Resumo

O consumo de etanol aumenta o estresse oxidativo no organismo prejudicando os 115 processos celulares e atenuando o desenvolvimento placentário. Várias citocinas 116 inflamatórias são importantes para a continuidade da gestação e podem ser 117 desreguladas após a ingestão de álcool levando a prejuízos na progressão placentária 118 e perdas nutricionais fetais. Diante disso, a melatonina tem sido alvo de estudos 119 devido seu possível efeito protetor sob a regulação das citocinas inflamatórias e para 120 diminuição da geração de radicais livres. Assim, o objetivo da pesquisa foi avaliar a 121 atuação da melatonina sob o consumo crônico de álcool em placentas de ratas, 122 Utilizou-se 30 ratas albinas divididas em 3 grupos: Controle 10 ratas prenhes que 123 não receberam álcool; Álcool 10 ratas prenhes submetidas ao consumo crônico de 124 álcool; Álcool + Mel - 10 ratas prenhes submetidas ao consumo de álcool associada à 125 melatonina. O álcool foi administrado na dose de 3g/kg por gavagem intragástrica e a 126 melatonina foi aplicada a noite na dose de 0,8mg/kg por via intraperitoneal. As 127 placentas foram pesadas e analisadas histopatologicamente, morfometricamente e 128 imunohistoquímicamente. Os resultados mostraram uma diminuição significativa no 129 peso placentário no grupo álcool, diferentemente do grupo álcool + mel onde as 130 médias se igualaram ao controle. Houve desorganização na zona do labirinto, ao 131 mesmo tempo em que a morfometria indicou redução nos vasos maternos e fetais no 132 grupo álcool. Nos animais dos grupos controle e álcool + mel não se observou 133 alterações histológicas ou morfométricas significativas. Na imunohistoquímica foi 134 observado forte marcação para os fatores TNF e VEGF no grupo álcool e ainda 135 mostrou proliferação celular reduzida e índice apoptótico elevado. Assim podemos 136 concluir que a melatonina pode atuar tanto na morfologia e morfometria das células 137 placentárias, quanto modulando a síntese de citocinas inflamatórias, proliferação 138 celular e apoptose em placentas de ratas submetidas ao consumo de álcool. 139 140 1 144 145

Ethanol consumption increases oxidative stress in the body, impairing cellular 147 processes and attenuating placental development. Several inflammatory cytokines are 148 important for the continuity of pregnancy and can be deregulated after alcohol 149 ingestion, leading to impaired placental progression and fetal nutritional losses. 150 Therefore, melatonin has been the subject of studies due to its possible protective 151 effect on the regulation of inflammatory cytokines and to reduce the generation of free 152 radicals. Thus, the objective of the research was to evaluate the performance of 153 melatonin under the chronic consumption of alcohol in rat placentas. We used 30 154 albino rats divided into 3 groups: Control 10 pregnant rats that did not receive alcohol; 155 Alcohol 10 pregnant rats submitted to chronic alcohol consumption; Alcohol + Honey 156 - 10 pregnant rats submitted to alcohol consumption associated with melatonin. 157 Alcohol was administered at a dose of 3g/kg by intragastric gavage and melatonin was 158 applied at night at a dose of 0.8mg/kg intraperitoneally. Placentas were weighed and 159 analyzed histopathologically, morphometrically and immunohistochemically. The 160 results showed a significant decrease in placental weight in the alcohol group, unlike 161 the alcohol + honey group where the means were equal to the control. There was 162 disorganization in the labyrinth zone, while morphometry indicated a reduction in 163 maternal and fetal vessels in the alcohol group. In the animals of the control and 164 alcohol + honey groups, no significant histological or morphometric alterations were 165 observed. In the immunohistochemistry, strong staining was observed for the factors 166 TNF and VEGF in the alcohol group and also showed reduced cell proliferation and 167 high apoptotic index. Thus, we can conclude that melatonin can act both on the 168 morphology and morphology of placental cells, as well as modulating the synthesis of 169 inflammatory cytokines, cell proliferation and apoptosis in placentas of rats submitted 170 to alcohol consumption. 171 172 .

Resumo

O estresse oxidativo (EO) e o estresse de retículo endoplasmático (ERE) estão entre as 10 principais causas da disfunção feto-placentária observada na pré-eclâmpsia, restrição de 11 crescimento intrauterino e aborto. No entanto, ainda não há informações se o hipotireoidismo 12 materno também causa estresse na interface materno-fetal e sobre o perfil de mediadores 13 antioxidantes e da resposta a proteínas mal enoveladas (UPR) na placenta ao longo da 14 gestação, uma vez que os mesmos também estão envolvidos no desenvolvimento adequado da 15 placenta. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão do HIF1, de 16 enzimas antioxidantes e mediadores da UPR durante a placentação de ratas (Capítulo 1) e se 17 o hipotireoidismo materno causa EO e ERE na interface materno-fetal (Capítulo 2). Além 18 disso, avaliamos o potencial terapêutico de duas porfirinas de manganês, MnIIIT2EPyP (MnP I) 19 e MnIIIT5B3EPyP (MnP II), na disfunção feto-placentária de ratas hipotireoideas (Capítulo 3), 20 uma vez que MnPs tem apresentado alto poder antioxidante, mas ainda não foram avaliadas 21 em doenças gestacionais. Para isso, três experimentos foram realizados utilizando ratas Wistar 22 (7-8 animais/grupo). O hipotireoidismo foi induzido pela administração diária de 23 propiltiouracil (4mg/Kg/dia) e o tratamento com as MnPs (0,1mg/Kg/dia) iniciou-se no 8° dia 24 de gestação (DG) (CEUA nº 002/17). No Capítulo 1, avaliou-se a expressão placentária de 25 enzimas antioxidantes (SOD1, GPX1, Catalase), mediadores da UPR (ATF6, PERK, GRP78, 26 CHOP) e de hipóxia (HIF1)no 10º, 12°, 14°, 16° e 18° DG. No Capítulo 2,avaliou-se o 27 desenvolvimento feto-placentário e a expressão decidual e placentária de mediadores 28 antioxidantes (Sod1, Sod2, Cat, Gpx1/2, GST, Nrf2), de hipóxia (Hif1), de dano oxidativo 29 ao DNA (8-OHdG) e da UPR (Perk, Atf6, Atf4, Xbp1, HO1, Grp78 e Chop) no 14º e 18º DG. 30 No Capítulo 3, avaliou-se o desenvolvimento feto-placentário e a expressão placentária e 31 decidual de mediadores antioxidantes (SOD1, CAT, GPx1, GST), de hipóxia (HIF1), de 32 dano oxidativo ao DNA (8-OHdG), de ERE (GRP78 e CHOP), imunológicos (TNF e IL-10) 33 e angiogênicos (VEGF). No Capítulo 1, maior imunomarcação placentária de HIF1 foi 34 observada no 16° e 18° DG, enquanto SOD1 e CAT apresentaram maior imunomarcação aos 35 14 e 18 DG. GPx1/2, GRP78 e CHOP apresentaram maior imunomarcação aos 18 DG. Em 36 relação a expressão gênica, Hif1 e Sod1 apresentaram maior expressão de mRNA no 12° e 37 16° DG. Em relação a GPx1, foi observada maior expressão no 10° e 16° DG, enquanto Cat, 38 Perk e Grp78 apresentaram maior expressão gênica no 14º DG, diferente de Atf6 que teve 39 maior expressão no 12° DG. Chop, por outro lado, manteve expressão elevada do 12º até o 40 18º DG, sugerindo ativação de ERE ao final da gestação. No Capítulo 2, a redução do peso 41 fetal e placentário nas ratas hipotireoideas foi associada com maior imunomarcação decidual 42 e/ou placentária de Hif1, 8-OHdG, SOD1, GPx1/2, Grp78 e CHOP aos 14 DG, enquanto 43 houve redução da expressão gênica placentária e/ou decidual de Sod1, Gpx1, Atf6, Perk, Ho1, 44 Xbp1, Grp78 e Chop no mesmo período gestacional. Já aos 18 DG, o hipotireoidismo 45 aumentou a imunomarcação decidual e/ou placentária de Hif1, 8-OHdG, ATF4, Grp78 e 46 CHOP, enquanto reduziu a imunomarcação e atividade enzimática de SOD, CAT, GST. O 47 hipotireoidismo também aumentou a expressão placentária de mRNA para Hif, Nrf2, Sod2, 48 Gpx1, Cat, Perk, Atf6 e Chop aos 18 DG, enquanto reduziu a expressão decidual de Sod2, Cat 49 e Atf6. No Capítulo 3, as MnPs aumentaram o peso fetal das ratas hipotireoideas, além da MnP I aumentar o peso dos órgãos fetais. As MnPs I e II restabeleceram a morfologia da zona 1 juncional e aumentaram a vascularização na placenta. As MnPs bloquearam o aumento de 2 mediadores de EO e ERE causado pelo hipotireoidismo, mostrando níveis de expressão de 3 HIF1, 8-OHdG, Gpx1, Grp78 e Chop semelhante ao controle, além de terem aumentado a 4 expressão proteica de SOD1, Cat e GPx1/2 e restaurado a expressão de IL10 e VEGF na 5 decídua e/ou placenta. No entanto, as MnPs não restauraram a baixa atividade enzimática 6 placentária de SOD, CAT e GST causada pelo hipotireoidismo, enquanto aumentaram a 7 expressão decidual e placentária de TNF.Este estudo demonstrou que a expressão placentária 8 de enzimas antioxidantes e mediadores da UPR em ratas é influenciada pela idade 9 gestacional, com maior expressão nos períodos de hipóxia e ao final da gestação, e que a 10 restrição feto-placentária observada no hipotireoidismo está associada com a ativação de EO e 11 ERE na interface materno-fetal. Além disso, o tratamento com MnPs melhora o 12 desenvolvimento feto-placentário e protege contra o EO e ERE causado pelo hipotireoidismo 13 em ratas, sugerindo uma ferramenta terapêutica promissora para disfunções gestacionais que 14 cursam com estresse placentário.

Oxidative stress (OS) and endoplasmic reticulum stress (ERS) are among the main causes of 10 fetoplacental dysfunction seen in pre-eclampsia, intrauterine growth restriction, and abortion. 11 However, there is still no information on whether maternal hypothyroidism also causes stress 12 at the maternal-fetal interface and on the profile of antioxidant mediators and the unfolded 13 protein response(UPR) in the placenta throughout pregnancy, as they are also involved in 14 proper placental development. Thus, the aim of this study was to evaluate the expression 15 profile of HIF1, antioxidant enzymes and UPR mediators during placentation in rats 16 (Chapter 1) and whether maternal hypothyroidism causes OS and ERS at the maternal-fetal 17 interface (Chapter 2). In addition, we evaluated the therapeutic potential of two manganese 18 porphyrins, MnIIIT2EPyP (MnP I) and MnIIIT5B3EPyP (MnP II), in the fetoplacental 19 dysfunction of hypothyroid rats (Chapter 3), since MnPs has shown high antioxidant power, 20 but still have not been evaluated for gestational disorders. For this, three experiments were 21 carried out using Wistar rats (7-8 animals/group). Hypothyroidism was induced by daily 22 administration of propylthiouracil (4mg/Kg/day) and treatment with MnPs (0.1mg/Kg/day) 23 started on the 8th day of pregnancy (DG) (CEUA nº 002/17). In Chapter 1, the placental 24 expression of antioxidant enzymes (SOD1, GPX1, Catalase) and UPR (ATF6, PERK, GRP78, 25 CHOP) and hypoxia (HIF1) mediators were evaluated at 10, 12, 14, 16 and 18 DG. In 26 Chapter 2, the fetoplacental development and placental and decidual expression of 27 antioxidant (Sod1, Sod2, Cat, Gpx1/2, GST, Nrf2) and hypoxia (Hif1) mediators were 28 analyzed at 14 and 18 DG, as well the expression of 8-OHdG, a marker of oxidative DNA 29 damage, and UPR mediators (Perk, Atf6, Atf4, Xbp1, HO1, Grp78 and Chop). In Chapter 3, 30 the fetoplacental development and placental expression of antioxidant (SOD1, CAT, GPx1, 31 GST) and hypoxia (HIF1) mediators, oxidative DNA damage marker (8-OHdG), and ERS 32 (GRP78 and CHOP), immunological (TNF and IL-10) and angiogenic (VEGF)mediators 33 were evaluated at 18 DG. In Chapter 1, higher placental immunostaining of HIF1 was 34 observed at 16 and 18 DG, while SOD1 and CAT showed higher immunostaining at 14 and 35 18 DG. GPx1/2, GRP78 and CHOP showed higher immunostaining at 18 DG. Regarding 36 gene expression, Hif1 and Sod1 showed higher mRNA expression at 12 and 16 DG. 37 Regarding GPx1, higher expression was observed at 10 and 16DG, while Cat, Perk and 38 Grp78 showed higher gene expression at 14 DG, unlike Atf6, which had higher expression in 39 the 12th DG. Chop, on the other hand, maintained high expression from the 12th to the 18th 40 day of pregnancy, suggesting ERS activation at the end of pregnancy. In Chapter 2, reduced 41 fetal and placental weight in hypothyroid rats was associated with increased decidual and/or 42 placental immunostaining of Hif1, 8-OHdG, SOD1, GPx1/2, Grp78 and CHOP at 14 DG, 43 while there was a reduction in gene expression placental and/or decidual of Sod1, Gpx1, Atf6, 44 Perk, Ho1, Xbp1, Grp78 and Chop in the same gestational period. At 18 DG, hypothyroidism 45 increased the decidual and/or placental immunostaining of Hif1, 8-OHdG, ATF4, Grp78 and 46 CHOP, while it reduced the immunostaining and enzymatic activity of Sod1, CAT, GST. 47 Hypothyroidism also increased placental mRNA expression for Hif, Nrf2, Sod2, Gpx1, Cat, 48 Perk, Atf6 and Chop at 18 DG, while decreasing the decidual expression of Sod2, Cat and 49 Atf6. In Chapter 3, MnPs increased the fetal weight of hypothyroid rats, in addition to MnP I increasing the weight of fetal organs. MnPs I and II restored the morphology of the junctional 1 zone and increased placental vascularization. MnPs blocked the increase of OS and ERS 2 mediators caused by hypothyroidism, showing similar levels of expression of HIF1, 8-3 OHdG, Gpx1, Grp78 and Chop to the control, in addition to increasing the protein expression 4 of SOD1, Cat and GPx1/2 and restored IL10 and VEGF expression in the decidua and/or 5 placenta. However, MnPs did not restore the low placental enzyme activity of SOD, CAT and 6 GST caused by hypothyroidism, while increasing the decidual and placental expression of 7 TNF. This study demonstrated that the placental expression of antioxidant enzymes and 8 UPR mediators in female rats is influenced by gestational age, with greater expression in the 9 periods of hypoxia and at the end of pregnancy, and that the fetal-placental restriction 10 observed in hypothyroidism is associated with activation of OS and ERS at the maternal-fetal 11 interface. Furthermore, treatment with MnPs improves fetal-placental development and 12 protects against OS and ERS caused by hypothyroidism in female rats, suggesting a 13 promising therapeutic tool for gestational disorders associated with placental stress.

Resumo

O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da ingestão materna de diferentes doses de cafeína durante a gestação e a lactação, na pele de ratas-mães e filhotes, bem como sua relação com as concentrações séricas do cortisol materno. Vinte e quatro ratas Wistar adultas foram distribuídas em quatro grupos, representados pelo controle e tratados, com cafeína nas doses de 25, 50 e 100mg/kg. Os grupos tratados receberam cafeína por sonda orogástrica durante toda a gestação e a lactação. O controle recebeu água destilada como placebo. Foram avaliados e quantificados os diferentes tipos de folículos pilosos e a espessura da epiderme. A técnica de imuno-histoquímica, com o uso do anticorpo anti-CDC47, foi utilizada para avaliar a proliferação celular da epiderme e dos folículos pilosos das mães. Na mãe, também foram mensurados os níveis séricos de cortisol pela técnica da quimioluminescência. Os dados foram submetidos à análise de variância com comparação das médias pelos testes Kruskal-Wallis e SNK. Nos grupos tratados com cafeína nas doses de 25 e 50mg/kg, tanto as mães quanto seus filhotes apresentaram hipotricose e/ou alopecia focal. Apesar de a frequência de alterações macroscópicas das mães ter sido superior a dos filhotes, nestes as lesões, quando presentes, foram difusas. A análise histológica demonstrou calcinose de folículos pilosos nas mães e nos filhotes. Mas a morfometria somente revelou diferença significativa no número de folículos pilosos das mães, bem como redução significativa da proliferação celular dos folículos pilosos do grupo tratado com 50mg/kg de cafeína. Os níveis de cortisol materno somente foram significativamente elevados no grupo tratado com 100mg/kg de cafeína. Conclui-se que a cafeína ingerida pelas ratas gestantes e lactantes pode causar lesões cutâneas tanto nas mães quanto nos filhotes, caracterizadas por hipotricose e/ou alopecia, independentemente dos níveis séricos do cortisol materno.

The aim of this study was to investigate the effects of maternal caffeine intake during pregnancy and lactation on the skin of rats and their offspring, as well as their relationship to maternal serum levels of cortisol. 24 adult Wistar rats were equally divided into four groups represented by the control and treated with caffeine at doses of 25, 50 and 100mg/kg. The groups received caffeine by orogastric tube during the entire pregnancy and lactation. The control received distilled water as placebo. Different types of hair follicles and the thickness of the epidermis were assessed and quantified. Immunohystochemistry technique using antibody anti-CDC47 was used to evaluate cellular proliferation of the epidermis and hair follicles of the mothers. Also in the mothers, serum levels of cortisol were measured by the chemiluminescence technique. Data were submitted to analysis of variance comparing mediums by Kruskall Wallis Test and SNK. In groups treated with caffeine 25 and 50mg/kg, both mothers and their puppies had focal alopecia and/or hypotrichosis. Despite the higher frequency of macroscopic changes on the mothers, these lesions were diffuse when present on the puppies. Histological analysis showed calcinosis of hair follicles in the mothers and their puppies. But morphometry revealed significant difference in the number of hair follicles from mothers, as well as a significant reduction of cell proliferation of hair follicles in the group treated with 50mg/kg of caffeine. Maternal cortisol levels were significantly elevated in the group treated with 100mg/kg of caffeine. It is concluded that caffeine intake by pregnant and lactating rats can cause skin lesions in both the mothers and their offspring, characterized by alopecia and/or hypotrichosis, regardless of serum levels of maternal cortisol.

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Diabetes mellitus is a metabolic disorder associated with hyperglycemia and caused by defect in insulin secretion. The search for better understanding of the mechanisms of induction of experimental diabetes and its complications is very important. The purpose of this study was to compare the induction of diabetes mellitus using alloxan 2% in Wistar rats at different doses. Doses of 120, 150, 200mg/kg alloxan 2% and control group were compared. Hyperglycemia and death were observed in all groups, but the higher glycemia and less percentage of death were significant at a dose of 120mg/kg. Glycosuria, polyuria and polydipsia were present in the animals of the three groups, but were significantly higher for G2 compared to other groups and weight loss was more intense in G1. Decreased urinary density was significant in G2 compared to G1 and G3 and there was an increase in urinary pH in all groups compared to control. Positive results for nitrite occurred in G2 and occult blood in the urine in all groups, with greater intensity for G1 followed by G2 and G3. Alloxan 2% intraperitoneally at the three doses used experimentally induced diabetes mellitus in Wistar rats. The dose of 120mg/kg was the most effective and induced disease in a greater number of animals and cause a lower incidence of death.

Diabetes mellitus é uma desordem metabólica associada com hiperglicemia e causada por defeito na secreção de insulina. A busca por melhor compreensão, dos mecanismos fisiopatológicos de indução experimental do diabetes e suas complicações é de grande importância. O objetivo deste estudo foi comparar a indução do diabetes mellitus, usando a aloxana a 2% em diferentes doses em ratas Wistar. Foram comparadas doses de 120, 150, 200mg/Kg de aloxana a 2% e grupo controle. Hiperglicemia e óbito foram observados nos três grupos, no entanto, a maior glicemia e menor percentual de óbito foram significativas utilizando a dose de 120mg/Kg. Glicosúria, poliúria e polidpsia estiveram presentes nos animais dos três grupos, mas foram significativamente maiores para o G2 comparado aos demais grupos e a perda de peso foi mais intensa no G1. Diminuição de densidade urinária foi significativa no G2 comparado ao G1 e G3 e houve aumento do pH urinário em todos os grupos comparado ao controle. Positividade para nitrito ocorreu no G2 e sangue oculto na urina em todos os grupos, com maior intensidade para o G1 seguido do G3 e G2. Aloxana a 2% nas três doses utilizadas induz experimentalmente o diabetes mellitus em ratas Wistar, sendo a dose de 120mg/kg a mais eficiente por induzir a doença em um maior número de animais e c ausar menor incidência de óbito.

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A dexametasona, um glicocorticóide sintético, tem a capacidade de atravessar a placenta aumentando o nível de circulação de corticosteróides da mãe para o feto durante a prenhez. Quando administrada nas fases finais da prenhez pode produzir efeitos indesejáveis na formação da placenta e em vários órgãos da prole. Assim, o presente estudo objetivou investigar o efeito da administração da dexametasona (0,8mg/dia/animal) nos cinco primeiros dias da prenhez, sobre o desenvolvimento placentário de ratas. Utilizou-se 30 ratas albinas, divididas em dois grupos: Grupo I -ratas prenhes sem aplicação de dexametasona, sacrificadas ao 7º e 14º dia; Grupo II -ratas submetidas à aplicação de dexametasona nos cinco primeiros dias de prenhez, sacrificadas ao 7º e 14º dia. Os resultados mostraram que a dexametasona não afetou o número e a histologia dos sítios de implantação, porém, promoveu alteração no disco placentário ocasionando hipertrofia na camada de células trofoblásticas gigantes. Não foram evidenciadas alterações no teor de colágeno, porém houve interferência no metabolismo do glicogênio no espongiotrofoblasto trofospongio. Na morfometria de linhas houve diferença entre os grupos na região de labirinto e células trofoblásticas gigantes, porém a morfometria de pontos só ratificou as alterações percebidas na região do labirinto.

The dexamethasone, a synthetic glucocorticoid, has the ability to cross the placenta by increasing the level of movement of corticosteroids from mother to fetus during pregnancy. When administered in the late stages of pregnancy can produce effects undesirable on placental formation. The present study aimed to investigate the effect of administration of dexamethasone (0.8mg/day/animal) in the first five days of pregnancy, on placental development in rats. We used 30 albino rats, divided into two groups: Group I -pregnant rats without the application of dexamethasone, sacrificed to the 7th and 14th day. Group II -rats subjected to the application of dexamethasone in the first five days of pregnancy, sacrificed to the 7th and 14th day. The results showed that dexamethasone did not affect the number and histology of the implantation sites, but promoted changes in the disk placental causing hypertrophy in trophoblastic giant cell layer. No changes were found in the content of collagen, but there was interference with the metabolism of glycogen in spongiotrophoblast. The morphometry of lines showed, a difference between groups in the region of labyrinth and trophoblast giant cell. However, in morphometry of points there was a difference between groups in the region of labyrinth.

Resumo

Durante a gestação, a decídua e a glândula metrial coordenam o processo de placentação permitindo a troca seletiva de nutrientes e metabólitos entre a mãe e o feto e dão subsídio para a permanência do embrião/feto semi-alogênico em íntimo contato com o útero. Mas, para o sucesso da gestação é fundamental que haja a interação coordenada entre a placenta e o útero comandanda por vários hormônios, dentre os quais os hormônios tireoidianos. Foram realizados dois experimentos distintos. O primeiro teve como objetivo avaliar a decidualização e a expressão de fatores angiogênicos na decídua e glândula metrial de ratas com hipotireoidismo e tratadas com L-tiroxina (T4) e o segundo objetivou avaliar o perfil de expressão espaçotemporal de fatores imunológicos e as células Natural Killer uterinas (uNKs) na decídua e glândula metrial de ratas com hipotireoidismo e tratadas com L-tiroxina (T4). Para o primeiro experimento foram utilizadas 72 ratas Wistar adultas distribuídas nos grupos hipotiroideo, tratado com T4 e controle. Aos 10, 14 e 19 dias de gestação (DG), a decídua e a glândula metrial foram coletadas para avaliação histomorfométrica e imunoistoquímica da expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Flk-1 e Tie-2. Para o segundo experimento foram utilizadas 108 ratas Wistar adultas, distribuídas em três grupos experimentais, hipotireoideo, tratado com T4 e controle. As ratas foram eutanasiadas aos 7, 10, 12, 14 e 19 DG. Avaliou-se a detecção imunoistoquímica de IFN, MIF, IL15, iNOS e a marcação com Lectina DBA para evidenciação das células uNK DBA+ na decídua e glândula metrial. Além disso, avaliou-se a expressão gênica de Ifn, Il15 e iNos por RT-PCR em tempo real. Os dados de ambos os experimentos foram analisados pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK). No primeiro experimento, evidenciou-se que o hipotireoidismo reduziu a área da decídua aos 10 e 19 DG. Além disso, o VEGF aumentou aos 10 e 14 DG e o Flk-1 apenas aos 14 DG, nos animais hipotireoideos, mas ambos foram reduzidos aos 19 DG na glândula metrial, sem alterar significativamente a área ocupada pelos vasos sanguíneos. As ratas tratadas com T4 apresentaram aumento do numero de vasos sanguíneos deciduais aos 10 e 19 DG. Além disso, aos 10 DG, o excesso de T4 resultou no aumento de Flk-1 na decídua e na glândula metrial. O hipotireoidismo aumentou o Tie-2 aos 10 e 19 DG na decídua e na glândula metrial. O segundo experimento mostrou que a expressão de fatores pró e anti-inflamatórios estudados oscilou ao longo da gestação em todos os grupos tanto na decídua quanto na glândula metrial. O hipotireoidismo aumentou a expressão proteica de iNOS aos 7 DG, IL15 e MIF aos 10 e 12 dias, IFN e MIF aos 14 DG na decídua e/ou glândula metrial e dos transcritos gênicos para iNos aos 12 e 19 DG e para Ifn e Il5 aos 14 DG. Além disso, o hipotireoidismo reduziu a expressão proteica dos fatores pró-inflamatórios MIF, aos 7 DG, e IFN, aos 12 dias, e do transcrito gênico para Ifn aos 10 e 19 DG. O hipotireoidismo também reduziu a expressão proteica do fator anti-inflamatório iNOS aos 12, 14 e 19 DG e reduziu seus transcritos gênicos aos 10 e 14 DG. Os grupos tratados com T4 apresentaram aumento da expressão proteica de IFN, IL15 e MIF aos 7 DG, IL15, iNOS e MIF aos 10 DG, MIF aos 12 DG na glândula metrial, IFN e MIF na decídua basal aos 14 DG. Além disso, o tratamento com T4 reduziu a expressão proteica de IFN aos 12 e 19 DG, IL15 aos 12 e 14 DG e iNOS aos 12 e 14 DG. Aos 7 e 10 DG houve a redução da migração de células uNK DBA+ para a decídua em ambos os grupos de tratamento. Entretanto, aos 12 DG houve aumento no grupo tratado com T4 e aos 14 DG redução no grupo hipotireoideo. Pode-se concluir com o primeiro experimento, que o hipotireoidismo reduz a área da decídua e aumenta a expressão de VEGF, Tie-2 e Flk-1. O excesso de T4 promove a angiogênese tecidual ao aumentar o número de vasos na decídua associado ao aumento da expressão de Flk-1. Com o segundo experimento conclui-se que, tanto o hipotireoidismo quanto o tratamento com tiroxina alteram o perfil de expressão espaço22 temporal dos fatores imunológicos da decídua e da glândula metrial ao longo da gestação. A redução dos fatores pró-inflamatórios IFN e IL15 é mais predominante no grupo tratado com T4, enquanto o hipotireoidismo compromete o desenvolvimento de um ambiente antiinflamatório na interface materno-fetal, uma vez que a redução do fator anti-inflamatório iNOS e das células uNK DBA+ é principalmente evidenciada neste grupo

During gestation, the decidua and metrial gland coordinate the placentation process, allowing the selective exchange of nutrients and metabolites between mother and fetus, and provides subsidy for the semi-allogeneic embryo/fetus to remain in close contact with the uterus. But for the success of gestation, it is essential that there is a coordinated interaction between the placenta and the uterus by various hormones, among which thyroid hormones. Two different experiments were performed. The first one was goal to evaluate the decidualization and expression of angiogenic factors and the second one evaluates the spatiotemporal expression profile of immunological factors and the uterine Natural Killer cells (uNKs) in the decidua and metrial gland of rats with hypothyroidism and treated with L-tyroxine (T4). For the first experiment, 72 adults Wistar rats were distributed in the hypothyroid, T4 treated and control groups. At 10, 14 and 19 days of gestation (DG), the decidua and metrial gland were collected for histomorphometric and immunohistochemical evaluation of vascular endothelial growth factor (VEGF), Flk-1 and Tie-2 expression. For the second experiment, 108 adults Wistar rats were distributed in three experimental groups, hypothyroid, treated with T4 and control. The rats were euthanized at 7, 10, 12, 14 and 19 DGs. The immunohistochemical detection of IFN, MIF, IL15, iNOS and the labeling with Lectin DBA were evaluated for the detection of uNK DBA+ cells in the decidua and metrial gland. In addition, the expression of Ifn, Il15 and iNos by real-time RT-PCR was evaluated. Data from both experiments were analyzed by the Student- Newman-Keuls (SNK) test. In the first experiment, it was shown that hypothyroidism reduced the decidua area at 10 and 19 DG. In addition, VEGF increased at 10 and 14 DG and Flk-1 only at 14 DGs in the hypothyroid animals, but both were reduced to 19 DGs in the metrial gland, without significantly altering the area occupied by the blood vessels. The rats treated with T4 showed an increase in the number of deciduous blood vessels at 10 and 19 DG. In addition, at 10 DGs, excess T4 resulted in the increase of Flk-1 in the decidua and in the metrial gland. Hypothyroidism increased Tie-2 at 10 and 19 DGs in the decidua and metrial gland. The second experiment showed that the expression of pro and anti-inflammatory factors studied oscillated throughout gestation in all groups, both in the decidua and in the metrial gland. Hypothyroidism increased the protein expression of iNOS at 7 DGs, IL15 and MIF at 10 and 12 days, IFN and MIF at 14 DGs in the decidua and/or metrial gland and the gene transcripts for iNos at 12 and 19 DGs and for Ifn and Il5 To 14 DGs. In addition, hypothyroidism reduced the protein expression of the proinflammatory factors MIF, at 7 DG, and IFN at 12 days, and of the gene transcript for Ifn at 10 and 19 DGs. Hypothyroidism also reduced the protein expression of the anti-inflammatory factor iNOS at 12, 14 and 19 DG and reduced its gene transcripts at 10 and 14 DGs. The T4 treated groups showed increased expression of IFN, IL15 and MIF at 7 DG, IL15, iNOS and MIF at 10 DG, MIF at 12 DGs in the metrial gland, IFN and MIF at the baseline decidua at 14 DGs. In addition, treatment with T4 reduced the protein expression of IFN at 12 and 19 DG, IL15 at 12 and 14 DG and iNOS at 12 and 14 DGs. At 7 and 10 DG there was a reduction of migration of uNK DBA+ cells to decidua in both treatment groups. However, at 12 DG there was an increase in the group treated with T4 and at 14 DG a reduction in the hypothyroid group. It can be concluded from the first experiment that hypothyroidism reduces the decidua area and increases the expression of VEGF, Tie-2 and Flk-1. Excess T4 promotes tissue angiogenesis by increasing the number of vessels in the decidua associated with increased expression of Flk-1. With the second experiment it was concluded that both hypothyroidism and thyroxine treatment altered the spatiotemporal expression profile of the immunological factors of the decidua and metrial gland throughout pregnancy. The reduction of the proinflammatory factors IFN and IL15 is more predominant in the group treated with T4, whereas hypothyroidism compromises the development of an anti-inflammatory environment at 24 the feto-maternal interface, since the reduction of the anti-inflammatory factor iNOS and of the uNK DBA+ cells is mainly evidenced in this group.

Resumo

Foram realizados dois experimentos distintos. O experimento 1 avaliou o efeito da lactação sobre a diferenciação osteogênica das células tronco mesenquimais do tecido adiposo (CTM-TA) de ratas. O experimento 2 avaliou a diferenciação osteogênica das CTM-TA sob efeito de duas concentrações de prolactina. No experimento 1, foram utilizadas 10 ratas Wistar distribuídas em dois grupos: 1) controle e 2) lactante. Aos 30 dias de lactação, os animais de ambos os grupos foram eutanasiados para a coleta do tecido adiposo visceral e extração das CTM. As células foram cultivadas em meio osteogênico por 7, 14 e 21 dias. Foram realizados os testes de conversão do MTT em cristais de formazan, atividade de fosfatase alcalina, síntese de colágeno, porcentagem de nódulos de mineralização e de células por campoe a quantificação dos transcriptos gênicos para fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno tipo I por RT-PCR tempo real. As médias foram comparadas pelo teste SNK e as diferenças foram consideradas significativas se p<0,05. O grupo lactante apresentou maior conversão do MTT em cristais de formazan aos 7, 14 e 21 dias e atividade da fosfatase alcalina e síntese de colágeno aos 14 dias. O grupo lactante apresentou maior porcentagem de nódulos de mineralização em relação ao controle, porém com menor porcentagem de células. A lactação promoveu aumento da expressão de osteopontina em todos os tempos, de sialoproteína aos 7 e 21 dias e de BMP-2 aos 21 dias. No entanto, a lactação reduziu a expressão de osteocalcina em todos os períodos. Conclui-se que as CTM-TA de ratas lactantes apresentaram maior potencial osteogênico caracterizado por aumento da síntese de matriz mineralizada e da expressão de proteínas colagênicas e não colagênicas da matriz. No experimento 2, as CTM-TA foram cultivadas em meio osteogênico com e sem adição de prolactina e distribuídas em três grupos: 1) CTM-TA (controle), 2) CTM-TA com adição de 100ng/mL de prolactina e 3) CTM-TA com adição de 300ng/mL de prolactina. Aos 21 dias de diferenciação, foram realizados os testes de conversão do MTT em cristais de formazan, porcentagem de nódulos de mineralização e de células por campo e quantificação dos transcriptos gênicos para fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno tipo I por RT-PCR tempo real. A adição de prolactina reduziu a conversão do MTT no grupo 3 e aumentou a porcentagem de células/campo nos grupos 2 e 3, porém sem aumentar significativamente a porcentagem de nódulos de mineralização e a expressão dos transcritos gênicos para colágeno tipo I e para as proteínas não colagênicas. Conclui-se que a adição de prolactina nas concentrações de 100ng/mL e 300ng/mL não altera a diferenciação osteogênica das CTM-TA de ratas apesar de aumentar a celularidade da cultura.

Two different experiments were performed. Experiment 1 evaluated the effect of lactation on the osteogenic differentiation of rats adipose derived-mesenchymal stem cells (ADSCs). Experiment 2 evaluated the osteogenic differentiation of ADSCs under the effect of two concentrations of prolactin. In experiment 1, ten Wistar rats were divided into two groups: 1) control, and 2) lactating. At 30 days of lactation, both groups were euthanized and samples of visceral adipose tissue were collected for ADSC extraction. ADSC was grown in osteogenic medium for 7, 14 and 21 days. The tests of MTT conversion into formazan crystals, alkaline phosphatase activity, collagen synthesis, percentage of mineralized nodules and cells per field and quantification of genic transcript for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I by RT-PCR real time were made. The means were compared by the SNK test and the differences were considered significant if p <0.05. The lactating group had an increase in the conversion of MTT into formazan crystals at 7, 14 and 21 days. Alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in the lactating group were greater only at 14 days. The lactation group had a higher percentage of mineralization nodules than control group, and a decrease in the percentage of cells. Lactation promoted increased in osteopontin expression at all times, bone sialoprotein at 7 and 21 days and BPM-2 only at 21 days. However, lactation reduced the expression of osteocalcin in all periods. It is concluded that the cells of lactating rats presented a greater osteogenic potential characterized by an increase of the mineralized matrix synthesis. In the experiment 2, ADSCs were grown in a medium with and without the addition of prolactin and distributed into three groups: 1) CTM-TA (control), 2) CTM-TA with addition of 100ng/mL prolactin, and 3) CTM-TA with addition of 300ng/mL prolactin. At 21 days of differentiation, the tests of MTT conversion into formazan crystals, percentage of mineralized nodules and cells per field and quantification of genic transcript for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I by RT-PCR real time were made. The addition of prolactin reduced the conversion of MTT in group 3 and increased the percentage of cells/field in the groups 2 and 3, however without significantly increasing the percentage of nodules of mineralization and the expression of the genic transcription for for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2, and collagen I. It is concluded that the addition of prolactin in concentrations of 100ng/mL and 300ng/mL does not change the osteogenic differentiation to the CTM-TA of female rats despite of increasing the cellularity of the culture.

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The cells of the myelo id, lymphoid , and erythroid lineage s of the bone marrow were quantified in rats with hypo and hyperthyroidism. Fifteen Wistar rats were divided into three groups: hypothyroid (n=5), hyperthyroid (n=5) , and control (n=5). Three months after the onset of the treatment s, euthanasia was performed . Bone marrow was aspirated from femurs of each animal to perform smear s that were stained with Quick Panoptic. T he percentage s of rubroblast, prorubrocyte, metarubrocyte, myeloblast, promyelocytes, metamyelocytes, myel ocytes, segmented, eosinophils, basophils, lymphocytes, plasma cells and monocytes in were determined a total of 500 cells. The bone marrow of animals with hypothyroidism had hypoplasia. The myeloid:erythroid ratio was higher in animals with thyroid dysfun ction. In hypo and hyperthyroidism, there was a significant reduction of the percentage of rubrocyte, metarubrocyte , and lymphocytes and increase of myelocytes and segmented cells. In hypothyroidism, there was a significant increase in the percentage of me tamyelocytes. It is c oncluded that both hypo and hyperfunction of thyroid increase the myeloid:erythroid ratio by increasing the number of cells of the myeloid lineage and reducing the cells of the erythroid lineage.

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Estudos em ratos demonstram que alterações no metabolismo, decorrentes do diabetes, refletem-se sobre o sistema imune. O cortisol tem importante efeito no controle e no metabolismo dos carboidratos, lipídios, proteínas e ajuda na reação metabólica ao estresse. O presente estudo teve por objetivo verificar a atividade funcional de macrófagos de ratas sensibilizadas pela aloxana, na presença do hormônio cortisol em duas fases (noturno e diurno). Foram utilizadas 40 ratas, Wistar, pesando em média 230g. O diabetes foi induzido pela injeção endovenosa da aloxana, na dose de 42mg/kg. As ratas foram divididas em 8 grupos; G1 controle diurno; G2 controle noturno; G3 aloxana diurno; G4 aloxana noturno; G5 cortisol diurno; G6 cortisol noturno; G7 aloxana e cortisol diurno e G8 aloxana e cortisol noturno. A glicemia dos 8 grupos foi avaliada durante 15 dias, em 4 momentos e em 2 períodos do dia. Após este período, as ratas foram sacrificadas, e os macrófagos foram obtidos da maceração de baço e as células separadas por gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia) e em seguida realizou-se a ativação funcional de fagócitos pela liberação do ânion superóxido (O2 -) pelo método do ferrocitocromo C. Para verificar o estresse oxidativo, avaliou-se a concentração da enzima superóxido dismutase, presente no plasma destes animais. A dosagem da SOD foi realizada pelo método de redução do NBT (nitro blue

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O efeito da atividade física no tratamento da osteoporose foi estudado em ratas distribuídas em dois experimentos. No primeiro, havia, um grupo castrado e o outro normal e no segundo, havia dois grupos castrados e um normal. Três meses após a castração, os animais do experimento 1 foram sacrificados para confirmar a indução da osteoporose e os animais do experimento 2 foram separados em três grupos: ratas com osteoporose ativas, com osteoporose sedentárias e ratas normais. Após três meses de exercício, todos os animais do experimento 2 foram sacrificados. Às necropsias, colheram-se os ossos longos, vértebras, maxila e mandíbula para avaliação histomorfométrica. Três meses após a castração, havia redução da quantidade de osso trabecular dos ossos longos e vértebras com hipotrofia e hipoplasia osteoblástica, confirmando a indução da osteoporose. As ratas com osteoporose ativas apresentaram aumento do tecido ósseo nos ossos longos e vértebras e aumento da espessura do osso nasal. Isso se deveu à hiperplasia osteoblástica, ao aumento das ramificações canaliculares dos osteócitos e ao estímulo da medula óssea. Conclui-se que a atividade física aumenta a quantidade de osso em todo o esqueleto de ratas com osteoporose

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A ivermectina foi descoberta em 1970, e desde então é utilizada em mais de 30 países. Na Medicina Veterinária é uma droga muito utilizada desde de 1981. Esta droga pertence ao grupo das avermectinas que são anti-helmínticos produzidos pela fermentação do Streptomyces avermitilis. A avaliação de efeitos tóxicos de um fármaco inclui pesquisas para avaliar sua toxicidade sobre o organismo materno, pois qualquer alteração metabólica que ocorra nele reflete-se no desenvolvimento do embrião ou feto. Drogas que causam toxicidade materna, quando administradas durante o período de lactação podem alterar o comportamento materno e impedir que as crias sejam cuidadas adequadamente afetando assim o seu desenvolvimento e, inclusive reduzindo suas chances de sobrevivência. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da ivermectina sobre o desempenho reprodutivo de ratas. Foram utilizadas 70 ratas albinas, adultas e virgens, divididas em sete grupos: GI-Ratas controle, tratadas com o veículo da ivermectina (placebo); GII-Ratas tratadas com 0,5 mg/kg de ivermectina via oral; GIII-Ratas tratadas com 1,0 mg/kg de ivermectina via oral; GIV-Ratas tratadas com 2,0 mg/kg de ivermectina via oral; GV-Ratas tratadas com 4,0 mg/kg de ivermectina via oral; GVI-Ratas tratadas com 8,0 mg/kg de ivermectina via oral; GVII-Ratas tratadas com 10,0 mg/kg de ivermectina via oral. Os animais foram tratados durante 45 dias, com administração do medicamento a cada três dias, totalizando 15 administrações, para cada animal. Após esse período foi feito o acompanhamento do ciclo estral. Os animais foram colocados para acasalar e após a detecção da prenhez, cada animal foi tratado com ivermectina, na dose correspondente a cada grupo. No oitavo dia de gestação foram eutanasiados 03 (três) animais de cada grupo para avaliação da gestação, observação de possíveis reabsorções, contagem e pesagem dos embriões implantados no útero. Os outros animais acasalados foram avaliados a gestação completa e a lactação; ao nascimento, os neonatos, foram contados, pesados e analisados quanto a existência de defeitos congênitos e mortalidade durante 15 dias. Baseado nos resultados obtidos pode-se concluir que o tratamento com a ivermectina determina: maior incidência da fase de estro; concentração de glândulas endometriais hiperplásicas; não altera a fertilidade; não causa toxicidade neonatal