Resumo
Neoplasias malignas em cadelas é uma das enfermidades mais frequentes em animais domésticos no Brasil. Tais neoplasias apresentam uma grande similaridade com neoplasias de mamas em mulheres e, devido a esse fato, o entendimento da patogênese e das características biológicas visando a identificação de fatores prognósticos e preditivos são necessários para a melhoria de tratamentos e diagnósticos mais eficazes. Estudos recentes buscam correlacionar a densidade microvascular (DMV) e a quantidade de células estromais através da quantificação de imunomarcadores considerados fatores prognósticos do câncer mamário. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a densidade de microvasos, por meio da contagem de vasos marcados por CD31, além de correlacionar a imunomarcação por VEGF-A e BMP2 com o subtipo histológico e grau de malignidade de neoplasias malignas mamárias de cadelas. Para tal, neoplasias malignas de mama em cadelas foram separadas quanto ao grau de malignidade em alto e baixo. Foi realizada imuno-histoquímica para os anticorpos anti-CD31, VEGF-A e BMP2, seguindo recomendações do fabricante do kit DAKO EnVision FLEX+. As amostras utilizadas no estudo foram provenientes de diagnóstico histopatológico de clínicas veterinárias da cidade de Goiânia-GO. Foram construídos blocos de microarranjo de tecido para otimização dos experimentos. Os testes estatísticos foram feitos com o software GraphPad Prism 7.0, considerando o nível de significância de 5%. A imunomarcação de CD31 foi diferente em todos os grupos analisados, assim como a marcação por VEGF-A e BMP2. Carcinomas com baixo grau de malignidade apresentaram maior imunomarcação por VEGF-A e BMP2, bem como maior DMV por CD31. O presente estudo demonstrou que carcinomas de baixo grau apresentaram uma maior imunomarcação pelos marcadores angiogênicos VEGF-A e CD31, bem como uma maior imunomarcação por BMP2, e tal achado reforça a ideia de que o VEGF-A é uma molécula envolvida na formação vascular e que BMP2 pode agir estimulando a angiogênese, principalmente por liberação de VEGF-A. Os nossos achados também sugerem a importância de outros fatores angiogênicos do microambiente do tumor na regulação da angiogênese tumoral em tumores mamários caninos. A realização deste trabalho demonstrou a importância da avaliação angiogênica por imuno-histoquímica na determinação de fatores prognósticos associados à neoplasias malignas mamárias caninas.
Malignant neoplasms in dogs is one of the most frequent diseases in domestic animals in Brazil. Such neoplasms have a great similarity with breast neoplasms in women and, due to this fact, an understanding of the pathogenesis and biological characteristics aiming at the identification of prognostic and predictive factors are necessary for the improvement of more effective treatments and diagnoses. Recent studies seek to demonstrate the microvascular density and the amount of stromal cells through the quantification of immunomarkers considered prognostic factors for breast cancer. In this context, the objective of this study was to evaluate the microvessel density, by counting vessels marked by CD31, in addition to correlating immunomarking by VEGF-A and BMP2 with the histological subtype and degree of malignancy of dogs' malignant neoplasms. For this, malignant breast neoplasms in dogs were separated as to the degree of malignancy in high and low. Immunohistochemistry was performed for anti-CD31, VEGF-A and BMP2 antibodies, following recommendations from the DAKO EnVision FLEX + kit manufacturer. The samples used in the study came from the histopathological diagnosis of veterinary clinics in the city of Goiânia-GO. Tissue microarray blocks were built to optimize the experiments. Statistical tests were performed using the GraphPad Prism 7.0 software, considering the significance level of 5%. The immunostaining of CD31 was different in all groups analyzed, as well as the staining by VEGF-A and BMP2. Carcinomas with a low degree of malignancy showed greater immunostaining by VEGF-A and BMP2, as well as greater MVD by CD31. The present study demonstrated that low-grade carcinomas show greater immunostaining by angiogenic markers VEGF-A and CD31, as well as greater immunostaining by BMP2, and this finding reinforces the idea that VEGF-A is a molecule involved in vascular formation and that BMP2 can act by stimulating angiogenesis, mainly by releasing VEGF-A. Our findings also suggest the importance of other angiogenic factors of the tumor microenvironment in the regulation of tumor angiogenesis in canine mammary tumors. This work demonstrated the importance of angiogenic evaluation by immunohistochemistry in determining prognostic factors associated with canine mammary malignancies.
Resumo
Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B (AU)
There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells (AU)
Assuntos
Animais , Camundongos , Diabetes Mellitus/diagnóstico , Diabetes Mellitus/metabolismo , Diabetes Mellitus/veterinária , Terapia Genética/veterinária , Receptor 1 de Fatores de Crescimento do Endotélio Vascular , Pâncreas/crescimento & desenvolvimentoResumo
Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B
There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells
Assuntos
Animais , Camundongos , Diabetes Mellitus/diagnóstico , Diabetes Mellitus/metabolismo , Diabetes Mellitus/veterinária , Terapia Genética/veterinária , Pâncreas/crescimento & desenvolvimento , Receptor 1 de Fatores de Crescimento do Endotélio VascularResumo
A formação de novos vasos sanguíneos é fundamental para o crescimento tumoral e a disseminação metastática, sendo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) uma das chaves reguladoras deste processo. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão imunohistoquímica de VEGF nos hemangiossarcomas e hemangiomas esplênicos, e rever a prevalência das demais afecções esplênicas através da análise retrospectiva do diagnóstico histopatológico de cães submetidos à esplenectomia. Os resultados foram confrontados com os exames laboratoriais, as manifestações clínicas, a presença de arritmias cardíacas e de hemoperitôneo. Participaram do estudo retrospectivo 109 cães atendidos no Serviço de Cirurgia de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, entre os anos de 2002 e 2009. A média de idade foi de 10 anos (± 3), não foi observado predileção sexual. Cães sem raça definida foram os mais acometidos, com peso médio de 22 kg (± 13). Cinqüenta e dois por cento (57/109) dos animais foram esplenectomizados devido a afecções não neoplásicas, enquanto que 48% (52/109), por neoplasias esplênicas. Dentre estes, o diagnóstico mais freqüente foi o hemangiossarcoma, acometendo 28 (54%) animais. Os sintomas mais freqüentes foram disorexia, apatia e emese. Cães com neoplasias malignas apresentaram níveis de hematócrito e hemácias significativamente menores que os acometidos por massas benignas. Do mesmo modo, a presença de hemoperitôneo, secundário à ruptura esplênica, correlacionou-se significativamente com a presença de neoplasia maligna. Arritmias cardíacas não foram fatores preditivos para a diferenciação da esplenomegalia. A avaliação imunohistoquímica da expressão tecidual de VEGF foi realizada em 23 hemangiossarcomas e 7 hemangiomas, revelando-se significativamente maior nas neoplasias malignas. Tal resultado sugere que a expressão deste fator pode estar relacionada à proliferação maligna observada nos hemangiossarcomas
New blood vessel formation is a fundamental event in the process of tumor growth and metastatic dissemination, being the vascular endothelial growth factor (VEGF) one of the key regulators of this process. The aim of this study was evaluate the VEGF immunohistochemical expression in splenic hemangiosarcomas and hemangiomas, and review the prevalence of canine splenic disorders through retrospective analysis of histological diagnosis after splenectomy. The results were confronted with laboratory findings, clinical signs and presence of cardiac arrhythmia and hemoperitoneum. A hundred nine dogs were included in the retrospective study at Veterinary Hospital of School of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo, between 2002 and 2009. The average age was 10 year ± 3, without sexual predilection. Mix breeds were the most frequent, and average weigh was 22kg ± 13. Overall, 52% (57/109) of dogs were splenectomized for nonneoplastic disease, although 48% (52/109) were splenectomized for neoplasia. Among these dogs the most common diagnosis was hemangiossarcoma (28 dogs, 54%). Frequently clinical signs included anorexia, lethargy and vomiting. Dogs with malignant neoplasia had significantly lower red blood cells counts and packed cell volume compared with values for dogs with benign masses. Similarly, hemoperitoneum secondary to splenic rupture had a significant correlation with malignant tumor. Cardiac arrhythmia was not useful in differentiating dogs with splenomegaly. Expression of vascular endothelial growth factor was made by immunohistochemical analyses in 23 hemangiosarcomas and 7 hemangiomas being significantly higher in malignant tumor. These data suggest that VEGF expression may contribute to malignant proliferation of hemangiossarcoma