Desenvolvimento embrionário/fetal, placentação e glicosaminoglicanos no aparelho reprodutor feminino e na placenta / Embryonic/fetal development, placentation and glycosaminoglycans in the female reproductive tract and placenta

Background: Fetal attachments, placentation and embryonic development have been widely discussed in rodents such as agoutisand cavies, as well as research on glycosaminoglycans (GAGs) in rats and rabbits. Moreover, studies on buffalo, cattle and sheep aredescribed in ruminants, and work has also been reported in sheep with GAGs in placentoma. However, further studies are needed inthis regard, since there are reports of economic losses associated with reproductive failures described for cattle such as changes in thechorion and allantois, and in sheep in which changes between the transition from vitelline to allantois circulation have been discussed.Review: In relation to embryonic development, detailed studies have been described in rodents such as rats (12 days old), desertmouse (15 days old) and agoutis at 30 days. Macroscopic structures such as the cephalic region, nose, optic vesicle, cervical curvature, thoracic and pelvic limbs were observed, as well as microscopic structures such as the pituitary, lung, heart, brain cavity, liver,retina, and ossification regions. There are reports of buffalo and cattle studies in ruminants describing early embryonic development.However, the research in the case of sheep is limited, meaning there is only the ultrasound examination, such as gestational diagnosisand morphometric measurement of the embryonic vesicle. Still, studies with umbilical funicular and placental development of sheepwith different gestational ages can be highlighted. Regarding extraembryonic annexes, four important structures which contributeto embryonic maintenance have been reported. These are called the chorion, amnion, allantois and yolk sac, respectively, and areresponsible for originating the placenta, embryonic protection, collecting metabolic waste and early embryonic nutrition. In...

Desenvolvimento embrionário/fetal, placentação e glicosaminoglicanos no aparelho reprodutor feminino e na placenta / Embryonic/fetal development, placentation and glycosaminoglycans in the female reproductive tract and placenta

Background: Fetal attachments, placentation and embryonic development have been widely discussed in rodents such as agoutisand cavies, as well as research on glycosaminoglycans (GAGs) in rats and rabbits. Moreover, studies on buffalo, cattle and sheep aredescribed in ruminants, and work has also been reported in sheep with GAGs in placentoma. However, further studies are needed inthis regard, since there are reports of economic losses associated with reproductive failures described for cattle such as changes in thechorion and allantois, and in sheep in which changes between the transition from vitelline to allantois circulation have been discussed.Review: In relation to embryonic development, detailed studies have been described in rodents such as rats (12 days old), desertmouse (15 days old) and agoutis at 30 days. Macroscopic structures such as the cephalic region, nose, optic vesicle, cervical curvature, thoracic and pelvic limbs were observed, as well as microscopic structures such as the pituitary, lung, heart, brain cavity, liver,retina, and ossification regions. There are reports of buffalo and cattle studies in ruminants describing early embryonic development.However, the research in the case of sheep is limited, meaning there is only the ultrasound examination, such as gestational diagnosisand morphometric measurement of the embryonic vesicle. Still, studies with umbilical funicular and placental development of sheepwith different gestational ages can be highlighted. Regarding extraembryonic annexes, four important structures which contributeto embryonic maintenance have been reported. These are called the chorion, amnion, allantois and yolk sac, respectively, and areresponsible for originating the placenta, embryonic protection, collecting metabolic waste and early embryonic nutrition. In...(AU)

Morphological analysis of the elastic and collagen fibers in the ram penis / Análise morfológica de fibras elásticas e colágenas no pênis de ovinos

The penis represents the organ of the male's copulation. It is essential to know the reproductive biology and the morphology of the reproductive organs to increase animal production. In order to contribute to this knowledge and provides information on the ram reproductive morphology, the purpose of this work was to describe the distribution, based on light microscopy, of the collagen and elastic fibers in the ram penis. For that, were collected transverse fragments of the penis (root, sigmoid flexure, body and glans) of seven rams. The specimens were fixed in paraformaldehyde for 24h and destined for the histological routine. The extracellular matrix of the ram penis was composed of collagen and elastic fibers. The penis was enveloped by the tunica albuginea, consisting essentially of collagen fibers, which were arranged in two layers: an outer longitudinal and an inner circular. This tunic emitted septa that penetrated the corpus cavernosum. The elastic fibers appeared transversely and longitudinally in the corpus cavernosum, corpus spongiosum, and next to the neurovascular bundle of the penis. This structure was not different to that reported for other domestic ruminants such as cattle and buffaloes.(AU)

O pênis representa o órgão da cópula do macho. É fundamental que se conheça a biologia reprodutiva e a morfologia dos órgãos reprodutores para o incremento da produção animal. Com o objetivo de contribuir para este conhecimento e fornecer informações sobre a morfologia reprodutiva de ovinos, o propósito deste trabalho foi descrever a distribuição, com base na microscopia de luz, das fibras colágenas e elásticas no pênis de ovinos. Para tanto, foram coletados fragmentos transversais do pênis (raiz, flexura sigmoide, corpo e glande) de sete ovinos. Os exemplares foram fixados em paraformaldeído por 24h e destinados à rotina histológica. A matriz extracelular do pênis de ovinos estava constituída por fibras colágenas e elásticas. O pênis estava envolvido pela túnica albugínea, formada essencialmente por fibras colágenas, que estavam arranjadas em duas camadas: longitudinal externa e circular interna. Esta túnica emitiu septos que penetraram no corpo cavernoso. As fibras elásticas apareceram de modo transversal e longitudinal nos corpos cavernoso e esponjoso e junto ao feixe vásculo-nervoso do pênis de ovinos. Esta estrutura mostrou-se similar ao encontrado em outros ruminantes domésticos como bovinos e bubalinos.(AU)

Morphological analysis of the elastic and collagen fibers in the ram penis / Análise morfológica de fibras elásticas e colágenas no pênis de ovinos

The penis represents the organ of the male's copulation. It is essential to know the reproductive biology and the morphology of the reproductive organs to increase animal production. In order to contribute to this knowledge and provides information on the ram reproductive morphology, the purpose of this work was to describe the distribution, based on light microscopy, of the collagen and elastic fibers in the ram penis. For that, were collected transverse fragments of the penis (root, sigmoid flexure, body and glans) of seven rams. The specimens were fixed in paraformaldehyde for 24h and destined for the histological routine. The extracellular matrix of the ram penis was composed of collagen and elastic fibers. The penis was enveloped by the tunica albuginea, consisting essentially of collagen fibers, which were arranged in two layers: an outer longitudinal and an inner circular. This tunic emitted septa that penetrated the corpus cavernosum. The elastic fibers appeared transversely and longitudinally in the corpus cavernosum, corpus spongiosum, and next to the neurovascular bundle of the penis. This structure was not different to that reported for other domestic ruminants such as cattle and buffaloes.(AU)

O pênis representa o órgão da cópula do macho. É fundamental que se conheça a biologia reprodutiva e a morfologia dos órgãos reprodutores para o incremento da produção animal. Com o objetivo de contribuir para este conhecimento e fornecer informações sobre a morfologia reprodutiva de ovinos, o propósito deste trabalho foi descrever a distribuição, com base na microscopia de luz, das fibras colágenas e elásticas no pênis de ovinos. Para tanto, foram coletados fragmentos transversais do pênis (raiz, flexura sigmoide, corpo e glande) de sete ovinos. Os exemplares foram fixados em paraformaldeído por 24h e destinados à rotina histológica. A matriz extracelular do pênis de ovinos estava constituída por fibras colágenas e elásticas. O pênis estava envolvido pela túnica albugínea, formada essencialmente por fibras colágenas, que estavam arranjadas em duas camadas: longitudinal externa e circular interna. Esta túnica emitiu septos que penetraram no corpo cavernoso. As fibras elásticas apareceram de modo transversal e longitudinal nos corpos cavernoso e esponjoso e junto ao feixe vásculo-nervoso do pênis de ovinos. Esta estrutura mostrou-se similar ao encontrado em outros ruminantes domésticos como bovinos e bubalinos.(AU)

Envolvimento da matriz extracelular no tumor mamário canino / Extracellular matrix involviment in canine mammary tumor

A glândula mamária (GM) é um tecido dinâmico, derivado da epiderme e o seu desenvolvimento depende da interação entre as células mamárias e o estroma. A matriz extracelular (MEC) representa o principal conteúdo extracelular, responsável pela sustentação do tecido conjuntivo, da membrana basal e serve como reservatório para muitos fatores de crescimento. MEC é constituída por fibras proteicas insolúveis, como colágenos, lamininas, fibronectinas, e polímeros solúveis, como proteoglicanos e glicosaminoglicanos. Essas moléculas que compõem a MEC são importantes, tanto durante a morfogênese da GM, como para a sua manutenção conferindo-lhe a sustentação e o armazenamento de substratos necessários para seu crescimento. A desorganização da MEC na GM pode ser um indício necessário para o início e a progressão dotumor de mama. O Tumor mamário canino (TMC) é referido como um complexo de neoplasias que tem a participação de diversos fatores para seu desenvolvimento, incluindo os componentes da MEC. Desta forma, a investigação da MEC no diagnóstico dos TMC torna-se importante, para estabelecer a correlação entre os seus componentes e as células neoplásicas, além de fornecer informações sobre o comportamento biológico e o estadiamento clínico dos TMC. O entendimento da participação dessas moléculas da MEC para o desenvolvimento do TMC pode favorecer abordagens terapêuticas mais específicas, tendo como alvo elementos da MEC. Portanto, esta revisão tem como foco a participação dos componentes da MEC nos processos que contribuem para o estabelecimento do TMC, o que pode favorecer abordagens terapêuticas que visem elementos da MEC.

Mammary gland (MG) is a dynamic tissue derived from the epidermis and your development depends on the interaction between mammary cells and stroma. Extracellular matrix (ECM) is the major extracellular content of tissues responsible for supporting connective tissue and basement membrane, and serves as a reservoir for many growth factors. ECM is comprised of insoluble protein fibers as collagens, laminins, fibronectins and soluble polymers as proteoglycans, and glycosaminoglycans. The ECM components are important both during morphogenesis of MG as to maintain this fabric giving support and storage of substrates needed for the growth. ECM disorder in GM may be the progression trigger of the breast tumor. Canine mammary tumor (CMT) is a complex of malignancies that have the participation of several factors for its development, including ECM components. Therefore an investigation of ECM in the diagnosis of CMT becomes important to establish a relationship between componentes of matrix and neoplastic cells, including information on the biological behavior and clinical staging of CMT. The knowledge of ECM molecules participation in the development of CMT may further therapeutic approaches targeting elements of ECM. Thus, this review has a focus on the ECM components participation in the processes that contribute to CMT establishment, which may favor therapeutic approaches targeting elements of ECM.

Envolvimento da matriz extracelular no tumor mamário canino / Extracellular matrix involviment in canine mammary tumor

A glândula mamária (GM) é um tecido dinâmico, derivado da epiderme e o seu desenvolvimento depende da interação entre as células mamárias e o estroma. A matriz extracelular (MEC) representa o principal conteúdo extracelular, responsável pela sustentação do tecido conjuntivo, da membrana basal e serve como reservatório para muitos fatores de crescimento. MEC é constituída por fibras proteicas insolúveis, como colágenos, lamininas, fibronectinas, e polímeros solúveis, como proteoglicanos e glicosaminoglicanos. Essas moléculas que compõem a MEC são importantes, tanto durante a morfogênese da GM, como para a sua manutenção conferindo-lhe a sustentação e o armazenamento de substratos necessários para seu crescimento. A desorganização da MEC na GM pode ser um indício necessário para o início e a progressão dotumor de mama. O Tumor mamário canino (TMC) é referido como um complexo de neoplasias que tem a participação de diversos fatores para seu desenvolvimento, incluindo os componentes da MEC. Desta forma, a investigação da MEC no diagnóstico dos TMC torna-se importante, para estabelecer a correlação entre os seus componentes e as células neoplásicas, além de fornecer informações sobre o comportamento biológico e o estadiamento clínico dos TMC. O entendimento da participação dessas moléculas da MEC para o desenvolvimento do TMC pode favorecer abordagens terapêuticas mais específicas, tendo como alvo elementos da MEC. Portanto, esta revisão tem como foco a participação dos componentes da MEC nos processos que contribuem para o estabelecimento do TMC, o que pode favorecer abordagens terapêuticas que visem elementos da MEC.(AU)

Mammary gland (MG) is a dynamic tissue derived from the epidermis and your development depends on the interaction between mammary cells and stroma. Extracellular matrix (ECM) is the major extracellular content of tissues responsible for supporting connective tissue and basement membrane, and serves as a reservoir for many growth factors. ECM is comprised of insoluble protein fibers as collagens, laminins, fibronectins and soluble polymers as proteoglycans, and glycosaminoglycans. The ECM components are important both during morphogenesis of MG as to maintain this fabric giving support and storage of substrates needed for the growth. ECM disorder in GM may be the progression trigger of the breast tumor. Canine mammary tumor (CMT) is a complex of malignancies that have the participation of several factors for its development, including ECM components. Therefore an investigation of ECM in the diagnosis of CMT becomes important to establish a relationship between componentes of matrix and neoplastic cells, including information on the biological behavior and clinical staging of CMT. The knowledge of ECM molecules participation in the development of CMT may further therapeutic approaches targeting elements of ECM. Thus, this review has a focus on the ECM components participation in the processes that contribute to CMT establishment, which may favor therapeutic approaches targeting elements of ECM.(AU)

Comparative histology in the liver and spleen of three species of freshwater teleost

We describe and compare the histology of liver and spleen ofGeophagus brasiliensis (Perciformes), Hypostomus francisci (Siluriformes) and Hoplias aff. malabaricus (Characiformes), tropical freshwater fishes. InG. brasiliensisandH. aff. malabaricusthe hepatocytes were arranged in tubular form whereas in H. franciscithey cord-like. In all species, hepatocytes presented glycogen, but in G. brasiliensis and H. aff. malabaricus they showed strong stained for hemossiderin in the cytoplasm. InG. brasiliensis and H. aff. malabaricus, melanomacrophage centres (MMCs) were associated to hepatic structures and only in G. brasiliensis was observed intrahepatic exocrine pancreas. The spleen, in all species, was characterized by red and white pulp without boundary between the two regions, but only in H. francisci was recorded nodular organization in splenic parenchyma. The G. brasiliensisandH. aff. malabaricuspresented in the white pulp MMCs linked mainly to ellipsoids. Besides, we observed large MMCs in the spleen in relation to liver of G. brasiliensis and H. aff. malabaricus. In liver, highest values of reticular fibers and collagen were observed inG. brasiliensis. In spleen, highest values of reticular fibers and collagen were recorded inH. aff. malabaricusandH. francisci, respectively. Histological differences confirm the hypothesis that the phylogenetic distance is reflected in liver and spleen.(AU)

Nós descrevemos e comparamos a histologia do fígado e do baço de Geophagus brasiliensis (Perciformes), Hypostomus francisci (Siluriformes) e Hoplias aff. malabaricus (Characiformes), peixes neotropicais de água doce. Em G. brasiliensis e H. aff. malabaricus os hepatócitos organizaram-se na forma tubular enquanto que em H. francisci eles apresentaram-se como cordões celulares. Em todas as espécies, os hepatócitos apresentaram glicogênio, mas em G. brasiliensis e H. aff. malabaricus, eles mostraram forte marcação para hemossiderina no citoplasma. Em G. brasiliensis e H. aff. malabaricus, centros melanomacrofágicos (CMMs) foram associados a estruturas hepáticas e somente em G. brasiliensis foi observado pâncreas exócrino intrahepático. O baço, em todas as espécies, foi caracterizado pela polpa vermelha e branca sem limites entre as duas regiões, mas somente em H. francisci foi registrado uma organização nodular no parênquima esplênico. G. brasiliensiseH. aff. malabaricusapresentaram na polpa branca CMMs associados principalmente a elipsoides. Além disso, nós observamos CMMs grandes no baço em relação ao fígado de G. brasiliensis e de H. aff. malabaricus. No fígado, valores altos de fibras reticulares e colágeno foram observado em G. brasiliensis. No baço, valores altos de fibras reticulares e colágeno foram registrados em H. aff. malabaricuseH. francisci, respectivamente. Diferenças histológicas confirmam a hipótese que a distância filogenética está refletida no fígado e no baço.(AU)

Utilização de derme canina para a bioengenharia de tecidos

A pele apresenta inúmeras funções entre elas, barreira contra produtos químicos e radiação, proteção contra traumas, entre outras. É composta por uma camada de epitélio estratificado externo (epiderme) e uma camada fibrosa (derme). A quebra ou perda da integridade anatômica, fisiológica e funcional da pele é denominada ferida cutânea. Essas aparecem em alta incidência na rotina clínico-cirúrgico veterinária, exigindo do cirurgião além do conhecimento anatômico, o domínio das diferentes técnicas reconstrutivas disponíveis para um planejamento cirúrgico adequado. Existem inúmeras técnicas cirúrgicas reconstrutivas voltadas ao propósito de acelerar o processo cicatricial, devolvendo à pele sua integridade, reestabelecendo suas funções e minimizando complicações. O tema vem sendo objeto de estudo de muitos pesquisadores, que se concentram na criação de um material sintético semelhante à matriz extracelular (MEC) da derme, combinada com a utilização de células-tronco. A engenharia biomédica tem possibilitado elaborar novas abordagens terapêuticas, para minimizar e tratar feridas de difícil cicatrização, constituindo deste modo avanços significativos nos últimos anos. Estes melhoraram a compreensão dos processos de cicatrização de feridas e de regeneração de tecidos. O estudo em pauta visa trazer uma contribuição ao tema valendo-se da utilização da Bioengenharia de Tecidos (scaffolds biológicos), como técnica reconstrutiva alternativa, no que se refere ao tratamento de feridas complexas, com grandes perdas teciduais e superfícies articulares, favorecendo o processo cicatricial e anulando as possíveis complicações em especial a rejeição. Para tanto, amostras de derme canina foram descelularizadas por processo químico/físico e recelularizadas com células tronco mesenquimais, onde após validação das técnicas, foram utilizados como tratamento nos pacientes dos Grupos 1 e 2 respectivamente, avaliando o processo cicatricial desses grupos em relação aos pacientes do Grupo controle, feridas tratadas por segunda intenção. Os resultados do presente trabalho comprovaram as propriedades biocompatíveis e biodegradáveis do scaffold descelularizado e recelularizado caracterizada pela integração, ausência de complicações cicatriciais, de rejeição, e/ou contaminação, demostraram segurança, facilidade de aplicação da técnica de enxertia, capacidade regenerativa pela presença de tecido cicatricial maturo e organizado (histopatológico), aspecto cosmético final da ferida desejável e observou-se que os três tratamentos se diferem entre si e que tanto o tipo de tratamento quanto o tamanho da ferida, afetam o tempo de cicatrização, constituindo-se uma ferramenta inovadora e funcionalmente promissora no tratamento de feridas cutâneas em modelos caninos.

The skin has numerous functions, including a barrier against chemicals and radiation, protection against trauma, among others. It consists of a layer of external stratified epithelium (epidermis) and a fibrous layer (dermis). The breakdown or loss of the anatomical, physiological and functional integrity of the skin is called a cutaneous wound. These appear in high incidence in the veterinary clinical-surgical routine, demanding from the surgeon in addition to anatomical knowledge, the mastery of the different reconstructive techniques available for an adequate surgical planning. There are numerous reconstructive surgical techniques aimed at accelerating the healing process, restoring integrity to the skin, restoring its functions and minimizing complications. The subject has been the subject of study by many researchers, who are concentrating on creating a synthetic material similar to the extracellular matrix (ECM) of the dermis, combined with the use of stem cells. Biomedical engineering has made it possible to develop new therapeutic approaches to minimize and treat wounds that are difficult to heal, thus constituting significant advances in recent years. These improved understanding of wound healing and tissue regeneration processes. The study in question aims to bring a contribution to the theme using the Bioengineering of Tissues (biological scaffolds), as an alternative reconstructive technique, with regard to the treatment of complex wounds, with great tissue losses and joint surfaces, favoring the process healing and canceling possible complications, especially rejection. For that, samples of canine dermis were decellularized by chemical / physical process and recellularized with mesenchymal stem cells, where after validation of the techniques, they were used as treatment in patients in Groups 1 and 2 respectively, evaluating the healing process of these groups in relation to patients control group, wounds treated by second intention. The results of the present study proved the biocompatible and biodegradable properties of the decellularized and recelularized scaffold characterized by integration, absence of scar complications, rejection, and / or contamination, demonstrated safety, ease of application of the grafting technique, regenerative capacity due to the presence of tissue mature and organized healing (histopathological), final cosmetic aspect of the desirable wound and it was observed that the three treatments differ from each other and that both the type of treatment and the size of the wound affect the healing time, constituting a tool innovative and functionally promising in the treatment of skin wounds in canine models.

Caracterização histomorfométrica e quantificação do colágeno tipo I e III do carcinoma mamário canino

As neoplasias mamárias são comumente encontradas em cães. Nos carcinomas mamários o microambiente tumoral é intensamente alterado. A remodelação da matriz extracelular pode levar a uma interação entre os componentes da matriz e as células neoplásicas que influenciam na progressão, invasão e metástases. Objetivou-se caracterizar o carcinoma mamário canino com e sem metástases pulmonares. Foram selecionadas 26 amostras em blocos de parafina de cães com carcinoma mamário nos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da UFV. Foram realizadas fotomicrografias e avaliações dos cortes histológicos em hematoxilina e eosina e Picrossirius red com luz polarizada. Em todas as lâminas foram realizadas análises histopatológicas com a realização da contagem mitótica, intensidade da necrose e do infiltrado inflamatório e análises morfométricas do núcleo, proporção das células carcinomatosas, necrose, células inflamatórias e vasos sanguíneos e quantificação do colágeno tipo I e III. A contagem mitótica e a intensidade da necrose foram maiores em carcinomas mamários de grau III. Na análise dos colágenos ocorreu um predomínio do colágeno tipo I, contudo a concentração dos colágenos tipo I e tipo III não foram influenciadas pelo grau e ocorrência de metástase. Nos carcinomas em tumor misto houve maior quantidade de colágeno tipo I nas neoplasias de grau I. A mensuração dos núcleos e as proporções de células carcinomatosas, necrose, células inflamatórias e vasos sanguíneos não foram significativas em relação aos graus e os grupos. Nos carcinomas em tumor misto houve uma relação significativa entre os núcleos com diâmetros maiores e a ausência de metástases. Os resultados demonstram que há maior relação entre o grau dos carcinomas mamários com as variáveis avaliadas, independente da presença ou ausência de metástase pulmonar.

Mamary neoplasms are commonly found in dogs. In mamary carcinomas, the tumor microenvironment is intensely altered. Extracellular matrix remodeling can lead to an interaction between matrix components and neoplastic cells that influence progression, invasion and metastasis. This study goal to characterize canine mammary carcinoma with and without lung metastases. Twenty-six samples were selected in paraffin blocks from dogs with mammary carcinoma in the files of the Veterinary Pathology Laboratory at UFV. Photomicrographs and evaluations of histological sections were taken in hematoxylin and eosin and Picrossirius red with polarized light. In all slides, histopathological analyzes were performed with mitotic counts, intensity of necrosis and inflammatory infiltrate and morphometric analyzes of the nucleus, proportion of carcinomatous cells, necrosis, inflammatory cells and blood vessels and quantification of collagen type I and III. Mitotic count and necrosis intensity were higher in grade III mamary carcinomas. In the analysis of collagens, there was a predominance of type I collagen, however the concentration of type I and type III collagens were not influenced by the degree and occurrence of metastasis. In mixed tumors carcinoma, there was a greater amount of collagen type I in grade I neoplasms. The measurement of nuclei and proportions of carcinoma cells, necrosis, inflammatory cells and blood vessels were not significant in relation to grades and groups. In mixed tumors carcinoma, there was a significant relationship between nuclei with larger diameters and the absence of metastases. The results demonstrate that there is a greater relationship between the degree of mamary carcinomas and the variables evaluated, regardless of the presence or absence of pulmonary metastasis.

Recelularização da matriz extracelular de músculo de cães saudáveis e distróficos

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária de caráter progressivo causada por mutação no gene produtor da proteína distrofina, responsável por ligar o citoesqueleto da célula muscular a matriz extracelular (MEC). Além de humanos, outros animais podem apresentar distrofias musculares, podendo ser utilizados como modelos para o estudo de distrofias musculares em humanos. O modelo animal mais utilizado é o modelo de Distrofia Muscular do Golden Retriever (GRMD). Os estudos de distrofias musculares podem ser associados a diversas áreas, como a Bioengenharia de tecidos, área que visa a utilização de MEC descelularizadas (scaffolds) para reparação/substituição de órgãos e tecidos, porém estes scaffolds também podem servir como ferramenta para estudo de MEC em doenças. Portando, o objetivo deste trabalho foi a caracterização de alguns componentes da MEC distrófica, sugerir se uma MEC distrófica pode ser um possível biomaterial para medicina regenerativa e a recelularização de MEC distróficas para observação da relação célula- matriz. Para realização deste trabalho, músculos bíceps femorais distróficos e não distróficos foram descelularizados com protocolo de utilização de SDS a 1% e passaram por análises de quantificação de DNA e fluorescência por DAPI para validação da descelularização e análises histológicas (colorações), imunohistoquímica e de Microscopia Eletrônica de Varredura para avaliação da composição, ultraestrutura e preservação das MEC distróficas e não distróficas. Como resultados, obtivemos as quantificações de DNA que alcançaram quantidade inferior a 50ng de DNA por mg de tecido e na fluorescência por DAPI não foram visualizados núcleos celulares nos tecidos descelularizados. Pelas análises histológicas foi possível observar a ausência de células nos tecidos descelularizados e a preservação de fibras colágenas da MEC. Pela imunohistoquímica, não foram observadas grandes diferenças nos componentes da MEC de músculos distróficos quando comparados com músculos não distróficos. Quando observadas, as células utilizadas para recelularização dos scaffolds apresentaram maior taxa de proliferação quando em contato com o scaffold muscular e o protocolo de esterilização do scaffold foi eficiente, já que os testes para detecção de micoplasma foram negativos. Foi observado o aumento da quantidade de DNAg após a recelularização dos scaffolds e pela MEV são visíveis camadas de células sobre a matriz extracelular. Concluímos que a MEC de músculo distrófico não interfere na diferenciação e adesão celular quando comparadas às MEC de músculo não distrófico. Embora o aumento de distrofina tenha sido observado em alguns processos de recelularização, mais estudos precisam ser realizados para comprovação deste dado.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive hereditary disease caused by a mutation in the gene producing the dystrophin protein, responsible for linking the cytoskeleton of the muscle cell to the extracellular matrix (ECM). In addition to humans, other animals may have muscular dystrophies and can be used as models for the study of muscular dystrophies in humans. The most used animal model is the Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) model. Muscular dystrophy studies can be associated with several areas, such as tissue bioengineering, an area that aims to use decellularized ECM (scaffolds) for repairing / replacing organs and tissues, but these scaffolds can also serve as a tool for studying the ECM in diseases. Therefore, the objective of this work was to characterize some components of the dystrophic ECM, to suggest whether a dystrophic ECM may be a possible biomaterial for regenerative medicine and the recellularization of dystrophic ECM to observe the cell-matrix relationship. To perform this work, dystrophic and non-dystrophic femoral biceps muscles were decellularized using a 1% SDS protocol and underwent DNA quantification and fluorescence analyzes by DAPI to validate decellularization and histological (staining), immunohistochemistry and Scanning Electron microscopy analyzes to evaluate the composition, ultrastructure and preservation of dystrophic and non-dystrophic ECM. As a result, we obtained the DNA quantifications that reached a quantity of less than 50ng of DNA per mg of tissue and in the fluorescence by DAPI, cell nuclei were not seen in the decellularized tissues. Through histological analyzes it was possible to observe the absence of cells in the decellularized tissues and the preservation of collagen fibers of the ECM. Due to immunohistochemistry, no major differences were observed in the ECM components of dystrophic muscles when compared with non-dystrophic muscles. When observed, the cells used to recellularize the scaffolds showed a higher proliferation rate when in contact with the muscle scaffold and the scaffold sterilization protocol was efficient, since the tests for mycoplasma detection were negative. An increase in the amount of DNAg was observed after the scaffolds were recellularized and by SEM, layers of cells are visible on the extracellular matrix. We conclude that the ECM of dystrophic muscle does not interfere with cell differentiation and adhesion when compared to the ECM of non-dystrophic muscle. Although the increase in dystrophin has been observed in some recellularization processes, more studies need to be carried out to prove this data.

Descelularização de coração suíno: caracterização e quantificação estereológica da matriz extracelular do ventrículo esquerdo

As doenças cardiovasculares são responsáveis pela maior causa de mortes do mundo todo, e em casos como infarto agudo do miocárdio, o tratamento padrão ouro é o transplante do órgão. O número de doadores cresceu no país nos últimos anos, ainda não consegue suprir a demanda. Neste contexto, a medicina regenerativa vem ganhando espaço, mais precisamente na produção de órgãos e tecidos a partir da técnica de descelularização, onde todas as células e fatores imunogênicos são retirados, mantendo apenas a arquitetura tridimensional, formada a partir de matriz extracelular (MEC). A MEC é um microambiente composto principalmente por proteínas estruturais, como por exemplo colágeno e elastina, proteínas de adesão e também os glicosaminoglicanos (GAGs), responsáveis pela substância amorfa. Ela não é responsável apenas pela arquitetura do tecido, mas também é responsável por todo suporte de comunicação, sinalização e estruturação. Embora inúmeros trabalhos venham estudando os componentes da MEC, faz-se necessário quantifica-los para melhor compreensão e sua aplicação. A MEC cardíaca é composta, na sua maioria por colágeno e elastina, elementos que fornecem estrutura mecânica do órgão. Neste trabalho objetivou-se caracterizar corações suínos descelularizados como um scaffold e quantificar estereologicamente, por meio de colorações específicas, como o colágeno e glicosaminoglicano totais, além de avaliar a complacência do órgão. A descelularização foi testada com formas de canulação diferentes, adotando a canulação pela artéria aorta, realizada a perfusão retrógrada em 25 dias, com sódio dodecil sulfato (SDS) a 1%, focando na maior retenção possível da estrutura da MEC. Em relação à sua composição, os corações descelularizados não apresentaram diferenças significativas quanto à complacência e ao valor de colágeno total, enquanto houve a diminuição dos GAGs; Essa diminuição nos corações decelularizados pode ser justificada pelo uso do SDS, já que são moléculas que possuem características higroscópica. Esses resultados reforçam a ideia de que o nosso protocolo de descelularização foi eficiente em relação à retenção das proteínas da MEC.

Cardiovascular diseases are responsible for the biggest cause of death worldwide, and in cases such as acute myocardial infarction, the gold standard treatment is organ transplantation. The number of donors has grown in the country in recent years, still unable to meet the demand. In this context, regenerative medicine has been gaining space, more precisely in the production of organs and tissues using the decellularization technique, where all cells and immunogenic factors are removed, maintaining only the three-dimensional architecture, formed from extracellular matrix (ECM). MEC is a microenvironment mainly composed of structural proteins, such as collagen and elastin, adhesion proteins and also glycosaminoglycans (GAGs), responsible for the amorphous substance. She is not only responsible for the architecture of the tissue, but is also responsible for all communication, signage and structuring support. Although numerous studies have been studying the components of MEC, it is necessary to quantify them for better understanding and their application. Cardiac ECM is mostly composed of collagen and elastin, elements that provide the organ's mechanical structure. This work aimed to characterize decellularized pig hearts as a scaffold and to quantify stereologically, through specific stains, such as total collagen and glycosaminoglycan, in addition to assessing the organ's compliance. Decellularization was tested with different forms of cannulation, adopting cannulation through the aortic artery, performed a retrograde perfusion in 25 days, with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), focusing on the greatest possible retention of the ECM structure. Regarding their composition, decellularized hearts did not show significant differences regarding compliance and total collagen value, while there was a decrease in GAGs; This decrease in decellularized hearts can be justified by the use of SDS, since they are molecules that have hygroscopic characteristics. These results reinforce the idea that our decellularization protocol was efficient in relation to the retention of MEC proteins.

Avaliação da composição da matriz extracelular do músculo estriado esquelético de cães com distrofia muscular comparados com cães não distróficos SÃO PAULO 2020

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença que causa degeneração progressiva dos músculos estriados esqueléticos e cardíacos, causada pela perda da função do gene da distrofina, devido a uma mutação genética. É caracterizada por uma perda progressiva da função muscular. Músculos com deficiência de distrofina são vulneráveis à danos induzidos pela contração, o que leva a ciclos repetidos de necrose e regeneração, resultando em falha de regeneração, aumento da fibrose e perda progressiva da função muscular. Dentro do músculo esquelético, a matriz extracelular é duplamente importante para fornecer um suporte celular e transmitir forças contráteis musculares. No entanto, o acúmulo patológico de certos componentes na matriz extracelular muscular, que ocorre na fibrose especificamente, prejudica a função celular normal e a transmissão de força, bem como inibe o reparo e a regeneração, compondo desse modo o defeito celular primário. A DMD vem recebendo atenção especial das comunidades médicas por ser uma doença comum em homens (devido à mutação que ocorre no cromossomo X), além de ser um distúrbio grave e atualmente uma doença sem cura. Devido à necessidade de se descobrir o real impacto da DMD na estrutura molecular dos músculos estriados esqueléticos e cardíacos a partir dos componentes proteicos da matriz extracelular dos músculos , avaliamos o grau de alterações de distrofia muscular de cães usados como modelo da DMD comparados com cães não distróficos. Assim, utilizando modelos caninos com distrofia muscular, devido à proximidade de sinais fenotípicos humanos, a saber, atrofia muscular, perda de massa corporal, fadiga muscular e comprometimento cardíaco, buscamos verificar a influência da distrofia muscular na estrutura proteica do músculo estriado esquelético. A partir de amostras de músculos descelularizados de cães distróficos e não distróficos, realizamos análises histológicas e imunohistoquímicas visando avaliar alteração nos componentes da matriz extracelular em cães com deficiência de distrofina. Obtivemos uma satisfatória descelularização, com ausência de núcleos celulares na matriz, e também constatamos que houve alterações na estrutura da matriz extracelular, a saber, preservação de colágeno e proteínas adesivas como fibronectina e laminina, bem como uma diminuição dos glicosaminoglicanos após o processo de descelularização.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a disease that causes progressive degeneration of the skeletal and cardiac striated muscles, caused by the loss of dystrophin gene function due to a genetic mutation. It is characterized by a progressive loss of muscle function. Muscles with dystrophin deficiency are vulnerable to contraction-induced damage, which leads to repeated cycles of necrosis and regeneration, resulting in failed regeneration, increased fibrosis, and progressive loss of muscle function. Within the skeletal muscle, the extracellular matrix is doubly important for providing cellular support and transmitting contractile muscle forces. However, the pathological accumulation of certain components in the extracellular muscle matrix, which occurs in fibrosis specifically, normal cell function and force transmission impairs, as well as inhibits repair and regeneration, thus composing the primary cell defect. DMD has been receiving special attention from medical communities because it is a common disease in men (due to the mutation that occurs in the X chromosome), as well as being a serious disorder and currently a disease without cure. Due to the need to discover the real impact of DMD on the molecular structure of the skeletal and cardiac striated muscles - from the protein components of the extracellular muscle matrix -, I evaluated the degree of muscular dystrophy changes in dogs used as a model of DMD compared with non-dystrophic dogs. Thus, using canine models with muscular dystrophy, due to the proximity of human phenotypic signs, namely, muscle atrophy, loss of body mass, muscle fatigue and cardiac involvement, I sought to verify the influence of muscular dystrophy on the protein structure of skeletal striated muscle. From samples of decellularized muscles of dystrophic and non-dystrophic dogs, we performed histological and immunohistochemical analyzes to evaluate changes in extracellular matrix components in dogs with dystrophin deficiency.We obtained satisfactory decellularization, with absence of cell nuclei in the matrix, and we also found that there were changes in the structure of the extracellular matrix, namely, preservation of collagen and adhesive proteins such as fibronectin and laminin, well as a decrease in glycosaminoglycans after the process of decellularization.

ORGANIZAÇÃO SUPRAMOLECULAR DE FIBRILAS COLÁGENAS ESTROMAIS EM CÓRNEAS DE FALCONIFORMES E STRIGIFORMES

Pereira, Amanda Garcia. Organização supramolecular de fibrilas c5lágenas no estroma corneal de Falconiformes e Strigiformes. 2020. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) Universidade de Franca, Franca - SP. Falconiformes e Strigiformes são aves de rapina que exercem atividades em períodos diurno e noturno, respectivamente. Seus olhos diferem quanto às habilidades de resolução de detalhes de objetos dos campos visuais monocular e binocular. Tais diferenças têm sido associadas à muitos fatores, dentre eles variações na configuração dos componentes do sistema óptico. A córnea é o elemento do sistema óptico que está em contato direto com o meio externo e suas funções refrativas surgem da organização supramolecular do colágeno fibrilar tipo I que compõe o estroma. A hipótese desse estudo é que existem diferenças supraorganizacionais entre fibrilas colágenas estromais das córneas de Falconiformes e Strigiformes. Para testar a hipótese, 22 córneas excisadas de Falconiformes das espécies Caracara plancus, Rupornis magnirostris e Falco sparverius e 28 provenientes de Strigiformes das espécies Tyto furcata, Pseudoscops clamator e Athene cunicularia foram processadas histotecnicamente para cortes de 8 m de espessura. Valores de retardo óptico associados às birrefringências total, de forma e intrínseca foram mensurados empregando-se microscópio de luz polarizada equipado com compensadores de fase. Coeficientes de coerência, ou seja, orientação de fibrilas colágenas, foram calculados por vídeo-análise de imagens. Todas as avaliações foram conduzidas tanto no estroma anterior quanto no posterior da córnea. Os dados foram analisados por métodos estatísticos uni- e multivariados. Diferenças foram significativas quando p < 0,05. Os resultados confirmaram a hipótese do estudo. Diferenças entre Falconiformes e Strigiformes foram encontradas no estroma anterior. Os retardos ópticos associados às birrefringências total e de forma foram maiores para Falconiformes (p < 0,0001). Em contrapartida, os coeficientes de coerência foram maiores para Strigiformes (p = 0,0168). A estatística multivariada mostrou que a dissimilaridade final entre córneas de Falconiformes e Strigiformes, em termos de supraorganização de fibrilas colágenas estromais, foi de 4,56%. É possível que as diferenças supraorganizacionais reportadas neste estudo sejam fontes de variação da qualidade visual de Falconiformes e Strigiformes. Assim, os resultados desta pesquisa pioneira fornecem as evidências necessárias para motivar novos estudos relacionando o poder de resolução e a performance refrativa do sistema óptico com as características supramoleculares do colágeno estromal da córnea.

Pereira, Amanda Garcia. Supramolecular organization of collagen fibrils in the corneal stroma of Falconiformes and Strigiformes. 2020. Dissertation (Master in Animal Science) - University of Franca, Franca - SP. Falconiformes and Strigiformes are raptors that perform activities during the day and night, respectively. Their eyes differ in their ability to resolve details of objects in the monocular and binocular visual fields. Such differences have been associated with many factors, including variations in the configuration of the components of the optical system. The cornea is the element of the optical system that is in direct contact with the external environment and its refractive functions arise from the supramolecular organization of the type I fibrillar collagen that makes up the stroma. The hypothesis of this study is that there are supraorganizational differences between stromal collagen fibrils in the corneas of Falconiformes and Strigiformes. To test the hypothesis, 22 corneas excised from Falconiformes of the species Caracara plancus, Rupornis magnirostris, and Falco sparverius and 28 from Strigiformes of the species Tyto furcata, Pseudoscops clamator, and Athene cunicularia were processed histotechnically for sections of 8 m in thickness. Optical retardation values associated with total, form, and intrinsic birefringences were measured using a polarized light microscope equipped with phase compensators. Coherence coefficients (orientation) of collagen fibrils were calculated by video image analysis. All assessments were conducted both in the anterior and posterior stroma of the cornea. The data were analyzed using uni- and multivariate statistical methods. Differences were significant when p < 0.05. The results confirmed the study's hypothesis. Differences between Falconiformes and Strigiformes were found in the anterior stroma. The optical retardations associated with total and form birefringences were higher for Falconiformes (p < 0.0001). In contrast, the coherence coefficients were higher for Strigiformes (p = 0.0168). Multivariate statistics showed that the final dissimilarity between Falconiform and Strigiform corneas, in terms of supraorganization of stromal collagen fibrils, was 4.56%. It is possible that the supraorganizational differences reported in this study are sources of variation of the visual quality of Falconiformes and Strigiformes. Thus, the results of this pioneering research provide the necessary evidence to motivate new studies relating the power resolution and the refractive performance of the optical system with the supramolecular characteristics of the corneal stromal collagen.

Recelularização de derme de rato Wistar São Paulo 2019

As lesões de pele são normais à todas as espécies,independentemente de sexo ou idade. A pele, por ser o maior órgão do corpo eservir de barreira primária às agressões químicas, físicas e biológicas do meio,é a primeira a sofrer lesões e as consequências das mesmas. Em animais estas lesões podem ser devido àbrigas, caças e/ou predações e, também, assim como em humanos se temuma causa muito comum de lesões dérmicas que são queimaduras ecarcinomas. Tendo em vista novas técnicas da bioengenharia tecidual, para arecomposição dessas lesões, estudos com resultados significativamente têm se mostradopromissores de formulações de scaffolds biológicos acelulares a partir dadescelularização de tecidos. A descelularização tem sua comprovação por uma variada gama de testes como microscopia eletrônica de varredura e testes de DNA genômico residual. Posteriormente o tecido pode passar pelo processo de recelularização utilizando células deinteresse, até mesmo do animal que irá receber este tecido,diminuindo os riscos de rejeição e melhorando a resposta ao transplantetecidual. Assim, este projeto visou a descelularização do tecido com a utilização de meios químicos e físicos seguida da esterilização e o estabelecimento de um protocolo de recelularização de um scaffold biológico descelularizado oriundo de derme derato Wistar utilizando nos testes fibroblastos murinos e células tronco mesenquimais oriundas de tecido adiposo canino durante 7 dias. Após testes de eficácia a recelularização do tecido foi comprovada por ensaiosde Imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura onde pode-se observar a aderência das células no scaffold biológico.

Skin lesions are normal to all species, regardless of gender or age. The skin, being the largest organ of the body and serving as a primary barrier to the chemical, physical and biological aggressions of the environment, is the first to suffer injuries and the consequences thereof. In animals these lesions may be due to fights, fights and / or predations, and also, as in humans, there is a very common cause of dermal lesions that are burns and carcinomas. In view of new techniques of tissue bioengineering, for the recomposition of these lesions, studies with results have been shown to be promising for formulations of acellular biological scaffolds from tissue decellularization. The decellularization has its proof by a varied range of tests such as scanning electron microscopy and residual genomic DNA tests. Subsequently the tissue can go through the process of recellularization using cells of interest, even the animal that will receive this tissue, reducing the risks of rejection and improving the response to tissue transplantation. Thus, this project aimed at the decellularization of the tissue with the use of chemical and physical means followed by sterilization and the establishment of a protocol for the recellularization of a decellularized scaffold from the Wistar rat dermis using murine fibroblasts and mesenchymal stem cells from canine adipose tissue for 7 days. After efficacy tests, the tissue recrystallization was confirmed by immunofluorescence assays and scanning electron microscopy where the adherence of the cells in the biological scaffold can be observed. Keywords: skin; scaffold; recellularization; decellularization; extracellular matrix

EFEITOS DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES MMP-2 E MMP-9 NO LÍQUIDO SINOVIAL DE EQUINOS COM SINOVITE INDUZIDA

O sistema musculoesquelético dos equinos sofre sobrecarga constante, o que aumenta sua predisposição a lesões e em especial o desenvolvimento de doenças articulares. Os tratamentos convencionais com anti-inflamatórios possuem efeitos passageiros e sintomáticos, além de efeitos adversos indesejados. Terapias celulares, como o Plasma Rico em Plaquetas (PRP), estão sendo estudadas e buscam a modulação dos fatores de degradação e regeneração da matriz extracelular (MEC). Um expressivo fator de degradação são as metaloproteinases (MMPs). As MMP-2 (Metaloproteinases de Matriz tipo 2) e MMP-9(Metaloproteinases de Matriztipo 9) são as mais expressivas no líquido sinovial (LS) de equinos. Portanto o objetivo dessa dissertação é revisar os elementos envolvidos nas artropatias, e investigar o efeito intra-articular do PRP nos níveis de MMP-2 e MMP-9 em equinos. Para esta pesquisa foram utilizados 12 equinos hígidos, divididos em Grupo Controle (GC) e Grupo Tratamento (GT). Foram realizadas induções de sinovite em todos os equinos com a aplicação delipopolissacarídeo (LPS) na articulação radiocárpica esquerda. O GT foi tratado com aplicação intra-sinovialde PRP preparado por dupla centrifugação. Utilizando a técnica de ELISA realizou-se análise do nível de MMP-2 e MMP-9 no líquido sinovial. Foram determinados também a densidade, pH, glicose, proteína, hemácias e contagem total e diferencial decélulas nucleadas. Essas análises foram realizadas antes e após a indução da sinovite, e seis, 24 e 48 horas após o tratamento com PRP. Quanto aos níveis de metaloproteinases, não houve diferença entre os grupos (p>0,05), assim como para a avaliação de glicose, hemácias e células nucleadas. Contudo, densidade, pH e proteínas foram diferentes na comparação entre os dois grupos, no tempo de seis horas após o tratamento com PRP (p=0,0057; p=0,0233; p=0,0152; respectivamente). No modelo experimental de sinovite induzida em equinos, o PRP influenciou os níveis de MMP-2, ainda que estatisticamente não tenha sido observado. Porém, o PRP não influênciou os níveis de MMP-9. Além disso, ele foi capaz de causar alterações nos aspectos físico-químicos e citológicos do LS.

The equine musculoskeletal system suffers contant overload, what increases its predispositon to injuries, particularly the development of joint diseases. Conventional anti-inflammatory treatments have both temporary and symptomatic effects, as well as unwanted side effects. Platelet Rich Plasma (PRP) has been studied as a regenerative cellular therapy for joint diseases as it aims the modulation of extracellular matrix degradation and regeneration (MEC) factors. Important degradation factors are the metalloproteinases (MMPs), especially MMP-2 (Matrix metalloproteinases type 2) and MMP-9 (Matrix metalloproteinases type 9) in equines. Therefore the aim of this dissertation is to review the elements involved in the arthropathies, and investigate the intra-articular effects of PRP on the MMP-2 and MMP-9expression. Twelve healthy horses were divided into groups: Control and Treatment (CG and GT). Induction of synovitis was performed in all horses by means of lipopolysaccharide (LPS) injection into the left radiocarpal joint. GT was treated with a single intrasinovial PRP injection. PRP was obtained by double centrifugation method. The expression of MMP-2 and MMP-9 in the synovial fluid was determined by ELISA test. Density, pH, glucose, protein, red blood cells and nucleated cells were also determined. These analysis were done prior to and after induction of synovitis and six, 24 and 48 hours after PRP injection. Regarding MMPs expression, there was no difference between groups (p> 0.05), as well as in the evaluation of glucose, red blood cells and nucleated cells. However, density, pH and proteins were different in the comparison between the two groups at six hours post PRP treatment (p = 0.0057; p = 0.0233; p = 0.0152, respectively). In the experimental model of induced synovitis in horses, PRP influenced MMP-2 levels, although it was not statistically observed. However, PRP is not influenced by MMP-9 levels. In addition, he was able to make use of pressure in the physical-chemical and cytological tissues of the LS.

Isolamento e caracterização de Fibroblastos Associados ao Câncer provenientes de Mastocitomas caninos e sua influência sobre a malignidade de células neoplásicas: uma abordagem molecular, patológica e in vitro

Os mastocitomas cutâneos (MCTs) são neoplasias comuns em cães e são considerados potencialmente malignos. Diversas pesquisas tentaram identificar biomarcadores para melhor predizer o comportamento biológico deste tumor. Além disso, estudos envolvendo o cultivo primário de MCTs caninos podem ser uma ferramenta valiosa para a análise das propriedades funcionais das células. O objetivo deste estudo foi identificar vias moleculares ligadas a características de malignidade histopatológicas, menor tempo de sobrevida e pior prognóstico associados ao MCT. Além disso, objetivamos investigar o comportamento de mastócitos in vitro obtidos a partir de MCTs de diferentes graus histopatológicos e determinar o tipo de interação com os fibroblastos estromais. Realizamos análises de expressão gênica em MCTs únicos obtidos de 15 cães e identificamos dois subtipos distintos de tumor alto risco e baixo risco - associados a diferenças nos graus histológicos, tempos de sobrevida, índices Ki67 e ocorrência de morte devido a doença. Análises comparativas de perfis de sequência de RNA revelaram 71 genes diferencialmente expressos entre MCTs de alto e baixo risco. Ademais, examinamos redes de co-expressão gênica para explorar as funções biológicas dos genes identificados. A construção da rede revelou 63 módulos gênicos, dos quais 4 foram significativamente associados ao grupo mais agressivo. Dois dos módulos gênicos positivamente correlacionados com MCTs de alto risco também foram associados à proliferação celular e à matriz extracelular. No topo do módulo de matriz extracelular, foram identificados genes com funções diretamente relacionadas àqueles de fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Análises imuno-histoquímicas também revelaram um maior número de CAFs em MCTs de alto risco. Os experimentos de cultivo foram feitos imediatamente após a ressecção cirúrgica e as células foram cultivadas em DMEM-F12 completo por 4 a 7 passagens. Os mastócitos foram evidenciados por coloração com Romanowsky e azul de toluidina com perda progressiva de seus grânulos em cultivo. A confirmação de fibroblastos como células aderentes foi feita por qRT-PCR para o gene da Proteína Específica de Fibroblastos 1 (FSP1). A caracterização dos fibroblastos cultivados como miofibroblastos foi realizada por imunofluorescência para -actina de músculo liso (SMA) e vimentina. A percentagem de células viáveis no sobrenadante foi determinada a cada passagem. Durante as 4-10 semanas de cultivo sem adição de fatores de crescimento ou citocinas, a população de mastócitos vivos diminuiu progressivamente e os fibroblastos e miofibroblastos continuam a crescer até a senescência. Amostras de MCTs de alto grau foram viáveis por períodos mais curtos (P =0.0442) e menor número de passagens (P <0.0001). Examinamos também os efeitos a curto prazo dos fibroblastos estromais na viabilidade dos mastócitos neoplásicos em diferentes condições de culturas. O contato célula-célula foi a melhor condição em que maior proporção de mastócitos neoplásicos permaneceu viável em comparação com todas as outras condições, isto é, utilizando-se de inserto e no cultivo de mastócitos isolados (P<0.05). Verificamos também que os mastócitos neoplásicos não ficam viáveis por mais de 4 dias na ausência de fibroblastos ou de seus fatores solúveis. Estes resultados indicam uma importante interação entre os mastócitos e os fibroblastos, que podem ocorrer no microambiente tumoral.

Mast cell tumours (MCTs) are common neoplasms in dogs and are considered potentially malignant. Several researches have attempted to identify biomarkers to better predict biological behavior for this tumor. In addition, studies with primary culture of canine MCTs coud be a valuable tool for the analysis of the cells functional properties. The objetive of this study was to identify molecular pathways connected to histopathological malignancies, shorter survival time and poor prognoses associated with MCTs. Moreover, we aimed to investigate the in vitro behavior of mast cells obtained from canine cutaneous MCTs of different histopathological grades and the type of interaction with the stromal fibroblasts. We performed genome-wide gene expression analyses on tissues obtained from 15 dogs with single MCTs, and identified two distinct tumour subtypes - high-risk and low-risk - associated with differences in histological grades, survival times, Ki67 indices, and occurrence of death due the disease. Comparative analyses of RNA sequence profiles revealed 71 genes that were differentially expressed between high and low-risk MCTs. In addition to these analyses, we examined gene co-expression networks to explore the biological functions of the identified genes. The network construction revealed 63 gene modules, 4 of which were significantly associated with the more aggressive tumour group. Two of the gene modules positively correlated with high-risk MCTs were also associated with cell proliferation and extracellular matrix-related terms. At the top of the extracellular matrix module category, genes with functions directly related to those of cancer-associated fibroblasts (CAFs) were identified. Immunohistochemical analyses also revealed a greater number of CAFs in high-risk MCTs. Culture experiments were made immediately after surgical resection and cells were cultured in complete DMEM-F12 for 4 to 7 passages. Mast cells was stained with Romanowsky and toluidine blue and showed progressive loss of their granules in culture. The presence of fibroblasts as adherent cells was confirmed by use of qRT-PCR for Fibroblast-specific Protein 1 (FSP1) gene. The characterization of cultured fibroblasts as myofibroblasts was performed by immunofluorescence for -smooth muscle-actin (SMA) and vimentin. The percentage of viable cells in the supernatant was determined in each passage. During 410 weeks of culture without any addition of growth factors or cytokines, living mast cell population decreased progressively and adherent fibroblasts and myofibroblasts continue to grow until senescence. High-grade MCTs samples were viable for shorter periods in culture (P=0.0442) and lower number of passages (P<0.0001). We also have examined the short-term effects of stroma fibroblasts on neoplastic mast cells in different cultures conditions. The cell-cell contact co-culture was the best condition in which canine neoplastic mast cells remained viable in highest proportion during the experiment compared to all other conditions, i.e. with the transwell condition and mast cells isolated cultures (P<0.05). We also found that isolated neoplastic mast cells are not viable for more than 4 days in the absence of fibroblasts or their soluble factors. These results indicate an important interaction between mast cells and fibroblasts, which may also occur in the tumor microenvirnomental setting.

Placenta bovina de clones descelularizada como fonte de scaffolds biológicos

A bioengenharia de tecidos visa o desenvolvimento de órgãos, ou partes deles, para que diretamente ou indiretamente atue na cura de doenças agudas e/ou crônicas. Sua finalidade não é apenas substituir, mas também recuperar a funcionalidade perdida, fornecendo elementos necessários para a reparação ou estimulando a capacidade de regeneração intrínseca do organismo, resultando numa possível redução de filas de transplantes. A utilização de órgãos ou fragmentos descelularizados scaffolds como fonte de biomateriais vem crescendo amplamente, entretanto a escassez de órgãos humanos para tal processo ainda é um grande desafio. Trabalhos recentes têm estudado a utilização de scaffolds originados de órgãos de diferentes espécies visando sua implantação, além da utilização de scaffolds xenólogos. Neste contexto, os scaffolds biológicos de origem animal, como a placenta de bovinos descelularizada, seriam promissores para esse uso, visto suas características vasculares, composição e fácil obtenção. O presente trabalho tem como objetivo desenvolver um scaffold biológico de origem placentária bovina de animais clonados, comparando tanto a origem placentária como a idade gestacional. As amostras das placentas bovinas de animais clonados foram obtidas por remoção cirúrgica no centro de reprodução assistida In Vitro Brasil e as placentas controle em frigoríficos e abatedouros conveniados. Tanto as amostras de transferência nuclear de células somáticas (TNCS) como as amostras controles foram submetidas a análises histológica, microscopia eletrônica por varredura, quantificação estereológica e quantificação de DNA. Os resultados obtidos com o processo descelularização, confirmaram a eficácia do protocolo e a preservação da matriz extracelular e vasos sanguíneo. Tanto as placentas bovinas de animais clonados, como as placentas bovinas de animais não clonados descelularizada, demonstra-se uma fonte viável na elaboração de scaffolds biológicos independentemente da idade e fonte gestacional.

The tissue bioengineering aimed to develop organs, or parts of them, that directly or indirectly act on the healing of acute and/or chronic diseases. Its purpose is not only to replace but also to recover lost functionality by providing the necessary elements for repairing or by stimulating the body's intrinsic regeneration capacity, resulting in a possible reduction of transplanting lists. The use of decellularized organs or fragments (scaffolds) as a source of biomaterials has been growing widely, but the scarcity of human organs for this process is still a great challenge. Recent works have studied the use of scaffolds originating from organs of different species aiming their implantation, besides the use of xenologous scaffolds. In this context, biological scaffolds from animal origin, such as the decellularized bovine placenta, could be promisor due to vascular characteristics, composition and availability. The present work aims to develop a biological scaffold from bovine placenta of cloned animals, comparing both placental origin and gestational age. The bovine placenta samples from cloned animals were obtained by surgical removal at the assisted reproduction center "In Vitro Brasil" and the control placenta samples were from slaughterhouses. Both the TNCS and the control samples were submitted to histological analysis, scanning electron microscopy, stereological quantification and DNA quantification. Partial results obtained with the decellularization process confirmed the protocol efficacy and the preservation of the extracellular matrix and blood vessels. Differences between ages and gestational sources are still in progressing analysis. Therefore, the decellularized bovine placenta demonstrates a viable source in the elaboration of biological scaffolds regardless of age and gestational source.

EFEITOS DAS CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS E DO DANTROLENE NA DISSINERGIA DETRUSOR-ESFÍNCTER DE RATOS SUBMETIDOS AO TRAUMA ESPINHAL AGUDO

Os distúrbios da micção, como a dissinergia detrusor-esfíncter, são as principais sequelas do trauma espinhal agudo nos segmentos espinhais suprassacrais. Por isso, estudos vêm sendo realizados com foco na compreensão da resposta da vesícula urinária frente à lesão causada pela dissinergia detrusor-esfíncter e no desenvolvimento de terapias eficientes. Sendo assim, o presente estudo objetivou avaliar a histomorfologia da vesícula urinária de ratos submetidos ao modelo de dissinergia detrusor-esfíncter e tratados com células-tronco mesenquimais e/ou dantrolene, bem como quantificar a musculatura lisa detrusora, as fibras elásticas e colágenas tipo I e III e monitorar a migração das células-tronco mesenquimais, após 30 dias da indução do trauma espinhal. As vesículas urinárias foram coletadas de ratos que haviam sido divididos em: grupo controle GN (n=5), grupo trauma GT (n=5), grupo dantrolene GDAN (n=5), grupo células-tronco mesenquimais GCM (n=5) e grupo associação GCMD (n=5). As vesículas urinárias foram coradas pelas técnicas hematoxilina e eosina, Weigert Van-Gieson e Picrosirius Red. Também foi realizada imunoistoquímica para monitorar a migração das células-tronco mesenquimais, modificadas geneticamente para expressão da proteína verde fluorescente, até a vesícula urinária. As células-tronco mesenquimais, mas não o dantrolene ou a associação, preservam a quantidade de fibras elásticas, colágenas tipo I e tipo III nas vesículas urinárias de ratos Wistar aos 30 dias após o trauma. Além disso, as células-tronco mesenquimais migram para a vesícula urinária após lesões consequentes da dissinergia detrusor-esfíncter induzida pelo trauma espinhal agudo experimental suprassacral em ratos Wistar.

Urinary disorders such as detrusor-sphincter dyssynergia are the main sequelae of acute spinal cord injury cranial to the sacral spinal segments. Therefore, studies have been performed with a focus on understanding the responses of the urinary bladder injured due to detrusor-sphincter dyssynergia and in the development of efficient therapies. Thus, the present study aimed to evaluate the urinary bladder histomorphology from rats submitted to a detrusor-sphincter dyssynergia model and treated with dantrolene and mesenchymal stem cells, as well as to quantify smooth muscle, elastic fibers and type I and III collagens after 30 days of spinal cord injury induction. The urinary bladders were collected from rats that were divided into: control group GN (n=5), trauma group GT (n=5), dantrolene group GDAN (n=5), mesenchymal stem cell group GCM (n=5) and association group GCMD (n=5). The urinary bladder samples were stained with hematoxylin and eosin, Weigert-Van Gieson and Picrosirius Red. Immunohistochemistry genetically modified mesechymal stem cells for expression of green fluorescent protein to the injured bladder. The mesenchymal stem cells, but not dantrolene or association, maintain the amount of elastic fibers and type I and III collagen fibers to the urinary bladder of Wistar rats 30 days after trauma. Besides that the mesenchymal stem cells migrates to the urinary bladder after suprassacral spinal cord injury in Wistar rats. was performed to monitor the migration of lesions consequent of detrusor-sphincter dyssynergia induced by experimental

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

Os objetivos da presente tese foram: 1) Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia, crescimento folicular, viabilidade, maturação oocitaria, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados e cultivados por 18 dias (Fase I); 2) Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional na ausência (folículos primordiais isolados inclusos em Alginato - 0,8%) ou na presença de tecido ovariano (Fase II); 3) Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 7 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos babuínos (Fase III) inclusos em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou polyethyleneglycol-vinyl sulfone (PEG-VS) - 5%); 4) Investigar o efeito de diferentes concentrações de Cilostamida (10 e 20 M) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante a MIV de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV). Na Fase I, os ovários caprinos foram transportados individualmente em MEM-HEPES a 4 ou 33 °C. Posteriormente, os folículos foram cultivados in vitro por 18 dias e os complexos cumulus-oócito (CCO) maturados por 32 horas. Na Fase II, os folículos primordiais caprinos inclusos em Alginato (10 folículos/gota), ou envoltos em tecido ovariano (in situ) encapsulado ou não em Alginato, foram cultivados por 7 dias. Na Fase III, os folículos babuínos previamente criopreservados foram cultivados por 10 dias incluso em tecido ovariano (in situ), na presença ou ausência de matrizes extracelulares (PEG-VS vs Alginato) e de FSH. Por fim, na Fase IV, CCOs caprinos e bovinos foram cultivados por 30 horas, iniciando com a adição da Cilostamida (10 ou 20 M) e/ou parede folicular por 6 ou 12 horas durante a pré-maturação in vitro (PMIV) antes da MIV (24 ou 18h). O melhor resultado para produção de oócitos totalmente crescidos e retomada meiótica foi obtido utilizando baixa (4 °C) para folículos pré-antrais e alta (33 °C) para folículos antrais iniciais (Fase I). Folículos primordiais caprinos isolados e encapsulados em Alginato apresentaram maiores percentuais de ativação folicular quando comparado aos demais tratamentos (Fase II). Na Fase III, a adição de FSH ao meio de cultivo no tratamento com matrizes (PEG-VS e Alginato) promoveu uma melhora na sobrevivência dos folículos pré-antrais babuínos inclusos em tecido ovariano após 10 dias cultivo in vitro. Na Fase IV, a combinação da concentração/tempo de exposição à Cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas na espécie bovina após 6 e 12 horas de cultivo. Como conclusão, a temperatura de transporte afetou diferencialmente o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais caprinos (Fase I); cultivo de folículos primordiais caprinos isolados e inclusos em Alginato permitiu uma melhor taxa de ativação folicular (Fase II). Em babuínos, utilização de matrizes extracelulares na presença de FSH melhorou a sobrevivência folicular após 10 dias de cultivo in vitro (Fase III). Por fim, na Fase IV, a Cilostamida retardou de forma concentração dependente a retomada da meiose somente na espécie bovina.

The objectives of this thesis were: 1) To determine the effect of transport temperature (4 vs 33ºC) on morphology, follicular growth, viability and oocyte maturation, and production of reactive oxygen species (ROS) of preantral and early antral follicles goats for 18 days in vitro culture (Phase I); 2) to evaluate follicular survival and activation rates after 7 days of in vitro culture in a three-dimensional system in the absence (isolated primordial follicles and included in Alginate - 0.8%) or in the presence of ovarian tissue (Phase II); 3) To investigate the survival, activation and follicular growth after 7 days of in vitro culture of ovarian fragments of baboons (Phase III) included in different matrices (Alginate - 1% or poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG) - 5%); 4) Investigate the effect of different concentrations of Cilostamida (10 and 20 M) and exposure times (6 and 12 hours) during IVF of bovine and goat oocytes (Phase IV). In Phase I, goat ovaries were individually transported in MEM-HEPES at 4 or 33 ° C. Subsequently, the follicles were cultured in vitro for 18 days and cumulus-oocyte (CCO) complexes matured for 32 hours. In Phase II, the primordial goat follicles included in Alginate (10 follicles / drop), or wrapped in ovarian tissue (in situ) encapsulated or not in Alginate, were cultured for 7 days. In Phase III, pre-cryopreserved baboon follicles were cultured for 10 days in ovarian tissue (in situ), in the presence or absence of extracellular matrices (PEG-VS vs. Alginate) and FSH. Finally, in the Phase IV, the goat and cattle COCs were cultured for 30 hours, starting with in vitro pre-maturation (IVPM) for 6 or 12 hours before IVM (24 or 18h). The best result for the production of fully-grown oocytes and meiotic resumption was obtained using low (4 ° C) for preantral follicles and high (33 ° C) for initial antral follicles (Phase I). Phase II results showed that caprine primordial follicles isolated and encapsulated in Alginate presented satisfactory rates of survival and higher percentages of follicular activation when compared to the other treatments. In the Phase III, treatments containing medium supplemented with FSH associated and extracellular matrices (Alginate and PEG-VS) promoted an improvement in the survival of baboon preantral follicles included in the ovarian tissue after 10 days in vitro culture. In the Phase IV, the combination of concentration/exposure time to cilostamide during IVPM delayed the meiotic progression only in the bovine species after 6 and 12 hours of culture. In conclusion, the transport temperature differentially affected the in vitro development of preantral follicles and initial antral follicles (Phase I); the in vitro culture of isolated goat primordial follicles enclosed in Alginate allowed a better rate of follicular activation (Phase II); In baboons, the use of extracellular matrices in the presence of FSH improved follicular survival after 10 days of in vitro culture (Phase III). Finally, in the Phase IV, the cilostamide delayed in a concentration/dependent manner the meiotic resumption in bovine species only.

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA E PROTÉICA DA VIA mTOR/4EBP1/eIF4E NOS CARCINOMAS PROSTÁTICOS CANINOS

O câncer é uma doença complexa que precisa de um microambiente favorável para seu crescimento e progressão. Esse microambiente tumoral esta constituido por células neoplásicas, vasos sanguíneos, células imunes, fibroblastos e a matriz extracellular (MEC). Geralmente, as células neoplásicas apresentam modificações nas suas vias de sinalização. No homem, a via mTOR/4E-BP1/eIF4E foi descrita como alterada em diferentes tumores, incluindo o câncer de próstata (CP).Além do homem, o cão é espécie doméstica que desenvolve com mais frequência o CP, sendo considerada um potencial modelo para estudos na área de Oncologia Comparada. Devido à limitada informação sobre a via mTOR/4E-BP1/eIF4E e os componentes da MEC nos CP caninos, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica e protéica de mTOR, 4E-BP-1 e eIF4E neste tipo de tumor. Outrossim, avaliar a expressão dos colágenos (C-I e C-III) pela técnica Picrosirius (PSR) e imuno-histoquímica no tecido prostático normal e neoplásico. Foram utilizadas 35 amostras de tecido prostático caninos. Identificou-se alta expressão protéica de p-mTOR e eIF4E nos CP caninos com alto GS ( 8), assim como, correlação positiva entre essas proteínas. Nos colágenos não foi observada diferença de expressão quando comparadas amostras de próstata normal e CP canino. De forma similar com o CP humano, estes resultados sugerem que p-mTOR e eIF4E podem ser bons marcadores para o processo carcinogênico prostático canino e estão correlacionados com alto GS. Além disso, a distribuição de colágenos foi similar no tecido prostático normal e neoplásico.

Cancer is a complex disease that needs a favorable microenvironment for its growth and progression. This tumor microenvironment consists of neoplastic cells, blood vessels, immune cells, fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Generally, neoplastic cells show modification in their signaling pathways. In men, the mTOR/4E-BP1/eIF4E pathway has been described as altered in different tumors, including prostate cancer (PC). Apart from men,the dog is the only species that develops with high frequencythePC, being considered a potential model for comparative oncology initiatives. Due to limited information on this pathway and ECM components in canine tumors, this study aimed to investigate mTOR, 4E-BP1 and eIF4E gene and protein expression in canine PC. Additionally, to evaluate the expression of collagens (C-I and C-III) by Picrosirius Red and Immunohistochemistry in normal samples and canine PC. Were used a total of 35 formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples from canine prostatic tissue. We identified higher p-mTOR and eIF4E protein levels in the canine PC with higher GS ( 8), as well as, significant positive correlation between these proteins. No difference statistical was observed in the collagen expression between normal samples and canine PC. Similar to human PC; our data suggested that p-mTOR and eIF4E good markers for canine prostatic carcinogenic process and are correlated with higher GS. Also, the distribution and collagen levels are similar in normal and neoplastic canine prostate.