Genetic diversity of Anaplasma marginale in calves under natural transmission conditions in the Northeast region of Pará / Diversidade genética de Anaplasma marginale em bezerros sob condições de transmissão natural na região Nordeste do Pará

The objective of the present study was to detect the genetic diversity of Anaplasma marginale strains in naturally infected calves from a rural property located in the northeastern region of the state of Pará, Eastern Amazon, which has a history of mortality due to anaplasmosis. Fourteen calves positive for A. marginale were selected using a semi-nested polymerase chain reaction for the target msp1α gene, with asymptomatic (n=3) and symptomatic (n=11) infections. After sequencing the samples, two genotypes were verified in the E and C regions and the structures in tandem repeats were determined. Nine different strains were found: eight related to the E genotype (α-ß-ß-Γ = one animal, asymptomatic; 16-F-17-F-F = two animals, symptomatic; α-ß-F-F-F-F = one animal, asymptomatic; 31-62-62-61 = one animal, symptomatic; τ-10-3 = three animals, two symptomatic and one asymptomatic; α-ß-ß-ß = one animal, symptomatic; τ-22 -13-18 = two animals, both symptomatic; ß-ß-ß-BRA1-31 = two animals, both symptomatic), and one related to genotype C (23-24-25-31-27-27 = one animal, asymptomatic). Genotype E was predominant in 92.86% of the samples (13/14), followed by genotype C (7.14%). This study made it possible to detect the genetic diversity of A. marginale in calves from the selected dairy farm, in addition to identifying the BRA1 sequence in the animals of the present study, which was recently diagnosed in Minas Gerais, demonstrating the dispersion of A. marginale strains in herds from different Brazilian states. Genetic diversity of A. marginale was observed in both symptomatic and asymptomatic calves. There were no significant differences when clinical signs were compared to the genotype verified in the infected animals. The prevalence of pathogenicity was not observed.

O objetivo do presente trabalho foi detectar a diversidade genética de cepas de Anaplasma marginale em bezerros naturalmente infectados oriundos de uma propriedade rural localizada na região nordeste do estado do Pará, Amazônia Oriental, a qual apresentava histórico de mortalidade devido à anaplasmose. Foram selecionados 14 bezerros positivos para A. marginale pela técnica de semi-nested PCR (nPCR) para o alvo no gene msp1α, com infecção assintomática (n=3) e sintomáticos (n=11). Após o sequenciamento das amostras foram verificados dois genótipos nas regiões E e C, e determinadas as estruturas em tandem repeats. Nove diferentes estirpes foram encontradas, sendo oito relacionadas ao genótipo E (α-ß-ß-Γ = um animal, assintomático; 16-F-17-F-F = dois animais, sintomáticos; α-ß-F-F-F-F = um animal, assintomático; 31-62-62-61 = um animal, sintomático; τ-10-3 = três animais, dois sintomáticos e um assintomático; α-ß-ß-ß = um animal, sintomático; τ-22-13-18 = dois animais, sintomáticos; ß-ß-ß-BRA1-31 = dois animais, sintomáticos) e uma relacionada ao genótipo C (23-24-25-31-27-27 = um animal, assintomático). O genótipo E foi predominante em 92,86% das amostras (13/14), seguido pelo genótipo C (7,14%). O estudo possibilitou a detecção da diversidade genética de A. marginale em bezerros dessa propriedade leiteira, além de identificar a sequência BRA1 nos animais do presente estudo, a qual foi diagnosticada recentemente em Minas Gerais, o que demonstra a dispersão das estirpes de A. marginale nos rebanhos de diferentes estados brasileiros. A diversidade genética de A. marginale foi observada tanto em bezerros sintomáticos quanto em assintomáticos e não houve diferença significativa quando se comparou os sinais clínicos ao genótipo verificado no animal infectado, não observando a prevalência de patogenicidade de estirpes.

High genetic diversity of Anaplasma marginale infecting dairy cattle in northeastern Brazil / Alta diversidade genética de Anaplasma marginale em bovinos de leite no nordeste do Brasil

Abstract Anaplasma marginale is an obligate intracellular Gram-negative bacterium found in ruminants' erythrocytes and is the etiological agent of bovine anaplasmosis. The bacterium's genetic diversity has been characterized based on sequences of major surface proteins (MSPs), such as MSP1α. The aim of the present study was to investigate the genetic diversity of A. marginale in cattle in the state of Maranhão, northeastern Brazil. To this end, 343 blood samples were harvested and subjected to iELISA assays using the recombinant surface protein MSP5. Out of 343 blood samples, 235 (68.5%) were randomly chosen and submitted to DNA extraction, qPCR and conventional PCR targeting the msp1α gene to determine amino acid sequences and classify the genotypes. The iELISA results showed 81.34% seropositivity (279/343), whereas qPCR revealed 224 positive samples (95.32%). Among these qPCR-positive samples, 67.4% (151/224) were also positive in the cPCR. Among the 50 obtained sequences, 21 strains had not been previously reported. Regarding the genotypes, H (26/50) and E (18/50) were identified most often, while genotypes F and C were only identified twice each and B and G once each. In conclusion, high prevalence and genetic diversity for A. marginale were observed in dairy cattle herds in the state of Maranhão.

Resumo Anaplasma marginale é uma bactéria Gram-negativa intracelular obrigatória de eritrócitos de ruminantes e responsável pela anaplasmose bovina. A diversidade genética de A. marginale tem sido caracterizada com base nas sequências das principais proteínas de superfície (MSPs), como a MSP1α. O objetivo deste estudo foi investigar a diversidade genética de A. marginale em bovinos no estado do Maranhão, Nordeste do Brasil. Dessa forma, 343 amostras de sangue foram submetidas ao ensaio iELISA, utilizando-se a proteína recombinante MSP5. Das 343 amostras de sangue, 235 (68,5%) foram escolhidas aleatoriamente e submetidas à extração de DNA, qPCR e PCR convencional para gene msp1α, para determinação das sequências de aminoácidos e classificação dos genótipos. Os resultados do iELISA mostraram 81,34% de soropositividade (279/343), enquanto qPCR revelou 224 amostras positivas (95,32%). Dentre estas na qPCR, 67,4% (151/224) mostraram-se positivas no PCR convencional. Das 50 sequências obtidas, 21 cepas não haviam sido relatadas anteriormente. Em relação aos genótipos, H (26/50) e E (18/50) foram os mais frequentes, enquanto os genótipos F e C foram identificados apenas duas vezes cada, e B e G uma vez cada. Em conclusão, alta prevalência e marcante diversidade genética de A. marginale foram observadas em rebanhos leiteiros no estado do Maranhão.

Immune response and biochemistry of calves immunized with rMSP1a ( Anaplasma marginale) using carbon nanotubes as carrier molecules / Resposta imunológica e bioquímica de bezerros imunizados com rMSP1 a (Anaplasma marginale) utilizando nanotubos de carbono como moléculas carreadoras

Vaccination against Anaplasma marginale has been considered an important control strategy for bovine anaplasmosis. Recently, mice immunized with rMSP1 a linked to carbon nanotubes (MWNT) showed significant immune responses, generating a new possibility for use of an inactivated vaccine. The objective of this study was to investigate the cellular and humoral responses in calves immunized with MWNT+rMSP1a , associated with inactivated vaccine of A. marginale produced in vitro, and evaluate the toxic effects of the MWNT on renal and hepatic function. rMSP1a was covalently linked to MWNT. Inactivated vaccine (AmUFMG2) was produced by cultivating A. marginale in IDE8 cells. Twenty-four Holstein calves were divided (four groups) and immunized subcutaneously with PBS and non-carboxylated MWNT (control, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1a (G3), and AmUFMG2 with MWNT+rMSP1a (G4). Blood samples were collected for total leukocyte counts, biochemical profiling and evaluation of the cellular and humoral response. Immunization with MWNT+rMSP1a induced increase in the total number of leukocytes, NK cells, in the lymphocyte populations and higher levels of antibodies compared to calves immunized only with AmUFMG2. Furthermore, MWNT did not induce changes in the biochemical profile. These data indicate that MWNT+rMSP1a were able to induce the immune responses more efficiently than AmUFMG2 alone, without generating toxicity.(AU)

Vacinação contra Anaplasma marginale tem sido considerada uma importante estratégia de controle da anaplasmose bovina. Recentemente, camundongos imunizados com rMSP1a funcionalizada à nanotubos de carbono (MWNT) apresentaram resposta imune significante, gerando nova possibilidade para o uso da vacina inativada. O objetivo desse estudo foi investigar a resposta celular e humoral em bezerros imunizados com MWNT+rMSP1a, associado com a vacina inativada de A. marginale produzida in vitro, e avaliar os efeitos tóxicos dos MWNT nas funções hepática e renal. rMSP1 a foi ligada covalentemente aos MWNT. Vacina inativada (AmUFMG2) foi produzida através do cultivo de A. marginale em células IDE8. Vinte e quatro bezerros Holandeses foram divididos (quatro grupos) e imunizados subcutaneamente com: PBS e MWNT não-carboxilados (controle, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1 a (G3), e AmUFMG2 com MWNT+rMSP1a (G4). Amostras de sangue foram coletadas para contagem de leucócitos, perfil bioquímico e avaliação da resposta celular e humoral. Imunização com MWNT+rMSP1a induziu aumento dos leucócitos totais, células NK, na população de linfócitos e altos níveis de anticorpos comparado com animais imunizados apenas com AmUFMG2. Além disso, MWNT não induziu alterações no perfil bioquímico. Esses dados indicam que MWNT+rMSP1a foram capazes de induzir eficientemente a resposta imune comparado com AmUFMG2 sozinho, sem gerar toxicidade.(AU)

Aspectos parasitológicos e laboratoriais da infecção por Anaplasma marginale em bovinos leiteiros em diferentes sistemas de criação intensiva

Anaplasma marginale é uma hemoparsitose responsável por prejuízos à bovinocultura devido aos surtos, com elevada mortalidade e custo com tratamento. Esta bactéria, uma vez adquirida, pode desencadear elevação de parasitemia em vacas lactantes. Além disso, pouco se sabe sobre a persistência desta rickettsiose em animais criados em diferentes sistemas intensivo de produção. Os resultados deste trabalho indicaram a ocorrência de transmissão transplacentária, bem como a capacidade do uso de diagnóstico parasitológico direto (por extensão sanguínea) e avaliação do volume globular para monitoramento de parasitemia (com aproximadamente 90 dias de idade) e triagem, respectivamente. Ainda, em diferentes sistemas de criação intensivo de vacas, todos animais em lactação apresentaram parasitemia persistente, além de titulação de anticorpos detectável para A. marginale, mesmo com números de lactações diferentes. Por fim, verificou a persistência de infecção de A. marginale e níves de anticorpos contra este agente, em vacas criadas em diferentes sistemas de produção intensivo. O critério estabelecido para a condição de estabilidade enzoótica para babesiose não se aplicou no primeiro estudo (com bezerras), mas foi observado no segundo (com vacas). Este é o primeiro trabalho que avaliou os aspectos parasitológicos, sorológicos e epidemiológico da infecção natural de A. marginale, em bovinos leiteiros acompanhados desde seis horas após o nascimento, até o início da primeira lactação, bem como foi analisado a correlação entre a parasitemia (qPCR e esfregaço sanguíneo) por A. marginale com o VGM e títulos de anticorpos anti-IgG destes animais.

Anaplasma marginale is a hemoparsitosis responsible for damage to cattle culture due to outbreaks, with high mortality and cost of treatment. These bacteria, once acquired, can trigger an increase in parasitemia in lactating cows. Furthermore, little is known about the persistence of this rickettsiosis in animals raised in different intensive production systems. The results of this study indicated the occurrence of transplacental transmission, as well as the ability to use direct parasitological diagnosis (by blood extension) and evaluation of globular volume for monitoring of parasitemia (at approximately 90 days of age) and screening, respectively. Furthermore, in different systems of intensive cow breeding, all lactating animals showed persistent parasitemia, in addition to detectable antibody titers to A. marginale, even in different lactation numbers. Finally, it verified the persistence of A. marginale infection and levels of antibodies against this agent, in cows raised in different intensive production systems. The established criterion for the condition of babesiosis enzootic stability was not applied in the first study (with calves) but was observed in the second (with cows). This is the first study that evaluated the parasitological, serological and epidemiological aspects of natural A. marginale infection in dairy cattle followed from six hours after birth until the beginning of the first lactation, as well as analyzing the correlation between parasitemia (qPCR and blood smear) by A. marginale with the PCV and anti-IgG antibody titers of these animals.

Análise da evolução do gene msp1 de Anaplasma marginale em bezerros e carrapatos e Propagação e caracterização de um isolado de Anaplasma marginale de Portugal em células IDE8

Este trabalho é composto de dois capítulos: O primeiro capítulo visou a avaliação da diversidade das sequências repetidas da proteína MSP1a de A. marginale em bovinos experimentalmente infectados e em R. microplus durante o período de 1 ano e realizou-se o reisolamento da estirpe AmRio 1 de A. marginale a partir de leucócitos. O segundo capítulo objetivou o isolamento, propagação e caracterização de uma estirpe de A. marginale de Portugal em células IDE8. Para a avaliação da diversidade de A. marginale, os bovinos foram infestados com larvas de R. microplus e posteriormente as estirpes AmRio 1 e AmRio 2 mantidas em cultivo celular foram inoculadas respectivamente no bovino 1 e no bovino 2. Posteriormente amostras de sangue foram colhidas durante 1 ano para realização de esfregaços, hematócrito, proteínas plasmáticas e a realização de seminested PCR para os genes msp5 e msp1. A partir de amostras de sangue também foram realizados isolamentos de A. marginale a partir de leucócitos. Carrapatos foram colhidos durante todo o período de estudo e suas glândulas salivares, intestinos e saliva foram submetidos à seminested PCR para o gene msp5 e msp1. Ambos os animais apresentaram estabilidade dos parâmetros avaliados e ausência de sinais clínicos, revelando uma persistência da infecção. Inclusões foram observadas em leucócitos em um esfregaço do animal 1, e foi realizado reisolamento de A. marginale nas quatro tentativas utilizando-se leucócitos para o inóculo. O animal 1 se tornou positivo para o gene msp5 a partir do dia 12 após a infecção, enquanto o animal 2 não se tornou positivo para a cepa inoculada durante todo o período de estudo analisado. As repetições em tandem avaliadas revelaram positividade para a estirpe AmRio 1 no animal 1. De 58 amostras de órgãos de carrapatos, 6 foram positivas para o gene msp5 no animal 1. No animal 2, de 20 amostras analisadas, 4 foram positivas para o gene msp5. No segundo capítulo utilizou-se eritrócitos de um bovino naturalmente infectado da região do Alentejo, Portugal, para a realização do isolamento de uma estirpe de A. marginale em células IDE8. O animal doador do inóculo foi considerado persistentemente infectado com 0,25% de rickettsemia. Observou-se inclusões características da infecção trinta e cinco dias após a inoculação em células IDE8.

This thesis consists of two chapters: The purpose of the first chapter was to evaluate the tandem repeat diversity in the major surface protein MSP1a of Anaplasma marginale in experimentally infected cattle and in Rhipicephalus microplus over the span of 1 year, and re-isolation of the A. marginale AmRio1 strain from cattle leukocytes was performed. The second chapter was aimed at isolating, propagating, and characterizing a novel Anaplasma sp. genotype from Portugal in IDE8 cells. To evaluate A. marginale genetic diversity, cattle were infested with R. microplus larvae and subsequently infected by A. marginale from tick cell cultures. The strains AmRio1 and AmRio2 were inoculated in bovine 1 and bovine 2, respectively. Subsequently, blood samples were collected over 1 year for blood smears, hematocrit, plasma proteins, and semi-nested polymerase chain reaction (PCR) for the msp5 and msp1 genes. A. marginale was also isolated from the cattle leukocytes. Ticks were collected and their salivary gland and gut DNA were tested using semi-nested PCR for the msp5 and msp1 genes. Both animals showed stability in the evaluated parameters and absence of clinical signs, showing that they had persistent infection. A blood smear from Animal 1 showed inclusions inside the leukocytes, and four attempts were made to isolate Anaplasma sp. from leukocytes for the inoculum. Animal 1 became positive for the msp5 gene on day 12 after infection, while positivity was detected in Animal 2 only 77 days after second exposure to the agent. The tandem repeats were stable when the blood and tick samples of both animals were evaluated, demonstrating the presence of the strains AmRio1 in Animal 1 and AmRio2 in Animal 2. In the second chapter, erythrocytes from a naturally infected bovine from Portugal were used for isolating Anaplasma sp. in IDE8 cells. Suggestive inclusions of infection were observed in the IDE8 cells 35 days after inoculation. The Anaplasmataceae family 16S rRNA gene from the cultures was sequenced, and showed that the isolated rickettsia was close to the A. platys species in the phylogenetic tree.

Outbreak of anaplasmosis associated with the presence of different Anaplasma marginale strains in dairy cattle in the states of São Paulo and Goiás, Brazil / Surto de anaplasmose associado com a presença de diferentes cepas de Anaplasma marginale em gado leiteiro dos estados de São Paulo e Goiás, Brasil

The present study reports the genetic diversity of Anaplasma marginale during anaplasmosis outbreaks in rural properties of the states of Goiás and São Paulo, Brazil. Mortality rates of 3.5% (37/1,050) in calves, 4.7% (45/954) in heifers and 1.1% (25/2,200) in lactating cows were observed in a cattle herd of the municipality of Mambaí, state of Goiás, central-western Brazil. In a cattle herd from the municipality of Lins, state of São Paulo, in southeastern Brazil, none of the animals died, despite presenting clinical signs suggestive of bovine anaplasmosis and exhibiting a drastic decrease in milk production. Thus, blood samples were collected from 100 animals with clinical signs suggestive of bovine anaplasmosis in the municipalities of Mambaí and Lins. Based on the microsatellite structure of the MSP1a of A. marginale, the genotypes E and H were observed in Lins, and the C, D and E genotypes were found in Mambaí. The analysis of the tandem repeat structures of the MSP1a showed nine different strains (τ-10 -15, α-β2, α-β3-13, α-β2 192, τ-β-100, α-β2-Γ, 193-β-100, 191-13-Γ and 191-13-18) in Lins and two (α-β3-Γ and E-F-φ2-F2) in Mambaí. Three new tandem repeats of MSP1a (191, 192 and 193) were described. The τ-10-15 and α-β3-Γ strains were predominantly associated with the occurrence of clinical anaplasmosis and mortality in calves, heifers and lactating cows.(AU)

O presente estudo relata a diversidade genética de Anaplasma marginale durante surtos de anaplasmose bovina no Brasil em propriedades localizadas nos Estados de Goiás e São Paulo. No rebanho bovino de Mambaí, Estado de Goiás, Centro-oeste do Brasil, observaram-se taxas de mortalidade de 3,5% (37/1050) nos bezerros; 4,7% (45/954) nas novilhas e 1,1% (25/2200) nas vacas em lactação. No rebanho bovino de Lins, Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil, embora os animais tenham apresentado sinais clínicos sugestivos de anaplasmose bovina, culminando em redução drástica da produção leiteira, nenhum animal veio a óbito. Assim, amostras de sangue de 100 bovinos com sinais clínicos sugestivos de anaplasmose foram coletadas em Mambaí-GO e Lins-SP. Baseando-se na estrutura do microssatélite da MSP1a de A. marginale, observou-se a presença dos genótipos E e H em Lins e C, D e E em Mambaí. A análise da estrutura em “tandem repeats” da MSP1a mostrou nove diferentes estirpes (τ-10 -15, α-β2, α-β3-13, α-β2 192, τ-β-100, α-β2-Γ, 193-β-100, 191-13-Γ e 191-13-18) em Lins e duas (α-β3-Γ e E-F-φ2-F2) em Mambaí. Três novos “tandem repeats” da MSP1a (191, 192 e 193) foram descritos. Foi observado predomínio das estirpes τ-10-15 e α-β3-Γ associado à ocorrência de anaplasmose clínica e mortalidade em bezerras, novilhas e vacas em lactação.(AU)

Immune response of calves inoculated with proteins of Anaplasma marginale bound to an immunostimulant complex / Resposta imune de bezerros inoculados com proteínas de Anaplasma marginale ligadas a um complexo imunoestimulante

Despite our current knowledge of the immunology, pathology, and genetics of Anaplasma marginale, prevention in cattle is currently based on old standbys, including live attenuated vaccines, antibiotic treatment, and maintaining enzootic stability in cattle herds. In the present study, we evaluated the use of an immunostimulant complex (ISCOMATRIX) adjuvant, associated with a pool of recombinant major surface proteins (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 and rMSP5) to improve the humoral immune response triggered in calves mainly by IgG2. Ten calves were divided in three groups: 4 calves were inoculated with the ISCOMATRIX/rMSPs (G1); 2 calves were inoculated with ISCOMATRIX adjuvant (G2); and 4 calves received saline (G3). Three inoculations were administered at 21-day intervals. In G1, the calves showed significant increases in total IgG, IgG1 and IgG2 levels 21 days after the second inoculation, compared to the control group (p < 0.05), and G1 calves remained above the cut-off value 28 days after the third inoculation (p < 0.05). The post-immunized sera from calves in G1 reacted specifically for each of the rMSPs used. In conclusion, the ISCOMATRIX/rMSPs induced antigen-specific seroconversion in calves. Therefore, additional testing to explore the protection induced by rMSPs, both alone and in conjunction with proteins previously identified as subdominant epitopes, is warranted.

Apesar dos avanços da imunologia, patologia e genética de Anaplasma marginale, a prevenção em bovinos ainda é baseada nas vacinas vivas atenuadas, na terapia com antibiótico e estabilidade enzoótica dos rebanhos bovinos. No presente estudo, avaliou-se o uso de um complexo imunoestimulante (ISCOMATRIX), associado às proteínas recombinantes de superfície (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 e rMSP5) para melhorar a resposta imune humoral desencadeada em bezerros, principalmente por IgG2. Dez animais foram divididos em três grupos: 4 bezerros foram inoculados com o ISCOMATRIX/rMSPs (G1), 2 bezerros foram inoculados com ISCOMATRIX adjuvante (G2) e 4 bezerros receberam salina (G3). Três doses vacinais foram administradas em intervalos de 21 dias. No G1, os bezerros apresentaram aumentos significativos nos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 21 dias após a segunda inoculação, em comparação com o grupo de controle (p <0,05). Nos bezerros do G1 esses níveis de anticorpos permaneceram acima do ponto de corte 28 dias após a terceira inoculação (p < 0,05). Os soros pós-imunização de bezerros do G1 reagiram especificamente com cada uma das rMSPs utilizadas. Em conclusão, o ISCOMATRIX/rMSPs induziu soroconversão antígeno-específica em bezerros. Portanto, se justifica a realização de ensaios adicionais para explorar a proteção induzida pela rMSPs, tanto sozinhas como em conjunto com novas proteínas identificadas com epítopos subdominantes.

Immune response of calves inoculated with proteins ofAnaplasma marginale bound to an immunostimulant complex

Despite our current knowledge of the immunology, pathology, and genetics of Anaplasma marginale, prevention in cattle is currently based on old standbys, including live attenuated vaccines, antibiotic treatment, and maintaining enzootic stability in cattle herds. In the present study, we evaluated the use of an immunostimulant complex (ISCOMATRIX) adjuvant, associated with a pool of recombinant major surface proteins (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 and rMSP5) to improve the humoral immune response triggered in calves mainly by IgG2. Ten calves were divided in three groups: 4 calves were inoculated with the ISCOMATRIX/rMSPs (G1); 2 calves were inoculated with ISCOMATRIX adjuvant (G2); and 4 calves received saline (G3). Three inoculations were administered at 21-day intervals. In G1, the calves showed significant increases in total IgG, IgG1 and IgG2 levels 21 days after the second inoculation, compared to the control group (p 0.05), and G1 calves remained above the cut-off value 28 days after the third inoculation (p 0.05). The post-immunized sera from calves in G1 reacted specifically for each of the rMSPs used. In conclusion, the ISCOMATRIX/rMSPs induced antigen-specific seroconversion in calves. Therefore, additional testing to explore the protection induced by rMSPs, both alone and in conjunction with proteins previously identified as subdominant epitopes, is warranted.

Apesar dos avanços da imunologia, patologia e genética deAnaplasma marginale, a prevenção em bovinos ainda é baseada nas vacinas vivas atenuadas, na terapia com antibiótico e estabilidade enzoótica dos rebanhos bovinos. No presente estudo, avaliou-se o uso de um complexo imunoestimulante (ISCOMATRIX), associado ás proteínas recombinantes de superfície (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 e rMSP5) para melhorar a resposta imune humoral desencadeada em bezerros, principalmente por IgG2. Dez animais foram divididos em três grupos: 4 bezerros foram inoculados com o ISCOMATRIX/rMSPs (G1), 2 bezerros foram inoculados com ISCOMATRIX adjuvante (G2) e 4 bezerros receberam salina (G3). Três doses vacinais foram administradas em intervalos de 21 dias. No G1, os bezerros apresentaram aumentos significativos nos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 21 dias após a segunda inoculação, em comparação com o grupo de controle (p 0,05). Nos bezerros do G1 esses níveis de anticoprpos permaneceram acima do ponto de corte 28 dias após a terceira inoculação (p 0,05). Os soros pós-imunização de bezerros do G1 reagiram especificamente com cada uma das rMSPs utilizadas. Em conclusão, o ISCOMATRIX/rMSPs induziu soroconversão antígeno-específica em bezerros. Portanto, se justifica a realização de ensaios adicionais para explorar a proteção induzida pela rMSPs, tanto sozinhas como em conjunto com novas proteínas identificadas com epitopos subdominantes.

Detection of genetic diversity of Anaplasma marginale isolates in Minas Gerais, Brazil / Detecção de diversidade genética de isolados Anaplasma marginale em Minas Gerais, Brasil

Bovine anaplasmosis, caused by the tick-borne rickettsiaAnaplasma marginale, is endemic in tropical and subtropical regions of the world and results in economic losses in the cattle industry. Major surface proteins (MSPs) have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and demonstrate that many isolates may occur in a given geographic area. However, in Brazil, little is known about the genetic diversity of A. marginale isolates within individual herds. This study was designed to examine the genetic variation among A. marginale infecting calves in a farm in the south of Minas Gerais State, Brazil. Blood samples collected from 100 calves were used to prepare Giemsastained smears that were microscopically examined for the presence of A. marginale. From each blood sample, DNA was extracted and analyzed by a polymerase chain reaction (PCR), followed by sequencing to determine diversity among the isolates. Examination of blood smears showed that 48% of the calves were infected with A. marginale, while the real-time PCR detected 70.2% positivity. Congenital infections were found in four calves. The microsatellite and tandem repeat analyses showed high genetic diversity among the isolates.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale e transmitida por carrapatos, é endêmica em regiões tropicais e subtropicais no mundo e causa grandes perdas econômicas na indústria de bovinos. Proteínas principais de superfície (MSPs) foram usados como marcadores para a caracterização genética de amostras de A. marginale, demonstrando que diferentes isolados podem ocorrer numa certa região geográfica. Porém, no Brasil pouco se sabe sobre a variedade genética de isolados de A. marginale em rebanhos individuais. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de variação genética entre bezerros infectados com A. marginale numa fazenda do sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de sangue coletadas de 100 bezerros foram utilizadas para o preparo de esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa, para detecção da infecção por A. marginale. Amostras de DNA extraídas de cada amostra foram analisadas através de PCR seguido de sequenciamento. O exame dos esfregaços demonstrou que 48% dos bezerros estavam infectados com A. marginale, enquanto que o PCR detectou 70,2% de positividade. Infecção congênita foi detectada em quatro bezerros. As análises de microsatélites e 'tandem repeats' comprovaram uma grande diversidade genética entre os isolados.

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Anaplasma marginale EM BOVINOS DE CORTE NO PANTANAL BRASILEIRO

Poucos são os estudos acerca da diversidade genética de Anaplasma marginale nos rebanhos bovinos brasileiros, principalmente no que diz respeito a bovinos de corte. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética de A. marginale, com base nos genes msp1 e msp4, em Bos taurus indicus amostrados no Pantanal brasileiro. Alíquotas de sangue com e sem EDTA foram colhidas de 400 bovinos (200 vacas e 200 bezerros) em cinco propriedades de cria e recria extensiva. Enquanto as amostras de soro foram submetidas ao Ensaio Imunoenzimático Indireto (iELISA) para detecção de anticorpos IgG anti-A. marginale, amostras de sangue total foram submetidas à avaliação do hematócrito e confecção de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, PCR em tempo real quantitativa (qPCR) baseada no gene msp1, semi-nested (sn)PCR baseada no gene msp1 e PCR convencional (cPCR) baseada no gene msp4 para A. marginale. Os produtos amplificados nos ensaios de snPCR e cPCR foram purificados e sequenciados pelo Método de Sanger. Sequências do gene msp1 foram submetidas à análise de diversidade pelo software RepeatAnalyser. Sequências do gene msp4 foram submetidas à análise de distância Network pelo software Splitstree e de genótipos pelo Software DnaSP5 e PopART. Cinco animais (duas vacas e três bezerros) apresentaram corpúsculos de A. marginale em esfregaços sanguíneos. As frequências de animais positivos pelo iELISA, qPCR e snPCR foram de 72,25% (289/400), 56,75% (227/400) e 22,9% (52/227), respectivamente. Os testes de iELISA e qPCR mostraram fraca concordância kappa. Vacas (154/200) mostraram-se estatisticamente mais soropositivas que bezerros (135/200) (P<0,05). Na qPCR, o número de bezerros (138/200) e valor médio de quantificação (1,3 x 106 cópias msp1 A. marginale/L) mostraram-se maiores quando comparados àqueles encontrados para as vacas (89/200; 3,9 x 104) (P<0,05). A rickettsemia estimada pela qPCR não mostrou correlação com o hematócrito dos animais. A análise de microssatélites das 26 sequências msp1 obtidas revelou a presença dos genótipos E (76,9%), C (15,38%) e B (7,69%). O software RepeatAnalyzer mostrou a ocorrência de 14 estirpes circulantes na região sob estudo, com oito nunca antes descritas na literatura (-10-13-13-18; -27-18; EV8-EV8-17; ----100; EV7-11-10-15; -11-11-27-18; -11-10-15; -27-13-18). Alta diversidade genética de A. marginale foi encontrada em bovinos de corte no Pantanal Brasileiro. Os índices de diversidade genética revelaram alta diversidade entre o grupo de genótipos/estirpes analisados, bem como na região de colheita, indicando a circulação de novos genótipos/estirpes no país, porém com baixa taxa de dispersão. A cPCR para o gene msp4 de A. marginale revelou 6,16% (14/227; 4 vacas e 10 bezerros) de positividade, Dois genótipos foram identificados entre as 14 sequências do presente estudo. Dezesseis genótipos foram obtidos entre as sequências estudadas em conjunto com as obtidas no GenBank, mostrando que os genótipos msp4 de A. marginale circulantes em bovinos de corte no Pantanal brasileiro são filogeograficamente relacionados àqueles circulantes em países das América do Sul e Central, Europa e Ásia.

There are few studies about the genetic diversity of Anaplasma marginale in Brazilian cattle herds, especially with regard to beef cattle. The present study aimed to evaluate the genetic diversity of A. marginale based on the msp1 and msp4 genes in Bos taurus indicus, sampled in the Brazilian Pantanal. Blood aliquots with and without EDTA were collected from 400 cattle (200 cows and 200 calves) in five extensive breeding and rearing properties. While the serum samples were submitted to the Indirect Immunoenzyme Assay (iELISA) for the detection of anti-A. marginale IgG antibodies, whole blood samples were submitted to the evaluation of hematocrit and Giemsa-stained blood smears, quantitative real-time PCR (qPCR) based on the msp1 gene, semi-nested (sn) PCR based on the msp1 gene and conventional PCR (cPCR) based on the msp4 gene for A. marginale. The amplified products obtained in the snPCR and cPCR assays were purified and sequenced by the Sanger Method. Sequences of the msp1 gene were submitted to diversity analysis by the RepeatAnalyser software. msp4 gene sequences were submitted to Network distance analysis using the Splitstree software and genotypes analysis by the DnaSP5 and PopART software. Five animals (two cows and three calves) presented A. marginale corpuscles in blood smears. The frequencies of iELISA positive animals, qPCR and snPCR were 72.25% (289/400), 56.75% (227/400) and 22.9% (52/227), respectively. The iELISA and qPCR tests showed weak kappa concordance. Cows (154/200) were statistically more seropositive than calves (135/200) (P <0.05). In the qPCR, the number of calves (138/200) and mean value of quantification (1.3 x 106 copies msp1 A. marginale/L) were higher when compared to those found for cows (89/200; 3.9 x 104) (P <0.05). The rickettsemia estimated by qPCR showed no correlation with the hematocrit of the animals. Microsatellite analysis of the obtained 26 msp1 sequences revealed the presence of E (76.9%), C (15.38%) and B (7.69%) genotypes. RepeatAnalyzer software showed the occurrence of 14 circulating strains in the studied region, with eight never previously described in the literature (-10-13-13-18; -27-18; EV8-EV8-17; -- --100; EV7-11-10-15; -11-11-27-18; -11-10-15; -27-13-18). High genetic diversity of A. marginale was found in beef cattle in the Brazilian Pantanal. The genetic diversity indexes showed high diversity among the group of genotypes / strains analyzed, as well as in the studied region, indicating the circulation of new genotypes / strains in the country, but with low dispersion rate. The cPCR based on the msp4 gene of A. marginale showed 6.16% (14/227, 4 cows and 10 calves) of positivity. Two genotypes were identified among the 14 sequences of the present study. Sixteen genotypes were obtained among the sequences found in the presente study in conjunction with those obtained in GenBank, showing that A. marginale msp4 genotypes circulating in beef cattle in the Brazilian Pantanal are phylogeographically related to those circulating in countries of South and Central América, Europe and Ásia

Detection of genetic diversity of Anaplasma marginale isolates in Minas Gerais, Brazil

Bovine anaplasmosis, caused by the tick-borne rickettsiaAnaplasma marginale, is endemic in tropical and subtropical regions of the world and results in economic losses in the cattle industry. Major surface proteins (MSPs) have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and demonstrate that many isolates may occur in a given geographic area. However, in Brazil, little is known about the genetic diversity of A. marginale isolates within individual herds. This study was designed to examine the genetic variation among A. marginale infecting calves in a farm in the south of Minas Gerais State, Brazil. Blood samples collected from 100 calves were used to prepare Giemsastained smears that were microscopically examined for the presence of A. marginale. From each blood sample, DNA was extracted and analyzed by a polymerase chain reaction (PCR), followed by sequencing to determine diversity among the isolates. Examination of blood smears showed that 48% of the calves were infected with A. marginale, while the real-time PCR detected 70.2% positivity. Congenital infections were found in four calves. The microsatellite and tandem repeat analyses showed high genetic diversity among the isolates.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale e transmitida por carrapatos, é endêmica em regiões tropicais e subtropicais no mundo e causa grandes perdas econômicas na industria de bovinos. Proteínas principais de superfície (MSPs) foram usados como marcadores para a caracterização genética de amostras de A. marginale, demonstrando que diferentes isolados podem ocorrer numa certa região geográfica. Porém, no Brasil pouco se sabe sobre a variedade genética de isolados de A. marginale em rebanhos individuais. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de variação genética entre bezerros infectados com A. marginale numa fazenda do sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de sangue coletadas de 100 bezerros foram utilizadas para o preparo de esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa, para detecção da infecção por A. marginale. Amostras de DNA extraídas de cada amostra foram analisadas através de PCR seguido de sequenciamento. O exame dos esfregaços demonstrou que 48% dos bezerros estavam infectados comA. marginale, enquanto que o PCR detectou 70,2% de positividade. Infecção congênita foi detectada em quatro bezerros. As análises de microsatélites e tandem repeats comprovaram uma grande diversidade genética entre os isolados.

Caracterização molecular e análise filogenética da cepa AmRio1 de Anaplasma marginale em bezerro e carrapatos experimentalmente infectados.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia intraeritrocítica Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae), é uma doença economicamente importante de bovinos que é endêmica em regiões tropicais e subtropicais do mundo. As Proteínas Principais de Superfície (MSPs) têm sido muito utilizadas em estudos envolvendo a rickettsia A. marginale, sendo MSP1a uma das mais estudadas, pois esta é uma adesina de eritrócitos bovinos e células de carrapato, possuindo assim um papel importante no fenótipo de transmissão do agente. Ao mesmo tempo, é considerada um marcador estável para cepas de A. marginale, uma vez que possui uma região C-terminal altamente conservada e uma região N- terminal, altamente variável, porém, constante para cepas. Acredita-se que esta proteína pode sofrer pressão seletiva pois possui um epítopo sensível à neutralização em sua região variável. Assim, em alterações casuais da estrutura das sequências repetidas devido à mutação, cepas bem adaptadas poderiam prevalecer no ambiente. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade do gene msp1 de A. marginale na infecção aguda e crônica em um bezerro imunocompetente experimentalmente infectado e em carrapatos. No estudo, foi utilizado um bezerro, que foi infectado experimentalmente com a cepa AmRio 1 de A. marginale por via endovenosa. Este bezerro foi acompanhado através da observação de sinais clínicos, temperatura retal, esfregaços sanguíneos e hematócrito do dia 2 após infecção experimental até o dia 28 após infecção. O bovino posteriormente foi infestado com 1g de larvas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus. O sangue do bezerro foi colhido do dia 2 ao dia 28 pós infecção. Os carrapatos foram recuperados na fase de partenógina e foram submetidos à dissecção para remoção de intestino e glândula salivar, e também foi colhida saliva de uma parte destes carrapatos. As amostras foram submetidas a PCR, possuindo como gene alvo msp1 . O produto desta reação foi enviado para sequenciamento em ambas as direções. Após a inoculação da cepa AmRio 1 de A. marginale, o bovino apresentou sinais clínicos e alterações em hematócrito e temperatura, havendo necessidade de tratamento de suporte para a recuperação do animal. Isto demonstra a patogenicidade da cepa. Todas as amostras do bezerro e dos carrapatos foram positivas na PCR. As sequências revelaram uma estabilidade nas sequências repetidas de MSP1a, tanto na infecção aguda quanto na crônica no bezerro e em todos os órgãos e salivas de carrapato. A positividade das salivas de carrapato indica que a cepa AmRio 1 de A. marginale é transmitida biologicamente por R. (Boophilus) microplus. Além disto, nos órgãos de carrapato haviam grandes quantidades de DNA de A. marginale, indicando a replicação do agente nos órgãos de R. (Boophilus) microplus.

Bovine anaplasmosis, caused by intraerythrocytic rickettsia Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae), is an economically important disease of cattle which is endemic in tropical and subtropical regions of the world. Major surface proteins (MSP) have been widely used in studies involving A. marginale rickettsia, being MSP1a one of the most studied because it is an adhesin for bovine erythrocytes and tick cells, thus having an important role in the transmission phenotype agent. At the same time, it is regarded as a stable marker for strains of A. marginale, since it has a highly conserved C-terminal region and a highly variable N-terminal region, but constant for strains. It is believed that this protein can undergo selective pressure because it has a neutralization-sensitive epitope in its variable region. Therefore, in random changes in the structure of tandem repeats due to mutation, well adapted strains could prevail in the environment. Thus, the aim of this study was to evaluate the diversity of msp1 gene of A. marginale in acute and chronic infection in one experimentally infected immunocompetent calf and in ticks. In the study, a calf, which was experimentally infected intravenously with AmRio 1 strain of A. marginale, was used. This calf was monitored by observing clinical signs, rectal temperature, blood smears and hematocrit of day-2 after experimental infection until the day 28 after infection. The bovine was subsequently infested with 1g of Rhipicephalus (Boophilus) microplus larvae. The calf's blood was collected from day 2 to day 28 after infection. Ticks were recovered parthenogenetic phase and underwent dissection of the intestines and salivary glands, and also saliva was collected from a number of these ticks. The samples were subjected to PCR, with msp1 as target gene. The product of this reaction was sent to sequencing in both directions. After inoculation of the strain AmRio 1 of A. marginale, the calf expressed clinical signs and changes in hematocrit and temperature, needing supportive treatment necessary for its recovery. This demonstrates the pathogenicity of the strain. All samples from the calf and ticks were positive in PCR. The sequences revealed a stability in tandem repeats of MSP1a, both in acute and chronic infection in the calf, and in all of the ticks' organs and saliva. The positivity of tick salivae indicates that the strain AmRio 1 A. marginale is biologically transmitted by R. (B.) microplus. In addition, ticks' organs had large quantities of DNA of A. marginale, indicating the agent's replication in organs of R. (B.) microplus.

DIVERSIDADE GENÉTICA DO ANAPLASMA MARGINALE EM CONDIÇÕES DE TRANSMISSÃO NATURAL

Anaplasma marginale é o mais prevalente patógeno transmitido por carrapatos em bovinos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A Proteína Principal de Superfície 1 alpha (MSP1a) do A. marginale contém um número variável de sequências repetidas na região animo-terminal e tem sido utilizada para a caracterização da diversidade genética desse patógeno. Nós realizamos um estudo longitudinal para averiguar a diversidade genética do A. marginale em um rebanho bovino leiteiro de Seropédica no estado do Rio de Janeiro e Taiaçu no estado de São Paulo, Brasil. Vinte bezerras foram avaliadas a cada três meses durante o primeiro ano de vida por esfregaço sanguíneo, Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (ELISA), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia da Polimerase (nPCR/qPCR). Adicionalmente, as amostras positivas para o gene msp1a usando nPCR foram sequenciadas. A frequência do A. marginale variou de 10 - 90% no esfregaço sanguíneo, 20 - 80% no ELISA/RIFI e 15 - 100% na qPCR. O número de copias da msp1a por mL de sangue variou de 1,04 x 101 a 6.76 x 1012 (Seropédica RJ) e 1.20 x 101 a 5.17 x 106 (Taiaçu SP). Os resultados mostraram que a diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Taiaçu (SP) foi baixa, com apenas três diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E. No entanto, os resultados mostraram que o diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Seropédica (RJ) foi elevada, com dezenove diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E e G. As estirpes 4-63-27 (27.4%) e -3- (77.8%) foram as mais comumente observadas em bezerras do estado do Rio de Janeiro e São Paulo, respectivamente. O novo conjunto de repetição da MSP1a 190 foi descrito em bezerras de Taiaçu e vinte e uma repetições em tandem da MSP1a resultou em novas sequências com alterações de aminoácidos, que foram rotulados como 165-186 em bezerras de Seropédica. Em Seropédica, três animais nasceram infectados com as estirpes 4-63-27, 78-242-25-31 e -102-15, sugerindo a ocorrência de transmissão transplacentária. Em Taiaçu, quatro animais infectados com a estirpe -3- morreram, mostrando assim que esta estirpe também está envolvida em casos de anaplasmose clínica em Taiaçu.

Anaplasma marginale is the most prevalent tick-borne pathogen in cattle in tropical and subtropical regions of the world. The A. marginale major surface protein 1 alpha (MSP1a) contains a variable number of tandem repeats in the amino terminal region and has been used for the characterization of pathogen genetic diversity. We conducted a longitudinal study to ascertain the genetic diversity of A. marginale in in a dairy cattle herd in Seropédica state of Rio de Janeiro and Taiaçu state of São Paulo, Brazil. Twenty calves were evaluated every three months during the first year of life by blood smear, Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Polymerase Chain Reaction (nPCR/qPCR). Additionally, samples positive for the msp1a gene using nPCR were sequenced. The prevalence of A. marginale ranged from 10 to 90% according to blood smears, 20-80% using ELISA/IFAT and 15-100% using qPCR. The number of msp1a copies per mL of blood ranged from 1,04x101 to 6.76x1012 (Seropédica RJ) and 1.20 x 101 to 5.17 x 106 (Taiaçu SP). The results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Taiaçu (SP) was low, with only three different strains identified, showing the microsatellite genotype E. However, the results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Seropédica (RJ) was high, with nineteen different strains identified, showing the microsatellite genotype E and G. The strains 4-63-27 (27.4%) and -3- (77.8%) were the most commonly observed in calves of Seropédica RJ and Taiaçu SP, respectively. The new MSP1a tandem repeat 190 was described in calves from Taiaçu and twenty-two MSP1a tandem repeats resulted in new sequences with amino acid changes, which were labeled as 165-186 in calves from Seropédica. In Seropedica, three animals were born infected, with strains 4-63-27, 78-242-25-31 and -102-15, suggesting the occurrence of transplacental transmission. In Taiaçu, four animals infected with the -3- strain died, showing that this strain is also involved in the clinical anaplasmosis cases.

UTILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES MSP1a E MSP2 NO DIAGNÓSTICO DA ANAPLASMOSE BOVINA

Ensaios de imunoadsorção indireta (ELISAs) baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes de isolado brasileiro de *A. marginale *foram desenvolvidos para detecção de anticorpos contra esta riquétsia em bovinos. As altas sensibilidades (99,0% para ambos os testes) e especificidades (100% para ambos os testes) foram confirmadas pela análise de soros positivos ou negativos para anticorpos contra *A. marginale*, respectivamente, pela imunofluorescência indireta. Pela análise de 583 soros de bovinos de três mesorregiões do Estado de Pernambuco, a concordância entre os dois testes foi alta, com índice Kappa de 0,89. As prevalências de bovinos soropositivos nestas mesorregiões também foram determinadas pelos dois testes, os quais definiram as mesorregiões Metropolitana do Recife e Mata Pernambucana como de estabilidade enzoótica para anaplasmose; e a mesorregião do Agreste como de instabilidade enzoótica. As performances similares dos dois ELISAs sugerem que ambos os testes podem ser usados em estudos epidemiológicos, para a detecção de anticorpos contra *A. marginale* em bovinos