Cellular components and TGF-beta1 content of a closed Tube system for Platelet Rich Plasma acquisition in horse] / [Componentes celulares e TGF-beta1 do plasma rico em plaquetas obtido por sistema fechado em equinos]

Platelet-rich plasma (PRP) has been proposed as an agent to accelerate the healing process and stimulate the regenerative capacity of tissues due to its abundance of growth factors. A large variety of kits and protocols are available to obtain PRP by different cell-separation systems. However, the lack of standardization may lead to inconsistent results. The aim of this study was to characterize cellular composition, platelet parameters using the ADVIA 120 flow cytometer, and TGF-ß1 concentration from the PRP product obtained through a closed system, using simple centrifugation. Six clinically healthy horses were used in this study. The protocol in the closed system resulted in approximately 1.6-fold higher platelet and approximately 2.0-fold lower white blood cell concentrations in comparison with whole blood values. The evaluated system was efficient in concentrating platelets and in retrieving a small number of leukocytes, using a protocol of single centrifugation at low speed.

O plasma rico em plaquetas (PRP) tem sido proposto como um agente para acelerar o processo de cicatrização e estimular a capacidade regenerativa dos tecidos, devido à sua abundância de fatores de crescimento. Uma grande variedade de kits e de protocolos está disponível para obtenção de PRP, utilizando-se diferentes sistemas de separação de células. No entanto, a falta de padronização pode levar a resultados inconsistentes. O objetivo deste estudo foi caracterizar a composição celular, os parâmetros plaquetários pelo citômetro de fluxo ADVIA 120 e a concentração de TGF-ß1 do PRP obtido em sistema fechado, por centrifugação simples. Seis cavalos clinicamente saudáveis ​​foram usados ​​neste estudo. O protocolo no sistema fechado resultou em concentrações de plaquetas aproximadamente 1,6 vez maior e concentrações de leucócitos aproximadamente 2,0 vezes menores em comparação com os valores do sangue total. O sistema avaliado foi eficiente na concentração de plaquetas e na recuperação de um pequeno número de leucócitos, utilizando um protocolo de centrifugação única em baixa velocidade.

Avaliação morfológica do concentrado autólogo de plaquetas em cães sob refrigeração e criopreservação em DMSO 6% / [Morphological evaluation of the autologous platelet concentrate in dogs under refrigeration and criopreservation in 6% DMSO]

The morphological characteristics of the autologous platelet concentrate (APC) of 31 dogs were evaluated after cooling and freezing in 6% DMSO. Blood from the jugular vein of each patient was collected and centrifuged at 191g for six minutes to obtain APC. In the fresh sample, the platelet count, MPV, PDW and cell morphology were evaluated. Four samples of each animal were sent for storage, one refrigerated at 4°C for seven days, another for 30 days and two more stored in a freezer at -80°C in the same time interval, using 6% DMSO as cryoprotectant. The conserved samples were submitted to the same laboratory analysis as the fresh sample. There was a difference between fresh and preserved samples for platelet count, cell concentration, MPV and PDW (P<0.05), except in the 30-day refrigerated group, which showed severe morphological changes. In the frozen group for seven days, no difference was observed in the percentage of activation (P>0.05). The results obtained lead to the conclusion that cryopreservation with 6% DMSO at -80°C for seven days is a favorable option for the maintenance of platelet concentrations and the morphological characteristics of APC in dogs.(AU)

AVALIAÇÕES HISTOLÓGICA, IMUNO-HISTOQUÍMICA, BIOMECÂNICA E DE MOLHABILIDADE DA MEMBRANA DE FIBRINA RICA EM PLAQUETAS E LEUCÓCITOS DE CÃES

O objetivo do estudo foi realizar análises histológica, imuno-histoquímica, biomecânica e de molhabilidade de membranas de fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF), obtidas do sangue de 10 cães hígidos da raça labrador retriever. Coletou-se amostra sanguínea da veia jugular externa com uso de tubo à vácuo sem anticoagulante, que foi imediatamente centrifugado no protocolo de 400g por 12 minutos, empregando centrífuga especializada. Removeu-se o coágulo da L-PRF do tubo e com auxílio de espátula foi raspado o coágulo de hemácias resguardando o buffy coat. A membrana da L-PRF foi produzida usando caixa de PRF. Na análise histológica as três porções da membrana foram identificadas, sendo a primeira composta principalmente por eritrócitos, com baixa densidade de leucócitos interpostos entre os mesmos; a segunda formada por leucócitos, predominantemente neutrófilos; e a terceira camada, de aspecto acidofílico, composta pela rede de fibrina. Na imunohistoquímica todas as amostras apresentaram marcação positiva para VEGF e PDGF, tanto no componente celular, como na malha de fibrina, porém com diferentes intensidades. As avaliações biomecânicas e de molhabilidade foram efetuadas em dois momentos. As membranas L-PRF de 30 minutos suportaram o dobro da tensão máxima em tração quando comparadas com as de 3 horas. A molhabilidade das membranas de 30 minutos foi estatisticamente maior que as de 3 horas. Conclui-se que o protocolo de centrifugação empregado permitiu o desenvolvimento da membrana da L-PRF em cães, comprovado pelas análises histológicas e imuno-histoquímicas, mostrando que o tempo pode influenciar na resistência mecânica e de molhabilidade.

This study aimed to perform histological, immunohistochemical, biomechanical, and wettability assessments of Leukocyte- and Platelet-Rich fibrin (L-PRF)membranes, obtained from the blood of healthy dogs. Ten client-ownedLabrador retriever dogs were enrolled. Blood samples were obtained from theexternal jugular vein with a vacuum tube without anticoagulant, which wasimmediately centrifuged at 400 g for 12 minutes in a dedicated centrifuge. TheL-PRF clot was removed from the tube and the red clot was released from the buffy coat with a spatula. The membrane was produced using a PRF box. Histological examination identified the three portions of the L-PRF membranes.The first portion was composed mainly of red blood cells with the presence of a low number of leukocytes among them. The second portion was composed of white blood cells, mainly neutrophils. The third portion composed of the fibrin network was characterized by an acidophilic stain. The immunohistochemical analysis showed that VEGF and PDGF were expressed in all samples at different intensities, both in cellular components and fibrin mesh. The biomechanical and wettability assessments were done in membranes 30 minutes and three hours after production. The 30-minute L-PRF membranes supported two times the maximum stress in tension testing compared to 3-hour L-PRF membranes. The wettability of the 30-minute sample membranes was statistically higher than the 3-hour sample membranes. In conclusion, the centrifugation protocol allowed producing L-PRF membrane in dogs, based on histological and immunohistochemical analysis; the mechanical resistance and wettability of the L-PRF membrane suffered the influence of the time.

Conservation and viability of refrigerated platelet-rich plasma from New Zealand rabbits / Conservação e viabilidade de plasma rico em plaquetas refrigerado de coelhos Nova Zelândia

Fifteen male New Zealand rabbits were used in this study, with the aim of storing their platelet-rich plasma (PRP) for 30 days at 4-6 C to investigate its conservation and viability during this period. Thirty samples of PRP were prepared and sorted into three equal groups (G1, G2, and G3), and every three days a sample was taken out for evaluationof the number of platelets, mean platelet volume (MPV), pH of the plasma, aggregation post addition of calcium thromboplastin, and for the presence of bacterial and fungal contamination. Results suggested that, for the number of platelets, there was no linear relationship over time. However, when comparing the number of platelets pre-storage to that post-storage, a statistical difference was observed. The hemogram MPV variables, pre and post-storage, also did not relate with time however, there was a statistical difference between the MPV of hemogram and MPV pre-storage, and between MPV pre-storage and MPV post-storage. From the pH evaluation, no influence of time on the variables was found, but statistical differences were found in the samples after storage between 30 and 6 days, 30 and 24 days, and 30 and 27 days. Platelet aggregation occurred within twenty seconds in all samples, independent of storage time. There was no growth of bacteria or yeast in any sample; however, mold growth occurred in the samples stored for 21 days from

Quinze coelhos machos da raça Nova Zelândia foram utilizados neste experimento, com a finalidade de armazenar o plasma rico em plaquetas (PRP) durante 30 dias a 4-6C para investigar a sua conservação e viabilidade durante este período. Trinta amostras de PRP foram preparadas e divididos em três grupos iguais (G1, G2 e G3), e de três em três dias foi retirada uma amostra para avaliação do número de plaquetas, volume plaquetário médio (VPM), pH do plasma, agregação após adição de tromboplastina cálcica, e para a presença de contaminação bacteriana e fúngica. Os resultados sugerem que, para o número de plaquetas, não houve uma relação linear com o tempo. No entanto, quando se compara o número de plaquetas pré-armazenamento com o pós-armazenamento, foi observada diferença estatística. As variáveis VPM no hemograma, pré e pós-armazenamento, também não se relacionou com o tempo, porém, houve diferença estatística entre o VPM do hemograma e pré-armazenamento, e entre VPM pré-armazenamento e pós-armazenamento. A partir da avaliação do pH, não houve influência do tempo sobre as variáveis, porém foram encontradas diferenças estatísticas nas amostras após o armazenamento entre 30 e 6, 30 e 24, e 30 e 27 dias. A agregação de plaquetas ocorreu no prazo de vinte segundos, em todas as amostras, independente do tempo de armazenamento. Não houve crescimento de bactérias ou fungos em qualquer a

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

O soro fetal bovino, utilizado como fonte proteica nos meios de maturação de oócitos e cultivo de embriões pode apresentar risco de contaminação ao meio. Esse fato incentiva estudos com o propósito de encontrar alternativas para substituí-lo. O plasma rico em plaquetas (PRP) estimula a mitogênese e a angiogênese, além de ser uma fonte de fácil aquisição e atuar liberando diversos fatores de crescimento no meio. Dessa forma, objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de PRP no meio tanto de maturação de oócitos quanto no de cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro. Inicialmente, o PRP e o soro fetal bovino (SFB) foram avaliados bioquimicamente e comparados quanto às concentrações de proteína, glicogênio, lipídeos e açúcares. Em seguida, para avaliar o efeito do PRP na maturação dos oócitos, essas estruturas foram distribuídas aleatoriamente no grupo controle (GC - TCM 199 + 10% SFB) e nos grupos tratamentos (G5 TCM 199 + 5% PRP e G10 TCM 199 + 10% de PRP). Após a maturação, os oócitos foram avaliados quanto a expansão das células do cumulus e maturação nuclear. Para avaliar o efeito do PRP no cultivo dos embriões, os presumíveis zigotos foram aleatoriamente distribuídos e cultivados no grupo controle (GC SOF + 10% SFB) e nos grupos tratamentos (G5 SOF + 5% de PRP e G10 SOF + 10% de PRP). Durante o cultivo embrionário, avaliou-se a taxa de clivagem, a taxa de blastocistos e a qualidade dos blastocistos de acordo com o número de blastômeros. A maturação os oócitos pertencentes ao GC (88,9 %) apresentaram maior (P < 0,05) expansão das células do cumulus que os dos G5 (34,1 %) e G10 (50,0 %) e a expansão dos oócitos do G10 foi maior (P < 0,05) que os do G5. Na maturação nuclear não foi verificada diferença (P > 0,05) entre os grupos. Observou-se maior (P < 0,05) clivagem no G5 (86,0%) quando comparado ao G10 (79,0%), porém com taxa similar ao GC (82,0%). A taxa de blastocistos produzidos do G5 (50,0 %) foi superior (P > 0,05) quando comparados ao GC (40,2 %) e G10 (34,2 %). A Taxa dos blastômeros foi maior (P < 0,05) no G5 (159,0±4,18) quando comparado ao GC (132,4±4,11) e G10 (127,1±5,88). Conclui-se que o PRP não exerce influência na maturação dos oócitos, entretanto suplementação de 5% no meio SOF aumenta a taxa de blastocistos produzidos e a qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro.

The fetal bovine serum, used as a protein source for in vitro culture media, holds risk of contamination to the medium. This fact encourages studies with the purpose of finding alternatives to replace it. Platelet-rich plasma (PRP) stimulates mitogenesis and angiogenesis besides being a source of easy acquisition and acting by releasing various growth factors in the medium. Thus, it was aimed to evaluate different PRP concentrations in bovine oocyte in vitro maturation medium and embryo in vitro culture. Initially, both PRP and FBS were evaluated biochemically and compared for protein, glycogen, lipids and sugars. Further, to evaluate the effect of the PRP during oocyte maturation, these structures were distributed randomly in the control group (CG - TCM 199 + 10% FSB) and on G5 - TCM 199 + 5% PRP and G10 TCM 199 + 10% PRP. After maturation, oocytes were evaluated according to cumulus cell expansion and nuclear maturation. To evaluate the effect of the PRP on embryo culture, presumptive zygotes were randomly distributed and cultivated in the control group (CG SOF + 10 % FSB) and experimental conditions (G5 SOF + 5% PRP and G10 SOF + 10% PRP). During embryo culture, a rate of cleavage, a rate of blastocysts and a quality of the blastocysts were evaluated according to the number of blastomeres. Oocyte maturation of the CG (88,9 %) showed higher (P < 0.05) cumulus cell expansion than G5 34,1 %) and G10 (50,0 %), while cumulus expansion on G10 was greater than (P < 0.05) G5. Nuclear maturation was not different (P > 0.05) among groups. There was a greater (P < 0.05) cleavage on G5 (86.0%) than G10 (79.0%), but similar to CG (82.0%). The rate of blastocysts produced from G5 (50.0%) was higher (P> 0.05) when compared to CG (40.2%) and G10 (34.2%). The rate of blastomers was higher (P <0.05) in G5 (159,0±4,18) when compared to GC (132,4±4,11) and G10 (127,1±5,88). It is concluded that PRP does not influence oocyte maturation, however, 5% supplementation in the SOF medium increases the rate of blastocysts produced and the quality of bovine embryos produced in vitro.

Padronização de técnica manual para obtenção de plasma rico em plaquetas de bovino / Standardization of manual technique for obtaining platelet-rich plasma in cattle

Para padronização de uma técnica manual para a obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo em bovinos com custo reduzido (método manual) e de boa qualidade (capacidade de concentrar plaquetas, alta concentração de fatores de crescimento e contaminação reduzida com leucócitos e eritrócitos), que poderá ser utilizado como um agente modulador da resposta imune de vacas com diferentes enfermidades, 450 ml de sangue total de nove vacas clinicamente saudáveis e com perfil hematológico normal foi coletado em bolsas de sangue CPDA-1 e processado dentro de quatro horas após a coleta. O sangue foi separado em alíquotas para avaliar 8 protocolos (P) de centrifugação dupla que variaram quanto a velocidade e o tempo de centrifugação. A contagem de plaquetas, eritrócitos e leucócitos na suspensão obtida (PRP) foi realizada pelo método manual em câmara de Neubauer: P5 (400g e 800g ambos durante 10 min) foi o protocolo com maior número de plaquetas, seguido por P3 (120g e 473g ambos durante 10 min), P4 (300g e 640g durante 10 min cada), P6 (640g durante 10 min e 640g durante 5 min), P8 (640g durante 5 min e 120g durante 10 min) e P7 (720g e 720g durante 5 min) e diferentes (p<0,05) dos menores valores encontrados em P1 (120g e 240g, ambos por 5 minutos) e P2 (120g e 473g ambos por 5 min). Em relação aos eritrócitos, P8, P7, P6, P5 e P4 apresentaram menores concentrações e maiores valores (p<0,05) foram observados em P3 e P2. Menores quantidades de leucócitos foram observadas em P5, P6, P8 e P7 com o maior valor obtido em P2 (p<0,05). Todos os protocolos (P1 a P8) foram eficientes em concentrar plaquetas sendo o valor mais baixo (3,65±0,79) observado em P1. Em relação aos fatores de crescimento ao se mensurar TGF- 1, os protocolos P1 e P8 evidenciaram valores mais elevados. De acordo com os resultados obtidos os protocolos P5 e P8 apresentaram os melhores resultados para confecção de PRP bovino.(AU)

For standardization of manual technique to obtain autologous platelet-rich plasma (PRP) in cattle with reduced cost (manual method) and good quality (ability to concentrate platelets, high level of growth factors and reduced contamination with leukocytes and erythrocytes), that may be used as a modulating agent of the immune response of cows chronically infected with various diseases, 450ml of whole blood from nine clinically and hematologically healthy cattle were collected in CPDA-1 bags and processed within four hours after collection. The blood was divided in aliquots to evaluate 8 protocols (P) of double centrifugation which varied as the speed and time of centrifugation. Platelet, erythrocytes and leukocytes counts in PRP were performed by manual method in a Neubauer chamber. The highest concentration of platelets was obtained in P5 (400g and 800g both for 10 min), followed by (p>0.05) P3 (120g e 473g ambos durante 10 min), P4 (300g e 640g durante 10 min cada), P6 (640g durante 10 min e 640g durante 5 min), P8 (640g durante 5 min e 120g durante 10 min) and P7 (720g and 720g both for 5 min) and different (p <0.05) than the protocols that had lower rates at P1 (120g to 240g, both for 5 minutes) and P2 (both 120g and 473g for 5 min). As for erythrocytes, P8, P7, P6, P5, P4 showed lower concentrations with higher values (p <0.05) observed in P3 and P2. Lesser values of leukocytes were found in P5, P6, P7 and P8 with the biggest value (p <0.05) obtained in P2. All protocols (P1 to P8) were efficient to concentrate platelets and the lowest value (3.65±0.79) was found in P1. Regarding TGF-ß1, the P1 and P8 protocols demonstrated the highest values. According to results, P5 and P8 protocols showed the best results for production of PRP in bovine.(AU)

Padronização de técnica manual para obtenção de plasma rico em plaquetas de bovino

Abstract: For standardization of manual technique to obtain autologous platelet-rich plasma (PRP) in cattle with reduced cost (manual method) and good quality (ability to concentrate platelets, high level of growth factors and reduced contamination with leukocytes and erythrocytes), that may be used as a modulating agent of the immune response of cows chronically infected with various diseases, 450ml of whole blood from nine clinically and hematologically healthy cattle were collected in CPDA-1 bags and processed within four hours after collection. The blood was divided in aliquots to evaluate 8 protocols (P) of double centrifugation which varied as the speed and time of centrifugation. Platelet, erythrocytes and leukocytes counts in PRP were performed by manual method in a Neubauer chamber. The highest concentration of platelets was obtained in P5 (400g and 800g both for 10 min), followed by (p>0.05) P3 (120g e 473g ambos durante 10 min), P4 (300g e 640g durante 10 min cada), P6 (640g durante 10 min e 640g durante 5 min), P8 (640g durante 5 min e 120g durante 10 min) and P7 (720g and 720g both for 5 min) and different (p 0.05) than the protocols that had lower rates at P1 (120g to 240g, both for 5 minutes) and P2 (both 120g and 473g for 5 min). As for erythrocytes, P8, P7, P6, P5, P4 showed lower concentrations with higher values (p 0.05) observed in P3 and P2. Lesser values of leukocytes were found in P5, P6, P7 and P8 with the biggest value (p 0.05) obtained in P2. All protocols (P1 to P8) were efficient to concentrate platelets and the lowest value (3.65±0.79) was found in P1. Regarding TGF-1, the P1 and P8 protocols demonstrated the highest values. According to results, P5 and P8 protocols showed the best results for production of PRP in bovine.

Resumo: Para padronização de uma técnica manual para a obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo em bovinos com custo reduzido (método manual) e de boa qualidade (capacidade de concentrar plaquetas, alta concentração de fatores de crescimento e contaminação reduzida com leucócitos e eritrócitos), que poderá ser utilizado como um agente modulador da resposta imune de vacas com diferentes enfermidades, 450 ml de sangue total de nove vacas clinicamente saudáveis e com perfil hematológico normal foi coletado em bolsas de sangue CPDA-1 e processado dentro de quatro horas após a coleta. O sangue foi separado em alíquotas para avaliar 8 protocolos (P) de centrifugação dupla que variaram quanto a velocidade e o tempo de centrifugação. A contagem de plaquetas, eritrócitos e leucócitos na suspensão obtida (PRP) foi realizada pelo método manual em câmara de Neubauer: P5 (400g e 800g ambos durante 10 min) foi o protocolo com maior número de plaquetas, seguido por P3 (120g e 473g ambos durante 10 min), P4 (300g e 640g durante 10 min cada), P6 (640g durante 10 min e 640g durante 5 min), P8 (640g durante 5 min e 120g durante 10 min) e P7 (720g e 720g durante 5 min) e diferentes (p 0,05) dos menores valores encontrados em P1 (120g e 240g, ambos por 5 minutos) e P2 (120g e 473g ambos por 5 min). Em relação aos eritrócitos, P8, P7, P6, P5 e P4 apresentaram menores concentrações e maiores valores (p 0,05) foram observados em P3 e P2. Menores quantidades de leucócitos foram observadas em P5, P6, P8 e P7 com o maior valor obtido em P2 (p 0,05). Todos os protocolos (P1 a P8) foram eficientes em concentrar plaquetas sendo o valor mais baixo (3,65±0,79) observado em P1. Em relação aos fatores de crescimento ao se mensurar TGF- 1, os protocolos P1 e P8 evidenciaram valores mais elevados. De acordo com os resultados obtidos os protocolos P5 e P8 apresentaram os melhores resultados para confecção de PRP bovino.

PROTOCOLOS PARA A PREPARAÇÃO DE CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE TROMBÓCITOS EM AVES

O estudo visou comparar e avaliar protocolos de produtos autógenos sanguíneos em aves, com base naqueles existentes para mamíferos. No Experimento 1 foram analisados dois protocolos para obtenção de plasma rico em trombócitos e leucócitos (L-PRT). Utilizaram-se 30 aves divididas em três Grupos equitativos: G1 - papagaios; G2 - tucanos-toco; G3 - galinhas domésticas. No protocolo 1, a primeira centrifugação foi a 220 gravidade (g) durante 10 minutos e a segunda a 660 g por 10 minutos. Após a segunda centrifugação, foi descartado 2/3 do sobrenadante, permanecendo apenas o L-PRT. No protocolo 2, a primeira centrifugação foi a 120 g durante 5 minutos e a segunda a 240 g por 5 minutos. Concluiu-se que houve diferenças na concentração de trombócitos entre as espécies, porém independente do protocolo a maior concentração foi nas galinhas, e entre os Protocolos o 2 foi o mais efetivo. No Experimento 2 foram produzidas e avaliadas histologicamente membranas de fibrina rica em trombócitos e leucócitos (L-TRF). Empregaram-se 40 aves divididas em quatro grupos equitativos: G1 araras, G2 - galinhas domésticas, G3 papagaios, G4 - tucanos-toco. Para cada ave foi coletado 0,5 ml de sangue, que foi depositado em tubo de vidro sem anticoagulante e centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. Membranas de L-TRF obtidas pela compressão dos cóagulos com gaze foram processadas para análise histológica. Foi possível concluir que é possível produzir membranas de L-TRF nas espécies de aves estudadas, porém histologicamente as proporções dos elementos avaliados foram similares apenas nas galinhas domésticas e papagaios.

This study aimed to compare and evaluate protocols of autogenous blood products in birds, based on protocols developed for mammals. In Experiment 1, two protocols were evaluated for obtaining Leukocyte- and Thrombocyte-Rich Plasma (L-TRP). Thirty birds were divided into three equally sized groups: G1 - parrots; G2 - toco toucans; G3 - domestic chickens. In Protocol 1 the first centrifugation was at 220 gravity (g) for 10 minutes and the second one at 660 g for 10 minutes. After the second centrifugation, 2/3 of the supernatant was discarded, leaving only the L-TRP. In protocol 2, the first centrifugation was at 120 g for 5 minutes and the second one at 240 g for 5 minutes. In conclusion, there were differences in thrombocyte concentration among the species, but independently of the protocol, the highest concentration was in chickens. Between the protocols, Protocol 2 was the most effective. In Experiment 2, Leukocyte- and Thrombocyte-Rich Fibrin (L-TRF) membranes were developed and assessed histologically. Forty birds were divided into four equally sized groups: G1 macaws, G2 - domestic chickens, G3 parrots, G4 - toco toucans. A total of 0.5 mL of blood was collected from each bird, which was put into glass tube without anticoagulant and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. L-TRF membranes produced after compression of the clot were processed for histological analysis. In conclusion, L-TRF membranes can be produced in the evaluated avian species, but the ratio of the elements evaluated histologically were similar only in domesticated chickens and parrots.

Comparação entre protocolos de obtenção de plasma rico em plaquetas em cães: estudo celular

VIDAL JUNIOR, André William Masseaux. Comparação entre protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas em cães: estudo celular. 2017. 67p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária, Ciências Clínicas). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2017. Foi proposto por esse estudo avaliar dois protocolos (PA e PB) para obtenção de PRP canino autólogo, de fácil execução em ambulatório (método semiautomático) e de boa qualidade (capacidade de concentração de plaquetas, avaliação qualitativa da morfologia das plaquetas e reduzida contaminação com eritrócitos), para posteriormente propor diferentes indicações terapêuticas desses PRP como agentes moduladores de recuperação tecidual, de acordo com o padrão celular leucocitário observado. Para isso foram utilizados 20 cães (Canis lupus familiaris) atendidos no Hospital Veterinário da UFRRJ (HV), machos e fêmeas, com idade variando entre 1 e 7 anos (média 4 anos), considerados saudáveis clinica e hematologicamente que se destinavam para cirurgias eletivas e/ou consultas de rotina. Após tricotomia e antissepsia adequadas, eram coletados 8 mL de sangue por venopunção da jugular sendo imediatamente acondicionados em dois frascos de 4 mL, do tipo vacuntainer, contendo citrato de sódio a 3,2%. O protocolo A utilizando centrifugação dupla com 210 xG e 370 xG e protocolo B utilizando centrifugação dupla com 140 xG e 330 xG. Amostras de PRP obtidas a partir de cada protocolo foram destinadas a contagem de plaquetas, hemácias e leucócitos em câmara de Neubauer, contagem diferencial dos leucócitos e observação da morfologia das plaquetas em esfregaços. Analisou-se os dados (médias e desvios padrão) pelo Teste t com 95% de probabilidade (p<0,05) utilizando-se correlação de Pearson para testar a relação entre a contagem de plaquetas e hemácias, plaquetas e leucócitos e leucócitos em relação as hemácias. Houve correlação negativa muito fraca entre plaquetas e leucócitos (= -0,03), negativa fraca entre plaquetas e hemácias (= -0,3) e correlação positiva forte entre leucócitos e hemácias (=0,75). Embora o protocolo B não tenha alcançando a média um milhão de plaquetas desejado (979300 ± 79631 células/µL), ambos os protocolos, A e B (4,42 ± 1,61 e 3,85 ± 1,55 vezes mais plaquetas que o sangue total, respectivamente) (p<0,05) foram eficientes em concentrar plaquetas. Os prolongamentos citoplasmáticos evidenciando ativação plaquetária estiveram presentes em 26,55 ± 6,72 % das plaquetas do protocolo A e 26,25 ± 7,03 % nas do protocolo B (p>0,05). PA e PB apresentaram reduzido número de hemácias (p>0,05) consideradas contaminantes das amostras e, quanto a quantidade de leucócitos, o protocolo A apresentou mais glóbulos brancos (p<0,05) que o protocolo B com maiores concentrações de basófilos, segmentados e linfócitos. Palavras-chave: fatores de crescimento, concentrado de plaquetas, terapia celular, caninos.

ABSTRACT VIDAL JUNIOR, André William Masseaux. Comparison between protocols for obtaining platelet-rich plasma in dogs: a cellular study. 2017. 67p. Dissertation (Master degree in Veterinary Medicine, Clinical Sciences). Veterinary Institute, Federal Rural University of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2017. It was proposed by this study to evaluate two protocols (PA and PB) to obtain autologous canine PRP, which is easy to perform in an ambulatory (semiautomatic method) and of good quality (platelet concentration, qualitative evaluation of platelet morphology and low contamination with Erythrocytes), to later propose different therapeutic indications of these PRPs as tissue modulating agents, according to the observed cellular leukocyte pattern. For this purpose, 20 dogs (Canis lupus familiaris) were used at the UFRRJ (HV) Veterinary Hospital, males and females, aged between 1 and 7 years (mean 4 years), considered clinically and hematologically healthy for elective surgeries and / or routine consultations. After adequate trichotomy and antisepsis, 8 mL of blood were collected by venipuncture of the jugular, being immediately packed in two 4 mL flasks, vacuntainer type, containing sodium citrate 3,2%. Protocol A using double centrifugation with 210 xG and 370 xG and protocol B using double centrifugation with 140 x G and 330 x G. PRP samples obtained from each protocol were used to count platelets, erythrocytes and leukocytes in the Neubauer chamber, differential leukocyte counting and observation of platelet morphology in smears. Data (mean and standard deviations) were analyzed by the 95% probability t test (p <0,05) using Pearson's correlation to test the relationship between platelet and erythrocyte counts, platelets and leukocytes and leukocytes in Relation to red blood cells. There was a very weak negative correlation between platelets and leukocytes ( = -0,03), weak negative between platelets and erythrocytes ( = -0,3) and strong positive correlation between leukocytes and erythrocytes ( = 0,75). Although Protocol B did not reach the desired one million platelets average (979300 ± 79631 cells / L), both protocols, A and B (4,42 ± 1,61 and 3,85 ± 1,55 times more platelets than Total blood, respectively) (p <0,05) were efficient in concentrating platelets. The cytoplasmic prolongations evidencing platelet activation were present in 26,55 ± 6,72% of platelets of protocol A and 26,25 ± 7,03% in those of protocol B (p> 0,05). A and B presented a small number of red blood cells (p> 0,05), which were considered to be contaminants of the samples and, for the quantity of leukocytes, protocol A presented more white blood cells (p <0,05) than protocol B with higher concentrations of basophils , and lymphocytes. Keywords: growth factors, platelet concentrate, cell therapy, canines.

Avaliação morfológica do concentrado Autólogo de plaquetas de cão sob refrigeração e criopreservação em DMSO 6%.

O objetivo deste estudo foi avaliar as características morfológicas do concentrado autólogo de plaquetas (CAP) no cão, após refrigeração e congelamento. Foram empregados 31 cães (20 fêmeas e 11 machos), de diferentes raças e idades, que se apresentaram no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) para tratamento ortopédico com indicação de terapia celular. Foram coletados nove mL de sangue da veia jugular, dos quais sete foram depositados em tubos de 8,5 mL contendo ACD-A como anticoagulante para a obtenção do CAP e, dois mL em um tubo com EDTA para a contagem de plaquetas, determinação do volume plaquetário médio (MPV) e da amplitude de distribuição plaquetária (PDW). O sangue foi centrifugado a 191g durante seis minutos (única centrifugação) para a obtenção do CAP. Na amostra fresca foram avaliadas a contagem plaquetária, o MPV, o PDW e morfologia celular. A avaliação morfológica foi realizada a partir da contagem de 200 plaquetas sob microscopia óptica que foram classificadas quanto à sua forma em inativas (forma discóide), incertas (perda da forma discóide sem presença de pseudópodes) e ativadas (com emissão de pseudópodes). Quatro amostras de cada animal foram encaminhadas para conservação, sendo uma refrigerada a 4°C por sete dias, outra por 30 dias e mais duas armazenadas em freezer a -80°C no mesmo intervalo de tempo, utilizando dimetil sulfóxido (DMSO) 6% como crioprotetor. Após este período, as amostras foram descongeladas em banho Maria a 37°C, e como as refrigeradas, foram submetidas às mesmas análises laboratoriais da amostra fresca. Verificou-se diferença entre as amostras fresca e conservadas quanto à contagem plaquetária, a concentração celular, ao MPV e ao PDW (P<0,05), exceto no grupo refrigerado por 30 dias, que mostrou alterações morfológicas graves. No grupo congelado por sete dias, não se observou diferença quanto à porcentagem de ativação (P>0,05). Os resultados obtidos levam a concluir que a criopreservação com DMSO 6% a -80°C por sete dias é uma opção favorável para a manutenção das concentrações plaquetárias e das características morfológicas do CAP em cães.

The objective of this study was to evaluate the morphological characteristics of autologous platelet concentrate (APC) in the dog, after refrigeration and freezing. Thirty-one dogs (20 females and 11 males) of different races and ages were submitted to the Veterinary Hospital of the Federal University of Minas Gerais (UFMG) for orthopedic treatment with indication of cellular therapy. 9 mL of jugular vein blood were collected, seven mL were deposited in 8.5 mL tubes containing ACD-A as anticoagulant to obtain APC and two mL in one tube with EDTA for platelet count, mean platelet volume (MPV) and platelet distribution width (PDW). The blood was centrifuged at 191 g for 6 minutes (single centrifugation) to obtain APC. In the fresh sample, the platelet count, MPV, PDW and cell morphology were evaluated. The morphological evaluation was performed by counting 200 platelets under optical microscopy that were classified as inactive (discoid form), uncertain (loss of discoid shape without pseudopodia) and activated (with pseudopod emission). Four samples of each animal were sent for storage, one refrigerated at 4 ° C for seven days, one for 30 days and two stored in a freezer at -80 ° C in the same time interval using 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) as cryoprotectant. After this period, the samples were thawed in a 37°C water bath and, as the refrigerated ones, were subjected to the same laboratory analysis as the fresh sample. There was a difference between fresh and preserved samples for platelet count, cell concentration, MPV and PDW (P<0.05), except in the group refrigerated for 30 days, which showed severe morphological alterations. In the frozen group for seven days, no difference was observed in the percentage of activation (P>0.05). The results obtained lead to the conclusion that cryopreservation with 6% DMSO at -80 ° C for seven days is a favorable option for the maintenance of platelet concentrations and the morphological characteristics of APC in dogs.

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA REPARAÇÃO TENDÍNEA UTILIZANDO MODELO EXPERIMENTAL EM OVINOS

A terapia de lesões tendíneas é reconhecida como um desafio na medicina humana e veterinária em parte devido à dificuldade do completo restabelecimento da morfologia tendínea e de sua resistência biomecânica. Diversas biotecnologias terapêuticas têm sido empregadas com resultados promissores na terapia da tendinite sendo o plasma rico em plaquetas (PRP) muito popular, no entanto, ainda faltam dados para a comprovação de sua real eficácia. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do PRP na cicatrização de lesão experimentalmente induzida no tendão flexor digital superficial (TFDS). Foi realizada tenotomia parcial da face palmar do TFDS com o auxílio de um punch dermatológico em 10 ovinos machos, estes foram divididos em dois grupos: grupo tratado (GT) com PRP autólogo; e grupo controle (GC) tratado com placebo. Foram realizadas avaliações clínicas, ultrassonográficas e termográficas. Na avaliação termográfica foi observado aumento de temperatura sobre a lesão tendínea do GC comparado ao GT. Na avaliação ultrassonográfica foi possível observar menor edema no GT em diferentes momentos, sugerindo uma possível ação antiinflamatória do PRP. Conclui-se que a administração de PRP apresentou efeitos benéficos no tratamento de lesões tendíneas experimentais de ovinos.

The tendon injuries therapy is recognized as a challenge in human and veterinary medicine in part because of the difficulty of the complete restoration of tendon morphology and its biomechanical strength. Various therapeutic biotechnologies have been employed with promising results in the treatment of tendinitis. The platelet-rich plasma (PRP) is very popular, however, there are still data to prove its real effectiveness. This study aimed to evaluate the effects of PRP in wound healing of experimentally induced lesion in the superficial digital flexor tendon (SDFT). The SDFT partial tenotomy of the palmar was conducted with the aid of a dermatological punch. 10 male sheep were divided into two groups: treated group (TG) with autologous PRP; and control group (CG) treated with placebo. Clinic, ultrasound and thermography evaluation were performed. Temperature increase of CG compared to the TG was observed in thermography evaluation. Lesser edema of TG was observed in ultrasound evaluation at different times, suggesting a possible anti-inflammatory action of PRP. The PRP administration showed beneficial effects in the treatment of sheep experimental tendon injuries.

Componentes ricos em plaquetas na reparação de afecções tendo-ligamentosas e osteo-articulares em animais

Platelet-rich plasma and platelet concentrates are involved in growing factors. Both have great therapeutic potential. When the alpha-granules are released by the active platelet, they act in the lesion site stimulating the chemotaxis, the fiberplasia and the angiogenesis. They improve the regeneration of the tissue. Although these rich platelet components are easy to obtain and efficiently to prove by medicine and dentistry, their use on vet medicine is recent. So, much more control studies need to be done. This article reviews morphological aspects of platelets, action of growing factors and use of components rich in platelet in wound healing tendons, ligaments and osteo-articular structures.

O plasma rico em plaquetas e o concentrado de plaquetas são fontes de diversos fatores de crescimento, com grande potencial terapêutico. Uma vez liberados dos grânulos alfa das plaquetas ativadas, esses fatores atuarão no sítio da lesão, estimulando a quimiotaxia, fibroplasia e angiogênese, melhorando assim a reparação tecidual. Embora esses componentes ricos em plaquetas sejam de fácil obtenção e de eficácia comprovada na medicina humana e odontologia, a utilização desses componentes na medicina veterinária é relativamente recente, necessitando ainda de estudos controlados. Neste artigo, os aspectos morfológicos das plaquetas, a ação dos fatores de crescimento e a utilização de componentes ricos em plaquetas na reparação tecidual de estruturas tendo-ligamentosas e osteo-articulares são revisados.

Componentes ricos em plaquetas na reparação de afecções tendo-ligamentosas e osteo-articulares em animais

Platelet-rich plasma and platelet concentrates are involved in growing factors. Both have great therapeutic potential. When the alpha-granules are released by the active platelet, they act in the lesion site stimulating the chemotaxis, the fiberplasia and the angiogenesis. They improve the regeneration of the tissue. Although these rich platelet components are easy to obtain and efficiently to prove by medicine and dentistry, their use on vet medicine is recent. So, much more control studies need to be done. This article reviews morphological aspects of platelets, action of growing factors and use of components rich in platelet in wound healing tendons, ligaments and osteo-articular structures.

O plasma rico em plaquetas e o concentrado de plaquetas são fontes de diversos fatores de crescimento, com grande potencial terapêutico. Uma vez liberados dos grânulos alfa das plaquetas ativadas, esses fatores atuarão no sítio da lesão, estimulando a quimiotaxia, fibroplasia e angiogênese, melhorando assim a reparação tecidual. Embora esses componentes ricos em plaquetas sejam de fácil obtenção e de eficácia comprovada na medicina humana e odontologia, a utilização desses componentes na medicina veterinária é relativamente recente, necessitando ainda de estudos controlados. Neste artigo, os aspectos morfológicos das plaquetas, a ação dos fatores de crescimento e a utilização de componentes ricos em plaquetas na reparação tecidual de estruturas tendo-ligamentosas e osteo-articulares são revisados.

Componentes ricos em plaquetas na reparação de afecções tendo-ligamentosas e osteo-articulares em animais

Platelet-rich plasma and platelet concentrates are involved in growing factors. Both have great therapeutic potential. When the alpha-granules are released by the active platelet, they act in the lesion site stimulating the chemotaxis, the fiberplasia and the angiogenesis. They improve the regeneration of the tissue. Although these rich platelet components are easy to obtain and efficiently to prove by medicine and dentistry, their use on vet medicine is recent. So, much more control studies need to be done. This article reviews morphological aspects of platelets, action of growing factors and use of components rich in platelet in wound healing tendons, ligaments and osteo-articular structures.

O plasma rico em plaquetas e o concentrado de plaquetas são fontes de diversos fatores de crescimento, com grande potencial terapêutico. Uma vez liberados dos grânulos alfa das plaquetas ativadas, esses fatores atuarão no sítio da lesão, estimulando a quimiotaxia, fibroplasia e angiogênese, melhorando assim a reparação tecidual. Embora esses componentes ricos em plaquetas sejam de fácil obtenção e de eficácia comprovada na medicina humana e odontologia, a utilização desses componentes na medicina veterinária é relativamente recente, necessitando ainda de estudos controlados. Neste artigo, os aspectos morfológicos das plaquetas, a ação dos fatores de crescimento e a utilização de componentes ricos em plaquetas na reparação tecidual de estruturas tendo-ligamentosas e osteo-articulares são revisados.

Conservation and viability of refrigerated platelet-rich plasma from New Zealand rabbits / Conservação e viabilidade de plasma rico em plaquetas refrigerado de coelhos Nova Zelândia

Fifteen male New Zealand rabbits were used in this study, with the aim of storing their platelet-rich plasma (PRP) for 30 days at 4-6 C to investigate its conservation and viability during this period. Thirty samples of PRP were prepared and sorted into three equal groups (G1, G2, and G3), and every three days a sample was taken out for evaluationof the number of platelets, mean platelet volume (MPV), pH of the plasma, aggregation post addition of calcium thromboplastin, and for the presence of bacterial and fungal contamination. Results suggested that, for the number of platelets, there was no linear relationship over time. However, when comparing the number of platelets pre-storage to that post-storage, a statistical difference was observed. The hemogram MPV variables, pre and post-storage, also did not relate with time however, there was a statistical difference between the MPV of hemogram and MPV pre-storage, and between MPV pre-storage and MPV post-storage. From the pH evaluation, no influence of time on the variables was found, but statistical differences were found in the samples after storage between 30 and 6 days, 30 and 24 days, and 30 and 27 days. Platelet aggregation occurred within twenty seconds in all samples, independent of storage time. There was no growth of bacteria or yeast in any sample; however, mold growth occurred in the samples stored for 21 days from

Quinze coelhos machos da raça Nova Zelândia foram utilizados neste experimento, com a finalidade de armazenar o plasma rico em plaquetas (PRP) durante 30 dias a 4-6C para investigar a sua conservação e viabilidade durante este período. Trinta amostras de PRP foram preparadas e divididos em três grupos iguais (G1, G2 e G3), e de três em três dias foi retirada uma amostra para avaliação do número de plaquetas, volume plaquetário médio (VPM), pH do plasma, agregação após adição de tromboplastina cálcica, e para a presença de contaminação bacteriana e fúngica. Os resultados sugerem que, para o número de plaquetas, não houve uma relação linear com o tempo. No entanto, quando se compara o número de plaquetas pré-armazenamento com o pós-armazenamento, foi observada diferença estatística. As variáveis VPM no hemograma, pré e pós-armazenamento, também não se relacionou com o tempo, porém, houve diferença estatística entre o VPM do hemograma e pré-armazenamento, e entre VPM pré-armazenamento e pós-armazenamento. A partir da avaliação do pH, não houve influência do tempo sobre as variáveis, porém foram encontradas diferenças estatísticas nas amostras após o armazenamento entre 30 e 6, 30 e 24, e 30 e 27 dias. A agregação de plaquetas ocorreu no prazo de vinte segundos, em todas as amostras, independente do tempo de armazenamento. Não houve crescimento de bactérias ou fungos em qualquer a