Assisted Reproductive Technologies (ART) and genome editing to support a sustainable livestock

This article provides an overview of assisted reproductive technologies (ART) and genome engineering to improve livestock production systems for the contribution of global sustainability. Most ruminant production systems are conducted on grassland conditions, as is the case of South American countries that are leaders in meat and milk production worldwide with a well-established grass-feed livestock. These systems have many strengths from an environmental perspective and consumer preferences but requires certain improvements to enhance resource efficiency. Reproductive performance is one of the main challenges particularly in cow-calf operations that usually are conducted under adverse conditions and thus ART can make a great contribution. Fixed-time artificial insemination is applied in South America in large scale programs as 20 to 30% of cows receive this technology every year in each country, with greater calving rate and significant herd genetic gain occurred in this region. Sexed semen has also been increasingly implemented, enhancing resource efficiency by a) obtaining desired female replacement and improving animal welfare by avoiding newborn male sacrifice in dairy industry, or b) alternatively producing male calves for beef industry. In vitro embryo production has been massively applied, with this region showing the greatest number of embryos produced worldwide leading to significant improvement in herd genetics and productivity. Although the contribution of these technologies is considerable, further improvements will be required for a significant livestock transformation and novel biotechnologies such as genome editing are already available. Through the CRISPR/Cas-based system it is possible to enhance food yield and quality, avoid animal welfare concerns, overcome animal health threats, and control pests and invasive species harming food production. In summary, a significant enhancement in livestock productivity and resource efficiency can be made through reproductive technologies and genome editing, improving at the same time profitability for farmers, and global food security and sustainability.(AU)

Use of melatonin in the in vitro production of bovine embryos / Uso da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos

We aimed to assess the effects of melatonin in the in vitro production of bovine embryos. Our experiment was conducted at the Laboratório de Reprodução Animal of the Universidade Estadual do Maranhão. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were distributed among treatments at concentrations of 0, 10-1, 10-3 and 10-5 µMol/L melatonin. Our experiment was further divided into two: the first was to assess the effect of different concentrations of melatonin (treatments) on the maturation rate of COCs, and the second was to assess the effects of melatonin treatments on the in vitro production of bovine embryos. The results from the first experiment demonstrated no significant difference between the in vitro maturation rate of the cultivated COCs in treatments with melatonin. In the second experiment, however, melatonin treatments yielded statistically higher cleavage, morula and blastocyst rates in the 10-5 µM group (52.9%, 52.9%, and 35.3%, respectively), and lower rates in the 10-1 µM group (19.5%, 19.5% and 7.8%, respectively), compared to the others. The control group (no melatonin) and the 10-3 µM group showed similar results. We concluded that supplementation of melatonin in the in vitro maturation medium resulted in no improvement in the oocyte maturation rate, but in the in vitro production of embryos at different concentrations, the 10-5 µM group displayed better results, but with no improvement in the variables (P < 0.05).(AU)

Objetivou-se avaliar os efeitos da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Estadual do Maranhão. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram distribuídos entre os tratamentos 0, 10-1, 10-3 e 10-5 µmol/L de melatonina. A avaliação foi dividida em dois experimentos, onde o primeiro avaliou o efeito dessas diferentes concentrações de melatonina (tratamentos) sobre a taxa de maturação dos CCOs e o segundo, o efeito desses tratamentos com melatonina sobre a produção in vitro de embriões bovinos. Os resultados no primeiro experimento demonstraram não haver diferença significativa na taxa de maturação in vitro dos CCOs cultivados no tratamento com melatonina. No entanto, o tratamento com melatonina no segundo experimento, as taxas de clivagens, mórulas e blastocistos, o grupo 10-5 µM foi estatisticamente superior (52,9%, 52,9% e 35,3%, respectivamente) e o grupo 10-1 µM inferior (19,5%, 19,5% e 7,8%, respectivamente) aos outros grupos. O grupo controle (sem melatonina) e o grupo 10-3 µM obtiveram resultados semelhantes. Concluiu-se que a suplementação da melatonina no meio de maturação in vitro não evidenciou melhoras na taxa de maturação dos oócitos, porém na produção in vitro de embriões em diferentes concentrações, o grupo 10-5 µM apresentou melhores resultados mesmo não havendo melhorias nas variáveis (P<0,05).(AU)

Use of melatonin in the in vitro production of bovine embryos / Uso da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos

We aimed to assess the effects of melatonin in the in vitro production of bovine embryos. Our experiment was conducted at the Laboratório de Reprodução Animal of the Universidade Estadual do Maranhão. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were distributed among treatments at concentrations of 0, 10-1, 10-3 and 10-5 µMol/L melatonin. Our experiment was further divided into two: the first was to assess the effect of different concentrations of melatonin (treatments) on the maturation rate of COCs, and the second was to assess the effects of melatonin treatments on the in vitro production of bovine embryos. The results from the first experiment demonstrated no significant difference between the in vitro maturation rate of the cultivated COCs in treatments with melatonin. In the second experiment, however, melatonin treatments yielded statistically higher cleavage, morula and blastocyst rates in the 10-5 µM group (52.9%, 52.9%, and 35.3%, respectively), and lower rates in the 10-1 µM group (19.5%, 19.5% and 7.8%, respectively), compared to the others. The control group (no melatonin) and the 10-3 µM group showed similar results. We concluded that supplementation of melatonin in the in vitro maturation medium resulted in no improvement in the oocyte maturation rate, but in the in vitro production of embryos at different concentrations, the 10-5 µM group displayed better results, but with no improvement in the variables (P < 0.05).

Objetivou-se avaliar os efeitos da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Estadual do Maranhão. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram distribuídos entre os tratamentos 0, 10-1, 10-3 e 10-5 µmol/L de melatonina. A avaliação foi dividida em dois experimentos, onde o primeiro avaliou o efeito dessas diferentes concentrações de melatonina (tratamentos) sobre a taxa de maturação dos CCOs e o segundo, o efeito desses tratamentos com melatonina sobre a produção in vitro de embriões bovinos. Os resultados no primeiro experimento demonstraram não haver diferença significativa na taxa de maturação in vitro dos CCOs cultivados no tratamento com melatonina. No entanto, o tratamento com melatonina no segundo experimento, as taxas de clivagens, mórulas e blastocistos, o grupo 10-5 µM foi estatisticamente superior (52,9%, 52,9% e 35,3%, respectivamente) e o grupo 10-1 µM inferior (19,5%, 19,5% e 7,8%, respectivamente) aos outros grupos. O grupo controle (sem melatonina) e o grupo 10-3 µM obtiveram resultados semelhantes. Concluiu-se que a suplementação da melatonina no meio de maturação in vitro não evidenciou melhoras na taxa de maturação dos oócitos, porém na produção in vitro de embriões em diferentes concentrações, o grupo 10-5 µM apresentou melhores resultados mesmo não havendo melhorias nas variáveis (P<0,05).

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.(AU)

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.(AU)

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.

Produção in vitro de embriões bovinos oriundos de fêmeas previamente tratadas com somatotropina recombinante bovina (rbST) / In vitro production of bovine embryos derived from females previously treated with recombinant bovine somatotropin (rbST)

This study aimed to evaluate the effect of rbST on in vitro production of Girolanda female embryos.Ovum Pick-Up (OPU) was performed to obtain the cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to thePIV. Pretreatment of rbST in cows Girolando did not influence the embryo development rate in vitro production.(AU)

Produção in vitro de embriões bovinos oriundos de fêmeas previamente tratadas com somatotropina recombinante bovina (rbST) / In vitro production of bovine embryos derived from females previously treated with recombinant bovine somatotropin (rbST)

This study aimed to evaluate the effect of rbST on in vitro production of Girolanda female embryos.Ovum Pick-Up (OPU) was performed to obtain the cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to thePIV. Pretreatment of rbST in cows Girolando did not influence the embryo development rate in vitro production.

Efeito da melatonina na maturação in vitro de oócitos caprinos / Effect of melatonin on in vitro maturation of goat oocytes

To evaluate the effect of melatonin on in vitro maturation of goat oocytes, 12 females were used asoocyte donor. They were subjected to ovarian stimulation and ovum pickup by laparotomy. Oocytes wereevaluated and allocated into three groups of in vitro maturation: M0 (oocytes matured in TCM199 andsupplements); M10 and M50 (oocytes matured in M0 medium supplemented with 10 μM and 50 μM melatonin,respectively). All groups were subjected to the cell incubator for 24 hours at 38.5°C with a humidifiedatmosphere containing 5% CO2. For data analysis, Chi-square test was used, with a probability of 5% and acorrelation test. In conclusion, melatonin reduced in vitro maturation rates of goat oocytes.(AU)

Efeito da melatonina na maturação in vitro de oócitos caprinos / Effect of melatonin on in vitro maturation of goat oocytes

To evaluate the effect of melatonin on in vitro maturation of goat oocytes, 12 females were used asoocyte donor. They were subjected to ovarian stimulation and ovum pickup by laparotomy. Oocytes wereevaluated and allocated into three groups of in vitro maturation: M0 (oocytes matured in TCM199 andsupplements); M10 and M50 (oocytes matured in M0 medium supplemented with 10 μM and 50 μM melatonin,respectively). All groups were subjected to the cell incubator for 24 hours at 38.5°C with a humidifiedatmosphere containing 5% CO2. For data analysis, Chi-square test was used, with a probability of 5% and acorrelation test. In conclusion, melatonin reduced in vitro maturation rates of goat oocytes.

Pre-incubation of porcine semen reduces the incidence of polyspermy on embryos derived from low quality oocytes / Pré-incubação dos espermatozoides suínos diminui polispermia e aumenta a produção embrionária em oócitos de baixa qualidade

The main cause of low efficiency of in vitro produced porcine embryos is the high polyspermic penetration rates at fertilization, which is aggravated in low quality oocytes. Experiment 1 evaluated the embryo development in high and low quality oocytes. Experiment 2 evaluated the embryo development and quality of low quality oocytes fertilized with sperm pre-incubated during 0h (control), 0.5h, 1h and 1.5h. Experiment 3 investigated fertilization and monospermic rates of the same groups of Experiment 2. Experiment 4 evaluated embryo development, cell density, fertilization and monospermic rates of high quality oocytes using semen pre incubated during the best time observed in the previous experiments. Cleavage and blastocyst rates were analyzed by chi-square test, and remaining data by ANOVA and Tukey test (P0.05). The cleavage (74.8 vs 51.7%) and blastocyst (33.7 vs 9.8%) rates were greater in oocytes of high versus low quality, with no differences in cell density. Fertilization rates (65.6 to 79.5%) were not influenced by pre-incubation time. However, semen pre-incubation during 1.5h increased monospermic penetration (53.3%) and cleavage rates (92.5%) in low quality oocytes. Blastocyst rate was improved with 1.5h of semen pre incubation; however they were still lower than that observed with high quality control oocytes. Ultimately, pre-incubation did not influence fertilization, monospermic penetration, embryo development rates, nor cell density in oocytes of high quality. Low-quality porcine oocytes resulted in better rates of embryo development if in vitro fertilized with sperm pre-incubated for 1.5 hour.(AU)

A principal causa da baixa eficiência na PIV de embriões suínos é a elevada taxa de polispermia, que é exacerbada em oócitos de baixa qualidade. O experimento 1 avaliou o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa e alta qualidade. O experimento 2 avaliou a qualidade e o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa qualidade fecundados com sêmen pré-incubado por 0h (controle), 0,5h, 1h e 1,5h. O experimento 3 investigou a fecundação e as taxas de monospermia dos mesmos grupos do experimento 2. O experimento 4 avaliou o desenvolvimento embrionário, a densidade celular, a fecundação e as taxas de monospermia de oócitos de alta qualidade, fecundados com sêmen pre-incubado com o melhor tempo observado nos experimentos anteriores. As taxas de clivagem e de blastocistos foram submetidas ao teste de Qui-quadrado e os demais dados submetidos à ANOVA e teste de Tukey (P0,05). As taxas de clivagem (74,8 vs 51,7%) e de blastocistos (33,7 vs 9,8%) foram superiores nos oócitos de alta qualidade, comparados aos de baixa qualidade, não havendo diferenças na quantidade de células embrionárias. As taxas de fecundação (65,6 vs 79,5%) não foram influenciadas pelo tempo de pré-incubação. Todavia, a pré-incubação do sêmen por 1,5h aumentou a penetração monospérmica (53,3%) e a taxa de clivagem (92,5%), nos oócitos de baixa qualidade. As taxas de blastocisto aumentaram com sêmen pré-incubado por 1,5h, que foram ainda inferiores às obtidas dos oócitos de alta qualidade do grupo controle. Finalmente, a pré-incubação do sêmen não influencia na fecundação, na penetração monospérmica, no desenvolvimento embrionário, nem na quantidade de células embrionárias com oócitos de alta qualidade. Oócitos suínos de baixa qualidade produzem melhores taxas de desenvolvimento embrionário se fecundados in vitro com sêmen pré-incubado por 1,5 horas.(AU)

Efeitos da suplementação com anetol durante a MIV e CIV na maturação oocitária e na produção e qualidade de embriões bovinos

A produção in vitro de embriões (PIV) vem apresentando um crescimento significativo, representando 73,7% dos embriões produzidos mundialmente em 2019. Apesar de sua viabilidade comercial, a PIV necessita de aprimoramento para expandir ainda mais seu potencial. Desta forma, o aumento nas taxas de produção e qualidade embrionária proporcionaria ganhos substanciais na pecuária. Objetivou-se avaliar o efeito do anetol na MIV, nas doses de 300 e 3000µg/mL (Experimento 1) e avaliar o efeito do anetol na MIV e/ou CIV, na dose de 300µg/mL, na produção e qualidade de embriões bovinos (Experimento 2). Foram coletados ovários provenientes de frigoríficos utilizados nos dois experimentos. Folículos de 2 a 8mm foram puncionados e submetidos à maturação com meio maturação in vitro (MIV) suplementado com SFB 10%. No experimento 1, foram divididos em 3 grupos experimentais, sendo o Grupo Controle composto por (meio base); Grupo M300 (meio base suplementado com 300 µg/ml de anetol) e Grupo M3000 (3000 µg/ml). Após a MIV, a maturação nuclear foi avaliada por meio da técnica de análise da configuração da cromatina para obtenção dos resultados de metáfase II. No experimento 2, a MIV foi realizada com meio base (Grupo Controle) ou suplementado com (300 µg/ml de anetol). Posteriormente, os oócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV), sendo divididos em 04 grupos: Grupo Controle M0-C0 maturados e cultivados em meio sem adição de anetol, Grupo M0-C300 maturados sem anetol e cultivados em meio com 300 µg/ml, Grupo M300-C0 µg/ml maturados com 300 µg/ml de anetol e cultivados sem anetol e o Grupo M300-C300 com meio contendo 300 µg/ml de anetol na maturação e no cultivo. No 3º dia do cultivo (D3), após a FIV foi avaliado a clivagem, no 7º dia após a FIV (D7), foi avaliado a produção de blastocistos e no 8º dia (D8) foi avaliado e classificado os blastocistos por meio de analise morfológica em estereomicroscópico. Como análise estatística foi utilizado a análise de variância, com on way ANOVA, utilizando o software GraphPad Prism versão 6.0 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA), e testes de Tukey (dados paramétricos). Observou-se que 300 µg/mL de anetol no meio MIV não promoveu diferença nas taxas de MII quando comparado ao grupo controle. Entretanto, a adição de 3000 µg/mL de anetol reduziu significativamente a porcentagem de CCOs que chegaram à metáfase II em relação aos demais grupos (P0,05). Em relação ao índice de clivagem, observamos que a adição de 300 µg/ml de anetol durante a MIV e a CIV aumentou a porcentagem de embriões clivados quando comparado aos demais grupos experimentais (P 0,05). Entretanto, nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos quanto a produção embrionária, avaliada pela taxa de formação de blastocistos no D8 (P>0,05), nem sobre a qualidade embrionária, obtida por meio da contagem do número total de células embrionárias (P>0,05). Apesar das evidencias dos efeitos antioxidantes do anetol, encontradas na literatura, neste estudo o teste de TBARS realizado no meio de produção de embriões não apresentou significância estatística. Os genes SOD 1, CAT e GST relacionados a resistência ao estresse oxidativo, apresentaram aumento em sua abundancia nas células da granulosa quando foi utilizado o anetol. Alem disso, os genes COX2 e HAS também se apresentaram elevados, ressaltando o efeito benéfico do anetol sobre o metabolismo das CCs. Os embriões produzidos com ócitos maturados em presença de anetol também apresentaram elevação de transcritos do gene GPX1 que está envolvido na metabolização do peróxido de hidrogenio. A elevação da abundancia destes transcritos demonstra a contribuição do anetol para a neutralização do efeito das EROS. Por outro lado, apesar do alto número de embriões produzido no grupo maturado e cultivado com anetol, os genes IFNT2 e HASPA1A se encontravam diminuídos. Conclui se que a adição de 300 µg/mL de anetol durante a MIV e a CIV melhora a clivagem embrionária sem comprometer o desenvolvimento posterior do blastocisto.

INTRODUCTION: In vitro embryo production (IVP) has shown significant rise, reaching 68.7% of the embryos produced worldwide in 2018. Despite its commercial viability, IVP needs improvement to further expand its potential. Thus, livestock would benefit with substantial gains from increased production rates and embryo quality. OBJECTIVE: The objective was to evaluate the effect of anethole on in vitro maturation (IVM) at doses of 300 µg/mL and 3,000 µg/mL (Experiment 1) and to evaluate the effect of anethole on IVM and/or in vitro culture (IVC) at a dose of 300 µg/mL on the production and quality of bovine embryos (Experiment 2). MATERIAL AND METHODS: A total of 700 oocytes from ovaries from slaughterhouses were collected to be used in the two experiments. The 2 to 8 mm follicles were punctured and submitted to maturation with IVM medium supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS). In Experiment 1, a total of 300 oocytes were used and divided into 3 experimental groups: the Control Group, composed of basal medium; Group M300 (basal medium supplemented with 300 µg/ml anethole); and Group M3000 (basal medium supplemented with 3,000 µg/ml). After IVM, nuclear maturation was evaluated using chromatin configuration analysis technique to obtain the results of metaphase II (MII) with the best concentration, which was used in Experiment 2. In Experiment 2, IVM was performed either with basal medium only (Control Group) or with supplementation (Group M300 300 µg/ml anethole). Subsequently, 400 oocytes were subjected to in vitro fertilization (IVF) and IVC, and then divided into four groups: Control Group M0-C0: matured and cultivated in medium without addition of anethole; Group M0-C300: matured without anethole and cultivated in medium with 300 µg/ml anethole; Group M300-C0: matured with 300 µg/ml anethole and cultivated without anethole; and Group M300-C300: matured and cultivated in medium containing 300 µg/ml anethole. On the 3rd day of culture (D3), cleavage was evaluated after IVF; on the 7th day after IVF (D7), blastocyst production was evaluated; and on the 8th day (D8), blastocysts were evaluated and classified through morphological analysis in a stereomicroscope. Statistical analysis was carried out by using the one-way analysis of variance (one-way ANOVA), as well as Tukey tests for parametric data. RESULTS: When 300 µg/mL anethole were added to the MIV medium, there was no difference in MII rates in comparison to the control group. However, the addition of 3,000 µg/mL anethole significantly reduced the percentage of cumulus-oocyte complex (COC) that reached MII in relation to the other groups (P 0.05). Regarding the cleavage index, the addition of 300 µg/ml anethole during IVM and IVC was observed to increase the percentage of cleaved embryos when compared to the other experimental groups (P 0.05). Nevertheless, no difference was found between the groups regarding embryo production, which was assessed by blastocyst formation rate on D8 (P > 0.05), nor related to embryo quality, which was obtained by counting the total number of embryonic cells (P > 0.05). In spite of the evidence of antioxidant effects of anethole pointed out in the literature, the TBARS test performed in this study in the embryo production medium did not show any statistical significance. The SOD1, CAT, and GST genes related to resistance to oxidative stress presented increased abundance in granulosa cells when anethole was used. In addition, the COX2 and HAS genes were also elevated, highlighting the beneficial effect of anethole on the metabolism of COCs. Similar to in embryos produced with cells matured in the presence of anethole, a rise was detected in transcripts of the GPX1 gene, which is involved in the metabolization of hydrogen peroxide. The increased abundance of these transcripts demonstrates the role of anethole in neutralizing the effect of ROS. On the other hand, regardless of the large number of embryos produced in the group matured and cultivated with anethole, the IFNT2 and HASPA1A genes were decreased. CONCLUSION: The addition of 300 µg/mL anethole during IVM and IVC improves embryonic cleavage without compromising blastocyst development.

ENALAPRILATO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES E GEL DE ENALAPRIL POR VIA INTRAVAGINAL EM BOVINOS

A reprodução é vista como um dos principais pilares da cadeia produtiva da carne bovina, pois ela é responsável pela produção do bezerro, considerado a matéria prima dessa indústria. Entretanto, ainda persistem inúmeros pontos de estrangulamento no processo reprodutivo dos bovinos, que podem ser amenizados com a utilização das biotécnicas reprodutivas dentre estas a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e a produção in vitro de embriões (PIV). Os protocolos de indução e sincronização da ovulação baseiam-se no conhecimento dos hormônios, parácrinos e autócrinos que interagem na função ovariana e dentre esses o Sistema Renina Angiotensina (SRA) ovariano. O enalapril, após administração por via oral, é rapidamente absorvido e, então, hidrolisado no fígado a enalaprilato, que é um inibidor específico da ECA, de longa ação, com meia vida efetiva de 11 horas. Pesquisas realizadas pelo nosso grupo, com caprinos, têm demostrado que a adição do enalapril a protocolo IATF, aumentou as taxas de prenhez, parição e gemelaridade. Na forma de óvulos vaginais, o enalapril aumentou a percentagem de inseminações intrauterinas por facilitar o relaxamento cervical. Diante desses resultados, o objetivo do trabalho foi estudar alternativas complexação do enalapril com outras substâncias, visando sua aplicabilidade prática nos protocolos de biotecnologia da reprodução em animais, além de verificar os efeitos do enalaprilato na maturação oocitária, fertilização e cultivo de embriões in vitro. Os resultados para o experimento de avaliação da dosagem de enalapril para bovinos administrado por via intravaginal utilizando as concentrações 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg e 0,8 mg/kg não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na avaliação da variável pressão arterial média, assim como não houve alteração nos níveis de ureia, creatinina, TGO, TGP e aldosterona. Em relação a utilização do enalaprilato nas concentrações 1 µM, 2 µM e 4 µM em todas as fases da produção in vitro de embriões os resultados demostram que não houve diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos para a taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Para os tratamentos com A-779 a 2 µM Enalaprilato a 2 µM e Enalaprilato a 2 µM + A-779 a 2 µM não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Com relação à qualidade avaliada por meio das massas celulares interna (MCI), total de células do trofoblasto (TE) e a proporção entre elas, verificou-se em relação ao número de células do trofoblasto (TE) e TC que os tratamentos com A-779, enalaprilato e associação entre eles apresentaram maior número de células em relação ao controle. Quando foi analisada a proporção entre MCI e TC observou-se que 100% dos embriões do tratamento Enal+A779, 65% dos ratados com Enal , 50% do tratados com A-779 e apenas 33,3% do grupo controle estavam dentro da faixa de 20 a 40% de células da MCI, considerada de melhor qualidade. Conclui-se que o enalaprilato não influenciou na produção de embriões bovinos in vitro, quando avaliados pelas técnicas convencianais, porém quando se avalia pelo número de células embrionárias e a proporção entre elas, os tratamentos com o enalaprilato, A-779 e enalaprilato associado com A-779 apresentaram efeito proliferativo para as células embrionárias, em especial para a massa celular interna, e efeito positivo para a qualidade embrionária avaliada pela proporção de células.

A reprodução é vista como um dos principais pilares da cadeia produtiva da carne bovina, pois ela é responsável pela produção do bezerro, considerado a matéria prima dessa indústria. Entretanto, ainda persistem inúmeros pontos de estrangulamento no processo reprodutivo dos bovinos, que podem ser amenizados com a utilização das biotécnicas reprodutivas dentre estas a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e a produção in vitro de embriões (PIV). Os protocolos de indução e sincronização da ovulação baseiam-se no conhecimento dos hormônios, parácrinos e autócrinos que interagem na função ovariana e dentre esses o Sistema Renina Angiotensina (SRA) ovariano. O enalapril, após administração por via oral, é rapidamente absorvido e, então, hidrolisado no fígado a enalaprilato, que é um inibidor específico da ECA, de longa ação, com meia vida efetiva de 11 horas. Pesquisas realizadas pelo nosso grupo, com caprinos, têm demostrado que a adição do enalapril a protocolo IATF, aumentou as taxas de prenhez, parição e gemelaridade. Na forma de óvulos vaginais, o enalapril aumentou a percentagem de inseminações intrauterinas por facilitar o relaxamento cervical. Diante desses resultados, o objetivo do trabalho foi estudar alternativas complexação do enalapril com outras substâncias, visando sua aplicabilidade prática nos protocolos de biotecnologia da reprodução em animais, além de verificar os efeitos do enalaprilato na maturação oocitária, fertilização e cultivo de embriões in vitro. Os resultados para o experimento de avaliação da dosagem de enalapril para bovinos administrado por via intravaginal utilizando as concentrações 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg e 0,8 mg/kg não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na avaliação da variável pressão arterial média, assim como não houve alteração nos níveis de ureia, creatinina, TGO, TGP e aldosterona. Em relação a utilização do enalaprilato nas concentrações 1 µM, 2 µM e 4 µM em todas as fases da produção in vitro de embriões os resultados demostram que não houve diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos para a taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Para os tratamentos com A-779 a 2 µM Enalaprilato a 2 µM e Enalaprilato a 2 µM + A-779 a 2 µM não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Com relação à qualidade avaliada por meio das massas celulares interna (MCI), total de células do trofoblasto (TE) e a proporção entre elas, verificou-se em relação ao número de células do trofoblasto (TE) e TC que os tratamentos com A-779, enalaprilato e associação entre eles apresentaram maior número de células em relação ao controle. Quando foi analisada a proporção entre MCI e TC observou-se que 100% dos embriões do tratamento Enal+A779, 65% dos ratados com Enal , 50% do tratados com A-779 e apenas 33,3% do grupo controle estavam dentro da faixa de 20 a 40% de células da MCI, considerada de melhor qualidade. Conclui-se que o enalaprilato não influenciou na produção de embriões bovinos in vitro, quando avaliados pelas técnicas convencianais, porém quando se avalia pelo número de células embrionárias e a proporção entre elas, os tratamentos com o enalaprilato, A-779 e enalaprilato associado com A-779 apresentaram efeito proliferativo para as células embrionárias, em especial para a massa celular interna, e efeito positivo para a qualidade embrionária avaliada pela proporção de células.

Uso de diferentes gonadotrofinas na maturação in vitro de oócitos ovinos

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do uso das gonadotrofinas eCG e hCG, comparado ao FSH, na maturação in vitro de oócitos ovinos. Para tanto, ovários ovinos foram transportados do matadouro local para o laboratório, em solução salina, a 0,9%, a 30°C, até duas horas após o abate. Após a colheita, os oócitos foram avaliados e divididos em três grupos: grupo CON, onde os oócitos foram imersos em meio MIV base: TCM-199, suplementado com EGF (20 ng/mL), cisteamina (100 L/mL); E2 (1 g/mL); L glutamina (1 mM), Piruvato (40 mM); Soro Fetal Bovino (10%v/v); nos grupos ECG e HCG, os oócitos foram imersos em meio MIV base, adicionado, respectivamente, de 10 UI/mL de eCG e de 10 UI/mL de hCG; já no grupo FSH, os oócitos foram imersos em meio MIV base, adicionado de 10 g/mL de FSH-p. A MIV dos oócitos foi realizada a 38,5°C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas. Não foram observadas diferenças significativas com relação à taxa de expansão de células do cumulus. Todavia, ao se comparar os grupos dentro de cada grau de expansão, no grupo FSH, foi obtido o maior percentual de oócitos com expansão total de células do cumulus (P<0,05). Já o grupo eCG foi superior para expansão moderada (P<0,05), enquanto o grupo HCG foi superior para expansão leve (P<0,05). A percentagem de oócitos em MII foi maior no grupo ECG do que no grupo CON e HCG (P<0,05), mas foi semelhante ao grupo FSH. Em conclusão, 10 UI de eCG podem ser utilizadas em substituição ao FSH na MIV de oócitos ovinos.

The aim of this study was to evaluate the effect of using gonadotropins eCG and hCG, compared to FSH, on in vitro maturation of sheep oocytes. To this end, sheep ovaries were transported from the local slaughterhouse to the laboratory in 0.9% saline at 30 °C within two hours of slaughter. After harvest, the oocytes were evaluated and allocated into three groups: CON group, where the oocytes were immersed in IVM base medium: TCM-199, supplemented with EGF (20 ng / mL), cysteamine (100 L / mL); E2 (1 g / mL); L - glutamine (1 mM), Pyruvate (40 mM); Fetal Calve Serum (10% v / v); in the ECG and HCG groups, the oocytes were immersed in IVM base medium, added, respectively, 10 IU / mL eCG and 10 IU / mL hCG; In the FSH group, the oocytes were immersed in IVM base medium, added with 10 g / mL pFSH. The IVM was performed at 38.5 °C, in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air, for 24 hours. No significant differences were observed with respect to cumulus cell expansion rate. However, when comparing the groups within each degree of expansion, in the FSH group, the highest percentage of oocytes with total cumulus cell expansion was obtained (P<0.05). The eCG group was superior for moderate expansion (P<0.05), while the HCG group was superior for mild expansion (P<0.05). The percentage of oocytes in MII was higher in the ECG group than in the CON and HCG groups (P <0.05), but was similar to the FSH group. In conclusion, 10 IU eCG can be used in place of FSH in sheep oocyte IVM.

Criotolerância de oócitos e embriões bovinos maturados com líquido folicular e/ou -mercaptoetanol / Cryotolerance of bovine oocytes and embryos maturated with follicular fluid and/or -mercaptoethanol

Cryotolerance of bovine oocytes and embryos maturated with addition of follicular fluid (LF) and ?-mercaptoethanol (BM) was evaluated. After vitrification, oocytes were maturated in: TCM-199 (control); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h in LF+18h TCM-199), and LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). There was not difference (p>0.05) in blastocysts rate in TCM (6.4%), BM (4.0%) and LF (3.4%) treatments. The hatching rates and cell density of hatched embryos did not differ (p>0.05) among treatments. In Experiment 2, hatched blastocysts (Bx) obtained in D7 or D8 were vitrified and evaluated according to its expanding and hatching rates. The expanding rate was similar (p>0.05), being observed a distinct pathway in hatching rate in D7 and D8 Bx. Higher hatching rate was observed in D7 Bx from control (TCM-54.2%) compared to BM (40.32%) and LF+BM (33.89%) treatments. The D8 Bx showed lower hatching rate in control (TCM-199) compared with D7 Bx. In BM, LF and LF+BM treatments, the hatching rate was similar for D7 or D8 embryos. Maturation with addition of LF and/or BM does not increase the oocyte or IVP embryo cryotolerance. Expanded blastocysts (D7) have higher cryotolerance and show a distinct pathway when added with LF or BM, in comparison with D8 embryos.

Foi avaliada a criotolerância de oócitos e embriões bovinos maturados com adição de líquido folicular (LF) e/ou ?-mercaptoetanol (BM). Após vitrificação, os oócitos foram maturados em: TCM-199 (controle); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h em LF+18h TCM-199) e LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). Não houve diferença (p>0,05) nas taxas de blastocistos dos tratamentos TCM (6,4%), BM (4,0%) e LF (3,4%). A eclosão e densidade celular dos embriões eclodidos não diferiram (p>0,05) nos tratamentos. No Experimento 2 blastocistos expandidos (Bx) obtidos em D7 ou D8 foram vitrificados, avaliando-se sua reexpansão e eclosão. A reexpansão foi semelhante (p>0,05), sendo observado comportamento distinto na eclosão entre Bx D7 e D8. Nos Bx D7 houve maior eclosão no controle (TCM54,2%) em relação ao BM (40,32%) e LF+BM (33,89%). Os Bx D8 apresentaram menor eclosão no controle (TCM) em relação aos Bx D7. Nos tratamentos BM, LF e LF+BM a eclosão foi semelhante para Bx D7 ou D8. A maturação com adição de LF e/ou BM não melhora a criotolerância de oócitos imaturos e embriões PIV. Blastocistos expandidos precoces (D7) são mais criotolerantes e apresentam um comportamento distinto à adição de LF e BM, em relação aos tardios (D8).

Criotolerância de oócitos e embriões bovinos maturados com líquido folicular e/ou -mercaptoetanol / Cryotolerance of bovine oocytes and embryos maturated with follicular fluid and/or -mercaptoethanol

Cryotolerance of bovine oocytes and embryos maturated with addition of follicular fluid (LF) and ?-mercaptoethanol (BM) was evaluated. After vitrification, oocytes were maturated in: TCM-199 (control); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h in LF+18h TCM-199), and LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). There was not difference (p>0.05) in blastocysts rate in TCM (6.4%), BM (4.0%) and LF (3.4%) treatments. The hatching rates and cell density of hatched embryos did not differ (p>0.05) among treatments. In Experiment 2, hatched blastocysts (Bx) obtained in D7 or D8 were vitrified and evaluated according to its expanding and hatching rates. The expanding rate was similar (p>0.05), being observed a distinct pathway in hatching rate in D7 and D8 Bx. Higher hatching rate was observed in D7 Bx from control (TCM-54.2%) compared to BM (40.32%) and LF+BM (33.89%) treatments. The D8 Bx showed lower hatching rate in control (TCM-199) compared with D7 Bx. In BM, LF and LF+BM treatments, the hatching rate was similar for D7 or D8 embryos. Maturation with addition of LF and/or BM does not increase the oocyte or IVP embryo cryotolerance. Expanded blastocysts (D7) have higher cryotolerance and show a distinct pathway when added with LF or BM, in comparison with D8 embryos.(AU)

Foi avaliada a criotolerância de oócitos e embriões bovinos maturados com adição de líquido folicular (LF) e/ou ?-mercaptoetanol (BM). Após vitrificação, os oócitos foram maturados em: TCM-199 (controle); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h em LF+18h TCM-199) e LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). Não houve diferença (p>0,05) nas taxas de blastocistos dos tratamentos TCM (6,4%), BM (4,0%) e LF (3,4%). A eclosão e densidade celular dos embriões eclodidos não diferiram (p>0,05) nos tratamentos. No Experimento 2 blastocistos expandidos (Bx) obtidos em D7 ou D8 foram vitrificados, avaliando-se sua reexpansão e eclosão. A reexpansão foi semelhante (p>0,05), sendo observado comportamento distinto na eclosão entre Bx D7 e D8. Nos Bx D7 houve maior eclosão no controle (TCM54,2%) em relação ao BM (40,32%) e LF+BM (33,89%). Os Bx D8 apresentaram menor eclosão no controle (TCM) em relação aos Bx D7. Nos tratamentos BM, LF e LF+BM a eclosão foi semelhante para Bx D7 ou D8. A maturação com adição de LF e/ou BM não melhora a criotolerância de oócitos imaturos e embriões PIV. Blastocistos expandidos precoces (D7) são mais criotolerantes e apresentam um comportamento distinto à adição de LF e BM, em relação aos tardios (D8).(AU)

CRIOTOLERÂNCIA DE OÓCITOS E EMBRIÕES BOVINOS MATURADOS COM LÍQUIDO FOLICULAR E/OU -MERCAPTOETANOL

Cryotolerance of bovine oocytes and embryos maturated with addition of follicular fluid (LF) and -mercaptoethanol (BM) was evaluated. After vitrification, oocytes were maturated in: TCM-199 (control); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h in LF+18h TCM-199), and LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). There was not difference (p>0.05) in blastocysts rate in TCM (6.4%), BM (4.0%) and LF (3.4%) treatments. The hatching rates and cell density of hatched embryos did not differ (p>0.05) among treatments. In Experiment 2, hatched blastocysts (Bx) obtained in D7 or D8 were vitrified and evaluated according to its expanding and hatching rates. The expanding rate was similar (p>0.05), being observed a distinct pathway in hatching rate in D7 and D8 Bx. Higher hatching rate was observed in D7 Bx from control (TCM-54.2%) compared to BM (40.32%) and LF+BM (33.89%) treatments. The D8 Bx showed lower hatching rate in control (TCM-199) compared with D7 Bx. In BM, LF and LF+BM treatments, the hatching rate was similar for D7 or D8 embryos. Maturation with addition of LF and/or BM does not increase the oocyte or IVP embryo cryotolerance. Expanded blastocysts (D7) have higher cryotolerance and show a distinct pathway when added with LF or BM, in comparison with D8 embryos.

Foi avaliada a criotolerância de oócitos e embriões bovinos maturados com adição de líquido folicular (LF) e/ou -mercaptoetanol (BM). Após vitrificação, os oócitos foram maturados em: TCM-199 (controle); BM (24h TCM-199+100µM BM); LF (6h em LF+18h TCM-199) e LF+BM (6h LF+18h TCM-199+100µM BM). Não houve diferença (p>0,05) nas taxas de blastocistos dos tratamentos TCM (6,4%), BM (4,0%) e LF (3,4%). A eclosão e densidade celular dos embriões eclodidos não diferiram (p>0,05) nos tratamentos. No Experimento 2 blastocistos expandidos (Bx) obtidos em D7 ou D8 foram vitrificados, avaliando-se sua reexpansão e eclosão. A reexpansão foi semelhante (p>0,05), sendo observado comportamento distinto na eclosão entre Bx D7 e D8. Nos Bx D7 houve maior eclosão no controle (TCM54,2%) em relação ao BM (40,32%) e LF+BM (33,89%). Os Bx D8 apresentaram menor eclosão no controle (TCM) em relação aos Bx D7. Nos tratamentos BM, LF e LF+BM a eclosão foi semelhante para Bx D7 ou D8. A maturação com adição de LF e/ou BM não melhora a criotolerância de oócitos imaturos e embriões PIV. Blastocistos expandidos precoces (D7) são mais criotolerantes e apresentam um comportamento distinto à adição de LF e BM, em relação aos tardios (D8).

VARIÁVEIS RELACIONADAS AO ESTABELECIMENTO E MANUTENÇÃO DA GESTAÇÃO EM PROGRAMAS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO.

A multiplicação de indivíduos geneticamente superiores se faz necessária para o incremento de produção dos sistemas. Entretanto, os resultados da multiplicação genética de fêmeas bovinos a partir de embriões produzidos in vitro (PIV) ainda são inferiores aos resultados de programas que utilizam embriões produzidos in vivo, se levarmos em consideração as etapas pós-transferência. Neste contexto, objetivou-se avaliar as variáveis que podem afetar a taxa de gestação e as perdas gestacionais de receptoras em programas de multiplicação genética por transferência de embriões (TE) produzidos in vitro. Para isso, o estudo utilizou informações de inovulações (n=60170) realizadas pela empresa Minerembryo Ltda., sediada em Alfenas, MG. No processo de seleção das receptoras da empresa, somente eram incluídos animais azebuados (Bos taurus taurus vs. Bos taurus indicus), com idade entre 2 a 5 anos, com mais de 330 kg, com bom escore de condição corporal (ECC de 3,5 ± 0,5), livres de brucelose e tuberculose ou patologia identificada ao exame ginecológico, tratados com Diidroestreptomicina e imunizados para IBR, BVD e leptospirose. Posteriormente, as informações colhidas dos programas referentes ao embrião (método de preservação, estádio de desenvolvimento, origem do embrião, sêmen utilizado na fertilização in vitro [FIV], grupo racial), à receptora (corno uterino no qual o embrião foi depositado, o tamanho do corpo lúteo [CL], o tipo de estro, o dia da TE), ao técnico responsável pela TE e à época do ano foram correlacionadas com os resultados do diagnóstico de gestação realizado aos 30, 60 e 90 dias após o estro. Ao final, os valores dessas correlações foram utilizados para inferir a importância das variáveis sobre a taxa de gestação e as perdas gestacionais em programas utilizando embriões PIV. Para validação de resultados, os modelos foram ajustados ao procedimento estatístico do Proc Glimmix para valores Binários utilizando o software estatístico SAS versão 9.4 (SAS Virtual University Edition). Probabilidades menores que 5% foram consideradas significativas. Por meio da análise dos resultados, observou-se que a origem do embrião, o grupo racial, o tipo de estro, o tamanho do CL, o corno uterino, o técnico responsável pela TE, o mês do ano (p<0,0001), o método de conservação (p<0,003), o estádio de desenvolvimento embrionário (p<0,0002), o sêmen (p<0,0005), o dia da TE (p<0,02), influenciaram a taxa de gestação e, uma vez estabelecida a gestação, a origem do embrião (p<0,04), o grupo racial (p<0,001) e a época do ano (p<0,0001) influenciaram as taxas de perdas gestacionais. Conclui-se que as variáveis analisadas são dependentes em programas de TE, entretanto, dentre os fatores analisados, os correlacionados ao embrião foram mais relevantes para obtenção de melhores resultados em programas de multiplicação genética utilizando embriões PIV.

The multiplication of genetically superior individuals is necessary to increase the production of the systems. However, the results of the genetic multiplication of bovine females from embryos produced in vitro (IVP) are still inferior to the results of programs that use embryos produced in vivo, considering the post-transfer stages. In this context, the objective was to evaluate the variables that may affect the pregnancy rate and the gestational losses of recipients in programs of genetic multiplication by embryo transfer (ET) produced in vitro. For this, the study used information from innovations (n = 60170) carried out by the company Minerembryo Ltda., Headquartered in Alfenas, MG. In the selection process of the company's recipients, only azebuous animals (Bos taurus taurus vs. Bos taurus indicus), aged 2 to 5 years, weighing more than 330 kg, with a good body condition score (ECC of 3, 5 ± 0.5), free of brucellosis and tuberculosis or pathology identified by gynecological examination, treated with Dihydroestreptomycin and immunized for IBR, BVD and leptospirosis. Subsequently, the information collected from the programs related to the embryo (preservation method, stage of development, origin of the embryo, semen used in in vitro fertilization [IVF], racial group), to the recipient (uterine horn in which the embryo was deposited, the corpus luteum size [CL], type of estrus, day of ET), the technician responsible for ET and the time of year were correlated with the results of the pregnancy diagnosis performed at 30, 60 and 90 days after estrus. In the end, the values of these correlations were used to infer the importance of the variables on the pregnancy rate and the pregnancy losses in programs using PIV embryos. To validate results, the models were adjusted to the Proc Glimmix statistical procedure for Binary values using the statistical software SAS version 9.4 (SAS Virtual University Edition). Probabilities less than 5% were considered significant. Through the analysis of the results, it was observed that the origin of the embryo, the racial group, the type of estrus, the size of the CL, the uterine horn, the technician responsible for the ET, the month of the year (p <0.0001 ), the conservation method (p <0.003), the embryonic development stage (p <0.0002), the semen (p <0.0005), the ET day (p <0.02), influenced the rate of pregnancy and, once the pregnancy was established, the origin of the embryo (p <0.04), the racial group (p <0.001) and the time of year (p <0.0001) influenced the rates of pregnancy losses. It is concluded that the analyzed variables are dependent on ET programs, however, among the factors analyzed, those related to the embryo were more relevant to obtain better results in genetic multiplication programs using PIV embryos.

EFEITOS DO FSH, AMPc, hCG E COMBINAÇÕES, NO MEIO DE MATURAÇÃO E INFLUÊNCIA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A maturação oocitária é um complexo bem orquestrado que culmina na liberação de um oócito capaz de ser fertilizado, permitindo assim, o desenvolvimento embrionário. A maturação in vitro (MIV) é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro de embriões (PIVE) e a não competência oocitária nesta fase altera drasticamente a taxa de produção embrionária. Apesar de todos os esforços para a melhoria da PIVE, apenas uma parcela de 35 a 40% dos oócitos bovinos maturados in vitro, desenvolvem-se até o estádio de blastocisto. Acredita-se que a falta de sincronia existente entre a maturação nuclear e a maturação citoplasmática oocitária seja um fator limitante na qualidade da PIVE. Dessa forma, o uso de reguladores durante a MIV, tem se destacado e melhorado a sincronia da maturação nuclear e citoplasmática dos oócitos, e consequentemente, a taxa de produção embrionária. Nesse contexto, o presente estudo teve como finalidade avaliar a influência dos reguladores de maturação - hormônio folículo estimulante (FSH), monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e gonadotrofina coriônica humana (hCG), e suas combinações - na presença de albumina sérica bovina (BSA) como fonte protéica, sobre a MIV de oócitos bovinos, comparados ao grupo controle, com soro fetal bovino (SFB) sem adição dos reguladores. Foram formados dez grupos experimentais (T1: SFB, T2: FSH, T3: AMPc, T4: hCG, T5: FSH+AMPc, T6: FSH+hCG, T7: AMPc+hCG, T8: FSH+AMPc+hCG e T9: (FSH+AMPC) por 12 horas + hCG nas outras 12 horas, T10: BSA). Foram avaliadas as taxas de maturação nuclear e citoplasmática, de acordo com a presença de metáfase II (MII), migração dos grânulos corticais e mitocôndrias, capacidade em produzir embriões e acúmulo lipídico embrionário. Os resultados demonstraram que o uso do BSA durante a MIV provocou atraso na retomada da meiose em todos os grupos experimentais analisados, comparados à maturação com SFB (p < 0,05). Porém, a distribuição de grânulos corticais e de mitocôndrias no ooplasma, bem como a taxa de produção embrionária, apresentaram melhores resultados quando o SFB foi utilizado (p < 0,05). Além disso, a substituição do SFB pelo BSA na MIV não reduz os níveis lipídicos dos embriões produzidos in vitro (PIV) (p > 0,05). Conclui-se que, o uso do BSA durante a MIV de oócitos bovinos, permite o atraso da reativação da meiose, contudo, a presença do SFB nessa etapa é de suma importância para a maturação das organelas citoplasmáticas e na produção in vitro de embriões bovinos.

Oocyte maturation is a well-orchestrated complex that culminates in the release of an oocyte capable of being fertilized, thus allowing embryonic development. In vitro maturation (IVM) is one of the determining steps for the success of in vitro production of embryos (IVPE) and the lack of oocyte competence in this phase dramatically changes the rate of embryonic production. Despite all efforts to improve IVPE, only a portion of 35 to 40% of bovine oocytes matured in vitro, develop until the blastocyst stage. It is believed that the lack of synchrony between nuclear maturation and oocyte cytoplasmic maturation is a limiting factor in the quality of IVPE. Thus, the use of regulators during IVM, has highlighted and improved the synchrony of oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, and consequently, the rate of embryonic production. In this context, the present study aimed to evaluate the influence of maturation regulators - follicle stimulating hormone (FSH), cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and human chorionic gonadotropin (hCG), and their combinations - in the presence of bovine serum albumin (BSA) as a protein source, on the bovine oocyte IVM, compared to the control group, with fetal bovine serum (FBS) without the addition of regulators. Ten experimental groups were formed (T1: FBS, T2: FSH, T3: cAMP, T4: hCG, T5: FSH + cAMP, T6: FSH + hCG, T7: cAMP + hCG, T8: FSH + cAMP + hCG and T9: (FSH + cAMP) for 12 hours + hCG in the other 12 hours, T10: BSA). Nuclear and cytoplasmic maturation rates were evaluated according to the presence of metaphase II (MII), migration of cortical granules and mitochondrias, ability to produce embryos and embryonic lipid accumulation. The results demonstrated that the use of BSA during IVM caused a delay in the resumption of meiosis in all experimental groups analyzed, compared to maturation with FBS (p < 0,05). However, the distribution of cortical granules and mitochondrias in the ooplasm, as well as the rate of embryonic production, showed better results when FBS was used (p < 0,05). In addition, the replacement of FBS by BSA in IVM does not reduce the lipid levels of embryos produced in vitro (IVP) (p> 0.05). It is concluded that the use of BSA during IVM of bovine oocytes allows the delay of meiosis reactivation, however, the presence of FBS in this stage is of paramount importance for the maturation of cytoplasmic organelles and in vitro production of embryos bovine.

Laparoscopic ovum pick up (LOPU) in goats: from hormonal treatment to oocyte possible destinations / Colheita de oócitos por laparoscopia em caprinos: do tratamento hormonal aos possíveis destinos dos oócitos

Whether we are collecting oocytes from donors as part of a program of in vitro embryo production (IVP) and/or to promote advances in emerging biotechnologies as cloning and transgenesis, the success rate depends on the development of methodological aspects of recovering oocytes. To succeed, sufficient number of good quality oocytes is the prerequisite for various reproductive techniques and laparoscopic ovum pick up (LOPU) is the recommended technique for obtaining them from live goats. However, the variability of the quantity and quality of the oocytes collected still limits the large-scale use of this technology. Under the current conditions, too large variability is reported with oocyte recovery rates ranging from 40 to 90%, and the number of harvested oocytes per female between 4 and 14, in different laboratories. This variability can depend on either intrinsic characteristic of the donors, suchas breed, age, individual response or on aspects that we might be able to control, such as stimulation treatment, type of needle, aspiration pressure, among others. We believe that new investigations should contribute to significant improvement of LOPU yield. This review aims to report different factors influencing goat donor response for LOPU, presenting main steps for oocytes recovery as well as technical alternatives for improving LOPU efficiency. Furthermore, it is aimed to discuss about the potential use of goatoocytes after their recovery by LOPU and present overall results in goat IVP worldwide.(AU)

Independentemente se a coleta de oócitos é parte de um programa de produção in vitro de embriões (PIVE) e/ou promoverá avanços biotecnológicos como clonagem e transgênese, os aspectos metodológicos nas técnicas de recuperação de oócitos são imprescindíveis. Para alcançar sucesso de forma ótima, número suficiente de oócitos de boa qualidade é pré-requisito para diversas técnicas reprodutivas e a colheita de oócitos por laparoscopia (COL) é a técnica recomendada para obtê-los de cabras saudáveis. Entretanto, a variabilidade na quantidade e qualidade de oócitos coletados ainda limita o uso desta tecnologia em grande escala. Sob as condições atuais, uma grande variação é relatada na literatura com taxas de recuperação de oócitos variando de 40 a 90% e o número de estruturas coletadas por fêmea entre 4 e 14 oócitos em diferentes laboratórios. Esta variabilidade pode ocorrer tanto em função de variáveis não controláveis, como raça, idade e características intrínsecas da cabra, como devido a aspectos controláveis, como o tratamento superestimulatório, tipo da agulha, pressão de aspiração, dentre outros. Acredita-se que novas pesquisas devam contribuir significativamente para a melhoria da técnica de COL. Esta revisão objetiva relatar os diferentes fatores que influenciam a resposta de cabras doadoras após COL, apresentando as principais etapas para recuperação oocitária assim como modificações técnicas propostas para melhoria da eficiência da COL. Além disso, discutir sobre potencias aplicações de oócitos caprinos depois de sua recuperação por COL e resultados gerais sobre a técnica no mundo.(AU)

Laparoscopic ovum pick up (LOPU) in goats: from hormonal treatment to oocyte possible destinations / Colheita de oócitos por laparoscopia em caprinos: do tratamento hormonal aos possíveis destinos dos oócitos

Whether we are collecting oocytes from donors as part of a program of in vitro embryo production (IVP) and/or to promote advances in emerging biotechnologies as cloning and transgenesis, the success rate depends on the development of methodological aspects of recovering oocytes. To succeed, sufficient number of good quality oocytes is the prerequisite for various reproductive techniques and laparoscopic ovum pick up (LOPU) is the recommended technique for obtaining them from live goats. However, the variability of the quantity and quality of the oocytes collected still limits the large-scale use of this technology. Under the current conditions, too large variability is reported with oocyte recovery rates ranging from 40 to 90%, and the number of harvested oocytes per female between 4 and 14, in different laboratories. This variability can depend on either intrinsic characteristic of the donors, suchas breed, age, individual response or on aspects that we might be able to control, such as stimulation treatment, type of needle, aspiration pressure, among others. We believe that new investigations should contribute to significant improvement of LOPU yield. This review aims to report different factors influencing goat donor response for LOPU, presenting main steps for oocytes recovery as well as technical alternatives for improving LOPU efficiency. Furthermore, it is aimed to discuss about the potential use of goatoocytes after their recovery by LOPU and present overall results in goat IVP worldwide.

Independentemente se a coleta de oócitos é parte de um programa de produção in vitro de embriões (PIVE) e/ou promoverá avanços biotecnológicos como clonagem e transgênese, os aspectos metodológicos nas técnicas de recuperação de oócitos são imprescindíveis. Para alcançar sucesso de forma ótima, número suficiente de oócitos de boa qualidade é pré-requisito para diversas técnicas reprodutivas e a colheita de oócitos por laparoscopia (COL) é a técnica recomendada para obtê-los de cabras saudáveis. Entretanto, a variabilidade na quantidade e qualidade de oócitos coletados ainda limita o uso desta tecnologia em grande escala. Sob as condições atuais, uma grande variação é relatada na literatura com taxas de recuperação de oócitos variando de 40 a 90% e o número de estruturas coletadas por fêmea entre 4 e 14 oócitos em diferentes laboratórios. Esta variabilidade pode ocorrer tanto em função de variáveis não controláveis, como raça, idade e características intrínsecas da cabra, como devido a aspectos controláveis, como o tratamento superestimulatório, tipo da agulha, pressão de aspiração, dentre outros. Acredita-se que novas pesquisas devam contribuir significativamente para a melhoria da técnica de COL. Esta revisão objetiva relatar os diferentes fatores que influenciam a resposta de cabras doadoras após COL, apresentando as principais etapas para recuperação oocitária assim como modificações técnicas propostas para melhoria da eficiência da COL. Além disso, discutir sobre potencias aplicações de oócitos caprinos depois de sua recuperação por COL e resultados gerais sobre a técnica no mundo.