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1.
Pesqui. vet. bras ; 40(12): 1063-1072, Dec. 2020. tab, graf, ilus
Artigo em Inglês | LILACS, VETINDEX | ID: biblio-1155041

Resumo

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)


A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)


Assuntos
Animais , Bovinos , Placenta , Bovinos/genética , Células Clonais , Epigenômica , Fator de Crescimento Insulin-Like II/análise , Metilação de DNA
2.
Pesqui. vet. bras ; 40(12): 1063-1072, dez. 2020. tab, graf, ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-32675

Resumo

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals' placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.(AU)


A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.(AU)


Assuntos
Animais , Bovinos , Placenta , Bovinos/genética , Células Clonais , Epigenômica , Fator de Crescimento Insulin-Like II/análise , Metilação de DNA
3.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-212987

Resumo

Embriões bovinos produzidos in vitro por fecundação in vitro (PIV/FIV) e transferência nuclear (TN) apresentam diferenças bioquímicas, metabólicas, moleculares, histológicas e de desenvolvimento quando comparados aos seus equivalentes in vivo. Destacam-se anormalidades tanto pré-natais durante a placentação e mortalidade embrionária por subdesenvolvimento inicial, quanto pós-natais, caracterizados pela Síndrome do Neonato Anormal (AOS). Estudos evidenciam que há importantes alterações nos padrões de imprinting genômico embriões de PIV, especialmente no padrão de expressão de imprinting do sistema IGF, sendo o ligante IGF2, um gene de expressão paterna de caráter pleiotrópico e de efeito promotor de crescimento e diferenciação, e o receptor IGF2R, um gene de expressão materna que contrapõe os efeitos do gene IGF2. Assim, o presente estudo objetivou realizar a superexpressão epissomal transiente do gene IGF2 pela técnica de microinjeção citoplasmática em embriões bovinos no estádio de 1-célula produzidos por FIV visando o aumento da eficiência nos índices de desenvolvimento, cinética e qualidade embrionária in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Após nove repetições, um total de 1.752 complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram maturados e fecundados in vitro e posteriormente segregados em seis grupos experimentais: um controle não-microinjetado, um controle microinjetado com tampão tris-EDTA, ou TE (0 ng/L), e quatros grupos de microinjeção com doses crescentes (10, 20, 40, 80 ng/L) do vetor de expressão epissomal do gene IGF2 acompanhado do gene da proteína GFP em TE. No Dia 2 de desenvolvimento, foram avaliadas as taxas de clivagem e sobrevivência pós-microinjeção, além do número de blastômeros, e no Dia 7 de desenvolvimento, após cultivo in vitro, avaliaram-se as taxas de blastocisto, estádio de desenvolvimento e qualidade embrionária, taxa de embriões fluorescentes e número total de células em blastocistos. A microinjeção citoplasmática de zigotos foi efetiva em dispor o vetor de expressão no ooplasma, independente dos grupos, com média de 58% de blastocistos com fluorescência positiva no Dia 7 de desenvolvimento. A dose de 10 ng/L de microinjeção do vetor promoveu uma menor taxa de blastocistos (10,4%), porém com blastocistos em estádios mais avançados de desenvolvimento (93,0%), com melhor qualidade morfológica (73% de Grau 1) e maior número de células (116,0 ± 3,0) em relação ao controle FIV não microinjetado (23,3%, 75,0%, 58,0%, e 75,0 ± 6,8, respectivamente). Em resumo, a microinjeção de embriões com um vetor de superexpressão do gene IGF2 promoveu uma taxa de desenvolvimento similar aos controles, com diferenças quando se utilizou a dose de 10 ng/L, com uma menor taxa de blastocistos, porém com maior cinética de desenvolvimento, qualidade morfológica e número de células totais, indicando um possível efeito promotor do crescimento do gene IGF2 no desenvolvimento de embriões bovinos de PIV, do estádio de 1-célula até blastocisto.


Bovine IVP embryos produced by in vitro fertilization (IVF) or nuclear transfer (TN) usually have significant biochemical, metabolic, molecular, histological and developmental differences through birth and beyond when compared to the in vivo counterparts. To note, prenatal abnormalities during placentation and embryonic mortality due to early underdevelopment, and postnatal clinical symptoms, collectively named the Abnormal Offspring Syndrome (AOS,) are common occurrences for IVP embryos. Studies show that important changes usually occur in the pattern of genomic imprinting in IVP embryos, especially in the imprinting pattern of the IGF system, with the IGF2 ligand being a pleiotropic paternally expressed gene with a growth promoting effect, and the receptor IGF2R being a maternal expressed gene that counteracts the effects of the IGF2 gene. Thus, the present study aimed to induce a transient episomal overexpression of the IGF2 gene in bovine IVP embryos following the cytoplasmic microinjection at the 1-cell stage for the increase in embryo development, kinetics and morphological quality up to Day 7 of development. After nine replicates, a total of 1,752 bovine cumulus-oocyte complexes (CCOs) were matured and fertilized in vitro and subsequently segregated into six experimental groups: a non-microinjected control group, a microinjected control group using only tris-EDTA buffer, or TE (0 ng/L ), and four microinjection groups at increasing doses (10, 20, 40, 80 ng/L) of the vector in TE for the episomal expression of the IGF2 and the GFP genes. On Day 2 of development, cleavage and post-microinjection survival rates were evaluated, in addition to the estimation of the number of blastomeres. On Day 7 of development, blastocyst rates and stage of development, embryo quality, GFP fluorescence and total cell numbers were evaluated in resulting blastocysts after in vitro culture. Cytoplasmic microinjection of zygotes was effective in delivering the expression vector into the ooplasm, irrespective of the groups, with 58% of positive GFP fluorescence in Day-7 blastocysts. Considering developmental rates and embryo kinetics, the 10 ng/L microinjection vector dose promoted a lower blastocyst rate (10.4%), but with blastocysts at more advanced stages of development (93.0%), better morphological quality (73% Grade 1) and higher number of cells (116.0 ± 3.0) than non-microinjected IVF controls (23.3%, 75.0%, 58.0%, and 75.0 ± 6.8, respectively). In summary, the microinjection of embryos with an IGF2 gene overexpression vector promoted a developmental rate similar to IVF controls, with differences only when the 10-ng/L dose was used, with a lower blastocyst rate, but with higher developmental kinetics, morphological quality and total number of cells, indicating a possible growth promoting effect of the IGF2 gene on development of bovine IVP embryos, from the 1-cell to the blastocyst stages.

4.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216876

Resumo

A idade reprodutiva da fêmea é um dos fatores que afeta a produção in vitro de embriões. Sabe-se que ovócitos de fêmeas pré-púberes comparados com fêmeas púberes apresentam menor competência de desenvolvimento. Portanto, é importante compreender os aspectos que causam essa menor competência para se alcançar uma melhor eficiência da PIVE. Nesta pesquisa comparou-se o padrão de metilação do gene XIST e da ICR/H19 de ovócitos obtidos de marrãs pré-puberes e porcas cíclicas antes e depois da maturação in vitro. Para a ICR/H19, não houve diferenças para os níveis de metilação entre os tratamentos avaliados. Os percentuais de metilação foram: mGV (36,15 ± 8,6%), pGV (30,14 ± 7,2%), mMII (17,35 ± 6,7%) e pMII (19,96 ± 6,9%). Porém, quando comparados ao controle (espermatozoide - 94,3 ± 1,04%), os ovócitos de mMII e pMII foram menos metilados (p=0,0001). Esses dados confirmam a característica imprinted do gene, com espermatozoide metilado e ovócito MII desmetilado. O gene XIST apresentou padrões de metilação diferentes entre os grupos mGV (17,29 ± 5,8%) e pGV (48,81 ± 9,6%) (p=0,0305), entre mGV e mMII (0,28 ± 0,2%) (p=0,0342) e entre mMII e pMII (82,35%) (p=0,0001). Quando comparado com o padrão de espermatozoide (0,42 ± 0,42%), os ovócitos de pMII foram estatisticamente diferentes (p=0,0001), porém os ovócitos de mMII foram iguais. Esses dados confirmam que essa região do XIST também apresenta uma característica imprinted, com espermatozoide desmetilado e ovócitos pMII metilado. Além disso, os resultados mostraram que os ovócitos menos competentes, de marrãs, não conseguiram se reprogramar corretamente para essa região do XIST após a maturação in vitro. Assim, sugere-se que essa região tem potencial para ser utilizada como um marcador molecular epigenético para competência ovocitária, já que os ovócitos menos competentes apresentaram um padrão de metilação muito alterado do que aquele esperado para um ovócito maturado.


The reproductive age of the female is one of the factors that affects the in vitro embryo production. It is known that oocytes from prepubertal females compared to cycling females have lower developmental competence. Therefore, it is important to better understand the aspects causing this lesse competence to achieve better efficiency of the IVP. In this research, the methylation pattern of the XIST gene and the ICR/H19 of oocytes obtained from prepubertal gilts (g) and cycling sows (s) were compared. Regarding the ICR/H19, there were no differences for methylation levels among the groups. The methylation percentage were: gGV (36.15 ± 8.6%), sGV (30.14 ± 7.2%), gMII (17.35 ± 6.7%) and sMII (19.96 ± 6,9%). However, when compared to the control (spermatozoa - 94.3 ± 1.04%), gMIII and sMII were less methylated (p=0.0001). These data confirm the imprinted pattern of the gene, with spermatozoa highly methylated and MII oocytes hypomethylated. The XIST gene showed different methylation pattern when comparing gGV (17.29 ± 5.8%) and sGV (48.81 ± 9.6%) groups (p=0.0305), gGV and gMII (0.28 ± 0.2%) (p=0.0342) and gMIII and sMII (82.35%) (p=0.0001). However, to the spermatozoa (0.42 ± 0.42%), sMII oocytes comparing were different (p = 0.0001). These data confirm that this region of the XIST also exhibits an imprinted pattern, with spermatozoa demethylated and the oocytes highly methylated. In addition, results showed that less competent oocytes, from gilts, were unable to correctly reprogram the methylation pattern of this region of XIST after in vitro maturation. Thus, it is suggested that this region of XIST has potential to be used as an epigenetic molecular marker for oocyte competence, since the less competent oocytes exhibit an altered methylation pattern than that what is expected for a matured competent oocyte.

5.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-215606

Resumo

O mecanismo epigenético de imprinting genômico exerce um papel fundamental durante o desenvolvimento placentário, embrionário e comportamental de mamíferos. Os genes regulados por imprinting genômico são caracterizados pela expressão monoalélica parental específica, sendo esta controlada por fatores regulatórios, como a metilação do DNA. Muitos dos genes de imprinting genômico já foram molecularmente identificados em diferentes espécies, como humanos e camundongos. Entretanto, esses genes são pouco caracterizados em ruminantes. Nas últimas décadas, com o avanço do uso das tecnologias de reprodução assistida (ART), como fertilização in vitro (FIV) e clonagem, tem sido detectada a perda no padrão de imprinting (LOI, Loss Of Imprinting) nas progênies derivadas de ART. Visto que os genes de imprinting genômico estão dispostos em cluster ao longo do genoma, observa-se alterações multilocus devido a utilização de ART. A consequência da LOI é o surgimento de síndromes, já descritas em humanos e bovinos. Embora a etiologia da Large Offspring Syndrome (LOS) / Abnormal Offspring Syndrome (AOS), em bovinos, e a Beckwith-Wiedemann (SBW), em humanos, sejam relacionadas molecular e fenotipicamente, poucos estudos demonstram a associação da LOS/AOS com múltiplas alterações nos genes de imprinting. Entre os principais genes estudados na LOS/AOS, em bovinos, estão o H19, o KCNQ1OT1 e o PEG1/MEST. Recentemente foi observada a presença de um transcrito antisense ao PEG1/MEST, denominado MESTIT1, que aparentemente possui função regulatória do gene PEG1/MEST. Em vista disso, o presente estudo foi dividido em quatro partes, sendo que a primeira parte visa uma revisão sistemática sobre os estudos multilocus feitos na LOS/AOS, em bovinos, comparando com a SBW, em humanos; já a segunda parte corresponde a realização da análise do padrão de metilação do DNA em amostras de fígado e coração de clones bovinos no gene PEG1/MEST; complementada pela terceira parte que visou a avaliação da presença de transcrito antisense MESTIT1 em amostras de fígado de clones e tecidos de fígado e cérebro nos animais de reprodução natural; na quarta, e última, parte foi realizada a análise do padrão de metilação do DNA nas regiões controladoras de imprinting dos genes H19 e KCNQ1OT1 em amostras de fígado e coração de clones bovinos.


The epigenetic mechanism of genomic imprinting plays a fundamental role during the placental, embryonic and behavioral development of mammals. Genes regulated by genomic imprinting are characterized by specific parental monoallelic expression, which is controlled by regulatory factors such as DNA methylation. Many of the genomic imprinting genes have already been molecularly identified in different species, such as humans and mice. However, these genes are poorly characterized in ruminants. In the last decades, with the use of assisted reproduction technologies (ART), such as in vitro fertilization (IVF) and cloning, loss of imprinting (LOI) has been detected in progenies derived from ART. Since genomic imprinting genes are clustered along the genome, multilocus changes are observed due to the use of ART. The consequence of LOI is the emergence of syndromes, already described in humans and cattle. Although the etiology of Large Offspring Syndrome (LOS)/Abnormal Offspring Syndrome (AOS) in cattle, and Beckwith-Wiedemann (BWS) in humans, are molecularly and phenotypically related, few studies demonstrate the association of LOS/AOS with multiple changes in imprinting genes. Among the major genes studied in LOS/AOS in cattle are H19, KCNQ1OT1 and PEG1/MEST. Recently the presence of an antisense transcript to PEG1/MEST, denominated MESTIT1, in which apparently has regulating function of the gene PEG1 has been observed. Thus, the present study was divided in four parts, in which the first part aims at a systematic review on multilocus studies made in LOS/AOS, in cattle, comparing with BWS in humans. The second part was the analysis of the DNA methylation pattern in liver and heart samples of bovine clones in the PEG1 gene, complemented by the third part that aimed to evaluate the presence of antisense transcript MESTIT1 in liver samples from clones and liver and brain tissues in natural breeding animals. The fourth and last part was made analysis of the methylation pattern of DNA imprinting regions of the H19 and KCNQ1OT1 genes in liver and heart samples from bovine clones.

6.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216446

Resumo

O splicing de precursores de RNA mensageiro para mRNA maduro é um componente crítico da regulação gênica. O processo pode codificar proteínas distintas ou afetar a estabilidade, localização e tradução de mRNAs. Já foram descritas diversas correlações entre uma maior mortalidade embrionária precoce, principalmente em embriões de produzidos in vitro (PIV), que apresentavam retardo de crescimento do concepto e expressões reduzidas de IGF2 com anormalidades placentárias e fetais durante a fase fetal. O locus IGF2 é uma região genômica complexa que produz múltiplos transcritos com splicing alternativos, a partir de vários exons distintos controlados por quatro promotores diferentes. O presente estudo explorou a expressão dos diferentes promotores do IGF2 em oócitos bovinos e embriões bovinos em estádios de pré-implantação, no intuito de esclarecer alguns aspectos da fisiologia do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Para descrever o comportamento do gene IGF2, estruturas de PIV em vários estádios de desenvolvimento, desde oócitos imaturos até blastocistos expandidos, foram produzidas e coletadas em três rotinas, em pools de cinco estruturas por estádio. O RNA total foi extraído dos pools e submetido à transcrição reversa para a obtenção de cDNA, o qual foi utilizado para estimar a abundância das quatro isoformas de mRNA para o IGF2 por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando inicializadores específicos para cada promotor do gene IGF2. Os produtos de amplificação foram submetidas ao sequenciamento de DNA para confirmação molecular. Os dados de expressão quantitativa das isoformas do IGF2 foram transformados em log para a normalização, foram analisados pelo Mixed Procedure do SAS, com comparações pareadas por LSM, para P<0,05. A expressão dirigida pelos promotores P2 e P4 seguiram o padrão observado no mRNA ativo do gene IGF2. Um pico inicial pôde ser visto em estádios precoces, entre oócitos maturados e o estádio embrionário de 2-células, principalmente causada por uma expressão materna e acumulação de transcritos antes da fecundação, seguido por uma diminuição da quantidade de transcritos até a ativação do genoma embrionário, no estádio embrionário de 8-células. Então, um novo aumento dos transcritos pôde ser detectado na compactação e cavitação embrionária. A expressão dirigida pelo promotor P1 do IGF2 mostrou-se menos representativo nas fases iniciais, havendo aumento durante a compactação, após a ativação genômica, prévia à cavitação. Diferentemente, a atividade do promotor P3 não foi detectada em embriões, estando possivelmente presente apenas em estádios mais avançados de desenvolvimento. Futuros estudos genéticos focados no desenvolvimento embrionário inicial devem prestar especial atenção ao papel da expressão do promotor P4 do gene IGF2, com os promotores P1 e P2 tendo um aparente papel secundário no desenvolvimento inicial, enquanto o promotor P3, se geneticamente manipulado, poderia trazer mudanças fisiológicas somente posteriormente no desenvolvimento. Os achados deste estudo fornecem uma compreensão adicional da biologia do desenvolvimento de embriões derivados de PIV, bem como novas possibilidades para o uso da expressão dos diferentes promotores do gene IGF2 para a manipulação genética durante estádios pre-implantacionais de embriões bovinos, o que pode ser um caminho para estudos que visam o aumento da viabilidade e a redução da mortalidade embrionária no início da gestação pela modulação da taxa de crescimento após a produção embrionária in vitro.


The splicing of messenger RNA precursors to mature mRNA is a critical component of the gene regulation that can encode distinct protein or affect mRNA stability, localization, and translation. Correlations between the higher early embryonic mortality in in vitro-produced (IVP) embryos with the growth retardation of the conceptus and reduced expressions of IGF2 with placental and fetal abnormalities in the fetal phase in development have already been established. The IGF2 locus is a complex genomic region that produces multiple alternative splicing transcripts of several leader exons controlled by four distinct promoters. The present study evaluated the pattern of the promoter-specific IGF2 expression in bovine oocytes and in preimplantation embryos, as a means of unraveling some aspects of the developmental physiology of bovine embryos produced in vitro. To describe the behavior of the IGF2 gene, IVP-derived structures from distinct stages of development, from immature oocytes to expanded blastocyst, were collected in three IVP procedures, in pools of five structures per stage. Total RNA was extracted from the pools and reverse transcribed in cDNA, which were evaluated to estimate the abundance of the four different IGF2 mRNA isoforms by real time quantitative PCR system (qPCR), using IGF2 promoter-specific primers. Amplifications were DNA sequenced for confirmation. Data comprising quantitative IGF2 isoform expression were log transformed for normality and analyzed by the Mixed Procedure of SAS, with pairwise comparisons by LSM, for P<0.05. Promoter P2 and P4 IGF2 expression followed the pattern seen in active mRNA of IGF2 gene. An initial peak could be seen in early development, between matured oocytes and 2-cells stage embryos, mostly from accumulation prior to fertilization, followed by a decrease in abundance until embryo genome activation, at the 8-cells stage embryo. Then, a new surge in splicing variants could be detected at compaction and cavitation. Promoter P1 IGF2 expression showed to be less representative at the initial stages, having a notorious increase during compaction, after genomic activation, prior to cavitation. Differently, Promoter P3 activity was not detected at all stages, possibly being more relevant at more advanced stages in development. Future genetic studies focused on early embryonic development should pay especial attention to the role of the P4 promoter for IGF2 expression, with the P1 and P2 promoters having an apparent secondary role during early development, whereas the P3 promoter, if genetically manipulated, could possibly bring physiological changes only latter in development. The findings of this study provide some further understanding of aspects in developmental biology for IVP-derived embryos, also offering novel possibilities for the use of promoter-specific IGF2 expression for genetic manipulation during preimplantation embryo stages in cattle, which may be a path for studies seeking an increase in embryo viability and reduction of embryo mortality in early pregnancy by the modulation of growth rate after in vitro embryo production.

7.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-207442

Resumo

O imprinting genômico é a diferenciação epigenética dos cromossomos parentais. O processo envolve a discriminação dos alelos parentais com marcas de metilação do DNA no contexto da sequência CpG e resulta na expressão monoalélica origem parental-dependente de um conjunto de genes, determinante para o desenvolvimento embrionário normal. A diferenciação epigenética dos cromossomos parentais surgiu com a evolução dos marsupiais para prevenir a partenogênese, a poliploidia e controlar possíveis efeitos deletérios em genes essenciais para o desenvolvimento placentário. A maioria dos estudos sobre imprinting genômico é em roedores e humanos. Em primatas não humanos (chimpanzé, orangotango, macaco rhesus, sagui e galago) os estudos são escaços. O quimerismo, a gemelação e os cuidados aloparentais, características dos saguis (Callithrix spp.), podem impactar os efeitos do imprinting genômico. Neste estudo investigamos a existência de marcas imprintadas de metilação do DNA em tecidos não quiméricos de saguis nos domínios ortólogos das regiões diferencialmente metiladas (DMRs) dos genes SNRPN, SNURF, GRB10, IGF2, IGF2R em humanos. Esses genes estão relacionados ao comportamento, a reprodução, o crescimento e ao deenvolvimento embrionário. Para cada região determinamos o perfil de metilação pontual utilizando digestão enzimática sensível à metilação associada à PCR quantitativa fluorescente e investigamos se metilação é alelo-específica por minissequenciamento de SNPs. Em sangue, para os domínios dos genes SNURF, IGF2 e IGF2R o perfil de metilação foi intermediário (mediana de 50,7%) e a metilação foi alelo-específica, consistente com a ocorrência de marcas imprintadas. Contudo, os perfis variaram desde hipometilado a hipermetilado entre indivíduos e entre diferentes tecidos de um mesmo indivíduo. Concluimos que em sangue de saguis as regiões ortólogas das DMRs SNURF, IGF2, IGF2R possuem marcas imprintadas de metilação do DNA.


Genomic imprinting is the epigenetic differentiation of the parental chromosomes. The process involves discriminating the parental alleles with DNA methylation marks in the context of the dinucleotide CpG sequence and results in the parental-of-origin dependent monoallelic expression of a group of genes that are determinant of the normal embryonic development. The epigenetic differentiation of the parental chromosomes emerged with the evolution of the marsupials to prevent the parthenogenesis, the polyploidy and to control possible deleterious effects in genes that are essential for the development of the placenta. Most studies about genomic imprinting are in rodents and humans. In the nonhuman primates (chimpanzees, urangotangs, rhesus monkeys, marmosets and galagos) the studies are scarce. The chimerism, the twinning and the alloparental care are characteristic features in the marmoset (Callithrix spp.) and they can impact the effects of the genomic imprinting. In this study, we investigate in nonchimeric tissues of marmosets the occurrence of DNA methylation imprinted marks in the ortholog domains of human differentially methylated regions (DMR) of the SNRPN, SNURF, GRB10, IGF2, IGF2R genes. The target genes are related with the behavior, reproduction, growth and embrionary development. For each region, we determined the methylation profile at specific CpG sites, using a methylation-sensitive restriction enzyme method associated to quantitative fluorescent PCR and investigate by single nucleotide primer extension whether the methylation is allele-specific. In blood, for the SNURF, IGF2 and IGF2R ortholog domains, the methylation profile was intermediate (median 50,7%) and the methylation was allele-specific, consistent with the occurrence of imprinting marks. Nevertheless, the profiles varied from hypomethylated to hypermethylated among individuals and between different tissues of the same individual. We conclude that the marmoset ortholog regions of the SNURF, IGF2, IGF2R human DMRs have DNA methylation imprinted marks in peripheral blood.

8.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-205270

Resumo

O objetivo do experimento I foi avaliar a interação entre a dois ganhos médio diário [GMD - fator nutricional (ganho alto GA = 0,700 e ganho baixo GB = 0,300 Kg/dia)] e a diferença esperada da progênie (DEP para idade ao primeiro parto; fator genético) na puberdade de novilhas Nelore. Foram utilizadas 56 novilhas desmamadas com 8 meses de idade, filhas de 4 touros [2 precoce (P) e 2 tardios (T)]. Formado um esquema em fatorial 2 x 2, no qual o fator 1 foi o GMD e o fator 2 foi a DEP do touro, constituindo assim quatro tratamentos: Touro precoce com GMD Alto (PGA), touro precoce com GMD Baixo (PGB), touro tardio com GMD Alto (TGA), touro tardio com GMD Baixo (TGB). Houve efeito dos tratamentos na porcentagem de novilhas púberes (PGA e PGB = 100%; TGA = 83% até 27 meses de idade; TGB = 38% até 4 anos de idade). As novilhas do PGA apresentaram a menor (P = 0,0001) idade na puberdade (18 ± 1 meses). Contudo, a nutrição atrasou a puberdade em cerca de 10 meses nas novilhas filhas de touro precoce e tardio (PGA = 18 ± 1 vs. PGB = 29 ± 1 meses; TGA = 24 ± 1 vs. 34 ± 1 meses). Assim podemos concluir que a DEP para IPP foi o fator necessário o adiantamento idade a puberdade. No entanto, o GMD é um fator limitante para o aparecimento da puberdade. O objetivo do experimento II foi avaliar a o efeito do imprinting metabólico dos 3 aos 7 meses de idade na puberdade em Cruzadas (Angus x Nelore). Os tratamentos foram arranjados em esquema fatorial 2 x 2, no qual o fator 1 foi alto e médio GMD dos 3 aos 7 meses de idade (fase 1) e o fator 2 foi alto e médio GMD dos 7 meses de idade até a puberdade (fase 2). Formando os seguintes tratamentos: CAA Novilhas cruzadas submetidas ao alto GMD nas duas fases do experimento; CAM - Alto GMD na fase 1 e médio GMD na fase 2; CMA- Médio GMD na fase1 e alto GMD na fase 2; CMM- Médio GMD nas fases 1 e 2. O alto e médio GMD foi atingido pela restrição do consumo de matéria seca (CMS) no médio GMD. As novilhas dos tratamentos CAA, CAM e CMA apresentaram puberdade na mesma idade (cerca de 12 meses). As novilhas cruzadas submetidas ao alto GMD na fase 2 foram mais pesadas (P = 0,0379) na puberdade do que novilhas submetidas ao baixo GMD. O alto GMD dos 3 aos 7 meses de idade não impactou na puberdade das novilhas cruzadas. O objetivo e a metodologia do experimento III foi semelhante ao experimento II, no entanto foram utilizadas novilhas Nelores (N) ao invés de cruzadas e o experimento terminou aos 19 meses de idade. Houve efeito do imprinting metabólico em novilhas Nelore submetidas ao alto GMD dos 3 aos 7 meses de idade. A taxa de puberdade nas novilhas Nelore até os 19 meses de idade foi influenciada (P = 0,0145) pelo tratamento (NAA = 84%; NAM = 60%; NMA = 50%; NMM = 23%). As novilhas Nelore que foram mantidas no alto GMD na fase 2, tiveram maior (P = 0,0001) CMS, mas os tratamentos NAM e NMA tiveram a mesma porcentagem de novilhas púberes. O alto GMD dos 3 aos 7 meses dia idade aumentou a porcentagem de novilhas Nelore púberes aos 19 meses de idade.


The objective of experiment I was to evaluate the interaction between two average daily gain (ADG nutritional factor (high gain HG = 0,700 and low gain LG = 0,300 kg/day)] and expected progeny differences (EPD to age at first calving; genetic factor) on puberty of Nellore heifers. Were used 56 heifers, weaning at 8 months of age, daughter of 4 sires [ 2 precocious (P) and 2 later (L)]. Forming a factorial scheme 2 x 2, where the factor 1 was the ADG and the factor 2 was the EPD of sire, forming four treatments: Precocious sire with HG (PHG), precocious sire with LG (PLG), later sire with HG (LHG) and later sire with LG (LLG). There was effect of treatment in percentage of puberty heifers (PHG and PLG = 100%; LHG = 83% until 27 month of age; LLG = 38% until 4 years old). Heifers of PHG treatment showed the lowest (P = 0,0001) age at puberty (18 months of age). However, the nutritional factor delay about 10 months the age at puberty in precocious and later heifers (PHG = 18 ± 1 vs. PLG = 29 ± 1 months; LHG = 24 ± 1 vs. LLG = 34 ± 1 months of age). The EPD to age at the first calving was necessary factor to anticipate age at puberty. However, the ADG was limiting to puberty onset. The objective of experiment II was to evaluate of the effect of metabolic imprinting from 3 to 7 month of age in puberty of crossbreed heifers (Angus x Nellore). The treatments were arranged in factorial scheme 2 x 2, where the factor 1 were high (H) and medium (M) ADG from 3 to 7 months of age (phase 1) and the factor 2 were high and medium ADG from 7 months of age to puberty onset (phase 2). Forming the treatments: CHH crossbreed heifers submitted to high ADG in both phases of experiment; NHM and CHM high ADG in phase 1 and medium ADG in phase 2; NMH and CMH medium ADG in phase 1 and high ADG in phase 2; NMM and CMM Medium ADG in both phases. The high and medium ADG was targeted by restriction of dry mater intake (DMI) in medium ADG. Crossbreed heifers of treatments CHH, CHM, CMH showed the same age at puberty, about 12 months. Heifers submitted to high ADG on phase 2 were heavier (P = 0,0379) at puberty than heifers submitted to low ADG. The high ADG from 3 to 7 months did not affect puberty onset in crossbreed heifers. The objective and methodology used in experiment III was the same of used in experiment II. However, were used Nellore Heifers (N) instead of crossbreed heifers and the experimental period ended to 19 month of age. There was effect of metabolic imprinting on puberty of Nellore heifers submitted to high ADG from 3 to 7 months of age. Percentage of Nellore puberty heifers until 19 months of age was affect (P = 0,0145) by treatments (NHH = 84%; NHM = 60%; NMH = 50%; NMM = 23%). Nellore heifers that were kept in high ADG during phase 2, had increase (P = 0,0001) in DMI than heifers in low ADG, but NHM and NMH had the same percentage of puberty Nellore heifers. The high ADG from 3 to 7 month of age increased the percentage of puberty Nellore heifers at 19 months of age.

9.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203748

Resumo

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro.


Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency.

10.
Acta sci. vet. (Impr.) ; 39(suppl.1): s263-s272, 2011.
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1412827

Resumo

Background: One of the key biological principles that differentiate mammals from other phyla is the presence of the placenta. This is a unique and complex tissue that plays an essential role in the development of the fetus and has both short terms effects in terms of reproductive efficiency, and long term effects in terms of adult onset diseases exacerbated by an inadequate fetal environment. Yet in spite of decades of intense study there is still a large number of unanswered questions regarding the function of this organ. This is true for both humans and domestic animals species. Review: In the past, studies focused on placental function and placental/fetal interactions have examined at most a few genes/ proteins at a time; what is commonly referred to as the candidate gene approach. While this approach has been quite successful, and has helped develop the knowledge base that we have at present, it is also limiting in scope. New genomic technologies allow simultaneous analysis of most, if not all, of the genes expressed in placental and fetal tissues. However these technologies also present significant challenges due to the massive amount of information that is generated. This entails not just how to handle the generated data, but also how to properly analyze it and interpret it. Fortunately, a large number of computer algorithms have been, and continued to be, developed that permit not just the identification of which genes are disregulated in the system being studied, but perhaps more importantly, permits the identification of which biological pathways are affected. This in effect convert a list of genes that in most cases defy interpretation, into a more biologically-oriented set of results that provide a better understanding of the system. This knowledge can then be used to design direct biochemical and physiological experiments that, in essence, allow the investigator to move from the gene level to the system level. This review will cover some of the fundamental aspects of gene expression profile data capture, and the different approaches that are used to analyze the data generated, including brief descriptions of some of the most commonly used web-based gene expression profiling analysis programs. In addition, methods for searching and downloading dataset of interest that can help complement your own data will be reviewed. In particular, focus will be placed on how this technology can be utilized to study placental and fetal growth abnormalities in humans, with an emphasis on fetal growth restriction and preeclampsia. Additionally, similar approaches will be described that helped to elucidate the conservation and possible function of imprinted genes in swine. Conclusion: This manuscript describes methods for capturing and analyzing gene expression profiles with an emphasis of how this technology was applied to the study of placental function in humans and swine. In addition, it provides a description of web-based systems that can be used to analyze data generated by your own studies as well as method for searching and downloading data generated by others.


Assuntos
Humanos , Animais , Placenta/fisiologia , Suínos/fisiologia , Impressão Genômica , Epigênese Genética , Transcriptoma , Testes de Função Placentária
11.
Braz. J. Biol. ; 70(1): 145-149, Feb. 2010. tab, ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-2642

Resumo

The aim of this study was to evaluate different mating strategies among endogamic strains to create F1 populations of mice, minimising the effect of inbreeding depression on somatic development and embryo yield. Females from the strains Swiss, CBA and C57Bl/6 were divided in nine experimental mate arrangements. The total numbers of pups born alive per dam and somatic development, estimated by weighing and measuring the crown-rump length, were recorded. Superovulation response was evaluated in outbreed females. Litter size differed among endogamic dams, irrespective of the sire. Somatic development results suggest heterosis and imprinting phenomena, once a differential parental effect was demonstrated. There was no difference in corpora lutea, ova or embryos recovered (P > 0.05), but recovery and viability rates differ among F1 groups (P < 0.05). The association of dam prolificity with somatic development and superovulation response of the pups should be considered for experimental F1 populations establishment. The use of outbreed animals, however, did not reduce response variability to hormone treatment.(AU)


Objetivou-se neste estudo avaliar diferentes estratégias de cruzamento entre linhagens endogâmicas para a formação de populações de camundongos F1, minimizando o efeito da depressão por endogamia nos resultados de desenvolvimento somático e produção de embriões. Fêmeas das linhagens Swiss, CBA e C57Bl/6, foram distribuídas em nove possíveis cruzamentos. Foram registrados o número de filhotes nascidos vivos por matriz e o desenvolvimento somático dos mesmos, mensurado pelo peso e comprimento. A resposta superovulatória foi avaliada nas fêmeas cruzadas. O tamanho das ninhadas diferiu entre as linhagens das matrizes, de forma independente da linhagem dos reprodutores. Os resultados do desenvolvimento somático sugerem a ocorrência de heterose e imprinting, uma vez que foi demonstrado um efeito parental diferenciado. Não foram observadas diferenças no número de corpos lúteos, estruturas ou embriões recuperados (P > 0,05), mas as taxas de recuperação e o percentual de embriões viáveis diferiram entre os grupos (P < 0,05). A associação da prolificidade da linhagem das matrizes com as características do desenvolvimento somático e resposta superovulatória dos filhotes deve ser considerada no estabelecimento de populações experimentais F1. O uso de animais cruzados, contudo, não reduziu a variabilidade da resposta aos tratamentos hormonais.(AU)


Assuntos
Animais , Masculino , Feminino , Gravidez , Camundongos , Animais Recém-Nascidos/crescimento & desenvolvimento , Embrião de Mamíferos/fisiologia , Desenvolvimento Embrionário/fisiologia , Impressão Genômica/genética , Animais Recém-Nascidos/genética , Desenvolvimento Embrionário/genética , Impressão Genômica/fisiologia , Camundongos Endogâmicos C57BL , Camundongos Endogâmicos CBA
12.
Anim. Reprod. (Online) ; 7(3): 197-203, July/September 2010. ilus, graf
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1461636

Resumo

Many of the developmental anomalies observed in cloned animals are related to fetal and placental overgrowth, a phenomenon known as the “large offspring syndrome” (LOS) in ruminants. It has been hypothesized that the epigenetic control of imprinted genes, i.e. genes that are expressed in a parental-specific manner, is at the root of LOS. Our recent research has focused on understanding the epigenetic alterations to imprinted genes that are associated with assisted reproductive technologies (ART), such as early embryo in vitro culture (IVC) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in cattle. We have searched and identified single nucleotide polymorphisms in Bos indicus DNA useful for analysis of parental-specific alleles and their respective transcripts in tissues from hybrid embryos derived by crossing Bos indicus and Bos taurus cattle. Due to the frequency of placental anomalies in SCNT and in some IVC gestations, our initial studies focused on genes known to be necessary for trophoblast proliferation (Mammalian Achaete Scute-like Homologue 2; ASCL2) and differentiation (Heart and neural crest cell derivative 1; HAND1). ASCL2 was bi-allelically expressed prior to implantation but paternally silenced after implantation. At day 17, SCNT embryos showed more abundant ASCL2 and less abundant HAND1 transcripts. After implantation, SCNT fetal cotyledons displayed higher ASCL2 and HAND1 than AI and IVC tissues. To further investigate epigenetic anomalies, we analyzed the differentially methylated regions of other imprinted genes in cattle, i.e. SNRPN, H19 and the IGF2R. Compared with the patterns observed in vivo (AI), we observed a generalized hypomethylation of the imprinted allele and the bi-allelic expression of embryos produced by SCNT...


Assuntos
Animais , Bovinos , Células Clonais/fisiologia , Epigênese Genética/fisiologia , Impressão Genômica/genética , Técnicas de Reprodução Assistida/efeitos adversos , Diagnóstico Pré-Natal/mortalidade , Mortalidade Infantil
13.
Anim. Reprod. ; 7(3): 197-203, July/September 2010. ilus, graf
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-5920

Resumo

Many of the developmental anomalies observed in cloned animals are related to fetal and placental overgrowth, a phenomenon known as the “large offspring syndrome” (LOS) in ruminants. It has been hypothesized that the epigenetic control of imprinted genes, i.e. genes that are expressed in a parental-specific manner, is at the root of LOS. Our recent research has focused on understanding the epigenetic alterations to imprinted genes that are associated with assisted reproductive technologies (ART), such as early embryo in vitro culture (IVC) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in cattle. We have searched and identified single nucleotide polymorphisms in Bos indicus DNA useful for analysis of parental-specific alleles and their respective transcripts in tissues from hybrid embryos derived by crossing Bos indicus and Bos taurus cattle. Due to the frequency of placental anomalies in SCNT and in some IVC gestations, our initial studies focused on genes known to be necessary for trophoblast proliferation (Mammalian Achaete Scute-like Homologue 2; ASCL2) and differentiation (Heart and neural crest cell derivative 1; HAND1). ASCL2 was bi-allelically expressed prior to implantation but paternally silenced after implantation. At day 17, SCNT embryos showed more abundant ASCL2 and less abundant HAND1 transcripts. After implantation, SCNT fetal cotyledons displayed higher ASCL2 and HAND1 than AI and IVC tissues. To further investigate epigenetic anomalies, we analyzed the differentially methylated regions of other imprinted genes in cattle, i.e. SNRPN, H19 and the IGF2R. Compared with the patterns observed in vivo (AI), we observed a generalized hypomethylation of the imprinted allele and the bi-allelic expression of embryos produced by SCNT...(AU)


Assuntos
Animais , Bovinos , Epigênese Genética/fisiologia , Células Clonais/fisiologia , Técnicas de Reprodução Assistida/efeitos adversos , Impressão Genômica/genética , Diagnóstico Pré-Natal/mortalidade , Mortalidade Infantil
14.
Anim. Reprod. (Online) ; 7(3): 168-176, July/September 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1461639

Resumo

Imprinted genes, which are epigenetically modified such that only a single parental allele is expressed, are often regulated by imprinting control regions (ICRs). ICRs typically are DNA methylated in the male or female germline and this DNA methylation is subsequently maintained, even when the genome is reprogrammed after fertilization. Many of the manipulations associated with Assisted Reproductive Technologies (ART) occur during periods of epigenetic reprogramming and it should, therefore, not be surprising that animal data show that loss of imprinting and loss of DNA methylation of ICRs is associated with procedures such as superovulation, in vitro fertilization and embryos culture and transfer. Less clear is whether there is an increase in loss of imprinting disorders associated with ART. Here we review the human and animal literature and discuss what it is necessary to address current controversies.


Assuntos
Impressão Genômica/genética , Região de Controle de Locus Gênico/genética , Técnicas de Reprodução Assistida , Metilação de DNA
15.
Anim. Reprod. ; 7(3): 168-176, July/September 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-5923

Resumo

Imprinted genes, which are epigenetically modified such that only a single parental allele is expressed, are often regulated by imprinting control regions (ICRs). ICRs typically are DNA methylated in the male or female germline and this DNA methylation is subsequently maintained, even when the genome is reprogrammed after fertilization. Many of the manipulations associated with Assisted Reproductive Technologies (ART) occur during periods of epigenetic reprogramming and it should, therefore, not be surprising that animal data show that loss of imprinting and loss of DNA methylation of ICRs is associated with procedures such as superovulation, in vitro fertilization and embryos culture and transfer. Less clear is whether there is an increase in loss of imprinting disorders associated with ART. Here we review the human and animal literature and discuss what it is necessary to address current controversies.(AU)


Assuntos
Impressão Genômica/genética , Região de Controle de Locus Gênico/genética , Técnicas de Reprodução Assistida , Metilação de DNA
16.
Anim. Reprod. (Online) ; 7(3): 154-164, July/September 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1461641

Resumo

Although assisted reproductive technologies (ARTs) have allowed millions of otherwise infertile couples to conceive children of their own, concerns remain about the safety of these procedures due to an increased incidence of epigenetic disorders in children born following the use of ART. Specifically, abnormal genomic imprinting and/or diseases caused by abnormal imprinting have been reported. While the frequencies of these defects among all ART offspring remain very low, studies have shown that children born using ARTs can be up to six times more likely to develop certain imprinting disorders than those who are naturally conceived. In addition, studies of animals produced from ART-derived embryos and/or superovulated oocytes have revealed abnormal allele-specific expression and DNA methylation profiles at imprinted genes. Many different aspects of ART procedures have been implicated in the etiology of imprinting disorders. However, it remains difficult to distinguish between abnormalities that develop as a result of inherent consequences of infertility and those induced directly by ART procedures. In support of the latter, there is a growing body of evidence suggesting that the use of exogenous gonadotropins to stimulate folliculogenesis (superovulation) in females undergoing ARTs may contribute to the induction of abnormal genomic imprinting. The association between superovulation and imprinting disorders is difficult to fully assess because of the high variability in ART protocols, especially those applied to human patients, and the small number of animal studies published to date. However, because the use of ARTs is becoming increasingly prevalent in developed countries, and ovarian stimulation is typically an indispensable part of these procedures, further investigation into the potential for these procedures to induce epigenetic defects is highly warranted. Here, we review the existing literature suggesting a potential causal relationship between endocrine stimulation and the induction of imprinting abnormalities. In addition, we suggest directions for future research in this area.


Assuntos
Epigênese Genética/genética , Impressão Genômica/genética , Metilação de DNA , Sistema Endócrino/embriologia , Técnicas de Reprodução Assistida/efeitos adversos , Componentes Genômicos/fisiologia , Células Germinativas/fisiologia , Indução da Ovulação/métodos
17.
Anim. Reprod. ; 7(3): 154-164, July/September 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-5925

Resumo

Although assisted reproductive technologies (ARTs) have allowed millions of otherwise infertile couples to conceive children of their own, concerns remain about the safety of these procedures due to an increased incidence of epigenetic disorders in children born following the use of ART. Specifically, abnormal genomic imprinting and/or diseases caused by abnormal imprinting have been reported. While the frequencies of these defects among all ART offspring remain very low, studies have shown that children born using ARTs can be up to six times more likely to develop certain imprinting disorders than those who are naturally conceived. In addition, studies of animals produced from ART-derived embryos and/or superovulated oocytes have revealed abnormal allele-specific expression and DNA methylation profiles at imprinted genes. Many different aspects of ART procedures have been implicated in the etiology of imprinting disorders. However, it remains difficult to distinguish between abnormalities that develop as a result of inherent consequences of infertility and those induced directly by ART procedures. In support of the latter, there is a growing body of evidence suggesting that the use of exogenous gonadotropins to stimulate folliculogenesis (superovulation) in females undergoing ARTs may contribute to the induction of abnormal genomic imprinting. The association between superovulation and imprinting disorders is difficult to fully assess because of the high variability in ART protocols, especially those applied to human patients, and the small number of animal studies published to date. However, because the use of ARTs is becoming increasingly prevalent in developed countries, and ovarian stimulation is typically an indispensable part of these procedures, further investigation into the potential for these procedures to induce epigenetic defects is highly warranted. Here, we review the existing literature suggesting a potential causal relationship between endocrine stimulation and the induction of imprinting abnormalities. In addition, we suggest directions for future research in this area.(AU)


Assuntos
Sistema Endócrino/embriologia , Epigênese Genética/genética , Técnicas de Reprodução Assistida/efeitos adversos , Metilação de DNA , Impressão Genômica/genética , Indução da Ovulação/métodos , Componentes Genômicos/fisiologia , Células Germinativas/fisiologia
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