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1.
Pesqui. vet. bras ; 40(12): 1063-1072, Dec. 2020. tab, graf, ilus
Artigo em Inglês | LILACS, VETINDEX | ID: biblio-1155041

Resumo

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)


A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)


Assuntos
Animais , Bovinos , Placenta , Bovinos/genética , Células Clonais , Epigenômica , Fator de Crescimento Insulin-Like II/análise , Metilação de DNA
2.
Pesqui. vet. bras ; 40(12): 1063-1072, dez. 2020. tab, graf, ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-32675

Resumo

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)


A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)


Assuntos
Animais , Bovinos , Placenta , Bovinos/genética , Células Clonais , Epigenômica , Fator de Crescimento Insulin-Like II/análise , Metilação de DNA
3.
Pesqui. vet. bras ; 37(5): 526-530, maio 2017. graf
Artigo em Português | VETINDEX | ID: vti-734752

Resumo

Objetivou-se avaliar a expressão do mRNA para o gene do fator de crescimento IGF-2 em oócitos e células do cumulus de ovelhas em diferentes estágios do desenvolvimento folicular. Os folículos classificados morfologicamente como antrais (terciários e pré-ovulatórios) foram aspirados manualmente para obtenção dos oócitos e células do cumulus. Os folículos pré-antrais (secundários) foram extraídos do córtex ovariano, por microdissecção, e os oócitos retirados. Nos dois grupos, os oócitos foram desnudados e agrupados em pools de dez células cada (Grupo A, n=10; Grupo B, n=10) e dez amostras com grupos de células do cumulus (Grupo A1, n=10, B1, n=10). O mRNA foi extraído e convertido em cDNA utilizando a técnica da RT-PCR, utilizando Oligo DT randômico para o mRNA. A análise da expressão confirmou a expressão gênica para IGF-2 nos grupos de oócitos e células do cumulus. Houve um aumento da expressão relativa do mRNA para IGF-2 nos grupos de oócitos durante a fase mais tardia do desenvolvimento folicular e as diferenças foram consideradas significantes (p<0,05). Não houve variação significante da expressão de IGF2 entre os grupos de células do cumulus. Conclui-se que o fator de crescimento IGF-2 tem níveis mais elevados de expressão em oócitos ovinos, na segunda fase do desenvolvimento folicular, mas expressão semelhante em células do cumulus durante as fases estudadas do desenvolvimento folicular.(AU)


The aim of this study was to analyze the mRNA expression of IGF-2 growth factor in oocytes and cumulus cells from native sheep follicles at different stages of follicular development. The classified morphologically as antral follicles (tertiary preovulatory) were aspirated manually to obtain the oocyte and the cumulus cells. The preantral follicles (secondary) were extracted from the ovarian cortex by microdissection, and oocytes were removed. In both groups, oocytes were denuded and grouped into pools of ten cells each (Group A, n=10, Group B, n=10) and ten samples with groups of cumulus cells (Group A1, n=10; B1, n=10). The mRNA was extracted and converted to cDNA using the RT-PCR technique. The expression analysis confirmed the expression of IGF-2 gene for groups of oocyte and the cumulus cells. There was an increase in the relative expression of mRNA for IGF-2 for groups of oocytes during the later stage of follicular development and differences were considered significant (p<0.05). There was no significant variation in the expression of IGF2 between groups of cumulus cells. It is concluded that the growth factor IGF-2 has higher levels of expression in sheep oocytes in the second stage of follicular development in the conditions adopted and similar expression in cumulus cells during various stages of follicular development.(AU)


Assuntos
Animais , Ovinos/crescimento & desenvolvimento , Fator de Crescimento Insulin-Like II/análise , Oócitos , Fase Folicular , RNA Mensageiro/análise , Brasil
4.
Pesqui. vet. bras ; 37(5): 526-530, maio 2017. tab, graf
Artigo em Português | LILACS, VETINDEX | ID: biblio-895438

Resumo

Objetivou-se avaliar a expressão do mRNA para o gene do fator de crescimento IGF-2 em oócitos e células do cumulus de ovelhas em diferentes estágios do desenvolvimento folicular. Os folículos classificados morfologicamente como antrais (terciários e pré-ovulatórios) foram aspirados manualmente para obtenção dos oócitos e células do cumulus. Os folículos pré-antrais (secundários) foram extraídos do córtex ovariano, por microdissecção, e os oócitos retirados. Nos dois grupos, os oócitos foram desnudados e agrupados em "pools" de dez células cada (Grupo A, n=10; Grupo B, n=10) e dez amostras com grupos de células do cumulus (Grupo A1, n=10, B1, n=10). O mRNA foi extraído e convertido em cDNA utilizando a técnica da RT-PCR, utilizando Oligo DT randômico para o mRNA. A análise da expressão confirmou a expressão gênica para IGF-2 nos grupos de oócitos e células do cumulus. Houve um aumento da expressão relativa do mRNA para IGF-2 nos grupos de oócitos durante a fase mais tardia do desenvolvimento folicular e as diferenças foram consideradas significantes (p<0,05). Não houve variação significante da expressão de IGF2 entre os grupos de células do cumulus. Conclui-se que o fator de crescimento IGF-2 tem níveis mais elevados de expressão em oócitos ovinos, na segunda fase do desenvolvimento folicular, mas expressão semelhante em células do cumulus durante as fases estudadas do desenvolvimento folicular.(AU)


The aim of this study was to analyze the mRNA expression of IGF-2 growth factor in oocytes and cumulus cells from native sheep follicles at different stages of follicular development. The classified morphologically as antral follicles (tertiary preovulatory) were aspirated manually to obtain the oocyte and the cumulus cells. The preantral follicles (secondary) were extracted from the ovarian cortex by microdissection, and oocytes were removed. In both groups, oocytes were denuded and grouped into "pools" of ten cells each (Group A, n=10, Group B, n=10) and ten samples with groups of cumulus cells (Group A1, n=10; B1, n=10). The mRNA was extracted and converted to cDNA using the RT-PCR technique. The expression analysis confirmed the expression of IGF-2 gene for groups of oocyte and the cumulus cells. There was an increase in the relative expression of mRNA for IGF-2 for groups of oocytes during the later stage of follicular development and differences were considered significant (p<0.05). There was no significant variation in the expression of IGF2 between groups of cumulus cells. It is concluded that the growth factor IGF-2 has higher levels of expression in sheep oocytes in the second stage of follicular development in the conditions adopted and similar expression in cumulus cells during various stages of follicular development.(AU)


Assuntos
Animais , Feminino , Oócitos , RNA Mensageiro , Fator de Crescimento Insulin-Like II , Ovinos/fisiologia , Folículo Ovariano , Células do Cúmulo , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/veterinária
5.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216876

Resumo

A idade reprodutiva da fêmea é um dos fatores que afeta a produção in vitro de embriões. Sabe-se que ovócitos de fêmeas pré-púberes comparados com fêmeas púberes apresentam menor competência de desenvolvimento. Portanto, é importante compreender os aspectos que causam essa menor competência para se alcançar uma melhor eficiência da PIVE. Nesta pesquisa comparou-se o padrão de metilação do gene XIST e da ICR/H19 de ovócitos obtidos de marrãs pré-puberes e porcas cíclicas antes e depois da maturação in vitro. Para a ICR/H19, não houve diferenças para os níveis de metilação entre os tratamentos avaliados. Os percentuais de metilação foram: mGV (36,15 ± 8,6%), pGV (30,14 ± 7,2%), mMII (17,35 ± 6,7%) e pMII (19,96 ± 6,9%). Porém, quando comparados ao controle (espermatozoide - 94,3 ± 1,04%), os ovócitos de mMII e pMII foram menos metilados (p=0,0001). Esses dados confirmam a característica imprinted do gene, com espermatozoide metilado e ovócito MII desmetilado. O gene XIST apresentou padrões de metilação diferentes entre os grupos mGV (17,29 ± 5,8%) e pGV (48,81 ± 9,6%) (p=0,0305), entre mGV e mMII (0,28 ± 0,2%) (p=0,0342) e entre mMII e pMII (82,35%) (p=0,0001). Quando comparado com o padrão de espermatozoide (0,42 ± 0,42%), os ovócitos de pMII foram estatisticamente diferentes (p=0,0001), porém os ovócitos de mMII foram iguais. Esses dados confirmam que essa região do XIST também apresenta uma característica imprinted, com espermatozoide desmetilado e ovócitos pMII metilado. Além disso, os resultados mostraram que os ovócitos menos competentes, de marrãs, não conseguiram se reprogramar corretamente para essa região do XIST após a maturação in vitro. Assim, sugere-se que essa região tem potencial para ser utilizada como um marcador molecular epigenético para competência ovocitária, já que os ovócitos menos competentes apresentaram um padrão de metilação muito alterado do que aquele esperado para um ovócito maturado.


The reproductive age of the female is one of the factors that affects the in vitro embryo production. It is known that oocytes from prepubertal females compared to cycling females have lower developmental competence. Therefore, it is important to better understand the aspects causing this lesse competence to achieve better efficiency of the IVP. In this research, the methylation pattern of the XIST gene and the ICR/H19 of oocytes obtained from prepubertal gilts (g) and cycling sows (s) were compared. Regarding the ICR/H19, there were no differences for methylation levels among the groups. The methylation percentage were: gGV (36.15 ± 8.6%), sGV (30.14 ± 7.2%), gMII (17.35 ± 6.7%) and sMII (19.96 ± 6,9%). However, when compared to the control (spermatozoa - 94.3 ± 1.04%), gMIII and sMII were less methylated (p=0.0001). These data confirm the imprinted pattern of the gene, with spermatozoa highly methylated and MII oocytes hypomethylated. The XIST gene showed different methylation pattern when comparing gGV (17.29 ± 5.8%) and sGV (48.81 ± 9.6%) groups (p=0.0305), gGV and gMII (0.28 ± 0.2%) (p=0.0342) and gMIII and sMII (82.35%) (p=0.0001). However, to the spermatozoa (0.42 ± 0.42%), sMII oocytes comparing were different (p = 0.0001). These data confirm that this region of the XIST also exhibits an imprinted pattern, with spermatozoa demethylated and the oocytes highly methylated. In addition, results showed that less competent oocytes, from gilts, were unable to correctly reprogram the methylation pattern of this region of XIST after in vitro maturation. Thus, it is suggested that this region of XIST has potential to be used as an epigenetic molecular marker for oocyte competence, since the less competent oocytes exhibit an altered methylation pattern than that what is expected for a matured competent oocyte.

6.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216446

Resumo

O splicing de precursores de RNA mensageiro para mRNA maduro é um componente crítico da regulação gênica. O processo pode codificar proteínas distintas ou afetar a estabilidade, localização e tradução de mRNAs. Já foram descritas diversas correlações entre uma maior mortalidade embrionária precoce, principalmente em embriões de produzidos in vitro (PIV), que apresentavam retardo de crescimento do concepto e expressões reduzidas de IGF2 com anormalidades placentárias e fetais durante a fase fetal. O locus IGF2 é uma região genômica complexa que produz múltiplos transcritos com splicing alternativos, a partir de vários exons distintos controlados por quatro promotores diferentes. O presente estudo explorou a expressão dos diferentes promotores do IGF2 em oócitos bovinos e embriões bovinos em estádios de pré-implantação, no intuito de esclarecer alguns aspectos da fisiologia do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Para descrever o comportamento do gene IGF2, estruturas de PIV em vários estádios de desenvolvimento, desde oócitos imaturos até blastocistos expandidos, foram produzidas e coletadas em três rotinas, em pools de cinco estruturas por estádio. O RNA total foi extraído dos pools e submetido à transcrição reversa para a obtenção de cDNA, o qual foi utilizado para estimar a abundância das quatro isoformas de mRNA para o IGF2 por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando inicializadores específicos para cada promotor do gene IGF2. Os produtos de amplificação foram submetidas ao sequenciamento de DNA para confirmação molecular. Os dados de expressão quantitativa das isoformas do IGF2 foram transformados em log para a normalização, foram analisados pelo Mixed Procedure do SAS, com comparações pareadas por LSM, para P<0,05. A expressão dirigida pelos promotores P2 e P4 seguiram o padrão observado no mRNA ativo do gene IGF2. Um pico inicial pôde ser visto em estádios precoces, entre oócitos maturados e o estádio embrionário de 2-células, principalmente causada por uma expressão materna e acumulação de transcritos antes da fecundação, seguido por uma diminuição da quantidade de transcritos até a ativação do genoma embrionário, no estádio embrionário de 8-células. Então, um novo aumento dos transcritos pôde ser detectado na compactação e cavitação embrionária. A expressão dirigida pelo promotor P1 do IGF2 mostrou-se menos representativo nas fases iniciais, havendo aumento durante a compactação, após a ativação genômica, prévia à cavitação. Diferentemente, a atividade do promotor P3 não foi detectada em embriões, estando possivelmente presente apenas em estádios mais avançados de desenvolvimento. Futuros estudos genéticos focados no desenvolvimento embrionário inicial devem prestar especial atenção ao papel da expressão do promotor P4 do gene IGF2, com os promotores P1 e P2 tendo um aparente papel secundário no desenvolvimento inicial, enquanto o promotor P3, se geneticamente manipulado, poderia trazer mudanças fisiológicas somente posteriormente no desenvolvimento. Os achados deste estudo fornecem uma compreensão adicional da biologia do desenvolvimento de embriões derivados de PIV, bem como novas possibilidades para o uso da expressão dos diferentes promotores do gene IGF2 para a manipulação genética durante estádios pre-implantacionais de embriões bovinos, o que pode ser um caminho para estudos que visam o aumento da viabilidade e a redução da mortalidade embrionária no início da gestação pela modulação da taxa de crescimento após a produção embrionária in vitro.


The splicing of messenger RNA precursors to mature mRNA is a critical component of the gene regulation that can encode distinct protein or affect mRNA stability, localization, and translation. Correlations between the higher early embryonic mortality in in vitro-produced (IVP) embryos with the growth retardation of the conceptus and reduced expressions of IGF2 with placental and fetal abnormalities in the fetal phase in development have already been established. The IGF2 locus is a complex genomic region that produces multiple alternative splicing transcripts of several leader exons controlled by four distinct promoters. The present study evaluated the pattern of the promoter-specific IGF2 expression in bovine oocytes and in preimplantation embryos, as a means of unraveling some aspects of the developmental physiology of bovine embryos produced in vitro. To describe the behavior of the IGF2 gene, IVP-derived structures from distinct stages of development, from immature oocytes to expanded blastocyst, were collected in three IVP procedures, in pools of five structures per stage. Total RNA was extracted from the pools and reverse transcribed in cDNA, which were evaluated to estimate the abundance of the four different IGF2 mRNA isoforms by real time quantitative PCR system (qPCR), using IGF2 promoter-specific primers. Amplifications were DNA sequenced for confirmation. Data comprising quantitative IGF2 isoform expression were log transformed for normality and analyzed by the Mixed Procedure of SAS, with pairwise comparisons by LSM, for P<0.05. Promoter P2 and P4 IGF2 expression followed the pattern seen in active mRNA of IGF2 gene. An initial peak could be seen in early development, between matured oocytes and 2-cells stage embryos, mostly from accumulation prior to fertilization, followed by a decrease in abundance until embryo genome activation, at the 8-cells stage embryo. Then, a new surge in splicing variants could be detected at compaction and cavitation. Promoter P1 IGF2 expression showed to be less representative at the initial stages, having a notorious increase during compaction, after genomic activation, prior to cavitation. Differently, Promoter P3 activity was not detected at all stages, possibly being more relevant at more advanced stages in development. Future genetic studies focused on early embryonic development should pay especial attention to the role of the P4 promoter for IGF2 expression, with the P1 and P2 promoters having an apparent secondary role during early development, whereas the P3 promoter, if genetically manipulated, could possibly bring physiological changes only latter in development. The findings of this study provide some further understanding of aspects in developmental biology for IVP-derived embryos, also offering novel possibilities for the use of promoter-specific IGF2 expression for genetic manipulation during preimplantation embryo stages in cattle, which may be a path for studies seeking an increase in embryo viability and reduction of embryo mortality in early pregnancy by the modulation of growth rate after in vitro embryo production.

7.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203748

Resumo

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro.


Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency.

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