mesenquimais e células pluripotentes induzidas) em queratinócitos. Neste trabalho foi possível compreender a morfologia do sistema tegumentar com ênfase no cultivo de fibroblastos do cavalo Baixadeiro para a conservação genética, bem como a 9 associação de células tronco com a bioengenharia para a construção de um substituto de pele para lesões cutâneas em equinos.

The Baixadeiro horse is a rustic ecotype with potential to resist the typical climate of the Baixada Maranhense, more specifically to the flooded fields of this region. Thus, this work had different objectives and was therefore divided into four chapters. In Chapter I, it was proposed to describe the architecture and structure of the integumentary apparatus; Chapter II aimed to isolate and characterize fibroblasts for genetic conservation; The purpose of Chapter III was to establish a skin decellularization protocol that maintains the architecture of the extracellular matrix; Finally, in Chapter IV it was proposed to differentiate stem cells into keratinocytes. As a result of chapter I, it was found that the embryos showed differences in epidermis formation along the body regions with cytokeratin 18 marking in the epidermal tissue cytoplasm. GFAP protein demonstrates the presence of sensory receptors during dermis development and type I collagen in the extracellular matrix. As a result of Chapter II, the fibroblasts presented elongated cytoplasm and centralized spherical nucleus with high proliferation capacity and marked for mesenchymal stem cells. As a result of Chapter III, extracellular matrix components such as proteoglycans, collagen fibers, fibronectin and laminin remained after detergent use, indicating efficient decellularization. In addition, it has been shown that scaffolds allowed the growth of fetal fibroblasts. Chapter IV induced differentiation of stem cells (mesenchymal cells and induced pluripotent cells) into keratinocytes. In this thesis, it was possible to understand the morphology of the integumentary system with an emphasis on the cultivation of lowland horse fibroblasts for genetic conservation, as well as the association of stem cells with bioengineering to construct a skin substitute for skin lesions in horses.

Nanotubos de carbono: potencial de uso em medicina veterinária / Carbon nanotubes: potential use in veterinary medicine

A utilização de nanomateriais em sistemas de segurança alimentar, detecção de patógenos, proteção de ambientes, no diagnóstico e tratamento de doenças, como sistema de entrega de fármacos e na bioengenharia tecidual tem contribuído para os avanços alcançados na ciência animal. Suas propriedades físicas, químicas e mecânicas, além de seu grande potencial de associação com outros materiais contribuem para sua aplicação em diferentes campos da medicina veterinária, por exemplo, como biomarcadores, onde as propriedades eletrônicas e ópticas possibilitam a transdução de sinais, na terapia fototérmica, devido à habilidade em converter a luz infravermelha (LIV) em calor, na engenharia tecidual, graças à resistência mecânica, flexibilidade, elasticidade e baixa densidade, além de muitas outras possíveis aplicações. O objetivo deste trabalho é informar sobre conceitos, propriedades e aplicações dos NTCs, destacando sua aplicabilidade nas áreas biomédicas, com destaque para setores da medicina veterinária que já se utilizam desse material.(AU)

The use of nanomaterials in systems of food safety, pathogen detection, protection environments, diagnosis and treatment of diseases such as drug delivery system and tissue engineering has contributed to advances in animal science. Carbon nanotubes are an example, their use has been highlighted in different biological areas. Their physical, chemical and mechanical properties as well as its great potential for combination with other materials contribute to its application in different fields of veterinary medicine, for example, as biomarkers, where the electronic and optical properties enable signal transduction, in photothermal therapy due the ability to convert infrared light (LIV) into heat, in tissue engineering due to mechanical strength, flexibility, elasticity, low density, and many other possible applications. The objective of this review is to present the CNTs and the main areas of animal science that surpass in the study of this material.(AU)

Sciatic nerve regeneration in rats by a nerve conduit engineering with a membrane derived from natural latex / Regeneração do nervo ciático em ratos através de um conduto confeccionado com uma membrana de látex natural

PURPOSE: To evaluate the capacity of natural latex membrane to accelerate and improve the regeneration quality of the of rat sciatic nerves. METHODS: Forty male adult Wistar rats were used, anesthetized and operated to cut the sciatic nerve and receive an autograft or a conduit made with a membrane derived from natural latex (Hevea brasiliensis). Four or eight weeks after surgery, to investigate motor nerve recovery, we analyzed the neurological function by walking pattern (footprints analysis and computerized treadmill), electrophysiological evaluation and histological analysis of regenerated nerve (autologous nerve graft or tissue cables between the nerve stumps), and anterior tibial and gastrocnemius muscles. RESULTS: All functional and morphological analysis showed that the rats transplanted with latex conduit had a better neurological recovery than those operated with autologous nerve: quality of footprints, performance on treadmill (p<0.01), electrophysiological response (p<0.05), and quality of histological aspects on neural regeneration. CONCLUSION: The data reported showed behavioral and functional recovery in rats implanted with latex conduit for sciatic nerve repair, supporting a complete morphological and physiological regeneration of the nerve.(AU)

OBJETIVO: Avaliar a capacidade de uma membrana de látex natural em acelerar e melhorar a qualidade da regeneração do nervo ciático seccionado de ratos. MÉTODOS: Foram utilizados 40 ratos machos adultos da linhagem Wistar, anestesiados e operados com autoenxerto ou com interposição de um tubo confeccionado com uma membrana derivada do latex natural (Havea brasiliensis). Quatro ou oito semanas após a cirurgia, para investigar a recuperação motora do nervo, foram analisadas a função neurológica através do padrão da marcha (análise das pegadas e esteira computadorizada), avaliação eletrofisiológica e análise histológica do nervo regenerado (enxerto de nervo autólogo ou formação de nervo novo entre os cotos nervosos) e músculos gastrocnêmio e tibial anterior. RESULTADOS: Todas as análises morfológicas e funcionais demonstraram que os ratos transplantados com o conduto de látex tiveram recuperação melhor do que aqueles operados com nervo autólogo: qualidade das pegadas impressas, desempenho em esteira (p<0,01), resposta eletrofisiológica (p<0,05), e qualidade histológica da regeneração nervosa. CONCLUSÃO: Os dados apresentados demonstraram recuperação comportamental e funcional nos ratos implantados com o conduto de látex para a reparação do nervo ciático por meio de uma completa regeneração morfológica e fisiológica do nervo.(AU)

Engraftment of human adipose derived stem cells delivered in a hyaluronic acid preparation in mice / Implante de células tronco do tecido adiposo humano numa preparação de ácido hialurônico em camundongos

PURPOSE: To evaluate the implant of human adipose derived stem cells (ADSC) delivered in hyaluronic acid gel (HA), injected in the subcutaneous of athymic mice. METHODS: Control implants -HA plus culture media was injected in the subcutaneous of the left sub scapular area of 12 athymic mice. ADSC implants: HA plus ADSC suspended in culture media was injected in the subcutaneous, at the contra lateral area, of the same animals. With eight weeks, animals were sacrificed and the recovered implants were processed for extraction of genomic DNA, and histological study by hematoxilin-eosin staining and immunufluorescence using anti human vimentin and anti von Willebrand factor antibodies. RESULTS: Controls: Not visualized at the injection site. An amorphous substance was observed in hematoxilin-eosin stained sections. Human vimentin and anti von Willebrand factor were not detected. No human DNA was detected. ADSC implants - A plug was visible at the site of injection. Fusiform cells were observed in sections stained by hematoxilin- eosin and both human vimentin and anti von Willebrand factor were detected by immunofluorescence. The presence of human DNA was confirmed. CONCLUSION: The delivery of human adipose derived stem cells in preparations of hyaluronic acid assured cells engraftment at the site of injection.(AU)

OBJETIVO: Avaliar o implante de células tronco do tecido adiposo humano (CTTAH) em gel de ácido hialurônico (AH), injetados no tecido subcutâneo de camundongos atímicos. MÉTODOS: Implantes controle - HA com meio de cultura foram injetados no tecido subcutâneo da região infraescapular esquerda de 12 camundongos atímicos. Implantes de CTTAH: HA com CTTAH suspensas em meio de cultura foi injetado no subcutâneo da região contra lateral, dos mesmos animais. Com oito semanas, os animais foram sacrificados e os implantes recuperados foram processados para extração de DNA genômico, estudo histológico por coloração por hematoxilina eosina e imnuoflurescência utilizando anticorpos anti vimentina humana e anti fator de von Willebrand. RESULTADOS: Controles - implantes não visualizados no local da injeção. Uma substância amorfa foi observada nos cortes corados por hematoxilina eosina. Vimentina humana e fator anti von Willebrand não foram identificados. DNA humano não foi detectado. Implantes de CTTAH - Uma massa era visível no local da injeção. Células fusiformes foram observadas nos corte corados com hematoxilina eosina. Tanto vimentina humana quanto fator de von Willebrand foram identificados pela imunofluorescência. A presença de DNA humano foi confirmada. CONCLUSÃO: O implante de células tronco do tecido adiposo humano em veículo de ácido hialurônico gel assegurou a manutenção das células no local do implante.(AU)

PRÓTESE VASCULAR DE POLICAPROLACTONA PARA SUBSTITUTO DE ARTÉRIA, COM LIBERAÇÃO CONTROLADA DE HEPARINA NO LOCAL DO IMPLANTE.

As doenças cardiovasculares e isquêmicas são causadoras de perda de qualidade de vida pela população mundial. Apesar das medidas profiláticas estarem tomando cada vez mais importância, os procedimentos cirúrgicos de revascularização autóloga para tratamento destas doenças ainda são largamente aplicados em vários casos, entretanto estes apresentam fatores complicadores como o risco de tromboembolismo, e contra-indicações em pacientes com outras doenças crônicas associadas. Sendo assim, pesquisadores vêm estudando a utilização de próteses sintéticas que minimizem os riscos dos procedimentos invasivos. Para tanto, o objetivo da presente pesquisa foi de construir uma prótese vascular de policaproclactona com liberação controlada de heparina. Para tanto, o polímero foi solubilizado em diclorometano e a solução foi banhada em formas tubulares pelo processo de rotomoldagem até a construção da estrutura tubular que posteriormente foi impregnada de heparina por sonoforese. As próteses tubulares passaram por testes de coagulação in vitro e assim como citotoxicidade in vitro em fibroblastos e células endoteliais. Posteriormente foram implantadas em artérias femorais de ratos wistar e após 30 dias realizou-se a biópsia dos vasos com implantes que foram analisadas por microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura. As próteses com heparina não apresentaram fatores de coagulação in vitro enquanto que as próteses sem heparina coagularam no mesmo teste. Não foi observada citotoxicidade para fibroblastos e células endoteliais e em ambas as culturas e ainda foi demonstrado um crescimento celular de 24h e 48h após o teste de MTT. O implante não apresentou alterações morfológicas no local do implante de acordo com os resultados da microscopia por H/E e MEV. As perspectivas deste estudo revelam que a policaprolactona por ser amplamente utilizada como nanocarreador de fármacos e também como biomaterial para engenharia tecidual, pode ser uma boa alternativa para aplicação na indústria biomédica como próteses para vasos sanguíneos com liberação controlada de heparina.

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Avaliação do hidrogel de quitosana/glicerol fosfato como matriz de suporte para células-tronco de equinos / Evaluation of chitosan/glycero phosphate hydrogel as scaffold for equine stem cells

Lesões cartilagíneas apresentam grande dificuldade em cicatrizar e algumas técnicas cirúrgicas tem sido desenvolvidas, mas seus resultados são falhos ao longo do tempo. Desta forma, a aplicação da engenharia tecidual para a reconstrução de lesões de cartilagem tem despertado interesse crescente. A correta combinação entre as fontes celulares, matrizes de suporte e fatores de crescimento podem melhorar a qualidade do tecido reparado. Neste caso, as fontes celulares mais promissoras são as células-tronco, devido sua alta taxa de proliferação e capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares. As matrizes de suporte tem papel fundamental na adesão, proliferação e diferenciação celular, sendo que diversos tipos de biomateriais tem sido estudados. A quitosana é um polímero natural, biocompatível e biodegradável, que tem se mostrado interessante na utilização na engenharia tecidual. O presente estudo objetivou avaliar o hidrogel de Quitosana/Glicerol Fosfato como matriz de suporte para células-tronco de equinos. [...] Apesar de promissor o uso deste biomaterial em engenharia tecidual de cartilagem necessita de algumas melhorias, particularmente em relação à homogeneidade, força mecânica e aderência celular. Este parece ser o primeiro relato do cultivo de células-tronco mesenquimais originadas da polpa dentária na espécie equina

Cartilage injuries have great difficulty healing and some surgical techniques have been developed, however, results fail over time. Thus, the application of tissue engineering in cartilage injuries repair has gained interest. The correct combination of cell source, scaffolds, and growth factors may improve the quality of the repaired tissue. In this case, the most promising cell sources are stem cells because of their high proliferation rate and ability to be transformed into several cell types. Scaffolds have a fundamental role in cell adhesion, proliferation, and differentiation, thus, several biomaterials have been studied. Chitosan is a natural polymer, biocompatible and biodegradable, suitable for use in tissue engineering. This study aimed at evaluating Chitosan/Glycerophosphate hydrogel as scaffold for equine stem cells. [...] However, this seems to be a characteristic of cells cultivated in hydrogel, thus, being associated with softeness and lack of cell-matrix adhesion. This may explain the reduced quantity of cells in the medium throughout the experiment. Despite the promissing use of this biomaterial in cartilage tissue engineering, improvements related to homogeinity, mechanical strengh, and cell adhesion must be studied. This seems to be the first report on the cultivation of mesenchymal stem cells originating from equine dental pulp

Avaliação do hidrogel de quitosana/glicerol fosfato como matriz de suporte para células-tronco de equinos / Evaluation of chitosan/glycero phosphate hydrogel as scaffold for equine stem cells

Lesões cartilagíneas apresentam grande dificuldade em cicatrizar e algumas técnicas cirúrgicas tem sido desenvolvidas, mas seus resultados são falhos ao longo do tempo. Desta forma, a aplicação da engenharia tecidual para a reconstrução de lesões de cartilagem tem despertado interesse crescente. A correta combinação entre as fontes celulares, matrizes de suporte e fatores de crescimento podem melhorar a qualidade do tecido reparado. Neste caso, as fontes celulares mais promissoras são as células-tronco, devido sua alta taxa de proliferação e capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares. As matrizes de suporte tem papel fundamental na adesão, proliferação e diferenciação celular, sendo que diversos tipos de biomateriais tem sido estudados. A quitosana é um polímero natural, biocompatível e biodegradável, que tem se mostrado interessante na utilização na engenharia tecidual. O presente estudo objetivou avaliar o hidrogel de Quitosana/Glicerol Fosfato como matriz de suporte para células-tronco de equinos. [...] Apesar de promissor o uso deste biomaterial em engenharia tecidual de cartilagem necessita de algumas melhorias, particularmente em relação à homogeneidade, força mecânica e aderência celular. Este parece ser o primeiro relato do cultivo de células-tronco mesenquimais originadas da polpa dentária na espécie equina (AU)

Cartilage injuries have great difficulty healing and some surgical techniques have been developed, however, results fail over time. Thus, the application of tissue engineering in cartilage injuries repair has gained interest. The correct combination of cell source, scaffolds, and growth factors may improve the quality of the repaired tissue. In this case, the most promising cell sources are stem cells because of their high proliferation rate and ability to be transformed into several cell types. Scaffolds have a fundamental role in cell adhesion, proliferation, and differentiation, thus, several biomaterials have been studied. Chitosan is a natural polymer, biocompatible and biodegradable, suitable for use in tissue engineering. This study aimed at evaluating Chitosan/Glycerophosphate hydrogel as scaffold for equine stem cells. [...] However, this seems to be a characteristic of cells cultivated in hydrogel, thus, being associated with softeness and lack of cell-matrix adhesion. This may explain the reduced quantity of cells in the medium throughout the experiment. Despite the promissing use of this biomaterial in cartilage tissue engineering, improvements related to homogeinity, mechanical strengh, and cell adhesion must be studied. This seems to be the first report on the cultivation of mesenchymal stem cells originating from equine dental pulp (AU)