Bacterial communities in artisanal raw bovine milk cheeses from the southern region of Brazil / Comunidades bacterianas em queijos artesanais de leite bovino cru da região sul do Brasil

The production of artisanal cheeses made with raw bovine milk has grown in the southern region of Brazil. It is important to obtain information about the risks of this practice, especially concerning food safety. In this study, next-generation sequencing was used to identify and characterize the bacterial communities of artisanal raw milk cheeses. We analyzed one pool of five raw milk samples (control group M1) from different dairy farms and nine pools (M2-M10) of 45 artisanal raw milk cheeses.The characterization of the bacterial communities included 199 species distributed across 59 different genera dispersed among the samples. Among the genera observed, 11 were classified as beneficial to the aroma, flavour, colour, and texture of the cheese. Thirty-one genera were classified as harmful to these characteristics. Another 17 were classified as potential pathogens for animals and humans, including Aeromonas, Bacillus, Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, and bacteria of the coliform group, including E. coli and Klebsiella. There was a significant difference (P < 0.05) in the number of bacterial communities identified between the control group (M1) and the two pools of artisanal raw milk cheeses (M2 and M8). This study demonstrated that next-generation sequencing provides in-depth information on the composition of the microbiota in artisanal raw milk cheeses, characterizing bacterial communities, identifying the wide microbial diversity, and identifying microbial benefits and risks.

Devido ao aumento da produção de queijos artesanais com leite bovino cru na região sul do Brasil, é importante obter informações sobre os riscos desta prática, principalmente no que se refere à segurança do alimento. Neste estudo foi utilizada a técnica de Next Generation Sequencing (NGS) para identificar e caracterizar comunidades bacterianas de queijos artesanais de leite cru. Foram analisados um pool de cinco amostras de leite cru como grupo controle (M1) de diferentes propriedades leiteiras localizadas na região norte do estado do Rio Grande do Sul, e nove pools (M2-M10) de 45 queijos artesanais de leite cru. A caracterização das comunidades bacterianas incluiu 199 espécies distribuídas em 59 gêneros diferentes dispersos entre as amostras. Dentre os gêneros observados, 11 foram classificados como benéficos ao aroma, sabor, cor e textura do queijo, enquanto 31 gêneros foram classificados como prejudiciais a essas características. Outros 17 foram classificados como potenciais patogênicos para animais e humanos, incluindo Aeromonas, Bacillus, Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, bactérias do grupo coliforme como Escherichia coli e Klebsiella. Houve diferença significativa (P < 0,05) entre o número de comunidades bacterianas identificadas no grupo controle (M1) e dois pools de queijos artesanais de leite cru (M2 e M8). Este estudo demonstra que o NGS fornece informações detalhadas sobre a composição da microbiota em queijos artesanais de leite cru, caracterizando comunidades bacterianas, identificando a ampla diversidade microbiana, os benefícios e riscos microbianos.

Avaliação do microbioma cutâneo de gatos com dermatofitose pela técnica de sequenciamento de alto rendimento e caracterização de proteínas imunodominantes do Microsporum canis para o sorodiagnóstico da dermatofitose felina

A dermatofitose e uma doenca fungica comumente vista no atendimento ambulatorial de felinos. A sua importancia clinica e epidemiologica reside no fato de ser uma dermatopatia cosmopolita, infecciosa, contagiosa e zoonotica. Atualmente, o cultivo fungico e a principal ferramenta de diagnostico utilizada, porem a sua morosidade na emissao do resultado indica a necessidade do desenvolvimento de novas estrategias de diagnostico. A aplicacao de tecnologias de imunodiagnostico, bem como tecnologias de sequenciamento da microbiota, tem um grande potencial para contribuir na identificacao e desenvolvimento de novos alvos diagnosticos. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar as proteinas imunodominantes do Microsporum canis para aplicabilidade no sorodiagnostico da dermatofitose felina. Alem disso, objetivou-se avaliar a composicao e a diversidade das microbiotas fungica e bacteriana de gatos com dermatofitose, gatos assintomaticos (carreadores de M. canis) e gatos higidos. Para os ensaios de caracterizacao das proteinas de M. canis, foram colhidas amostras cutaneas e de sangue de 70 felinos: sintomaticos (n= 20), assintomaticos (n= 20), negativos (n = 20) e negativos heterologos (n= 10). As amostras cutaneas foram submetidas a cultivos fungicos para confirmacao diagnostica e subsequente extracao de M. canis e as amostras de sangue foram avaliadas por Western blot uni e bidimensional. Para a realizacao dos ensaios de sequenciamento da microbiota, foram colhidas amostras cutaneas, pelos metodos carpete e escova de dentes, de 45 felinos: sintomaticos (n= 15), assintomaticos (n= 15) e negativos (n= 15). Essas amostras foram submetidas ao sequenciamento de alto rendimento na plataforma Illumina utilizando analise dos genes 16S rRNA e ITS1. Na avaliacao bidimensional das proteinas de M. canis, foi observado que elas se encontravam majoritariamente na faixa de pH de 7 a 3. Ainda, o WB revelou um amplo perfil antigenico com proteinas variando de 150 a 20 kDa em peso molecular. As proteinas de 30 e 42 kDa demonstraram intensa imunorreatividade em felinos sintomaticos e assintomaticos e baixa imunorreatividade nos negativos. O teste de Western blot conseguiu discriminar bem os gatos positivos dos gatos negativos para M. canis demonstrando elevados indices de sensibilidade (92,5%) e especificidade (90%) diagnosticas. Quanto aos resultados da analise de sequenciamento, foi observado que gatos sintomaticos e assintomaticos apresentaram um padrao semelhante na composicao e distribuicao da microbiota. Adicionalmente, nao foi observado diferenca estatistica na distribuicao relativa do Microsporum entre esses grupos. Os resultados do imunodiagnostico sugerem que as proteinas de 30 e 42 kDa apresentam elevada acuracia diagnostica e podem ser utilizadas em teste de WB, bem como sao potenciais candidatas a purificacao e subsequente utilizacao em ensaios enzimaticos. Adicionalmente, conclui-se que a atividade proteolitica do M. canis possui maior acao em ph acido. Em relacao aos dados do sequenciamento, conclui-se que o desencadeamento da dermatofitose esta mais relacionado a fatores intrinsecos referentes a imunidade do hospedeiro do que com fatores relacionados ao dermatofito ou com a distribuicao/composicao da microbiota comensal. Adicionalmente, conclui-se que embora o M. canis seja o agente causal e fator determinante para o desencadeamento da dermatofitose, sua acao isolada nao e suficiente para desencadear a enfermidade.

Dermatophytosis is a superficial fungal disease commonly seen in dermatological practice. This mycosis is an important skin disease of cats because it is contagious, infectious and can be transmitted to people. Currently, several diagnostic techniques are available to confirm clinical suspicion, and the fungal culture remains one of the most employed diagnostic tools. However, dermatophytes are slow-growing fungi and it may take several weeks for results. Therefore, the development of new diagnostic tests as immunodiagnostic, as well as microbiota sequencing Technologies can contribute to the proper identification and development of new diagnostic targets. The aim of this study was to identify the immunodominant proteins of Microsporum canis for the serological diagnosis of feline dermatophytosis. Additionally, this study aimed to evaluate the composition and diversity of skin fungal and bacterial communities of cats with dermatophytosis, asymptomatic cats (carriers of M. canis), and healthy cats. For the M. canis protein study, skin and blood samples were collected from 70 cats: symptomatic (n=20), asymptomatic (n=20), negative (n=20) and heterologous negative (n=10 ). Skin samples were submitted to fungal cultures for diagnostic confirmation and subsequent extraction of M. canis, and blood samples were evaluated by Western blot. For the microbiota study, skin samples were collected by combing the coat using a sterile polyester carpet and toothbrush, from 45 cats: symptomatic (n=15), asymptomatic (n=15) and negative (n=15). Samples were submitted to next-generation sequencing on the Illumina platform using 16S rRNA and ITS1 gene analysis. In the two-dimensional evaluation of M. canis proteins, it was observed that they were distributed in the pH range of 7 to 3. Furthermore, the WB revealed a broad antigenic profile with proteins ranging from 150 to 20 kDa. The 30 and 42 kDa proteins showed strong immunoreactivity in symptomatic and asymptomatic samples and low immunoreactivity in negative samples. The Western blot test was able to distinguish positive and negative cats for M. canis, showing high sensitivity (92.5%) and specificity (90%). The microbiota analysis showed that symptomatic and asymptomatic cats presented a similar pattern in the composition and distribution of skin microbiota. Additionally, no statistical difference was observed in the relative distribution of Microsporum between these groups. Immunodiagnostic results suggest that proteins of 30 and 42 kDa present high diagnostic accuracy and can be applied in WB tests, as well as being potential candidates for purification and subsequent application in serological assays. Additionally, it is concluded that the proteolytic activity of M. canis occurred mainly in acidic ph. Regarding the sequencing data, it is concluded that dermatophytosis is more linked to the host's immunity than to factors associated with the dermatophyte or distribution of the commensal microbiota. Additionally, it is concluded that although M. canis is the causative agent and responsible for triggering dermatophytosis, its isolated activity is not sufficient to trigger the disease.

Comportamento reprodutivo de Melanotênia Boesemani e fecundidade em três faixas de tamanho / Reproductive behavior of Boeseman's rainbowfish and fecundity in three size ranges

Registrou-se o comportamento reprodutivo e se comparou a fertilidade e fecundidade de 16 casais demelanotênia boesemani (Melanotaenia boesemani Allen e Cross, 1980), com tamanhos entre 1,437 g e 4,484 g, afim de elucidar características reprodutivas dessa espécie que é valorizada no comércio de peixes ornamentais.Observou-se que o comportamento de corte e acasalamento é idêntico para todos os tamanhos e similar ao deoutras espécies do grupo das melanotênias. Através de análise multivariada percebeu-se distribuição de trêsfaixas de tamanho 48,7 mm (1,579 g; n = 6), 57,2 mm (2,619 g; n=8) e 65,8 (4,484 g; n=1) com resultadosdistintos para características reprodutivas. Sendo as fêmeas de tamanho mediano (57,2 mm) as que apresentarammelhor rendimento reprodutivo com média total de 1.046 ovos, em 32 dias, sendo 691 a média de ovosfecundados e viáveis (66,1%).(AU)

It was registered the reproductive behavior of Boeseman's rainbowfish (Melanotaenia boesemani Allenand Cross, 1980), comparing fecundity and fertility of individuals weghing between 1.437 g and 4.484 g, aimingat understand the reproductive characteristics of this high-value species among the ornamental fish commerce.It was observed that courtship and breeding behavior are identical for all the evaluated sizes and similar forthose from the rainbowfish group. Through the multivariated analysis, it was noted the distribution of three sizeranges 48.7 mm (1.579 g; n = 6), 57.2 mm (2.619 g; n=8) and 65.8 (4.484 g; n=1) with different results forreproductive characteristics. Females with medium size (57.2 mm) presented the best reproductive yield, withtotal average of 1,046 eggs within 32 days, being 691 the average of fecundated and viable eggs (66.1%).(AU)

Comportamento reprodutivo de Melanotênia Boesemani e fecundidade em três faixas de tamanho / Reproductive behavior of Boeseman's rainbowfish and fecundity in three size ranges

Registrou-se o comportamento reprodutivo e se comparou a fertilidade e fecundidade de 16 casais demelanotênia boesemani (Melanotaenia boesemani Allen e Cross, 1980), com tamanhos entre 1,437 g e 4,484 g, afim de elucidar características reprodutivas dessa espécie que é valorizada no comércio de peixes ornamentais.Observou-se que o comportamento de corte e acasalamento é idêntico para todos os tamanhos e similar ao deoutras espécies do grupo das melanotênias. Através de análise multivariada percebeu-se distribuição de trêsfaixas de tamanho – 48,7 mm (1,579 g; n = 6), 57,2 mm (2,619 g; n=8) e 65,8 (4,484 g; n=1) – com resultadosdistintos para características reprodutivas. Sendo as fêmeas de tamanho mediano (57,2 mm) as que apresentarammelhor rendimento reprodutivo com média total de 1.046 ovos, em 32 dias, sendo 691 a média de ovosfecundados e viáveis (66,1%).

It was registered the reproductive behavior of Boeseman's rainbowfish (Melanotaenia boesemani Allenand Cross, 1980), comparing fecundity and fertility of individuals weghing between 1.437 g and 4.484 g, aimingat understand the reproductive characteristics of this high-value species among the ornamental fish commerce.It was observed that courtship and breeding behavior are identical for all the evaluated sizes and similar forthose from the rainbowfish group. Through the multivariated analysis, it was noted the distribution of three sizeranges – 48.7 mm (1.579 g; n = 6), 57.2 mm (2.619 g; n=8) and 65.8 (4.484 g; n=1) – with different results forreproductive characteristics. Females with medium size (57.2 mm) presented the best reproductive yield, withtotal average of 1,046 eggs within 32 days, being 691 the average of fecundated and viable eggs (66.1%).

Hemoparasitos em mamíferos silvestres oriundos da Mata Atlântica-Bahia: Um estudo de revisão sistemática, meta-análise e detecção molecular.

DE ALMEIDA, P.H.A. Hemoparasitos em mamíferos silvestres oriundos da Mata Atlântica-Bahia: Um estudo de revisão sistemática, meta-análise e detecção molecular. 2020, 93p. Tese (Doutorado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia. A Mata Atlântica é um bioma que apresenta uma grande diversidade de espécies endêmicas, como também a que possui o maior índice de espécies com perigo de extinção, fato este que torna o bioma como um hotspot para a preservação da biodiversidade. O desequilíbrio ambiental possui um forte poder na difusão e no aparecimento de doenças parasitárias em mamíferos silvestres, e dentre as parasitoses encontradastem-se aquelas causadas por protozoários. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar as taxas de infecção entre diferentes ordens de mamíferos no Brasil, através da revisão sistemática e meta-análise e conhecer a diversidade de protozoários em pequenos mamíferos oriundos do litoral Sul baiano no Estado da Bahia. Para a revisão foi realizada uma busca nas bases de dados Pubmed, Medline, Lilacs, Science direct e Scielo, sem filtro de idioma e com filtro de tempo de 2000-2020. Para condução desse processo, adotou-se a ferramenta StArt. Com base nos critérios de seleção todos os estudos que relatavam a infecção de T. cruzi em mamíferos silvestres no Brasil foram escolhidos. Para análises estatísticas foi utilizada a estatística descritiva e a meta-análise do evento dicotômico com a distribuição binominal, conduzida em Microsoft Excel. Para avaliar a heterogeneidade entre os estudos foi utilizado o cálculo das estatísticas Q e I 2 . Depois de ler todos os resumos e com base nos critérios de seleção, 35 estudos continha informações importantes da infecção em mamíferos silvestres. Entre as nove ordens de mamíferos silvestres identificadas como reservatório para o T. cruzi, três dessas ordens apresentaram maior frequência combinada: Chiroptera (55,57%); Carnívora (38,10%) e Primata (27,85%), pelo diagnóstico molecular. A detecção de protozoários foi realizada a partir de amostras de tecidos de mamíferos silvestres das ordens Rodentia e Didelphimorphia, em pool de órgãos (coração, encéfalo, pulmão, fígado e baço) de cada animal, que foram macerados e armazenados a -20oC. Para a detecção de T. cruzi foi realizada extração de DNA utilizando kit comercial e quantificação em NanoDrop®, seguida de nested-PCR para amplificação de sequências de kDNA com uso dos iniciadores S17 e S18. Dos 153 mamíferos silvestres identificados na ordem Didelphimorphia e Rodentia, foram examinados exemplares de seis e treze espécies de cada ordem, respectivamente. Um Didelphis aurita apresentou amplificação de DNA compatível com Trypanosoma ssp, correspondendo a 0,65% das amostras examinadas. Para a análise dos pools obtidos foi utilizada a técnica de sequenciamento de nova geração a partir da Plataforma Ion Torrent, foram retiradas as suspensões de tecidos que compuseram pools de até 25 amostras, agrupadas considerando as espécies de mamíferos e o seu local de origem: Una, Ilhéus, Belmonte e Mascote, resultando num total de 15 pools. Os pools obtidos foram sequenciados na Plataforma Ion Torren, sendo detectados Plasmodium berghei e P. yeolli yeolli em roedores (Hylaeamys laticeps e Thaptomys nigrita) e marsupiais (Marmosa murina) e Besnoitia besnoiti em marsupiais (Marmosa demerarae) e roedores (Akodon cursor). Nesse estudo, não houve associação entre a espécie de protozoário detectado e o município de origem da amostra, bem como a espécie. O presente estudo permitiu verificar a presença de protozoários em mamíferos silvestres no litoral Sul do Estado da Bahia, utilizando técnicas moleculares. Além disso, a revisão sistemática e meta-análise servirão como base para informar o atual contexto da infecção de T. cruzi em mamíferos silvestres noBrasil.

DE ALMEIDA, P.H.A. Molecular detection of protozoa in wild animals from Atlantic Forest. 2020, 92p. Thesis (PhD in Animal Science in the Tropics) - Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia. The Atlantic Forest is a biome that presents a great diversity of endemic species, as well asthe one that has the highest index of endangered species, a fact that makes the biome a hotspot for the preservation of biodiversity. The environmental imbalance has a strong power in the diffusion and the appearance of parasitic diseases in wild mammals, and among the parasites found there are those caused by protozoa. Thus, the objective of this work was to evaluate the infection rates among different orders of mammals in Brazil, through systematic review and meta-analysis and to know the diversity of protozoa in small mammals from the south coast of Bahia in the State of Bahia. For the review, a search was carried out in the databases Pubmed, Medline, Lilacs, Science direct and Scielo, without language filter and with 2000-2020 time filter. To conduct this process, the StArt tool was adopted. Based on the selection criteria, all studies that reported T. cruzi infection in wild mammals in Brazil were chosen. For statistical analysis, descriptive statistics, and meta-analysis of the dichotomous event with binomial distribution were used, conducted in Microsoft Excel. To assess the heterogeneity between the studies, the calculation of the Q and I 2 statistics was used. After reading all the abstracts and based on the selection criteria, 35 studies contained important information on infection in wild mammals. Among the nine orders of wild mammals identified as a reservoir for T. cruzi, three of these orders had the highest combined frequency: Chiroptera (55.57%); Carnivorous (38.10%) and Primate (27.85%), due to molecular diagnosis. The detection of protozoa was performed using tissue samples from wild mammals of the orders Rodentia and Didelphimorphia, in an organ pool (heart, brain, lung, liver and spleen) of each animal, which were macerated and stored at -20oC. For the detection of T. cruzi, DNA extraction was performed using a commercial kit and quantification in NanoDrop®, followed by nested-PCR for amplification of kDNA sequences using primers S17 and S18. Of the 153 wild mammals identified in the order Didelphimorphia and Rodentia, specimens of six and thirteen species of each order, respectively, were examined. A Didelphis aurita showed amplification of DNA compatible with Trypanosoma ssp, corresponding to 0.65% of the samples examined. For the analysis of the pools obtained, the new generation sequencing technique was used from the Ion Torrent Platform, the suspensions of tissues that composed pools of up to 25 samples were removed, grouped considering the mammal species and their place of origin: Una , Ilhéus, Belmonte and Mascote, resulting in a total of 15 pools. The pools obtained were sequenced on the Ion Torren Platform, with Plasmodium berghei and P. yeolli yeolli being detected in rodents (Hylaeamys laticeps and Thaptomys nigrita) and marsupials (Marmosa murina) and Besnoitia besnoiti in marsupials (Marmosa demerarae) and rodents (Akodon cursor). In this study, there was no association between the detected protozoan species and the municipality of origin of the sample, as well as the species. The present study allowed to verify the presence of protozoa in wild mammals on the southern coast of the State of Bahia, using molecular techniques. In addition, the systematic review and meta-analysis will serve as a basis to inform the current context of T. cruzi infection in wild mammals in Brazil.

IDENTIFICAÇÃO DA MICROBIOTA FECAL DE EQUINOS SUBMETIDOS A SOBRECARGA DE AMIDO

A microbiota bacteriana intestinal dos equinos é heterogênea e complexa, podendo ser alterada por variações introduzida na dieta. A ingestão excessiva de carboidrato solúvel altera a microbiota intestinal com possíveis consequências catastróficas sistêmicas. Com este estudo, buscou-se avaliar as implicações da sobrecarga dietética experimental com amido sobre a microbiota fecal, correlacionando-a com a indução de laminite aguda. Foram utilizados 10 equinos (fêmeas ou machos castrados) SRD, idade média de 13±5,6 anos, e peso médio de 353±28 kg. Os animais foram distribuídos num delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x2 com medidas repetidas no tempo, sendo quatro grupos: controle (GC) - água (10L) por sonda nasogástrica e, após oito horas, solução fisiológica 0,9% (5L) pela cânula cecal; controle-tampão (GCT) - água (10L) por sonda nasogástrica e, após oito horas, solução alcalinizante (3,5g de Al(OH)3, 65,6g de Mg(OH)2) e 1,2g de simeticona pela cânula cecal; amido-controle (GAC) - amido (17,6g/kg) diluído em água (10L) e, após oito horas, solução fisiológica 0,9% (5L) pela cânula cecal; amido-tampão (GAT) - amido (17,6g/kg) diluído em água (10L) e, após oito horas, solução alcalinizante (3,5g de Al(OH)3, 65,6g de Mg(OH)2) e 1,2g de simeticona pela cânula cecal. Amostras de fezes foram colhidas da ampola retal em seis intervalos de tempo: T0 (basal); T8; T12; T24; T48; T72 horas, respectivamente, após a indução com amido. Em período imediato à colheita, avaliaram-se claudicação, sinais de desconforto abdominal, ingestão de água e feno, qualidade das fezes, temperatura e frequência cardíaca. Para a extração de DNA metagenômico, amplificação e sequenciamento das regiões V4-V5 do gene 16S rRNA, empregaram-se kits específicos para sequenciador Illumina. As análises das sequências foram feitas pelo programa QIIME. Ocorreu proliferação de bactérias amilolíticas, principalmente das familílias Streptococcaceae e Lactobacillaceae, entre 12 e 48 horas após a ingestão do amido. Concomitantemente, houve diminuição da abundância relativa das bactérias fibrolíticas (Ruminococcus, Clostridum e Eubacterium). A sobrecarga dietética com amido induziu alterações clínicas de laminite aguda a partir de 12 horas da indução. Conclui-se que ocorreu disbiose intestinal com a predominância dos gêneros bacterianos Streptococcus e Lactobacillus associada ao aumento da sensibilidade dos cascos, visto que as alterações clínicas e mudanças na microbiota fecal foram temporalmente coincidentes.

The horses intestinal bacteria microbiota is heterogeneous and complex, and can be changed by diet variations. The excessive intake of soluble carbohydrate changes the intestinal microbiota with possible consequences systemic catastrophic. Then, the goal of this study is to evaluate possible changes by starch overload in the fecal microbiota, correlating with acute laminitis. Ten mixed breed horses (female or gelding), mean age 13±5,6 years and mean weight 353±28 kg, were used. They were distributed in a completely randomized design in 2x2 factorial arrangement with repeated measurements over time, being four groups: control (GC) - water (10L) by nasogastric tube and, after eight hours, physiological solution 0,9% (5L) by cecal cannula; buffer-control (GCT) - water (10L) by nasogastric tube and, after eight hours, buffer solution (3,5g of Al(OH)3, 65,6g of Mg(OH)2) and 1,2g of simethicone by cecal cannula; starch-control (GAC) - starch (17,6g/kg) diluted in water (10L) and, after eight hours, physiological solution 0,9% (5L) by cecal cannula; and buffer-starch (GAT) - starch (17,6g/kg) diluted in water (10L) and, after eight hours, buffer solution (3,5g of Al(OH)3, 65,6g of Mg(OH)2) and 1,2g of simethicone by cecal cannula. The fecal samples were collected from rectal ampoule in six collection time: T0 (basal); T8; T12; T24; T48; T72 hours, respectively, after the starch overload. After this, the lameness, the abdominal pain sings, the water and hay intake, the quality of the feces, the rectal temperature and the heart rate were evaluated. Specifics kits for Illumina plataform were used for extraction and amplification of the metagenomic DNA, and sequencing of the V4-V5 regions of the gene 16S rRNA. All the sequences analysis was made by QUIIME program. There was proliferation of amilolytic bacteria, mainly from Streptococcaceae and Lactobacillaceae families, between 12 and 48 hours after starch overload. At the same time, there was decrease of the relative abundance of fribolytic bacteria (Ruminococcus, Clostridium and Eubacterium). The starch overload induced clinical changes of acute laminitis from 12 hours of induction. It was concluded that there was gut disbiose with predominance of genera Streptococcus and Lactobacillus in association with greater hoof sensitivity, since clinical and fecal microbiota changes were concomitant.

Seleção de marcadores moleculares em associação a características de interesse produtivo no tambaqui (Colossoma macropomum)

O Tambaqui (Colossoma macropomum), natural das bacias do rio Amazonas e do rio Orinoco, possui características favoráveis ao sistema de cultivo e boa aceitação de mercado. Contudo, há poucos estudos genéticos realizados com esta espécie, especialmente de melhoramento genético. Para a construção de um mapa genético desta espécie, é necessário o desenvolvimento de um elevado número de marcadores moleculares. Desta forma, este estudo teve como objetivo caracterizar microssatélites gene-associados e neutros (não gênicos), obtidos por Next Generation Sequencing (RNA-seq e Whole Genome Shotgun - WGS, respectivamente), para serem disponibilizados em estudos de associação com QTLs (Quantitative Trait Loci) e construção de um mapa genético. De modo geral, a avaliação de 200 marcadores (100 de cada conjunto) resultou em 45 loci polimórficos. Do conjunto de marcadores RNA-seq, as heterozigosidades observada e esperada (HO e HE) variaram de 0,09 a 0,73, e 0,09 a 0,85, respectivamente. Do conjunto WGS, HO e HE variaram de 0,33 a 0,95, e 0,28 a 0,92, respectivamente. Posteriormente, alguns microssatélites foram testados em três famílias de C. macropomum para buscar associações com características de resistência à bactéria e crescimento. Para o estudo de resistência, três famílias (n = 120), foram submetidas ao desafio bacteriano com Aeromonas hydrophila. Os dados do desafio apresentaram diferenças significativas nos tempos de morte e taxa de mortalidade entre as famílias. O crescimento foi avaliado por medidas morfométricas e peso, sendo que todas as características estavam correlacionadas significativamente (p < 0,01). Análises de associação microssatélite/fenótipo sugeriram que o marcador gene-associado c3842 (tncrc6b) está associado ao comprimento padrão (CP) e um marcador neutro (r912) com a altura 2 (A2). O presente estudo possibilitou prospectar marcadores moleculares associados com crescimento que poderão ser utilizados na validação de seleção assistida por marcadores em famílias de tambaqui. Em conclusão, estes dados servirão como subsídios biotecnológicos para acelerar o melhoramento genético do tambaqui, que é a principal espécie nativa produzida na América do Sul.

Tambaqui (Colossoma macropomum), is a fish species of the Amazon and Orinoco rivers, with favorable traits to the production system and market acceptance. However, there are few genetic studies with this species, especially genetic improvement. For the construction of a genetic map of this species, the development of a high number of molecular markers is necessary. Thus, this study aimed to characterize gene-associated and neutral (non-gene) microsatellites obtained by Next Generation Sequencing (RNA-seq and Whole Genome Shotgun - WGS, respectively), to be available in association studies with Quantitative Trait Loci (QTLs) and construction of a genetic map. Overall, the evaluation of 200 markers (100 of each set) resulted in 45 polymorphic loci. In the RNA-seq data, the observed and expected heterozygosity (Ho and He) ranged from 0.09 to 0.73, and 0.09 to 0.85, respectively. In the WGS data, Ho and He ranged from 0.33 to 0.95, and 0.28 to 0.92, respectively. Subsequently, some microsatellites were tested in three families of C. macropomum to seek associations with bacterial resistance and growth characteristics. For the resistance study, three families (n = 120) were submitted to the bacterial challenge with Aeromonas hydrophila. The challenge data presented significant differences in time of death and mortality rate among the families. Growth was evaluated by morphometric measures and weight, and all the characteristics were significantly correlated (p < 0.01). Microsatellite/phenotype association analyzes have suggested that the gene-associated marker (tncrc6b) is associated with the standard length (CP) and a neutral marker (r912) with height 2 (A2). The present study made it possible to prospect for molecular markers associated with growth that could be used in the validation of marker - assisted selection in tambaqui families. In conclusion, these data will serve as biotechnology subsidies to accelerate the genetic improvement of tambaqui, which is the main native species produced in South America.

Perfil transcriptômico de oócitos maturados e blastocistos bubalinos (Bubalus bubalis) produzidos in vitro

Os búfalos tem potencial econômico e industrial que está, no entanto, sub-utilizado devido, entre outros fatores, a baixa eficiência de biotecnologias reprodutivas como a Produção In Vitro de Embriões (PIVE). A eficiência da PIVE, por sua vez, relaciona-se ao conhecimento sobre o funcionamento de oócitos e embriões. Nesse sentido, o uso de Sequenciamento De Nova Geração (NGS) de RNA (RNA-seq) têm proporcionado avanços para o entendimento dos mecanismos de maturação oocitária e desenvolvimento embrionário em diversas espécies domésticas, e foram revisados no capítulo 1. Este trabalho é dedicado ao estudo dos aspectos moleculares da maturação oocitária e desenvolvimento embrionário em bubalinos. No capítulo 2, foi feita a descrição e análise dos transcriptomas de oócitos maturados e blastocistos produzidos in vitro de búfalos. Para isso, mRNA foi extraído para a construção de bibliotecas barcoded, que foram sequenciadas na plataforma Ion ProtonTM. As reads foram alinhadas ao genoma de referência bovino (Bos taurus UMD3.1), sendo utilizados o programa Cufflinks para calcular a abundância relativa dos transcritos e o pacote DESeq2 para analisar a expressão. Observou-se a expressão de 13.976 genes, dos quais houve genes compartilhados (62%) e exclusivos com funções especializadas em oócitos (1,6%) e blastocistos (15,7%). Houve 4.153 genes diferencialmente expressos em blastocistos em relação aos oócitos, dos quais alguns genes com maior variação de expressão foram relacionados ao metabolismo de lipídios, implantação e maturação oocitária. Foi elaborado um painel transcriptômico de oócitos e blastocistos in vitro de búfalos, sendo discutida a importância de genes alvo promissores em futuras estratégias de aprimoramento da PIVE na espécie bubalina. No capítulo 3, os transcriptomas de oócitos e blastocistos de búfalos foram comparados aos de bovinos relatados na literatura. Dado que os protocolos de PIVE em búfalos são em grande parte inspirados em bovinos, esta comparação foi utilizada para indicar as simailaridades dos transcriptomas dessas espécies. Foi utilizada a análise de redes de co-expressão e preservação de módulos do pacote WGCNA do programa R. Como resultado, foi observada grande similaridade dos perfis transcriptômicos de búfalos e bovinos. Dos 7 módulos de co-expressão identificados em búfalos, 4 foram fortemente preservados (Z-summary>10) em bovinos, sendo suas ontologias gênicas relacionadas ao programa de desenvolvimento embrionário. Porém, o perfil de expressão dentro dos módulos, definido pelos hub genes, foi diferente, indicando diferenças importantes, em termos de interações gênicas, entre as duas espécies. Conclui-se que esta análise inicial dos transcriptomas de oócitos e blastocistos bubalinos indicou a presença de genes relevantes para a qualidade oocitária e embrionária. E a comparação dos transcriptomas de búfalos e bovinos indicoudiferenças de expressão dentro de módulos conservados que justificam a elaboração de protocolos de PIVE específicos para búfalos.

The buffalos have economic and industrial potential, which is, however, underutilized due, among other factors, to the low efficiency of reproductive biotechnologies such as In Vitro Embryo Production (PIVE). The efficiency of PIVE, in turn, is related to knowledge about the functioning of oocytes and embryos. In this sense, the use of New Generation Sequencing (NGS) of RNA (RNA-seq) has provided advances for the understanding of the mechanisms of oocyte maturation and embryo development in several domestic species, and were reviewed in chapter 1. This work is dedicated To study the molecular aspects of oocyte maturation and embryonic development in buffalos. In chapter 2, the description and analysis of the transcriptomes of mature oocytes and blastocysts produced in vitro of buffalos was made. For this, mRNA was extracted for the construction of barcoded libraries, which were sequenced on the Proton Ion platform. The reads were aligned to the bovine reference genome (Bos taurus UMD3.1), using the Cufflinks program to calculate the relative abundance of the transcripts and the DESeq2 package to analyze expression. It was observed the expression of 13,976 genes, of which there were shared (62%) and exclusive genes with specialized functions in oocytes (1.6%) and blastocysts (15.7%). There were 4,153 genes differentially expressed in blastocysts in relation to oocytes, of which some genes with greater variation in expression were related to lipid metabolism, implantation and oocyte maturation. A transcriptomic panel of oocytes and in vitro blastocysts of buffalos was elaborated, and the importance of promising target genes was discussed in future strategies for enhancement of PIVE in the buffalo species. In chapter 3, transcripts of oocytes and buffalo blastocysts were compared to those of cattle reported in the literature. Since the PIVE protocols in buffalos are largely bovine inspired, this comparison was used to indicate the mimicry of the transcriptomes of these species. The analysis of coexpression networks and preservation of modules of the WGCNA package of the R program was used. As a result, a great similarity of buffalo and bovine transcriptomic profiles was observed. Of the 7 co-expression modules identified in buffalo, 4 were strongly preserved (Z-summary> 10) in cattle, with their genetic ontologies related to the embryonic development program. However, the expression profile within the modules, defined by the genes hub, was different, indicating important differences in terms of gene interactions between the two species. It is concluded that this initial analysis of oocyte and buffalo blastocyst transcripts indicated the presence of genes relevant for oocyte and embryonic quality. And the comparison of buffalo and bovine transcriptomes indicated differences of expression within conserved modules that justify the elaboration of specific PIVE protocols for buffalos.

ANÁLISE DO VIROMA DE SOROS DE MATRIZES SUÍNAS COM PARTOS NORMAIS E COM NATIMORTALIDADE

Falhas reprodutivas são importante causa de prejuízos econômicos na suinocultura. Elas implicam na diminuição do número de leitões nascidos vivos e aumentam o descarte de animais e as taxas de reposição de matrizes, levando à redução da produtividade do rebanho. Embora a maioria dos casos de natimortalidade sejam associados a fatores não infecciosos, os agentes infecciosos possuem um papel importante e ainda pouco conhecido na etiologia deste quadro. Até o presente, nenhum trabalho foi realizado visando o estudo do conjunto de vírus que possam estar presentes em matrizes com eventos de natimortalidade por ocasião do parto. Em função disso, o presente trabalho teve por objetivo examinar o viroma do soro de matrizes suínas com e sem casos de natimortalidade. Foram coletadas 94 amostras de soro de matrizes de seis granjas distribuídas em cinco municípios do Rio Grande do Sul. Em cada granja foram formados dois pools de soros: um composto por matrizes que pariram (um ou mais) natimortos e outro por matrizes que pariram leitegadas sem natimortos. Os pools foram submetidos à extração de ácido nucleico viral, enriquecimento e sequenciamento de alto desempenho, buscando a identificação de agentes que possam representar um fator de risco à natimortalidade em suínos. Não foi possível identificar diferenças significativas nos viromas de matrizes correlacionadas à ocorrência de natimortalidade. Não obstante, foi possível identificar uma ampla variedade de genomas virais, a maioria deles correspondendo a vírus das famílias Anelloviridae. Este estudo permitiu ainda identificar 20 genomas completos de três espécies de vírus: torque teno vírus suíno 1a e 1b, circovírus suíno tipo 3 (PCV3) e vírus circulares DNA fita simples codificantes de replicase (CRESS), seis dos quais até o presente ainda não reportados em suínos. Em duas granjas, em matrizes que apresentaram natimortalidade, foram identificados genomas de PCV3, cuja participação como potencial causador de problemas reprodutivos precisa ser futuramente investigada. Não foram identificados vírus com genoma de RNA. Este estudo traz uma contribuição ao conhecimento do viroma em soros de matrizes suínas e, paralelamente, busca contribuir para o esclarecimento das possíveis causas de natimortalidade de origem infecciosa em suínos.

Reproductive failure in swine herds is an important cause of economic losses. It leads to a decrease in the number of piglets reared per sow and may imply in the need for replacement of sows, reducing the productivity in a herd. Although the majority of cases of stillbirths have been attributed to non-infectious causes, several infectious agents have been implicated in the etiology of such condition. Nevertheless, other as yet unknown agents may be involved in the pathogenesis of stillbirths. The aim of this work was to investigate the virome in sera of sows without and with one or more cases of stillbirth in the litter. Sera were collected from 94 sows of six commercial farms in five municipalities in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Two pools of sera were collected from each farm: one representative of sows that had at least on stillbirth in the last litter and another composed by sera of sows that had litters with no stillbirths. The pools were subjected to nucleic acid extraction, enrichment and high throughput sequencing. No significant differences were detected in the serum viromes of sows with or without stillbirth. Nevertheless, it was possible to identify a wide variety of viral genomes, most of these representing viruses of Anelloviridae family. In addition, the present work allowed the identification of 20 complete genome sequences including torque teno sus virus 1a and 1b, porcine circovirus 3 (PCV3) and circular rep-encoding ssDNA viruses (CRESS), including six species not previously reported in swine. In two farms, PCV3 genomes were identified in the serum pools of sows which had cases of stillbirth. The role for this virus as a potential cause of reproductive failure needs additional investigations. No genomes of viruses with RNA genomes were identified. This study provides a contribution to the knowledge on the serum virome of pregnant sows. In addition, it is expected to aid in the identification of possible causes of stillbirth in swine.

Identificação de Loci microssatélites em Viola - Loricariichthys anus (Valenciennes, 1840)

No Brasil existe uma rica diversidade de peixes, porém, pouco se conhece sobre a biologia das diferentes espécies. A Viola Loricariichthys anus é uma espécie nativa do sul da América do Sul que possui grande potencial econômico e que necessita de uma grande atenção em relação à conservação. Os marcadores microssatélites são uma ótima ferramenta para o estudo genético, conservação e melhoramento genético de peixes, ainda mais com as tecnologias de nova geração de sequenciamento, que diminuem os custos e otimizam o tempo e os resultados. O objetivo do trabalho foi identificar loci microssatélites para a espécie não-modelo L. anus para posteriormente conhecer como a espécie está e se comporta geneticamente. A extração de DNA foi realizada pelo protocolo de extração de sílica de vidro modificada. Uma biblioteca genômica shotgun paired-end foi preparada através do protocolo Kit Illumina Nextera DNA Library, sendo então sequenciada em um sequenciador MiSeq Illumina e as 1.103.580 leituras obtidas foram analisadas no programa PAL_FINDER_V0.02.03 a fim de reconhecer os marcadores microssatélites. Foram obtidos 444 loci microssatélites potencialmente amplificáveis (PALs), dos quais 161 eram de dinucleotídeos, 65 de trinucleotídeos, 170 de tetranucleotídos, 32 de pentanucleotídeos e 16 de hexanucleotídeos. Um grupo de doze loci foram escolhidos para validação através da técnica de PCR, destes 6 foram amplificados quatro dinucleotídeos e dois tetranucleotídeos. Contudo, podemos definir que a estratégia de sequenciamento através de biblioteca shotgun paired-end da plataforma MiSeq (Illumina) apresentou-se eficaz mesmo apresentando um baixo número de PALs quando comparado a outros trabalhos, além de ser rápida e de baixo custo, quando comparada a técnicas antigas, para desenvolver marcadores microssatélites para espécies não modelo como a viola.

In Brazil there is a rich diversity of fish, however, little is known about the biology of different species. The Viola - Loricariichthys anus - is a native species of southern South America which has great economic potential and requires great attention towards conservation. Microsatellite markers are a great tool for the genetic study, conservation and breeding of fish, especially with the next-generation sequencing technologies that reduce costs and optimize time and results. The objective was to identify microsatellite loci for the non-template species L. anus and know how the species is and behave genetically. DNA extraction was performed by the modified glass silica extraction protocol. A genomic library shotgun paired-end was prepared by Kit Nextera Illumina DNA Library protocol and then sequenced in a MiSeq Illumina sequencer and 1,103,580 of obtained readings were analyzed in PAL_FINDER_V0.02.03 program to recognize the microsatellite markers. Were obtained 444 microsatellite loci potentially amplifiable (PALs), of which 161 were dinucleotides, 65 were trinucleotides, 170 were tetranucleotides, 32 and 16 pentanucleotides and hexanucleotides. A group of twelve loci were chosen for validation by PCR. These 6 were amplified - four dinucleotides and two tetranucleotídes. However, we can define the sequencing strategy through library shotgun paired-end MiSeq platform (Illumina) presented itself effective even with a low number of PALs when compared with other studies, as well as being quick and inexpensive to develop microsatellite markers for non-template species such as the viola.

Transcriptoma de metacestóide de Taenia saginata

Taenia saginata representa uma ameaça à segurança alimentar e à saúde pública devido à infecção pela ingestão de carne mal cozida e contaminada. Esta zoonose está amplamente distribuída, afetando humanos, os hospedeiros definitivos, e bovinos, hospedeiros intermediários. Além disto, a cisticercose bovina é responsável por perdas econômicas significativas devido à condenação de carcaças infectadas. A estratégia fundamental para o controle do complexo teníase-cisticercose consiste em interromper o ciclo evolutivo do parasita, evitando assim a infecção nos animais e no homem. Assim, a principal medida praticada no Brasil tem sido a inspeção de carcaças durante o abate, a qual é também a forma mais comum de diagnóstico. A insuficiente informação molecular de T. saginata tem dificultado o avanço das pesquisas para o aprimoramento de testes diagnósticos, o desenvolvimento de vacinas e a identificação de novas drogas para tratamento. Com o intuito de adquirir informação sobre o estágio de desenvolvimento metacestóide do parasita, foi utilizada a tecnologia de RNAseq para a montagem do transcriptoma de metacestóide de T. saginata. Estes dados serão úteis para estudos futuros envolvendo triagem para diagnóstico e marcadores imunoprofiláticos para a cisticercose bovina.

Taenia saginata represents a threat to food security and public health in consequence of human infection by ingestion of contaminated undercooked meat. This zoonosis is worldwide distributed, affecting human, definitive host, and bovine, intermediate host. Besides, bovine cysticercosis is responsible for significant economic losses due to the condemnation of infected carcasses. The main strategy to control taeniasis-cysticercosis complex consists of interrupting the parasites biological cycle, thus preve nting human and animal infection. Therefore, in Brasil the main control measure has been the carcass inspection during the slaughter, which is also the most common diagnostic practice. Insufficient T. saginata molecular information makes difficult consistent advances to the improvement of diagnostic tests, vaccine development and the identification of new drugs for treatment. In order to gain insights about the parasite's metacestode developmental stage, RNAseq technology was used to assemble the whole transcriptome of a T. saginata metacestode. These data will also be useful for the next generation screening studies of diagnostic and immunoprophylatic markers for bovine cysticercosis.