Resumo

Military conflicts have been significant obstacles in detecting and treating infectious disease diseases due to the diminished public health infrastructure, resulting in malaria endemicity. A variety of violent and destructive incidents were experienced by FATA (Federally Administered Tribal Areas). It was a struggle to pursue an epidemiological analysis due to continuing conflict and Talibanization. Clinical isolates were collected from Bajaur, Mohmand, Khyber, Orakzai agencies from May 2017 to May 2018. For Giemsa staining, full blood EDTA blood samples have been collected from symptomatic participants. Malaria-positive microscopy isolates were spotted on filter papers for future Plasmodial molecular detection by nested polymerase chain reaction (nPCR) of small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes specific primers. Since reconfirming the nPCR, a malariometric study of 762 patients found 679 positive malaria cases. Plasmodium vivax was 523 (77%), Plasmodium falciparum 121 (18%), 35 (5%) were with mixed-species infection (P. vivax plus P. falciparum), and 83 were declared negative by PCR. Among the five agencies of FATA, Khyber agency has the highest malaria incidence (19%) with followed by P. vivax (19%) and P. falciparum (4.1%). In contrast, Kurram has about (14%), including (10.8%) P. vivax and (2.7%) P. falciparum cases, the lowest malaria epidemiology. Surprisingly, no significant differences in the distribution of mixed-species infection among all five agencies. P. falciparum and P. vivax were two prevalent FATA malaria species in Pakistan's war-torn area. To overcome this rising incidence of malaria, this study recommends that initiating malaria awareness campaigns in school should be supported by public health agencies and malaria related education locally, targeting children and parents alike.

Os conflitos militares têm sido obstáculos significativos na detecção e tratamento de doenças infecciosas devido à diminuição da infraestrutura de saúde pública, resultando na endemicidade da malária. Uma variedade de incidentes violentos e destrutivos foi vivida pelas FATA (áreas tribais administradas pelo governo federal). Foi uma luta busca ruma análise epidemiológica devido ao conflito contínuo e à talibanização. Isolados clínicos foram coletados de agências Bajaur, Mohmand, Khyber e Orakzai, de maio de 2017 a maio de 2018. Para a coloração de Giemsa, amostras de sangue completo com EDTA foram coletadas de participantes sintomáticos. Isolados de microscopia positivos para malária foram colocados em papéis de filtro para futura detecção molecular plasmódica por reação em cadeia da polimerase aninhada (nPCR) de primers específicos de genes de subunidade ribossômica de ácido ribonucleico (ssrRNA). Desde a reconfirmação do nPCR, um estudo malariométrico de 762 pacientes encontrou 679 casos positivos de malária. Plasmodium vivax foi 523 (77%), Plasmodium falciparum 121 (18%), 35 (5%) eram com infecção de espécies mistas (P. vivax mais P. falciparum) e 83 foram declarados negativos por PCR. Entre as cinco agências da FATA, a agência Khyber tem a maior incidência de malária (19%), seguida por P. vivax (19%) e P. falciparum (4,1%). Em contraste, Kurram tem cerca de 14%, incluindo 10,8% casos de P. vivax e 2,7% P. falciparum, a epidemiologia de malária mais baixa. Surpreendentemente, não há diferenças significativas na distribuição da infecção de espécies mistas entre todas as cinco agências. P. falciparum e P. vivax foram duas espécies prevalentes de malária FATA na área devastada pela guerra no Paquistão. Para superar essa incidência crescente de malária, este estudo recomenda que o início de campanhas de conscientização sobre a malária na escola deve ser apoiado por agências de saúde pública e educação relacionada com a malária localmente, visando crianças e pais.

Resumo

Abstract Military conflicts have been significant obstacles in detecting and treating infectious disease diseases due to the diminished public health infrastructure, resulting in malaria endemicity. A variety of violent and destructive incidents were experienced by FATA (Federally Administered Tribal Areas). It was a struggle to pursue an epidemiological analysis due to continuing conflict and Talibanization. Clinical isolates were collected from Bajaur, Mohmand, Khyber, Orakzai agencies from May 2017 to May 2018. For Giemsa staining, full blood EDTA blood samples have been collected from symptomatic participants. Malaria-positive microscopy isolates were spotted on filter papers for future Plasmodial molecular detection by nested polymerase chain reaction (nPCR) of small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes specific primers. Since reconfirming the nPCR, a malariometric study of 762 patients found 679 positive malaria cases. Plasmodium vivax was 523 (77%), Plasmodium falciparum 121 (18%), 35 (5%) were with mixed-species infection (P. vivax plus P. falciparum), and 83 were declared negative by PCR. Among the five agencies of FATA, Khyber agency has the highest malaria incidence (19%) with followed by P. vivax (19%) and P. falciparum (4.1%). In contrast, Kurram has about (14%), including (10.8%) P. vivax and (2.7%) P. falciparum cases, the lowest malaria epidemiology. Surprisingly, no significant differences in the distribution of mixed-species infection among all five agencies. P. falciparum and P. vivax were two prevalent FATA malaria species in Pakistans war-torn area. To overcome this rising incidence of malaria, this study recommends that initiating malaria awareness campaigns in school should be supported by public health agencies and malaria-related education locally, targeting children and parents alike.

Resumo Os conflitos militares têm sido obstáculos significativos na detecção e tratamento de doenças infecciosas devido à diminuição da infraestrutura de saúde pública, resultando na endemicidade da malária. Uma variedade de incidentes violentos e destrutivos foi vivida pelas FATA (áreas tribais administradas pelo governo federal). Foi uma luta buscar uma análise epidemiológica devido ao conflito contínuo e à talibanização. Isolados clínicos foram coletados de agências Bajaur, Mohmand, Khyber e Orakzai, de maio de 2017 a maio de 2018. Para a coloração de Giemsa, amostras de sangue completo com EDTA foram coletadas de participantes sintomáticos. Isolados de microscopia positivos para malária foram colocados em papéis de filtro para futura detecção molecular plasmódica por reação em cadeia da polimerase aninhada (nPCR) de primers específicos de genes de subunidade ribossômica de ácido ribonucleico (ssrRNA). Desde a reconfirmação do nPCR, um estudo malariométrico de 762 pacientes encontrou 679 casos positivos de malária. Plasmodium vivax foi 523 (77%), Plasmodium falciparum 121 (18%), 35 (5%) eram com infecção de espécies mistas (P. vivax mais P. falciparum) e 83 foram declarados negativos por PCR. Entre as cinco agências da FATA, a agência Khyber tem a maior incidência de malária (19%), seguida por P. vivax (19%) e P. falciparum (4,1%). Em contraste, Kurram tem cerca de 14%, incluindo 10,8% casos de P. vivax e 2,7% P. falciparum, a epidemiologia de malária mais baixa. Surpreendentemente, não há diferenças significativas na distribuição da infecção de espécies mistas entre todas as cinco agências. P. falciparum e P. vivax foram duas espécies prevalentes de malária FATA na área devastada pela guerra no Paquistão. Para superar essa incidência crescente de malária, este estudo recomenda que o início de campanhas de conscientização sobre a malária na escola deve ser apoiado por agências de saúde pública e educação relacionada com a malária localmente, visando crianças e pais.

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The study describes the genetic identification, clinical, and epidemiological characteristics of an outbreak of equine infectious anemia occurring in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Three animals kept in the periurban region of Uruguaiana city tested positive for the AGID test. The serology was performed as a requirement for transit. None of the animals showed clinical signs of infection, one animal was necropsied, and the others were stolen. In the post-mortem examination, no macroscopic changes were observed, and microscopically, discrete hemosiderosis was detected in fragments of the liver and spleen. Amplifying and sequencing a proviral DNA fragment in blood, spleen, and mesenteric lymph node samples confirmed EIAV infection. Phylogenetic analysis of the first sequenced EIAV sample from the Rio Grande do Sul State indicates a high similarity with other Brazilian samples. Results confirmed the viral presence in the state's herds and described epidemiological and virological characteristics of EIA that contribute to the maintenance and dissemination of the virus in herds.

O estudo descreve a identificação genética, as características clínicas e epidemiológicas de um foco de Anemia Infecciosa Equina que ocorreu no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Três equinos criados na região periurbana da cidade de Uruguaiana testaram positivos pela prova sorológica de IDGA. O exame foi realizado como requerimento para trânsito dos animais. Nenhum animal apresentava sinais clínicos da infecção, um cavalo foi necropsiado e os outros dois foram roubados. Na necropsia não obsevou-se nenhuma alteração e microscopicamente foi constatada hemosiderose discreta em fragmento do fígado e baço. A infecção foi confirmada pela amplificação e sequenciamento de um segmento do genoma pró-viral do EIAV de amostras do sangue, baço e linfonodo mesentérico. A análise filogenética do primeiro EIAV sequenciado no Estado do RS indica similaridade com outras amostras que circulam no Brasil. O resultado confirma a presença do vírus no rebanho equino da região e descreve características clínicas e epidemiológicas que contribuem para a manutenção e disseminação do vírus no rebanho.

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The aims of the present study were (i) to genotype Corynebacterium pseudotuberculosis, C. silvaticum, and C. auriscanis strains using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC-PCR), and (ii) to analyze the epidemiological relationships among isolates according to biovar (Equi and Ovis), species, host, and geographical origin of the C. pseudotuberculosis strains. Sixty-eight C. pseudotuberculosis, nine C. silvaticum, and one C. auriscanis, C. pseudotuberculosis ATCC® 19410™ strain and the attenuated C. pseudotuberculosis 1002 vaccinal strain were fingerprinted by ERIC 1+2-PCR. Field strains were isolated from various hosts (cattle, buffaloes, sheep, goats, horses, dogs, and pigs) in six countries (Mexico, Portugal, Brazil, Equatorial Guinea, Egypt, and Israel). High genetic diversity was found among the studied Corynebacterium spp. isolates, clustering in 24 genotypes with a Hunter & Gaston diversity index (HGDI) of 0.937. The minimal spanning tree of Corynebacterium spp. revealed three clonal complexes, each associated with one bacterial species. Twenty-two genotypes were observed among C. pseudotuberculosis isolates, with an HGDI of 0.934. Three major clonal complexes were formed at the minimal spanning tree, grouped around the geographic origin of C. pseudotuberculosis isolates. These results reinforce the high typeability, epidemiological concordance, and discriminatory power of ERIC-PCR as a consistent genotyping method for C. pseudotuberculosis, which could be useful as an epidemiological tool to control caseous lymphadenitis. Moreover, our results also indicate the potential of ERIC 1+2-PCR for the genotyping of other species of Corynebacterium other than C. pseudotuberculosis.

Os objetivos do presente estudo foram (i) genotipar amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis, C. silvaticum e C. auriscanis usando Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC-PCR), bem como (ii) analisar as relações epidemiológicas entre os isolados de acordo com biovar (Equi e Ovis), espécie, hospedeiro e origem geográfica das amostras de C. pseudotuberculosis. Sessenta e oito isolados de C. pseudotuberculosis, nove C. silvaticum, um C. auriscanis, C. pseudotuberculosis ATCC® 19410 ™ e a amostra vacinal atenuada C. pseudotuberculosis 1002 foram tipificadas por ERIC 1 + 2-PCR. As amostras de campo foram isoladas de diferentes hospedeiros (bovinos, búfalos, ovinos, caprinos, equinos, cães e suínos) em seis países (México, Portugal, Brasil, Guiné Equatorial, Egito e Israel). Uma alta diversidade genética foi observada entre os isolados de Corynebacterium spp., agrupados em vinte e quatro genótipos com um índice de diversidade Hunter & Gaston (HGDI) de 0,937. A análise da minimal spanning tree (MST) de Corynebacterium spp. revelou três complexos clonais, cada um associado a uma espécie bacteriana. Vinte e dois genótipos foram observados entre isolados de C. pseudotuberculosis, com um HGDI de 0,934. Na análise da MST, três grandes complexos clonais foram formados, agrupando-se em torno da origem geográfica dos isolados de C. pseudotuberculosis. Esses resultados reforçam a alta tipabilidade, concordância epidemiológica e poder discriminatório do ERIC-PCR como método consistente de genotipagem para C. pseudotuberculosis, podendo ser útil como ferramenta epidemiológica no controle da linfadenite caseosa. Além disso, os resultados também indicam o grande potencial de ERIC 1 + 2-PCR para genotipagem de espécies do gênero Corynebacterium além de C. pseudotuberculosis.

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a Colômbia, a brucelose bovina é uma doença endêmica, mas foi observado um aumento no número de bovinos soropositivos na região leiteira de Antioquia, considerada a principal área responsável pela produção de leite. O alarmante aumento do número de casos fez com que o Instituto Colombiano de Agricultura (ICA) declarasse quarentena na região desde 2018. O objetivo deste trabalho foi determinar a prevalência sorológica e molecular de brucelose em bovinos na principal região leiteira da Colômbia, identificando a presença de anticorpos, do material genético do agente etiológico e dos fatores individuais e de rebanho associados à ocorrência da doença. Foi realizado um estudo epidemiológico do tipo transversal, a traves de um questionário epidemiológico conduzido por entrevistadores previamente treinados, com informações epidemiológicas para identificar fatores associados a presencia de bruceloses bovina na região de estudo. Um total de 656 amostras de sangue total e soro sanguíneo foram obtidas de vacas 2 anos de idade, de 40 rebanhos, em quatro municípios do norte de Antioquia. O Teste Rosa de Bengala (RBT) foi usado como teste de triagem. Amostras RBT positivas foram confirmadas pelo Ensaio de Polarização de Fluorescência (FPA) e ELISA competitiva (cELISA) no Laboratório Nacional de Diagnóstico Veterinário do ICA. A detecção molecular foi realizada por ensaio de PCR em tempo real baseado em sonda (qPCR), usando a amplificação do gene bcsp31. As Brucella-DNA cepas de campo e as cepas vacinais, foram genotipadas mediante um ensaio baseado em marcadores SNP (Single Nucleotide Polimorphism). A ferramenta de geoprocessamento QGIS, foi utilizada para obter a georreferenciamento dos rebanhos positivos. Os fatores associados a presença de Brucella-DNA foram avaliados por meio de modelos de regressão logística. O ensaio qPCR detectou 9,5% (n=62/656; IC 95%: 7,3, 12,0) dos animais com presença de Brucella-DNA, enquanto o teste sorológico detectou 6,6% (n=43/656; IC: 4,8, 8,7). Foi observado que 62,5% (n=25/40; IC 95%: 45,8, 77,3) dos casos positivos foram detectados no rebanho pela qPCR, enquanto apenas 27,5% (n=11/40; IC 95%: 14,6, 43,9) foram detectados pelo teste sorológico. O teste Cohen´s Kappa determinou uma fraca concordância entre os métodos sorológicos e moleculares. O ensaio qPCR, apresentou uma eficiência de 92,35%, e teve uma duração de 32 min. A acurácia diagnóstica da qPCR pela área sob a Curva Receptor-Operador (ROC) teve desempenho igual a 0,75 ±0,047 (IC 95%: 0,65, 0,84). Toda as amostras positivas pela qPCR foram genotipadas como cepas de Brucella spp. de campo empregando o ensaio SNP. O estudo conseguiu diferenciar as cepas de Brucella abortus de campo da cepa vacinal RB51. Nos modelos de regressão logística, foi observado que as práticas de manejo, associadas principalmente à reprodução, assim como a presença de espécies silvestres e a proximidade dos rebanhos das estradas, oferecem condições favoráveis para o processo de disseminação da Brucella spp. Esta pesquisa concluiu que a introdução de técnicas moleculares, a partir de amostras clínicas coletadas a campo, atuam como ferramentas para complementar o diagnóstico sorológico de bruceloses bovina, melhorando a acurácia dos resultados, permitindo uma detecção precoce de Brucella spp. circulantes. Tanto as prevalências sorológicas quanto as prevalências moleculares estiverem de acordo com a declaração de quarentena na região, sendo a prevalência molecular muito maior. Por fim, as técnicas moleculares permitem reconhecer fatores epidemiológicos associados à presença do agente etiológico no animal e não associados apenas à presença de anticorpos, possibilitando direcionar ações de prevenção e controle ajustadas ao nível local e detectadas a partir de fases de infecção de difícil diagnostico, como aquelas iniciais ou crônicas.

In Colombia, bovine brucellosis is an endemic disease, but an unusual increase in the number of seropositive cases in a leading dairy region, given raised an alarm and caused the Colombian Institute of Agriculture to quarantine for brucellosis in the Antioquia region in 2018. This epidemiological study was conducted to determine the seroprevalence and molecular prevalence of bovine brucellosis in the leading dairy region of Colombia that was declared quarantined for brucellosis, and to evaluate the factors associated with the presence of antibodies against Brucella spp, as well as the presence of Brucella-DNA at the animal and the herd level. A cross-sectional epidemiological study was carried out, using an epidemiological questionnaire, conducted by previously trained interviewers, with epidemiological information to identify factors associated with the presence of bovine brucellosis in the study region. A total of 656 serum and whole blood samples from 2-year-old cows in 40 herds were used screened The Rose Bengal Test (RBT) was used as the screening test. Positives RBT samples were confirmed by the Fluorescence Polarization Assay (FPA) and c ELISA at the National Veterinary Diagnostic Laboratory of the Colombian Agricultural Institute (ICA). Molecular detection was performed by Probe-based Real-time PCR (Probe-qPCR) assay, using the bcsp31 gene amplification. Brucella-DNA field strains and vaccine strains were genotyped employing the Single Nucleotide Polimorphism (SNP). The geoprocessing tool QGIS was used to obtain the georeferencing of positive herds. Factors associated with the presence of Brucella-DNA were evaluated using logistic regression models. The qPCR assay detected 9.5% (n=62/656; 95% CI: 7.3, 12.0) of the animals with Brucella-DNA presence, while the serological test detected a 6.6% (n=43/656; CI: 4.8, 8.7). 62.5% (n=25/40; 95% CI: 45.8, 77.3) of positive cases were detected at the herd-level by the qPCR, while only 27.5% (n=11/40; 95% CI: 14.6, 43.9) were detected by the serological test. The Cohen´s Kappa test determined a weak agreement between methods. The qPCR assay was accomplished in 32 min and had an efficiency of 92.35%. The diagnostic accuracy of the qPCR by the area under the Receiver-Operator Curve (ROC), had performance equal to 0.75 ±0.047 (95% CI: 0.65, 0.84). In the results obtained, it was observed that all positive herds by serology tests were also positive by the qPCR. However, not all positive herds by the qPCR were positive on the serology test. All positive samples were identified as field Brucella abortus strains employing the SNP-based assay. In logistic regression models, it was observed that management practices, mainly associated with reproduction, presence of wild species and the proximity of herds to the roads, offer favorable conditions for the process of dissemination of Brucella spp. among animals and in herds. This research concluded that the introduction of molecular techniques from clinical samples collected in the field act as tools to complement the diagnosis of bovine brucellosis. Molecular techniques also provide an improvement in the confidence of the results, when compared with serological techniques, and also allow for early detection of Brucella spp. circulating in the animal. The serological and molecular prevalence were in accordance with the declaration of quarantine in the region, with the molecular prevalence being much higher. Lastly, molecular techniques allow the researcher to recognize epidemiological factors associated with the presence of the etiological agent in the animal and not associated only with the presence of antibodies, making it possible to direct prevention and control actions adjusted at the local level and detected from difficult-to-diagnose infection phases, such as initial or chronic ones.

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In São Paulo the mumps virus (MuV) outbreaks have been increasing from 2011 to nowadays. MuV epidemiological surveillance has been improving by using the polymerase chain reaction in real time (rRT-PCR) in addition to the specific IgM antibody (IgM-Ab) detection; in some cases, genome sequencing studies were performed. Increased virus transmission and recent outbreaks have raised interest on MuV genotyping, as a means to understand the transmission pathways and to identify the vaccine-associated cases. From January 2011 to August 2016, MuV infection was analyzed at Institute Adolfo Lutz. A total of 232 (77.33 %) throat wash samples showed positivity to mumps genome, and 68 (22.66 %) were negative when analyzed by rRT-PCR. Among 15 samples for molecular analysis, 10 serum samples from respective patients were also available for detecting anti-MuV IgM-Ab; and from these, four (40%) samples were seropositive. Vaccination status was available only for patients from Cedral and Araraquara. Phylogenetic analysis revealed the circulation of the following mumps virus genotypes in the investigated periods: 2011(M), 2012, and 2013 (K); 2014 (N); 2015 (G, K, and N); 2016 (G). Knowledge on MuV molecular epidemiology in São Paulo-Brazil could contribute to the surveillance and epidemiological program in Brazil, and globally as well.

No estado de São Paulo têm ocorrido surtos de caxumba desde 2011. O diagnóstico laboratorial tem sido realizado no Instituto Adolfo Lutz utilizando-se a técnica de identificação de material genético viral por meio de reação de cadeia de polimerase-em tempo real (rRT-PCR) e pela detecção de anticorpos IgM (Ac-IgM) específicos circulantes. Os recentes surtos de caxumba têm aumentado o interesse em investigar os genótipos dos vírus prevalentes para identificar os casos associadas à vacina. De janeiro de 2011 a agosto de 2016, 300 amostras de lavados da orofaringe coletadas de pacientes suspeitos de infecção foram analisadas. O material genético viral específico foi detectado em 232 (77,33 %) amostras e 68 (22,66 %) foram negativas. Das 10 amostras analisadas pelo teste sorológico, quatro (40 %) demonstraram positividade para Ac-IgM específicos anti-vírus da caxumba e seis foram negativas. Somente os municípios Cedral e Araraquara forneceram os dados referentes à vacinação. Análise filogenética mostrou a circulação dos seguintes genótipos do vírus da caxumba no período investigado: 2011 (M), 2012 e 2013 (K); 2014 (N); 2015 (GKN); 2016 (G). A vigilância virológica é mundialmente imprescindível, para identificar a diversidade e a distribuição dos diferentes genótipos, com vistas à composição de vacinas específicas.

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More than 300 species have been described in the genus Hepatozoon, occurring in different vertebrates. Among these, only Hepatozoon canis and Hepatozoon americanum are seen in dogs. Different methods may be used for laboratory diagnosis. The most common of these is direct parasitological examination of parasite stages in blood smears. The aim of this investigation was to conduct a phylogenetic study on Hepatozoon isolates from symptomatic dogs in the city of Goiânia, Goiás, Brazil. Blood samples were obtained from 40 symptomatic dogs that had been referred to the Veterinary Hospital of the Federal University of Goiás. Among these, only two samples were positive for Hepatozoon spp. using the direct parasitological method. These samples were then subjected to a DNA extraction process and amplification of a fragment of the 18S rRNA by means of PCR. Subsequently, the PCR products from each sample were purified and sequenced. The sequences obtained were then analyzed using the BLASTn algorithm, which identified both sequences of this study as Hepatozoon canis. By applying the Mega4 software, it was confirmed that these isolates of H. canis from dogs in Goiânia are similar to other reference isolates of the same species from other regions of Brazil and worldwide.(AU)

São descritas mais de 300 espécies do gênero Hepatozoon que acometem diferentes vertebrados. Entre estas, apenas Hepatozoon canis e Hepatozoon americanum são descritas em cães. Diferentes métodos podem ser utilizados para o diagnóstico laboratorial. O mais empregado é o exame parasitológico direto do parasito em esfregaços sanguíneos. O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo filogenético em Hepatozoon isolados de cães sintomáticos de Goiânia, Goiás. As amostras de sangue foram obtidas de 40 cães sintomáticos encaminhados ao Hospital Veterinário da Universidade Federal de Goiás. Entre essas, duas únicas amostras foram positivas para Hepatozoon spp. pelo método parasitológico direto. Estas amostras foram, então, submetidas ao processo de extração de DNA e de amplificação de um fragmento de 18S rRNA por PCR. Ambas as amostras foram positivas na PCR. Posteriormente, os produtos de PCR de cada amostra foram purificados e sequenciados. As sequências obtidas foram analisadas pelo algoritmo BLASTn, sendo identificadas como Hepatozoon canis. Por meio do software Mega4 foi confirmado que estes isolados de H. canis de cães de Goiânia são semelhantes a outros isolados de referência da mesma espécie de outras regiões do Brasil e do mundo.(AU)

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Escherichia coli é um agente patogênico distribuído mundialmente e causador de uma série de infecções intestinais e extra intestinais. Devido as características de transmissão desse microrganismo, diversos surtos alimentares acontecem anualmente em todo mundo, principalmente pela relação com as cadeias produtivas animais. Deste modo, o objetivo deste estudo foi a avaliação de isolados de Escherichia coli patogênica obtidas em abatedouro misto (bovinos e suínos) afim de verificar possíveis rotas de contaminação cruzada entre diferentes espécies abatidas no mesmo local. Os isolados foram caracterizados quanto a sua virulência, patótipos, subtipos de Shiga-toxina, filogrupo, sorogrupo O157, O104 e big six e por fim foram determinadas associações entre os isolados com o reservatório animal, amostra e pontos de coleta. De 697 isolados confirmados como E. coli, 33 foram classificados como diarreiogênicas, sendo STEC/ EHEC (n= 21), aEPEC (n=10) and ETEC (n=2). Um total de 21 isolados produtores de Shiga-toxina foram analisados e classificados como: stx1 (n= 9), stx2 (n= 11) e para os genes stx1 e stx2 simultaneamente (n= 3). Em relação aos subtipos stx1, foram classificados como stx1a (n=7) e stx1c (n=1). Para os subtipos stx2 foram agrupados em stx2b (n=3), stx2c (n=8), stx2d (n=8), stx2f (n=1) and stx2g (n=2). A análise dos filogrupos classificou os isolados pelos métodos de Clermont, mostrando que B1 foi o filogrupo mais predominante. Três isolados de EPEC foram identificados como pertencentes ao sorotipo O26. Por meio da técnica de PFGE estabeleceu-se uma correlação entre filogrupos e patótipos. Os resultados obtidos indicam que não houve contaminação cruzada entre diferentes espécies abatidas em um mesmo local.

Escherichia coli is a pathogenic agent distributed worldwide and causes a series of intestinal and extra intestinal infections. Due to the transmission characteristics of this microorganism, several food outbreaks occur annually throughout the world, mainly due to the relationship with animal production chains. Thus, the aim of this study was evaluated pathogenic E. coli isolated from mixed slaughterhouse (bovine and swine) in order to verify possible cross-contamination routes between different species slaughtered in the same place. Besides to detect virulence factors, pathotypes, subtypes of Shiga-toxin, phylogroup, serogroup O157, O104 and big six serogroup of Escherichia coli strains and to determine the association of this isolates with the animal reservoir, sample, and collection points. From 697 isolates confirmed as E. coli, 33 were classified as diarrheagenic group, and from this total STEC/ EHEC (n= 21), aEPEC (n=10) and ETEC (n=2). A total of 21 isolates of Shiga-toxin producing were analyzed and classified as: stx1 (n= 9), stx2 (n= 11) and for the both genes stx1 and stx2 simultaneously (n= 3). Therefore, gene stx2 was more prevalent than stx1, there was no statistical difference between the results (P value < 0.05). Regarding stx1 subtyping, were classified as stx1a (n=7) and stx1c (n=1). For stx2 subtypes was as follows: stx2b (n=3), stx2c (n=8), stx2d (n=8), stx2f (n=1) and stx2g (n=2). Phylotyping analysis according Clermont methodology demonstrated majority of isolates as group B1. Three EPEC isolates were identified as belonging to serotype O26. PFGE showed a correlation between phylogroups and pathotypes. The results obtained shows that there was no cross-contamination between different species slaughtered in the same place.

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Background: Phylogenetic analyses are an essential part in the exploratory assessment of nucleic acid and amino acid sequences. Particularly in virology, they are able to delineate the evolution and epidemiology of disease etiologic agents and/or the evolutionary path of their hosts. The objective of this review is to help researchers who want to use phylogenetic analyses as a tool in virology and molecular epidemiology studies, presenting the most commonly used methodologies, describing the importance of the different techniques, their peculiar vocabulary and some examples of their use in virology. Review: This article starts presenting basic concepts of molecular epidemiology and molecular evolution, emphasizing their relevance in the context of viral infectious diseases. It presents a session on the vocabulary relevant to the subject, bringing readers to a minimum level of knowledge needed throughout this literature review. Within its main subject, the text explains what a molecular phylogenetic analysis is, starting from a multiple alignment of nucleotide or amino acid sequences. The different software used to perform multiple alignments may apply different algorithms. To build a phylogeny based on amino acid or nucleotide sequences it is necessary to produce a data matrix based on a model for nucleotide or amino acid replacement, also called evolutionary model. [...]

Resumo

Neste estudo, realizou-se genotipagem de isolados de Mycobacterium bovis, provenientes de amostras de tecidos de bovinos positivos no teste cervical comparativo (TCC) para tuberculose em Mato Grosso do Sul, por meio da técnica de spoligotyping. Tecidos de 13 bovinos positivos, oriundos de diferentes municípios do estado, foram cultivados em meio de Stonebrink. As colônias resultantes foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen e todos os isolados apresentaram características tintoriais de BAAR. Os 13 isolados de BAAR foram identificados por PCR multiplex (mPCR). O gene hsp65 foi alvo para identificação de Mycobacterium spp, a sequência de inserção IS6110 foi alvo para identificação de complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT) e a região rvd1rv2031c foi explorada para detecção de M. bovis. Os isolados micobacterianos foram genotipados pela técnica de spoligotyping. Dos 13 bovinos, sete tinham pelo menos uma lesão sugestiva de tuberculose em linfonodos retrofaríngeos, parotídeos e pulmonares ou no pulmão, e em seis não foram encontradas lesões visíveis sugestivas da doença. Na mPCR, 11/13 (84,6%) isolados foram positivos para Mycobacterium spp, 8/13 (61,5%) positivos para CMT e 7/13 (53,8%) positivos para M. bovis. Com base no spoligotyping, oito isolados de BAAR foram agrupados dentro de três diferentes agrupamentos de genótipos e uma amostra remanescente apresentou perfil único, sendo quatro isolados com padrão de espoligotipo SB0121, dois SB1145, dois SB0881 e um SB0140. A técnica de spoligotyping demonstrou que há diversidade genética entre os espoligotipos presentes no estado de Mato Grosso do Sul, embora predomine o perfil SB0121.

Spoligotyping was performed in the present study to genotype Mycobacterium bovis isolates obtained from tissues of cattle that were positive in the comparative intradermal tuberculin test (CITT) in the state of Mato Grosso do Sul (Brazil). Tissue samples from 13 positive cattle from different municipalities of the state were cultured using a Stonebrink medium. The resulting colonies were subjected to Ziehl-Neelsen staining and all isolates exhibited the staining characteristics of AFB. The 13 isolates of AFB were identified by means of a multiplex PCR (mPCR) assay. The hsp65 gene was targeted for the identification of Mycobacterium spp., whereas the IS6110 insertion sequence was targeted for the identification of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) and the rvd1rv2031c region was explored for the detection of Mycobacterium bovis. The spoligotyping assay was performed to genotype mycobacterial isolates. Of the 13 cattle, seven had at least one lesion suggestive of tuberculosis in the retropharyngeal, parotid and lung lymph nodes or lung. The remaining six exhibited no lesions suggestive of the disease. In the mPCR, 11 of the 13 isolates (84.6%) were positive for Mycobacterium spp., 8/13 (61.5%) were positive for the MTC and 7/13 (53.8%) were positive for M. bovis. Based on the spoligotyping, eight isolates were grouped into three different groups of genotypes and one isolate exhibited an orphan type. Four isolates exhibited spoligotype pattern SB0121, while two isolates were associated with the pattern SB1145, another two were associated with pattern SB0881 and one was associated with pattern SB0140. Spoligotyping confirmed the genetic diversity present among isolates found in the state of Mato Grosso do Sul. In addition, SB0121 was confirmed as the predominant profile.

Resumo

O presente trabalho traçou o perfil epidemiológico das infecções intramamárias (IIM) causadas por estafilococos em ovelhas Santa Inês através de ferramentas de biologia molecular contemplando os seguintes aspectos: 1) investigar a incidência de infecção intramamária (IIM) em ovelhas de corte no período pós-parto e a persistência da infecção durante a lactação, e seu efeito no crescimento de cordeiros. Neste estudo, 38 ovelhas e 44 cordeiros foram acompanhados do parto até o desmame aos 90 dias. Os cordeiros foram pesados ao nascimento e a cada 15 dias, e o exame microbiológico e identificação de Mycoplasma agalactiae pela reação da cadeia da polimerase (PCR) das amostras de leite das ovelhas foram realizados nos respectivos momentos. Observou-se que 14 (36,8%; 5 por Mycoplasma agalactiae; 5 por Staphylococcus sciuri, 2 por Staphylococcus aureus e 2 por Staphylococcus simulans) e 20 (31,6%) ovelhas apresentam IIM persistente e transiente, respectivamente. Portanto, 63,26% das IIM, todas por estafilococos não aureus, não persistiram durante a lactação, sugerindo perfil oportunistas de algumas espécies. A taxa de sobrevivência de cordeiros de ovelhas com IIM persistente (33,3%) foi bem menor que dos animais sadios (100%) ou com IIM transiente (91,7%). Além disto, houve diferença no ganho de peso para cordeiros de ovelhas persistentemente infectadas os 90 dias em relação aos demais grupos. Apesar do impacto negativo da mastite nas ovelhas Santa Inês sobre o desempenho e a morte de cordeiros, o agente etiológico e seu potencial para causar IIM persistente devem ser considerados. 2) relatar um caso esporádico de mastite gangrenosa causada por Staphylococcus haemolyticus multirresistente em ovelha Santa Inês. O exame microbiológico, o perfil de resistência a antimicrobianos e presença de fatores de virulência foram investigados. Os isolados de Staphylococcus haemolyticus apresentaram multirresistência a antimicrobianos, e foram positivos para dois genes enterotoxigênicos estafilocócicos e proteína B de ligação à fibronectina (fnbA). 3) investigar se os estafilococos isolados de mastite clínica e subclínica, do ápice das ovelhas e tonsilas de cordeiros são geneticamente distintos, e possuem genes relacionados à produção de enterotoxinas e resistência a meticilina e penicilina. Foram utilizados 78 isolados de estafilococos proveniente de ovelhas Santa Inês (Estudo 1). Os isolados de estafilococos foram identificados por MALDI-TOF MS, e a PCR foi realizada para identificação dos genes de virulência e resistência a antimicrobianos. Além disso, os isolados foram genotipados através de amplificação aleatória de DNA polimórfico - RAPD. Observou-se que S. aureus isolados de amostras de leite diferem daqueles isolados de nichos extramamários, diferentemente das espécies de estafilococos não-aureus. S. aureus hospedou a maioria dos genes de virulência e resistência. Detectou-se um isolado de S. aureus e um Staphylococcus sciuri isolados do ápice do teto resistente a meticilina. Portanto, o presente estudo forneceu informações mais detalhadas da epidemiologia dos estafilococos associados à ovelha. 4) relatar a presença de Staphylococcus sciuri portadores do gene de resistência a meticilina mecC, sendo, portanto, o primeiro relato no Brasil. A resistência a cefoxitina e oxacilina foram determinadas pela concentração inibitória mínima, e os genes de resistência foram confirmados por PCR, e sequenciamento dos produtos da PCR.

The present work traced the epidemiological profile of intramammary infections (IMI) caused by staphylococci in Santa Inês sheep using molecular biology tools covering the following aspects: 1) to investigate the incidence of intramammary infection (IMI) in meat ewes in the post-partum and the persistence of infection during lactation, and its effect on lamb growth. In this study, 38 ewes and 44 lambs were followed from birth until weaning at 90 days. The lambs were weighed at birth and every 15 days, and the microbiological examination and identification of Mycoplasma agalactiae by polymerase chain reaction (PCR) of the sheep's milk samples were performed at respective times. It was observed that 14 (36.8%; 5 by Mycoplasma agalactiae; 5 by Staphylococcus sciuri, 2 by Staphylococcus aureus and 2 by Staphylococcus simulans) and 20 (31.6%) sheep present persistent and transient IIM, respectively. Therefore, 63.26% of IMIs, all due to non-aureus staphylococci, did not persist during lactation, suggesting opportunistic profiles of some species. The survival rate of lambs from sheep with persistent IMI (33.3%) was much lower than healthy animals (100%) or with transient IMI (91.7%). In addition, there was a difference in weight gain for lambs from sheep persistently infected at 90 days in relation to the other groups. Despite the negative impact of mastitis on Santa Inês sheep on lamb performance and death, the etiologic agent and its potential to cause persistent IMI should be considered. 2) to report a sporadic case of gangrenous mastitis caused by multi-resistant Staphylococcus haemolyticus in Santa Inês sheep. The microbiological examination, the antimicrobial resistance profile and the presence of virulence factors were investigated. Staphylococcus haemolyticus isolates showed multidrug resistance to antimicrobials and were positive for two staphylococcal enterotoxygenic genes and fibronectin-binding protein (fnbA). 3) investigate whether the staphylococci isolated from clinical and subclinical mastitis, from apex of sheep and lambs' tonsils are genetically distinct, and have genes related to the production of enterotoxins and resistance to methicillin and penicillin. 78 staphylococcus isolates from Santa Inês sheep were used (Study 1). Staphylococcus isolates were identified by MALDI-TOF MS, and PCR was performed to identify the virulence and antimicrobial resistance genes. In addition, the isolates were genotyped by random amplification of polymorphic DNA (RAPD). It was observed that S. aureus isolated from milk samples differ from those isolated from extra-mammary niches, differently from non-aureus staphylococcus species. S. aureus hosted most virulence and resistance genes. An isolate of S. aureus and other of Staphylococcus sciuri shown methicillin-resistance. Therefore, the present study provided more detailed information on the epidemiology of staphylococci associated with sheep. 4) to report the presence of Staphylococcus sciuri carrying the methicillin resistance gene mecC, being, therefore, the first report in Brazil. Resistance to cefoxitin and oxacillin was determined by the minimum inhibitory concentration, and the resistance genes were confirmed by PCR, and sequencing of PCR products.

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Oncogenic HPV genotypes are strongly associated with premalignant and malignant cervical lesion. The purpose was to determine human papillomavirus (HPV) prevalence and genotypes, and to estimate cervical cancer risk factor associations. Cervical samples were obtained from 251 women seeking gynecological care at the Pelotas School of Medicine Clinic. This is a cross-sectional study. HPV-DNA was amplified by nested-PCR using MY09/11 and GP5/6 primers, and the sequencing was used for genotyping. Sociodemographic and behavioral risk factors were obtained by closed questionnaire, and its relationship to HPV infection prevalence were analyzed. Statistical analyses were performed using SPSS 16.0 software, and differences were considered significant at p < 0.05. As results, the prevalence of HPV infection was 29.9%. The most frequent genotype was HPV-16 (41.3%), followed by HPV-18 (17.3%), and HPV-33 (9.3%). Others nine HPV genotypes were also found. On this population, prevalence of oncogenic HPV genotypes was high, but does not seem to confer relationship with the risk factors investigated. Future investigations in larger populations are necessary, for the proposition of more appropriated monitoring strategies and treatment according to the Brazilian health service reality, as well as patients.

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O objetivo do presente trabalho foi utilizar métodos bacteriológicos e moleculares para a identificação do Mycobacteriumbovis em lesões observadas em carcaças de bovinos durante a inspeção postmortem de rotina em matadouros-frigoríficos com serviço de inspeção oficial. Foi acompanhado o abate e a inspeção de 825.394 bovinos, sadios ao exame ante mortem pelo serviço de inspeção oficial em dez matadouros-frigoríficos do estado da Bahia. Carcaça de 180 bovinos apresentaram lesões sugestivas de tuberculose e por outras linfadenites. No isolamento bacteriano, 25 amostras apresentaram crescimento disgônico de colônias de coloração creme-amareladas em meio de cultura Stonebrink-Leslie. Desses isolados, 14 foram identificados como M. bovis PCR multiplex e pela técnica do spoligotyping foram discriminados oito diferentes espoligotipos do M. bovis, sendo sete descritos na literatura e um novo spoligotipo sem descrição anterior. O espoligotipo majoritário foi o SB0121, com cinco amostras, sendo descrito no Brasil e em outros países, seguidos por dois clusters, SB295 e SB1055, com dois isolados cada. O espoligotipo SB1145 e SB1648 foram referidos apenas no Brasil e Dinamarca, respectivamente. O espoligotipo SB140 já foi encontrado no Brasil, Argentina, Uruguai e Paraguai. Estes resultados demonstram que os espoligotipos obtidos são compartilhados, até o momento, entre estados brasileiros e entre países da América Latina e Europa. Sendo assim, a discriminação molecular de isolados de M. bovis através do Spoligotyping constitui-se numa ferramenta para estudos epidemiológicos da tuberculose bovina no Estado da Bahia.

The aim of this study was to use bacteriological and molecular methods to identify Mycobacteriumbovis in lesions observed in cattle carcasses during routine post-mortem inspection in slaughterhouses with official inspection service. It was accompanied the slaughter and inspection of 825,394 cattle, healthy ante mortem examination by the official inspection service in ten slaughterhouses in the state of Bahia. Carcasses of 180 cattle presented lesions suggestive of tuberculosis and other lymphadenitis. In bacterial isolation, 25 samples showed dysgonic growth of colonies of creamy-yellow in medium-Stonebrink Leslie. From these isolates, 14 were identified as M. bovis and the multiplex PCR technique spoligotyping was discriminated against eight different spoligotypes of M. bovis, seven previously described in the literature and a new spoligotypes without former description. The major spoligotypes was SB0121, with five samples which has been described in Brazil and other countries, followed by two clusters, SB295 and SB1055, with two isolates each. The SB1145 and SB1648 spoligotypes were reported only in Brazil and Denmark, respectively. The spoligotypes SB140 has been found in Brazil, Argentina, Uruguay and Paraguay. These results demonstrate that the spoligotypes obtained are shared, so far, among Brazilian states and among Latin America and Europe. Thus, molecular discrimination of isolates of M. bovis by Spoligotyping constitutes a tool for epidemiological studies of bovine tuberculosis in the state of Bahia.

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Apesar de vários países terem erradicado a tuberculose bovina, o seu combate tem sido desafiador. Existem várias razões para a infecção residual nesses locais e a dinâmica da transmissão do Mycobacterium bovis ainda é pouco compreendida. O rastreamento da transmissão recente e suas redes de transmissão são essenciais no controle da tuberculose bovina. No entanto, as ferramentas clássicas de genotipagem não possuem poder discriminatório para determinar as rotas de transmissão e a temporalidade do foco de tuberculose bovina em uma área geográfica. Recentemente, esta abordagem epidemiológica pode ser realizada pelo sequenciamento do genoma completo (WGS), porém ainda não padronizada para facilitar investigações maiores, abrangendo diferentes laboratórios ou rastreamento de focos de tuberculose bovina. Com base nisso, objetivou-se analisar o Sequenciamento do Genoma Completo pela técnica do cgMSLT como ferramenta de Vigilância da Tuberculose Bovina no Estado de Santa Catarina. Este estudo forneceu a primeira descrição sobre a diversidade filogenética de isolados de M. bovis do Brasil baseado na análise do cgMSLT. Além disso, é a primeira confirmação independente do esquema cgMLST para o Complexo Mycobacterium tuberculosis, utilizada em isolados clínicos de M. bovis de amostras obtidas de bovinos com bTB, resultando -se na identificação de 11 Tipos de Complex. Na pesquisa atual, foi demonstrado que o conhecimento da epidemiologia combinado com dados do WGS pode fornecer um meio para investigações aprofundadas da dinâmica da bTB, destacando aspectos importantes e ainda não quantificados, como a extensão da transmissão entre espécies e a taxa de substituição. O custo decrescente, resolução adicional, e boa evidência com a localização espacial justicam o uso do WGS como ferramenta na vigilância da tuberculose bovina no Estado de Santa Catarina.

Although several countries have eradicated bovine tuberculosis, their fight has been challenging. There are several reasons for the residual infection in these sites and the transmission dynamics of Mycobacterium bovis is still poorly understood. Screening of the recent transmission and its transmission networks are essential in the control of bovine tuberculosis. However, the classic genotyping tools do not have discriminatory power to determine the transmission routes and the temporality of the focus of bovine tuberculosis in a geographic area. Recently, this epidemiological approach can be performed by complete genome sequencing (WGS), but not yet standardized to facilitate larger investigations, covering different laboratories or tracing of outbreaks of bovine tuberculosis. Based on this, the objective was to analyze the Whole Genome Sequencing using the cgMSLT technique as a Bovine Tuberculosis Surveillance tool in the State of Santa Catarina. This study provided the first description on the phylogenetic diversity of M. bovis isolates from Brazil based on cgMSLT analysis. In addition, it is the first independent confirmation of the cgMLST scheme for the Mycobacterium tuberculosis Complex, used in clinical isolates of M. bovis from samples obtained from bovines with bTB, resulting in the identification of 11 Complex Types. In current research, it has been shown that knowledge of epidemiology combined with WGS data can provide a means for in-depth investigations of bTB dynamics, highlighting important but not yet quantified aspects such as the extent of transmission between species and the rate of substitution. The decreasing cost, additional resolution, and good evidence for spatial location justify the use of WGS as a tool in the surveillance of bovine tuberculosis in the State of Santa Catarina.

Resumo

Técnicas de genotipificação do Mycobacterium bovis baseadas na amplificação do DNA via PCR como MIRU-VNTR constituem importantes ferramentas na investigação epidemiológica da tuberculose bovina (TB) em áreas de baixa prevalência, como no Estado de Mato Grosso. Isto posto e diante de limitadas informações a respeito dos genótipos grassantes no Estado, foi realizado monitoramento nas linhas de inspeção sanitária pós-abate em 35 matadouros-frigoríficos sob inspeção oficial para detectar lesões granulomatosas sugestivas de TB e proceder a coleta e análise de amostras. Foram processadas e analisadas 167 amostras mediante isolamento bacteriano e técnicas moleculares. Através do método de genotipagem MIRU-VNTR, 49 isolados de M. bovis foram analisados aplicando-se 24 pares de primers diferentes. Desses, 20 marcadores de VNTR mostraram polimorfismo genético. O locus QUB26 apresentou alto poder discriminatório (h=0,66) enquanto ETRC (0,54), Mtub21 (0,5), QUB11b (0,33) e Mtub34 (0,31) mostraram moderada diversidade alélica. Os outros 15 loci (Mtub 04, 29 e 39; MIRU 04, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39 e 40; ETR A; ETR B; QUB 4156) revelaram baixo poder discriminatório (h=0,02 - 0,27). Quatro loci (MIRU 2, 10 e 20; Mtub30) não apresentaram diversidade alélica. Foram observados 28 perfis genéticos (V1-V28) nos isolados de M. bovis obtidos em 35 propriedades rurais. Dentre essas, 30 (85,71%) apresentaram somente 1 tipo de perfil genético. Apenas 19 amostras (38,77%) apresentaram perfil MIRU-VNTR único revelando a existência de isolados com o mesmo perfil MIRU-VNTR entre diferentes regiões geográficas no Estado. O isolamento, seguido da identificação molecular e discriminação genotípica por MIRU-VNTR em isolados de M. bovis constituíram fontes de relevantes informações auxiliares no desenvolvimento de estratégias de erradicação da TB na região de estudo.

Mycobacterium bovis genotyping techniques based on PCR amplification as MIRU-VNTR are important tools in the epidemiological investigation of bovine tuberculosis in areas of low prevalence, such as in the state of Mato Grosso. Based on limited information about the genotypes in state, post-slaughter sanitary inspection lines were monitored in 35 slaughterhouses under official inspection to detect granulomatous lesions suggestive of TB and to collect and analyze samples. 167 Samples were processed and analyzed by bacterial isolation and molecular techniques. Through the MIRU-VNTR genotyping method, 49 M. bovis isolates were analyzed by applying 24 different primer pairs. Of these, 20 VNTR markers showed genetic polymorphism. The QUB26 locus presented high discriminatory power (h = 0.66) while ETRC (0.54), Mtub21 (0.5), QUB11b (0.33) and Mtub34 (0.31) showed moderate allelic diversity. The other 15 loci (Mtub 04, 29 e 39; MIRU 04, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39 e 40; ETR A; ETR B; QUB 4156) showed low discriminatory power (h = 0.02 - 0.27). Four loci (MIRU2, MIRU10, MIRU20 and Mtub30) did not present allelic diversity. Twenty-eight genotypes (V1-V28) were observed in the M. bovis isolates obtained from 35 rural properties. Among these, 30 (85.71%) presented only 1 genotype type. Only 19 samples (38.77%) presented a single MIRU-VNTR profile revealing the existence of isolates with the same MIRU-VNTR profile among different geographic regions in the State. Isolation, followed by molecular identification and genotypic discrimination by MIRU-VNTR in M. bovis isolates were sources of relevant auxiliary information in the development of strategies to eradicate TB in the study region

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A cinomose canina é uma doença viral sistêmica altamente contagiosa, de distribuição mundial e que afeta uma grande variedade de carnívoros terrestres. Este estudo teve como objetivo analisar o gene F completo de cepas de campo brasileiras do vírus da cinomose canina (CDV) e compará-las com outros isolados de CDV. As amostras biológicas caninas (n=15) utilizadas neste estudo foram coletadas entre 2003-2004 (n=6) e 2013-2016 (n=9) e submetidas a ensaio de RT-PCR para amplificação do gene F completo do CDV. A análise das sequências com 2.426 bp de 14 cepas brasileiras de CDV foram classificadas na linhagem EU1 / SA1, com um agrupamento temporal entre amostras antigas (2003-2004) e contemporâneas (2013-2016), independentemente do status vacinal dos animais amostrados. Uma cepa brasileira de CDV agrupou-se na linhagem Rockborn-like, apresentando alta similaridade (98,5%) com a cepa vacinal Rockborn. Para todas as cepas brasileiras, a região Fsp apresentou a maior variação nas sequências de aminoácidos (67,4% - 96,2%). As cepas brasileiras apresentaram-se mais divergentes em relação às cepas vacinais classificadas como NA1 (24,5% - 36,3%) quando comparadas com a também cepa vacinal Rockborn (11,2% - 14,9%). Dezessete resíduos de cisteína foram encontrados no gene F completo e quatro sítios de glicosilação não conservados foram identificados na região Fsp das cepas brasileiras de CDV. Os resultados sugerem a circulação da linhagem EU1 / SA1 por 25 anos no Brasil e a atual cocirculação de cepas antigas e contemporâneas de CDV. A região Fsp demonstrou ser adequada para estudos evolutivos. Este é o primeiro estudo que realizou a análise do gene F completo de cepas de camplo brasileiras de CDV contribuindo com informações relacionadas com a epidemiologia molecular do vírus.

Canine distemper is a highly contagious systemic viral disease of worldwide distribution and that affects a wide variety of terrestrial carnivores. This study aimed to analyze the whole canine distemper virus (CDV) F gene of Brazilian field strains isolated in dogs and compared it with other CDV isolates. Canine biological samples (n = 15) that were collected among 2003-2004 (n=6) and 2013-2016 (n=9) were subjected to RT-PCR assays for the amplification of full-length CDV F gene. The sequence analysis of 2,426 bp length of 14 Brazilian CDV field strains were classified as EU1/SA1 lineage, with a temporal clustering into past (2003-2004) and contemporaneous (2013-2016) strains, regardless of the vaccination status of animals sampled. One Brazilian strain clustered into the Rockborn-like lineage, showing high similarity (98.5%) with the Rockborn vaccine isolate. For all the Brazilian strains, the Fsp region showed high aa variation (67.4% 96.2%). The Brazilian strains were more Fsp-divergent of the NA1 (24.5% 36.3%) than to the Rockborn (11.2% 14.9%) vaccine strains. Seventeen cysteine residues in the full-length F gene and four non-conserved glycosylation sites were found in the Fsp region of Brazilian CDV strains. The results suggest a 25-year circulation of EU1/SA1 lineage in Brazil and reveal a currently co-circulation of past and contemporaneous CDV strains. The Fsp-coding region of CDV genome was shown to be suitable for evolutionary studies. This is the first study dedicated to the whole CDV F gene analysis from Brazilian field strains, complementing the knowledge on molecular epidemiology of the virus.

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Os objetivos gerais desta tese foram: (i) determinar o perfil etiológico e molecular da mastite clínica (MC) em 20 rebanhos leiteiros do Sudeste do Brasil; e, (ii) quantificar os antimicrobianos usados para tratamento da MC na população estudada. Para alcançar esses objetivos, quatro estudos foram realizados. No Estudo 1, foi caracterizada a frequência de patógenos causadores de MC e a gravidade das infecções nos rebanhos leiteiros. Além disso, foi determinada a taxa de incidência de mastite clínica (TIMC) e sua associação com as seguintes variáveis em nível de rebanho: contagem de células somáticas em leite de tanque (CCSLT), contagem bacteriana total em leite de tanque (CBTLT), tamanho (número de vacas em lactação), produção de leite, sistema de alojamento e estação do ano. A associação entre as variáveis em nível de rebanho e a TIMC foi determinada por dois grupos de modelos de regressão logística multivariada: um baseado na TIMC geral, e cinco baseados nos seguintes grupos específicos de patógenos: contagiosos, outros Gram-positivos, Gram-negativos, outros patógenos (composto de leveduras e Prototheca spp.), e cultura negativa. Um total de 5.957 casos de MC em nível de quarto mamário foi registrado e os patógenos mais prevalentes foram Escherichia coli (6,6% de todas as culturas), Streptococcus uberis (6,1%), e Streptococcus agalactiae (5,9%). A maioria dos casos de MC foi de gravidade leve (60,3%), enquanto 34,1% dos casos foram moderados e 5,6% foram graves. A TIMC geral foi de 9,7 casos por 10.000 quartos-dia em risco (QDR), e o único parâmetro em nível de rebanho associado com a TIMC geral foi a CCSLT, em que a TIMC mais alta foi observada em rebanhos com CCSLT >600.000 × 10 3 células/mL. Nos modelos que avaliaram os grupos específicos de patógenos, a TIMC de patógenos contagiosos foi associada com a CCSLT, produção de leite e sistema de alojamento. Na avaliação de outros patógenos Gram-positivos, a TIMC foi maior na estação chuvosa de 2015 em comparação com as outras categorias referentes à estação do ano. Adicionalmente, para o modelo avaliando o grupo de patógenos Gram-negativos, a TIMC foi mais alta em rebanhos com CBTLT >30.000 × 10 3 ufc/mL. O Estudo 2 teve como objetivo caracterizar o perfil de tratamento e o consumo de antimicrobianos em rebanhos leiteiros; e determinar a associação de uso de antimicrobianos (UAM) e as mesmas variáveis em nível de rebanho descritas no Estudo 1. Dados sobre as práticas terapêuticas e UAM foram obtidos de 19 rebanhos leiteiros durante um período de 12 meses por rebanho. A frequência de UAM para tratamento da MC foi quantificada mensalmente em unidades de doses definidas diárias (DDD) e expressa como incidência de tratamento antimicrobiano (ITA: número de DDD por 1.000 vacas em lactação-dia). A média de ITA mensal foi de 17,7 DDD por 1.000 vacas em lactação- dia (15,4 para compostos intramamários, e 2,2 para compostos sistêmicos). Entre os produtos intramamários, os aminoglicosídeos tiveram a ITA mais alta (11,7 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia), enquanto que para os compostos administrados pela via sistêmica, as fluoroquinolonas (4,2 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia) foram os antimicrobianos mais frequentemente usados. O tamanho do rebanho e CCSLT foram positivamente associados com a ITA. Além disso, a ITA foi mais alta em rebanhos com freestall do que em rebanhos com sistema tipo compost barn. No Estudo 3, determinou-se a filogenia de cepas de E. coli isoladas de casos de MC em vacas leiteiras, e a associação dos filogrupos mais frequentes com a susceptibilidade aos antimicrobianos. Um total de 100 isolados de E. coli identificados nos casos de MC descritos no Estudo 1 foram categorizados de acordo com os grupos filogenéticos por meio de um método de PCR quadruplex; o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos também foi avaliado. A maioria dos isolados pertenceram ao grupo A (52%), seguido dos grupos B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), e E (1%). Foram encontrados isolados resistentes para todos os antimicrobianos avaliados. De forma geral, mais de 96% dos isolados de E. coli foram resistentes a ampicilina, e mais de 23% foram resistentes a cefalotina, sulfadimetoxina ou tetraciclina. Altos níveis de resistência (>70%) foram encontrados também para eritromicina, oxacilina, penicilina e penicilina associada a novobiocina. Ao contrário, foi observado alta susceptibilidade ao ceftiofur (96.8%) entre os isolados de E. coli. Diferenças na susceptibilidade entre os grupos filogenéticos foi observada apenas para a cefalotina, em que os isolados de E. coli pertencentes ao filogrupo A foram inibidos em concentrações de antimicrobianas mais baixas que isolados pertencentes ao filogrupo B1. No Estudo 4, avaliou- se a diversidade genotípica entre isolados de Strep. agalactiae e Strep. uberis identificados em casos de MC em vacas leiteiras; adicionalmente, o estudo avaliou a associação dos genótipos agrupados de acordo com a similaridade genética com o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Os isolados foram genotipados por meio do método de amplificação randômica de DNA polimórfico (RAPD). Grande diversidade genotípica foi observada tanto para o Strep. agalactiae (45 subtipos de 89 isolados) quanto para Strep. uberis (56 subtipos de 89 isolados). Para a avaliação de susceptibilidade aos antimicrobianos, os subtipos de Strep. agalactiae foram agrupados em três clusters (Ia, Ib e II), enquanto que os subtipos de Strep. uberis foram agrupados em dois clusters (I e II) de acordo com a similaridade genética. De forma geral, os isolados de Strep. agalactiae apresentaram alta susceptibilidade à maioria dos antimicrobianos, exceto para tetraciclina e eritromicina. Diferenças na susceptibilidade aos antimicrobianos entre os clusters de Strep. agalactiae foram observadas para ampicilina, ceftiofur, eritromicina, pirlimicina, sulfadimetoxina e tetraciclina. Por outro lado, os isolados de Strep. uberis foram resistentes à maioria dos antimicrobianos, exceto para cefalotina e penicilina + novobiocina. Não foram encontradas diferenças entre os clusters para todos os antimicrobianos na análise de Strep. uberis. Em conclusão, os resultados desta tese indicaram alta TIMC nos rebanhos avaliados, e apesar de os patógenos ambientais serem a causa mais comum de MC nestes rebanhos, patógenos contagiosos como Strep. agalactiae e Staph. aureus, ainda são uma preocupação em alguns rebanhos do Brasil. Além disso, observaram-se altas frequências de UAM e de terapias não recomendadas em bula entre os rebanhos avaliados. O uso não judicioso de antimicrobianos pode se tornar um fator de risco para o desenvolvimento da resistência bacteriana aos antimicrobianos, o que foi inclusive observado para isolados pertencentes as três espécies bacterianas mais prevalentes nos casos de MC no nosso estudo (E. coli, Strep. agalactiae e Strep. uberis). Finalmente, pelo fato de algumas variáveis em nível de rebanho terem sido associadas com a TIMC e com o UAM em nosso estudo, é possível que hajam oportunidades para implementação de estratégias de manejo com o objetivo de melhorar o controle da MC em rebanhos leiteiros do sudeste do Brasil.

The general objectives of this thesis were: (i) to determine the etiological and molecular profile of clinical mastitis (CM) in 20 dairy herds of Southeast, Brazil; and (ii) to quantify antimicrobial used for treatment of CM in the study population. To achieve this goals, four studies were performed. In the Study 1, we characterized the pathogen frequency and severity of CM in dairy herds. In addition, we determined the incidence rate of clinical mastitis (IRCM) and its association with the following herd-level descriptors: bulk milk somatic cell count (BMSCC), bulk milk total bacterial count (BMTBC), herd size (number of lactating cows), milk yield, housing system and season. The association between herd-level descriptors and IRCM were determined by two groups of mixed regression models: one based on the overall IRCM, and five based on the following specific-pathogen groups: contagious, other Gram-positive, Gram- negative, other (composed of yeast and Prototheca spp), and negative culture. A total of 5,957 quarter-cases of CM were recorded and the most frequently isolated pathogens were Escherichia coli (6.6% of total cultures), Streptococcus uberis (6.1%), and Streptococcus agalactiae (5.9%). The majority of CM cases were mild (60.3%), while 34.1% were moderate and 5.6% severe. Overall, the IRCM was 9.7 quarter-cases per 10,000 quarter-days at risk (QDAR), and the only herd-level parameter associated with overall IRCM was BMSCC, in which the highest IRCM was observed for herds with BMSCC >600.000 × 10 3 cells/mL. In the models evaluating the specific-pathogen groups, IRCM with isolation of major contagious pathogens was associated with BMSCC, milk yield and housing system. For the evaluation of other Gram-positive pathogens, the IRCM was higher in the rainy season of 2015 in comparison with the other seasonal categories. In addition, for the model evaluating the Gram-negative group, the IRCM was highest in herds with BMTBC >30 × 10 3 cfu/mL. The Study 2 aimed to characterize the treatment profile and quantify the antimicrobial consumption for treatment of CM in dairy herds; and to determine the association of antimicrobial use (AMU) and the same herd-level descriptors as described in the Study 1. Data on treatment practices and AMU were obtained from 19 dairy herds for a period of 12 months per herd. The AMU for treatment of CM was quantified monthly in units of defined daily dose (DDD) and expressed as antimicrobial treatment incidence (ATI; number of DDD per 1,000 lactating cows-day). The overall monthly mean ATI was 17.7 DDD per 1,000 lactating cow-days (15.4 for intramammary compounds, and 2.2 for systemically administered antimicrobials). Among intramammary drugs, aminoglycosides had the highest ATI (11.7 DDD per 1,000 lactating cow-days), while for systemically administrated antimicrobials, fluoroquinolones (4.2 DDD per 1,000 lactating cow-days) were the most frequently used antimicrobials. Herd size and BMSCC were positively associated with ATI. In addition, herd-level ATI was higher in freestall herds than in compost bedded-pack barns. In the Study 3, we determined the phylogeny of E. coli strains isolated from CM in dairy cows and the association of most frequent phylogroups with antimicrobial susceptibility. A total of 100 E. coli isolates recovered from CM cases described in the Study 1 were categorized according to their phylogenetic group using a quadruplex PCR method; antimicrobial susceptibility pattern was also evaluated. Most isolates were assigned to phylogenetic group A (52%), followed by B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), and E (1%). Resistant isolates were observed for all evaluated antimicrobials. Overall, more than 96% of E. coli isolates were resistant to ampicillin, and more than 23% were resistant to cephalothin, sulphadimethoxine or tetracycline. High levels of resistance (>70%) were also found to erythromycin, oxacillin, penicillin, penicillin associated with novobiocin, and pirlimycin. In contrary, high susceptibility was observed to ceftiofur (96.8%) among E. coli isolates. Difference in the antimicrobial susceptibility among phylogenetic groups was observed only for cephalothin, in which E. coli strains belonging to the phylogroup A were inhibited at lower antimicrobial concentrations than strains assigned to the phylogroup B1. In Study 4, we evaluated the genotypic diversity among Strep. agalactiae and Strep. uberis isolates recovered from CM in dairy cows; in addition, the study evaluated the association of genotypes clustered by genetic similarity with antimicrobial susceptibility pattern. Isolates were subtyped using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. A great genotypic diversity was found for both Strep. agalactiae (45 subtypes out of 89 isolates) and Strep. uberis (56 subtypes out of 88 isolates). For evaluation of antimicrobial susceptibility, subtypes of Strep. agalactiae were clustered into three groups (Ia, Ib and II), while Strep. uberis subtypes were clustered into two groups (I and II) according to their genetic similarity. Overall, Strep. agalactiae isolates showed high susceptibility to most antimicrobials, except to tetracycline and erythromycin. Differences in the antimicrobial susceptibility among clusters of Strep. agalactiae were observed for ampicillin, ceftiofur, erythromycin, pirlimycin, sulphadimethoxine and tetracycline. In contrary, Strep. uberis isolates were categorized as resistant to most antimicrobials, except to cephalothin and penicillin+novobiocin. No differences were observed among clusters for all antimicrobials in the analysis of Strep. uberis. In conclusion, the results of this thesis indicated a high IRCM in the evaluated herds, and although environmental pathogens were the most common cause of CM in these herds, contagious pathogens such as Strep. agalactiae and Staph. aureus, are still a concern in some dairy herds of Brazil. Furthermore, high frequencies of AMU and off-label protocols were observed among the evaluated herds. The non-judicious use of antimicrobials can become a risk factor for the development of antimicrobial resistance, which was even observed for isolates belonging to the three most prevalent bacterial species identified from CM cases in our study (E. coli, Strep. agalactiae and Strep. uberis). Finally, because there were some herd-level descriptors associated with the IRCM and AMU in our study, there may be opportunity for management strategies aiming to improve the control of CM in dairy herds of southeastern Brazil.

Resumo

In parasitology, routine laboratory diagnosis involves conventional methods, such as optical microscopy, used for the morphological identification of parasites. Currently, molecular biology techniques are increasingly used to diagnose parasite structures in order to enhance the identification and characterization of parasites. The objective of the present study was to review the main current and new diagnostic techniques for confirmation of parasite infections, namely: polymerase chain reaction (PCR), real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Luminex xMAP, random amplified polymorphic DNA (RAPD), amplified fragment length polymorphism (AFLP), and restriction fragment length polymorphism (RFLP), in addition to microsatellites. Molecular assays have comprehensively assisted in the diagnosis, treatment and epidemiological studies of parasitic diseases that affect people worldwide, helping to control parasitic disease mortality.

Resumo

O gênero Aeromonas compreende espécies consideradas importantes patógenos para os seres humanos, sendo que a principal ação patogênica delas corresponde às gastroenterites. Tendo em vista sua importância como patógeno de origem alimentar, a ocorrência de Aeromonas spp. foi estudada em carcaças bovinas e ambiente do abatedouro em uma indústria do Estado de São Paulo, com o intuito de definir a possível origem comum dessas bactérias no ambiente do frigorífico através de métodos moleculares. Foram colhidas 15 amostras de 19 pontos, totalizando 285 unidades. As amostras foram colhidas dos seguintes pontos: pele seca e úmida, superfície muscular das carcaças durante a toalete e das carcaças resfriadas, mãos dos funcionários antes e durante o trabalho na sala de abate e câmara de resfriamento, facas, parede e piso da câmara de resfriamento, água (clorada, não clorada e residuária da lavagem das carcaças), carne, conteúdo intestinal e ambiente da sala de abate. Foi realizada a caracterização do gênero e os isolados foram analisados pelas técnicas de REP (Repetitive Extragenic Palindromic) e ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR. Foi encontrada similaridade ? 99% somente entre um isolado de superfície muscular de uma carcaça resfriada com um isolado de mão. As técnicas moleculares não possibilitaram a identificação precisa da origem das bactérias na indústria, mas possibilitaram inferir que os manipuladores podem atuar como disseminadores delas no ambiente de abate.

The genus Aeromonas comprises important human pathogens and the gastroenteritises are the most common infections attributed to these microorganisms. Considering their importance as foodborne pathogens, the occurrence of Aeromonas spp. was studied on bovine carcasses and in the environment of an abattoir in State of São Paulo, Brazil, with the aim of defining the possible origin of these bacteria in the abattoir environment using molecular methods. Fifteen samples from 19 points were collected, totaling 285 units. The collecting points were: dry and wet skin, muscle surface of the carcasses during trimming process and refrigerated carcasses, operatives' hands from the slaughter room before and during the work and from refrigerated rooms, knives, wall and floor from refrigerated room, water (chlorinated, nonchlorinated and from carcass washing), meat, intestinal content and slaughter room environment. Characterization of the genus was performed and the isolates were analyzed with REP (Repetitive Extragenic Palindromic) and ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR) techniques. A similarity of ? 99% was found only between one isolate from the muscle surface of one refrigerated carcass with one isolate from a hand. The molecular techniques did not enable the precise identification of the bacteria's origin within the industry, but they permitted the inference that the operatives can spread Aeromonas in the slaughter environment.

Resumo

As doenças virais de peixes causadas por vírus das famílias Iridoviridae e Alloherpesviridae estão distribuídas mundialmente e representam uma ameaça real a expansão do sistema aquícola mundial. Desse modo, tornam-se necessários o aprimoramento e aplicação das técnicas de diagnóstico existentes a fim de se controlar ou impedir o avanço dessas viroses entre países. Vírus do gênero Megalocytivirus (MV) e o Cyprinid herpesvirus (CyHV), tipos 1, 2 e 3, induzem enfermidades em peixes com elevada taxa de mortalidade. Já vírus do gênero Lymphocystivirus (LCDV), apesar da menor patogenicidade, causam graves perdas econômicas ao reduzirem o valor comercial dos animais infectados. Devido à escassez de dados disponíveis sobre a circulação desses vírus no Brasil, o presente estudo objetivou a prospecção, incluindo a detecção e caracterização por meio da utilização de técnicas moleculares, de MV, LCDV, CyHV-1, CyHV-2 e CyHV-3 em peixes ornamentais oriundos do município de São Paulo, bem como em espécies de peixes de vida livre e comerciais provenientes de 4 estados brasileiros. Para tanto, foram coletadas e caracterizadas amostras de 306 peixes de 47 espécies diferentes, sendo que todas foram processadas para CyHV-3 e 81 foram submetidas ao diagnóstico para os demais vírus, obtendo-se uma positividade de 47% para MV, 1,2% para LCDV e 2% para CyHV-3. Todas as amostras positivas eram oriundas de peixes ornamentais do município de São Paulo. A sequência nucleotídica de LCDV obtida agrupou-se filogeneticamente em clado do genótipo VII, com similaridade de 44,8-91,1% para com outras sequências homólogas. As sequências de MV agruparam-se em clado com outras sequências de origem asiática, exibindo similaridade de 47,2-99,2% para com outras sequências. Para CyHV-3, a similaridade entre as sequências obtidas e para com outras homólogas foi igual ou superior a 97,4%, agruparando-se em 2 clados distintos. Análises evolutivas indicaram seleção negativa fraca ou relaxada para todas as sequências dos 3 grupos virais estudados. Nesse sentido, destaca-se o ineditismo dos resultados obtidos para a melhor compreensão da epidemiologia molecular desses vírus no Brasil.

Viral fish disease caused by viruses of Iridoviridae and Alloherpesviridae families are distributed globally and represent a real threat to the expansion of world aquaculture system. Thus, improvement and application of current diagnostic techniques in order to control or stop the spread of these infections among countries become necessary. Virus of Megalocytivirus (MV) gender and the Cyprinid herpesvirus (CyHV), types 1, 2 and 3, induce diseases in fish with high mortality rate. Virus of Lymphocystivirus (LCDV) gender, despite their lower pathogenicity, cause severe economic losses by reducing the commercial value of infected animals. Due to the paucity of data available on the circulation of these viruses in Brazil, this study aimed to prospecting, including the detection and characterization through the use of molecular techniques, MV, LCDV, CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3 in ornamental fish come from the city of São Paulo, as well as in fish species of free and commercial life from 5 Brazilian states. For this purpose, 306 samples of 43 different species of fish were collected and characterized, all of which were processed to CyHV-3 and 81 were subjected to the diagnosis of other viruses, yielding a positivity rate of 47% for MV, 1.2% for LCDV and 2% for CyHV-3. All positive samples were from ornamental fish of São Paulo municipality. The only LCDV-nucleotide sequence obtained was grouped phylogenetically in the genotype VII clade, showing 44.8-91.1% similarity to other homologous sequences. Sequences of MV grouped into clade with Asian sequences, displaying 47.2-99.2% similarity to other homologous sequences. For CyHV-3, the similarity among the sequences obtained in this study and the similarity to homologous sequences was equal or superior to 97.4%, grouping into 2 distinct clades. Evolutionary analysis indicated weak or relaxed negative selection for all the sequences from the 3 studied virus groups. In this sense, it can highlight the novelty of the obtained results for a better understanding of the molecular epidemiology of these viruses in Brazil.