Uso de células-tronco no tratamento de sequelas neurológicas causadas pela cinomose / Use of stem cells in the treatment of sequelates neurological caused by cinomosis

A cinomose canina é uma doença infectocontagiosa causada pelo vírus Paramyxoviridae, que acomete cães de todas as idades, entretanto principalmente cães filhotes não vacinados. Uma das sequelas da doença é neurológica que, por muitas vezes, é de difícil tratamento. A terapia com células-tronco é uma alternativa para atenuar os sinais e sequelas neurológicas, propiciando melhor qualidade de vida para o animal. As células-tronco são células com alta capacidade de auto renovação e diferenciação, e, portanto, uma alternativa de tratamento para as sequelas neurológicas derivada pela cinomose.

Canine distemper is an infectocontagious disease caused by Paramyxoviridae virus, which affects dogs of all ages, however mainly unvaccinated puppies. Neurological manifestation are common in canine distemper which is often difficult to treat. Stem cell therapy is an alternative to attenuate neurological signs and sequel, providing better quality of life for the animal. Stem cells have high capacity for self-renewal and differentiation, and an alternative treatment for neurological sequel derived by distemper.

A modified hydrogel production protocol to decrease cellular content

Purpose: To analyze the cytotoxicity and cell in porcine-derived decellularized skin matrix. Methods: We analyzed the effect of multiple decellularization processes by histological analysis, DNA quantification, and flow cytometry. Subsequently, we analyzed the most appropriate hydrogel concentration to minimize cytotoxicity on fibroblast culture and to maximize cell proliferation. Results: After the fourth decellularization, the DNA quantification showed the lowest DNA concentration (< 50 ng/mg). Histological analysis showed no cell components in the hydrogel. Moreover, hematoxylin and eosin showed a heterogeneous structure of collagen fibers. The best hydrogel concentration ranged from 3 to 25%, and there was no significant difference between the 24 hours and seven days. Conclusions: The process of hydrogel production was effective for removing cells and DNA elements. The best hydrogel concentration ranged from 3 to 25%.

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use

ABSTRACT: Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF- (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.

RESUMO: O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF- antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use / Produção e validação de plasma rico em plaquetas canino liofilizado para fins de utilização terapêutica

Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-β, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF-β (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.(AU)

O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF-β antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- β (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.(AU)

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use / Produção e validação de plasma rico em plaquetas canino liofilizado para fins de utilização terapêutica

Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-β, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF-β (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.(AU)

O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF-β antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- β (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.(AU)

Modelo de indução de osteoporose em coelhas - avaliação radiográfica / Rabbit osteoporosis induction model - radiographic evaluation

In order to establish a bone loss induction model in rabbits to study osteoporosis, 18 rabbits underwent ovariectomy and received methylprednisolone 1mg/kg intramuscularly on alternate days for two weeks. Immediately before ovariectomy up to 42 days after methylprednisolone administration, radiographs of the right olecranon were taken in the mediolateral position to evaluate the radiographic optical density. Before the induction of osteoporosis, rabbits presented mean values of radiographic density of 2.305mm Al and at 42 days of 1.575mm Al. The values obtained were submitted to ANOVA for repeated measures that revealed a significant drop (P< 0.001) in the density over time, proving that the induction was able to trigger bone loss of these animals. With this, it can be affirmed that the adopted protocol was enough to provoke a significant bone loss, characterizing a valid model for the study of new treatments for osteoporosis.(AU)

Modelo de indução de osteoporose em coelhas - avaliação radiográfica / Rabbit osteoporosis induction model - radiographic evaluation

In order to establish a bone loss induction model in rabbits to study osteoporosis, 18 rabbits underwent ovariectomy and received methylprednisolone 1mg/kg intramuscularly on alternate days for two weeks. Immediately before ovariectomy up to 42 days after methylprednisolone administration, radiographs of the right olecranon were taken in the mediolateral position to evaluate the radiographic optical density. Before the induction of osteoporosis, rabbits presented mean values of radiographic density of 2.305mm Al and at 42 days of 1.575mm Al. The values obtained were submitted to ANOVA for repeated measures that revealed a significant drop (P< 0.001) in the density over time, proving that the induction was able to trigger bone loss of these animals. With this, it can be affirmed that the adopted protocol was enough to provoke a significant bone loss, characterizing a valid model for the study of new treatments for osteoporosis.(AU)

Células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) em animais domésticos e a possibilidade de geração in vitro de gametas / Induced pluripotent stem cells (iPS cells) in domestic animals and the possibility to generate gametes in vitro

Células-tronco são conhecidas pela característica de alto potencial de auto-renovação e podem ser classificadas segundo seu estágio de indiferenciação e perfil epigenético. Células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco adultas são bastante estudadas e caracterizadas, principalmente nos modelos humano e em camundongos por apresentarem novas possibilidades tanto para a medicina regenerativa quanto para o entendimento do desenvolvimento inicial dos mamíferos. Contudo, a derivação e a manutenção de CTEs em espécies domésticas é desafiadora e apresenta resultados inconsistentes em relação à manutenção da pluripotência in vitro. Nesse contexto, a geração das células pluripotentes induzidas in vitro (células iPS ou iPSCs) é imprescindível para a geração de novas possibilidades na medicina veterinária regenerativa e reprodutiva devido à capacidade de diferenciação destas em uma variedade de outros tipos celulares, inclusive em animais. Assim, esta revisão apresenta a geração das células iPS em animais domésticos, e em especial, recentes estudos sobre as etapas necessárias para a possibilidade de geração de gametas funcionais in vitro, uma importante contribuição na correção de infertilidades, conservação de espécies ameaçadas de extinção e geração de indivíduos geneticamente superiores ou modificados para aplicações agropecuárias ou biomédicas.(AU)

Stem cells are widely known for their high potential for self-renewal, being classified according to their stage of undifferentiation and epigenetic profile. Embryonic stem cells (ES) and adult stem cells are already well studied and characterized, mainly in human and mouse models, once they present new possibilities both for regenerative medicine and for understanding the initial development of mammals. However, the derivation and maintenance of ES in domestic species is challenging and presents inconsistent results regarding maintenance of in vitro pluripotency. In this context, the derivation of in vitro induced pluripotent cells (iPS cells or iPSCs) enables new possibilities in regenerative and reproductive veterinary medicine due to their ability to differentiate into a variety of other cell types. Therefore, this review presents the generation of iPS cells in domestic animals, and focuses on recent studies on the steps necessary for the generation of functional gametes in vitro, an important contribution of stem cells aiming the correction of infertility, the conservation of species in risk of extinction and for the generation of genetically superior or modified organisms for agricultural and biomedical applications.(AU)

Células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) em animais domésticos e a possibilidade de geração in vitro de gametas / Induced pluripotent stem cells (iPS cells) in domestic animals and the possibility to generate gametes in vitro

Células-tronco são conhecidas pela característica de alto potencial de auto-renovação e podem ser classificadas segundo seu estágio de indiferenciação e perfil epigenético. Células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco adultas são bastante estudadas e caracterizadas, principalmente nos modelos humano e em camundongos por apresentarem novas possibilidades tanto para a medicina regenerativa quanto para o entendimento do desenvolvimento inicial dos mamíferos. Contudo, a derivação e a manutenção de CTEs em espécies domésticas é desafiadora e apresenta resultados inconsistentes em relação à manutenção da pluripotência in vitro. Nesse contexto, a geração das células pluripotentes induzidas in vitro (células iPS ou iPSCs) é imprescindível para a geração de novas possibilidades na medicina veterinária regenerativa e reprodutiva devido à capacidade de diferenciação destas em uma variedade de outros tipos celulares, inclusive em animais. Assim, esta revisão apresenta a geração das células iPS em animais domésticos, e em especial, recentes estudos sobre as etapas necessárias para a possibilidade de geração de gametas funcionais in vitro, uma importante contribuição na correção de infertilidades, conservação de espécies ameaçadas de extinção e geração de indivíduos geneticamente superiores ou modificados para aplicações agropecuárias ou biomédicas.

Stem cells are widely known for their high potential for self-renewal, being classified according to their stage of undifferentiation and epigenetic profile. Embryonic stem cells (ES) and adult stem cells are already well studied and characterized, mainly in human and mouse models, once they present new possibilities both for regenerative medicine and for understanding the initial development of mammals. However, the derivation and maintenance of ES in domestic species is challenging and presents inconsistent results regarding maintenance of in vitro pluripotency. In this context, the derivation of in vitro induced pluripotent cells (iPS cells or iPSCs) enables new possibilities in regenerative and reproductive veterinary medicine due to their ability to differentiate into a variety of other cell types. Therefore, this review presents the generation of iPS cells in domestic animals, and focuses on recent studies on the steps necessary for the generation of functional gametes in vitro, an important contribution of stem cells aiming the correction of infertility, the conservation of species in risk of extinction and for the generation of genetically superior or modified organisms for agricultural and biomedical applications.

Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais extraídas do tecido adiposo e da medula óssea de cães / Isolation and culture of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow of dogs

Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães. (AU)

The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.(AU)

Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais extraídas do tecido adiposo e da medula óssea de cães / Isolation and culture of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow of dogs

Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães.

The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.

ISOLAMENTO E CULTIVO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS EXTRAÍDAS DO TECIDO ADIPOSO E DA MEDULA ÓSSEA DE CÃES

Abstract The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.

Resumo Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães.

Adipose tissue as mesenchymal stem cells source in equine tendinitis treatment / Tecido adiposo como fonte de células tronco mesenquimais no tratamento da tendinite equina

Tendinitis is an important high-relapse-rate disease, which compromises equine performance and may result in early athletic life end to affected animals. Many therapies have been set to treat equine tendinitis; however, just few result in improved relapse rates, quality of extracellular matrix (ECM) and increased biomechanical resistance of the treated tissue. Due to advances in the regenerative medicine, promising results were initially obtained through the implantation of mesenchymal stem cells (MSC) derived from the bone marrow in the equine tendon injury. Since then, many studies have been using MSCs from different sources for therapeutic means in equine. The adipose tissue has appeared as feasible MSC source. There are promising results involving equine tendinitis therapy using mesenchymal stem cells from adipose tissue (AdMSCs).

A tendinite é uma importante afecção com alta taxa de recidivas que compromete o desempenho de equinos e pode resultar no término precoce da vida atlética dos animais acometidos. Diversas terapias têm sido estabelecidas para o tratamento da tendinite equina, no entanto poucas resultam na melhora da taxa de recidiva, melhora da qualidade da matriz extracelular (MEC) e aumento da resistência biomecânica do tecido tratado. Com o advento da medicina regenerativa resultados promissores foram inicialmente obtidos com o implante de células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas da medula óssea na lesão tendínea de equinos. Desde então, diversos estudos têm sido conduzidos utilizando CTMs de diferentes fontes para esta finalidade terapêutica em equinos. O tecido adiposo tem se mostrado como uma fonte viável de CTMs e também há resultados promissores envolvendo a terapia da tendinite equina utilizando as células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdCTMs). Neste artigo, dados relacionados ao uso das AdCTMs na terapia da tendinite equina serão revisados.

Adipose tissue as mesenchymal stem cells source in equine tendinitis treatment / Tecido adiposo como fonte de células tronco mesenquimais no tratamento da tendinite equina

Tendinitis is an important high-relapse-rate disease, which compromises equine performance and may result in early athletic life end to affected animals. Many therapies have been set to treat equine tendinitis; however, just few result in improved relapse rates, quality of extracellular matrix (ECM) and increased biomechanical resistance of the treated tissue. Due to advances in the regenerative medicine, promising results were initially obtained through the implantation of mesenchymal stem cells (MSC) derived from the bone marrow in the equine tendon injury. Since then, many studies have been using MSCs from different sources for therapeutic means in equine. The adipose tissue has appeared as feasible MSC source. There are promising results involving equine tendinitis therapy using mesenchymal stem cells from adipose tissue (AdMSCs).(AU)

A tendinite é uma importante afecção com alta taxa de recidivas que compromete o desempenho de equinos e pode resultar no término precoce da vida atlética dos animais acometidos. Diversas terapias têm sido estabelecidas para o tratamento da tendinite equina, no entanto poucas resultam na melhora da taxa de recidiva, melhora da qualidade da matriz extracelular (MEC) e aumento da resistência biomecânica do tecido tratado. Com o advento da medicina regenerativa resultados promissores foram inicialmente obtidos com o implante de células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas da medula óssea na lesão tendínea de equinos. Desde então, diversos estudos têm sido conduzidos utilizando CTMs de diferentes fontes para esta finalidade terapêutica em equinos. O tecido adiposo tem se mostrado como uma fonte viável de CTMs e também há resultados promissores envolvendo a terapia da tendinite equina utilizando as células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdCTMs). Neste artigo, dados relacionados ao uso das AdCTMs na terapia da tendinite equina serão revisados.(AU)

Células Tronco Para o Tratamento da Lesão Medular Canina: Revisão Sistemática com Meta-Análise de Eficácia

A lesão medular espinhal (LME) tem sido alvo de uma variedade de estudos em diversos campos científicos, com inúmeras tentativas de demonstrar a melhoria da função locomotora em cães com LME após o transplante com células tronco mesenquimais (CTM). A LME faz parte de um grupo de doenças altamente debilitantes resultando em complicações como discinesia, perturbação nervosa, disreflexia e disfunção em esfíncteres. Trata-se de um problema mundial que atinge diversos cães que vivem com as sequelas de LME, como: paralisias, disfunções locomotoras e sensoriais, incontinência urinária, disfunção gastrointestinal. As alterações impactam na qualidade de vida dos cães acometidos e, representam um substancial investimento econômico, emocional e de tempo para a gestão dessa condição de cuidados de saúde entre os tutores de animais afetados, necessitando do desenvolvimento de uma terapia para o tratamento da LME bem como das sequelas provenientes. Sendo assim, esta revisão sistemática e meta-analítica foi elaborada para avaliar os efeitos das CTM na recuperação locomotora em cães frente à LME. A pesquisa dos artigos, foi realizada em cinco bancos de dados: MEDLINE (via PubMed), EMBASE (via OvidSP), Web of Science (BIOSIS), China Science and Technology Journal. O software RAYYAN® foi utilizado para organizar a leitura e seleção dos artigos pelos pesquisadores colaboradores envolvidos. Para a seleção de artigos relacionados ao estudo, foi utilizado o critério de elegibilidade PICO e a qualidade das evidências foi avaliada utilizando a metodologia Grading of Recommendations Assessment e Development and Evaluation (GRADE). Para as análise de revisão sistemática, foram selecionadas dez publicações para a revisão de estudos experimentais e dez para as análsises dos estudos clínicos. Sete publicações de estudos experimentais permitiram realizar as comparações de parâmetros para a meta-análise. Os resultados agrupados das revisões sistemáticas e da metanálise indicaram que o uso de CTM para a LME canina melhorou significativamente a recuperação locomotora dos cães. Conclui-se, portanto, que a utilização das CTM melhora a recuperação locomotora em cães com LME, apresentando ser uma estratégia terapêutica eficaz, entretanto, mais estudos são necessários para validar os resultados obtidos.

Spinal cord injury (SCI) has been the subject of a variety of studies in several scientific fields, with numerous attempts to demonstrate the improvement of locomotor function in dogs with SCI after transplantation with mesenchymal stem cells (MSC). SML is part of a group of highly debilitating diseases resulting in complications such as dyskinesia, nervous disturbance, dysreflexia and dysfunction in sphincters. This is a worldwide problem that affects many dogs that live with the sequelae of SCI, such as: paralysis, locomotor and sensory dysfunctions, urinary incontinence, gastrointestinal dysfunction. The changes impact the quality of life of affected dogs and represent a substantial economic, emotional and time investment for the management of this health care condition among the guardians of affected animals, requiring the development of a therapy to treat SML as well. as from the sequelae arising. Therefore, this systematic and meta-analytic review was designed to assess the effects of MSCs on locomotor recovery in dogs facing SCI. The search for articles was performed in five databases: MEDLINE (via PubMed), EMBASE (via OvidSP), Web of Science (BIOSIS), China Science and Technology Journal. RAYYAN® software was used to organize the reading and selection of articles by the collaborating researchers involved. For the selection of articles related to the study, the PICO eligibility criterion was used and the quality of evidence was assessed using the Grading of Recommendations Assessment and Development and Evaluation (GRADE) methodology. For the systematic review analysis, ten publications were selected for the review of experimental studies and ten for the analysis of clinical studies. Seven publications of experimental studies allowed for the comparisons of parameters for the meta-analysis. The pooled results of the systematic reviews and the meta-analysis indicated that the use of CTM for canine SML significantly improved the dogs' locomotor recovery. Therefore, it is concluded that the use of MSCs improves locomotor recovery in dogs with SCI, showing to be an effective therapeutic strategy, however, more studies are needed to validate the results obtained.

ESTUDO COMPARATIVO DA CAPACIDADE DE DIFERENCIAÇÃO TENOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE DIFERENTES FONTES TECIDUAIS EM CULTIVO 3D

As lesões tendíneas são causas importantes de claudicação e afastamento do esporte em equinos e no homem. A incidência de lesões é variada de acordo com a modalidade e intensidade atlética, compreendendo cerca de 30% das lesões musculoesqueléticas de ambas as espécies. Os tratamentos convencionais são pouco eficazes em reparar com qualidade a matriz extracelular (MEC), o que determina o elevado índice de recidivas. As células-tronco mesenquimais (CTM) ganharam destaque no tratamento das tendinopatias e demonstram resultados favoráveis nas características histológicas e mecânicas teciduais, bem como redução do tempo de reparação tendínea. Estas caracteristicas terapeuticas das CTM são atribuidas à sua habilidade de imunomodulação, característica anti-inflamatória, promotora da reorganização tecidual e capacidade de diferenciação em linhagens mesodermais. Já é conhecida a possibilidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro das CTM, no entanto a diferenciação tenogênica ainda não possui uma metodologia padronizada e eficaz. A modalidade de cultivo tridimensional (3D) de CTM em materiais sintéticos ou biológicos é capaz de estimular a diferenciação celular de acordo com a composição do arcabouço, além de oferecer proteção e potencializar o desempenho terapêutico. Objetivo: Determinar qual melhor fonte de CTM equinas dentre: tecido adiposo (CTMad); medula óssea (CTMmo); e tendão obtidos por isolamento (CTMtd ISO) ou explante (CTMtd EXPL), que possui a melhor capacidade de proliferação in vitro, diferenciação tenogênia em cultura 3D em hidrogel de MEC tendinea equina (HgMECTdEq) e cultivo 2D em membrana Transwell® revestida de colágeno I e III (1:1). Objetivamos também avaliar a eficácia de uma nova metodologia de diferenciação tenogênica. Métodos: As quatro diferentes fontes de CTM foram obtidas de um mesmo equino com 10 meses de idade. As amostras foram processadas e as CTM, isoladas e cultivadas. As células foram caracterizadas através de sua morfologia fibroblastóide, aderência ao plástico, expansão clonal, expressão de receptores de superficie CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- e diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. A capacidade de proliferação in vitro de cada origem foi avaliada pelos testes de Taxa de Proliferação Celular (TPC) e Tempo de Cuplicação da População Celular (TDPC), cultavas por 72 horas em três diferentes concentrações iniciais (1x104, 3x104 e 1x105). Foi avaliada a habilidade de diferenciação tenogênica de cada origem celular através da produção de colágeno pela coloração de Picrosirius Red quando cultivadas em membrana Transwell® revestida com COL1:COL3 e meio de diferenciação tenogênica (50 ng/ml de Proteína Óssea Morfogenética-12 (BMP-12), 50 g/ml de Ácido Ascórbico e 5 g/ml de ITS). O HgMECTdEq foi produzido de acordo com protocolo desenvolvido pelo Laboratório de Terapias Regenerativas da FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Posteriormente 2x105 CTM de cada origem foram adicionadas em cultivo 3D imersas em 0,5 mL de hidrogel e cultivadas por 7 dias em meio de cultivo padrão e de diferenciação tenogênica. Foi determinada a concentração de metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) pelo ensaio de zimografia e em análise quantitativa por PCR a expressão gênica dos marcadores de tenogênese Scleraxis, Mohawk, Biglicana, Decorin, Tenascina C, Colágeno I e Colágeno III, além do fator osteogênico RunX2 do cultivo 3D em HgMECTdEq e em cultivo 2D em membrana COL1:COL3, com meio padrão e de diferenciação tenogênica. Resultados: Todas as células apresentaram características similares quanto à morfologia fibroblastoide, aderência ao plástico e expansão clonal. Houve baixa expressão dos receptores de superfície CD105 para CTMtd ISO e CD44 para as CTMad e positiva expressão de MHC-II para as CTMtd EXPL. Superior habilidade de proliferação in vitro foi identificada para a CTMad e inferior capacidade de diferenciação adipogênica e condrogênica foi observada para as CTMtd EXPL. A nova metodologia de diferenciação tenogênica foi capaz de produzir a diferenciação tenogênica das quatro origens de CTM, com inferior produção de colágeno para as CTMmo. O meio de diferenciação tenogênico foi capaz de aumentar a concentração de MMP-2 e MMP-9 e também aumentar a expressão dos marcadores tenogênicos Sclerax, Mohawk, Biglicana, Decorin, COL1, COL3, Tenascina C e o fator esteogênico Runx2. Conclusão: A nova metodologia de diferenciação tenogênica proposta pelo estudo foi eficaz em induzir a tenogênese de todas as fontes de CTM avaliadas. De acordo com nossos resultados a melhor fonte em capacidade de proliferação, diferenciação tenogênica in vitro e seguridade para aplicações clínicas são as CTMad. As CTMtd ISO e EXPL, apesar de sua evidente capacidade de tenogênese, apresentam população heterogênia em cultivo e resultados de caracterização que desencorajam sua aplicação clínica, especialmente de forma alogênica.

Tendon injuries are important causes of lameness and withdrawal from sport in horses and men. The incidence of injuries varies according to the sport and athletic intensity, comprising about 30% of musculoskeletal injuries of both species. Conventional treatments are ineffective in repairing the extracellular matrix (ECM) with quality, which contributes to the high rate of recurrence. Mesenchymal stem cells (MSC) gained prominence in the treatment of tendinopathies and showed favorable results in the histological and mechanical tissue characteristics, as well as a reduction in the tendon repair time. These therapeutic characteristics of MSCs are attributed to their ability to immunomodulate, anti-inflammatory, promote tissue reorganization and differentiate into mesodermal lineages. The possibility of osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation in vitro of MSCs is already known, however tenogenic differentiation still does not have a standardized and effective methodology. The modality of three-dimensional (3D) culture of MSC in synthetic or biological materials is capable of stimulating cell differentiation according to the composition of the framework, in addition to offering protection and enhancing therapeutic performance. Objective: To determine the best source of equine MSCs among adipose tissue (MSCad), bone marrow (MSCmo) and tendon obtained by isolation (MSCtd ISO) or tendon explant (MSCtd EXPL), for in vitro proliferation and tenogenic differentiation under two different conditions: 3D hydrogel cultivation of equine tendon ECM (HgMECTdEq); and 2D cultivation on a type I and III collagen-coated membrane. We also aim to evaluate the effectiveness of a new formulation of a means inducing tenogenic differentiation. Methods: The four different sources of MSC were obtained from the same 10-month-old horse. Samples were processed and MSCs isolated and cultivated. The cells were characterized by their fibroblastoid morphology, plastic adherence, clonal expansion, expression of CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- surface receptors and osteogenic, adipogenic and differentiation. chondrogenic. The in vitro proliferation capacity of each source was evaluated by the Cell Proliferation Rate (CPT) and Population Doubling Time (PDT) tests, grown for 72 hours at three different initial concentrations (1x104, 3x104 and 1x105). The tenogenic differentiation ability of each cell origin was evaluated through the production of collagen by Picrosirius Red staining when cultivated on a Transwell® membrane coated with COL1:COL3 and tenogenic differentiation medium (50 ng/ml of Morphogenetic Bone Protein-12 (BMP) -12), 50 g/ml Ascorbic Acid and 5 g/ml ITS). The HgMECTdEq was produced according to a protocol developed by the Laboratory of Regenerative Therapies at FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Afterwards, 2x105 CTM of each origin were added in 3D culture immersed in 0.5 mL of hydrogel and cultivated for 7 days in standard culture medium and tenogenic differentiation. The concentration of matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) was determined by zymography assay and in quantitative analysis by PCR the gene expression of tenogenesis markers Scleraxis, Mohawk, Biglican, Decorin, Tenascin C, Collagen I and Collagen III, in addition to the osteogenic factor RunX2 from 3D culture in HgMECTdEq and in 2D culture in COL1:COL3 membrane, with standard culture medium and tenogenic differentiation. Results: All cells showed similar characteristics regarding fibroblastoid morphology, plastic adherence and clonal expansion. There was low expression of surface receptors CD105 for CTMtd ISO and CD44 for CTMad and positive expression of MHC-II for CTMtd EXPL. Superior in vitro proliferation ability was identified for MSCad and inferior capacity for adipogenic and chondrogenic differentiation was observed for MSCtd EXPL. The new tenogenic differentiation methodology demonstrated efficacy in the four MSC origins, with lower collagen production for MSCmo. The tenogenic differentiation medium was able to increase the concentration of MMP-2 and MMP-9 and also increase the expression of tenogenic markers Sclerax, Mohawk, Biglican, Decorin, COL1, COL3, Tenascin C and the osteogenic factor Runx2. Conclusion: According to our results, we determined that the best source of proliferation capacity and tenogenic differentiation in vitro are MSCad. MSCtd ISO showed an evident in vitro tenogenesis capacity, being a promising source of CTM. The new tenogenic differentiation methodology proposed by the study was effective in inducing tenogenesis of all MSC sources evaluated.

Isolation, expansion and differentiation of mesenchymal stromal cells from rabbits' bone marrow / Isolamento, expansão e diferenciação de celulas tronco mesenquimais oriundas da medula óssea de coelhos

Tissue engineering has been a fundamental technique in the regenerative medicine field, once it permits to build tri-dimensional tissue constructs associating undifferentiated mesenchymal cells (or mesenchymal stromal cells - MSCs) and scaffolds in vitro. Therefore, many studies have been carried out using these cells from different animal species, and rabbits are often used as animal model for in vivo tissue repair studies. However, most of the information available about MSCs harvesting and characterization is about human and murine cells, which brings some doubts to researchers who desire to work with a rabbit model in tissue repair studies based on MSCs. In this context, this study aimed to add and improve the information available in the scientific literature providing a complete technique for isolation, expansion and differentiation of MSCs from rabbits. Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) from humerus and femur of rabbits were obtained and to evaluate their proliferation rate, three different culture media were tested, here referred as DMEM-P, DMEM´S and α-MEM. The BMMCs were also cultured in osteogenic, chondrogenic and adipogenic induction media to prove their multipotentiality. It was concluded that the techniques suggested in this study can provide a guideline to harvest and isolate MSCs from bone marrow of rabbits in enough amount to allow their expansion and, based on the laboratory experience where the study was developed, it is also suggested a culture media formulation to provide a better cell proliferation rate with multipotentiality preservation.(AU)

A engenharia de tecidos tem sido uma técnica fundamental no campo da medicina regenerativa, uma vez que permite a criação de peças teciduais tri-dimensionais por meio da associação de células mesenquimais indiferenciadas (ou células estromais mesenquimais - CEMs) e moldes de biomateriais in vitro. Assim, muitos estudos têm sido realizados utilizando estas células oriundas de diferentes espécies animais, e os coelhos são frequentemente utilizados como um modelo animal para estudos in vivo de reparação tecidual. No entanto, a maioria das informações disponíveis sobre a coleta e caracterização de CEMs referem-se às células humanas e murinas, o que traz algumas dúvidas para pesquisadores que desejam trabalhar com coelhos em estudos de reparação de tecidos baseados em CEMs. Neste contexto, o presente estudo objetivou contribuir e aprimorar as informações disponíveis na literatura científica fornecendo uma técnica completa para o isolamento, expansão e diferenciação das MSCs de coelhos. Células mononucleares da medula óssea (CMMOs) do úmero e fêmur de coelhos foram obtidas e, para avaliar sua taxa de proliferação, três meios de cultura diferentes foram testadas, aqui referidos como DMEM-P, DMEM'S e α-MEM. As CMMOs também foram cultivadas em meios de indução osteogênico, condrogênico, e linhagens adipogênico para provar a sua multipotencialidade. Concluiu-se que as técnicas sugeridas neste estudo podem fornecer um guia para a coleta e isolamento de CEMs da medula óssea de coelhos em quantidade suficiente para permitir a sua expansão e, com base na experiência de laboratório onde o estudo foi desenvolvido, é também sugerida uma formulação de meio de cultivo para proporcionar uma melhor taxa de proliferação celular com preservação da multipotencialidade.(AU)

Penile reconstruction using mesenchymal stem cells

To compare the reconstruction of corpus cavernosum segments when seeded with mesenchymal stem cells and when stem cells are infused intravenously.METHODS: Sixteen New Zealand rabbits were submitted to reconstruction of the corpus cavernosum and distributed in Group A - decellularized matrices, Group B - decellularized matrices seeded with mesenchymal stem cells Group C - decellularized matrices submitted to intravenous infusion of mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cells were obtained by bone marrow aspiration. The venous filling aspect of the distal end of the corpus cavernosum was evaluated and the specimens were submitted to histological analisis and to immunohistochemistry. Cavernosometry was done in one animal of each groupRESULTS: Three animals on B and three animals on C presented full filling of distal end of the corpus cavernosum. No animals in A presented filling of the distal end of corpus cavernosum. At cavernosometry the animal on B attained 50 cmH2O, on C 110 cmH2O and on A 20 cmH2O. Trabeculae forming cavernous sinuses were found in groups B and C.CONCLUSION: The reconstruction of corpus cavernosum using descellularized matrices and mesenchymal stem cells, either by intravenous injection or directly seeded is possible, with growth of corpus cavernosum-like tissue.(AU)

Parâmetros genéticos para características produtivas e qualidade de pele em Tilápia do Nilo

O presente trabalho teve por objetivos estimar os componentes de variância e parâmetros genéticos de características de crescimento, rendimento de filé e qualidade de pele da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus); avaliar a associação genética entre características produtivas e espessura de pele; e verificar o efeito de grupos genéticos com alto e baixo valor genético para espessura de pele na expressão dos genes do colágeno tipo I, cadeias 2 e 3. Os animais utilizados neste estudo são da décima geração do programa de melhoramento genético de tilápia do Nilo, da Universidade Estadual de Maringá (PMGT-UEM). Para estimação dos componentes de variância, herdabilidade e correlações foram utilizados registros de 1.221 médias de três medidas de espessura de pele (EP), 1.213 medidas de rendimento de filé (RF) e 3.171 medidas de peso à despesca (PD). Para análise de expressão dos genes COL1A2 e COL1A3, foram coletadas peles de seis machos pertencentes à família de alto valor genético (AVG) e seis pertencentes à família de baixo valor genético (BVG). As estimativas de herdabilidade foram altas para PD (0,71), média para EP (0,59) e moderada para RF (0,21). A repetibilidade da espessura de pele foi de 0,66. A correlação genética entre EP e PD foi de 0,77 e entre EP e RF a correlação foi de -0,02, não sendo significativa. A expressão do gene COL1A3 foi maior no grupo AVG (7,38 UA) quando comparado ao grupo BVG (4,88 UA) (p=0,038). Os resultados, obtidos na análise genética quantitativa e de expressão gênica indicam que é possível por meio de seleção aumentar a espessura e a quantidade de colágeno tipo I na pele de tilápia, melhorando a qualidade da pele com a finalidade de utilizá-la como biomaterial. A estimativa da repetibilidade da espessura da pele demonstrou que não é necessário realizar mais que uma medida no mesmo animal. A correlação genética das características espessura da pele e peso à despesca é favorável, possibilitando resposta positiva em ambas as características e não afetando a característica rendimento de filé, tornando interessante o melhoramento da pele da tilápia do Nilo visando tanto o uso medicinal (xenoenxerto) quanto o ganho de peso.

The present study aimed to estimate the components of variance and genetic parameters of growth characteristics, fillet yield, and skin quality; to evaluate the genetic association between productive characteristics and skin thickness; and to verify the effect of genetic groups with high and low value genetics for skin thickness in the expression of type I collagen genes, 2 and 3 chains in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). The animals used in this study are from the tenth generation of the Nile tilapia breeding program, from the State University of Maringá (PMGT-UEM). To estimate the variance components, heritability and correlations were used records of 1,221 averages three skin thickness measurements (EP), 1,213 fillet yield information (RF) and 3,171 harvesting weight (PD). For the expression analysis of COL1A2 and COL1A3 genes, skins were collected from six males belonging to the family of high genetic value (AVG) and six to the family of low genetic value (BVG) for skin thickness. Heritability estimates were high for PD (0.71), medium for EP (0.59) and moderate for RF (0.21). The repeatability of the skin thickness was 0.66. The genetic correlation between EP and PD was 0.77, but between EP and RF the estimated value was -0.02, not being significant. COL1A3 gene expression was higher in the AVG group (7.38 AU) when compared to the BVG group (4.88 AU) (p = 0.038). The results, obtained in the quantitative genetic analysis and gene expression, indicate that it is possible through selection to increase the thickness and the amount of type I collagen in tilapia skin, improving the skin quality to use it as biomaterial. The repeatability estimate of the skin thickness, demonstrated that it is not necessary to perform more than one measurement on the same animal. The correlation between the genetic values of the characteristic skin thickness and weight at harvest is favorable, enabling a positive response in both characteristics and not affecting the fillet yield characteristic, making it interesting looking for Nile Tilapia skin improvement aiming at both medicinal use (xenograft) and weight gain.

CÉLULAS MESENQUIMAIS ADIPODERIVADAS ALOGÊNICAS NA ANGIOGÊNESE DURANTE A FASE INFLAMATÓRIA DE CICATRIZAÇÃO EM ENXERTOS CUTÂNEOS DE ESPESSURA COMPLETA

Enxertos cutâneos de espessura completa possuem a característica inicial de nutrição sem um aporte sanguíneo autônomo, predispondo a altas taxas de necrose. Células mesenquimais adipoderivadas (ADSC) auxiliam no desenvolvimento da angiogênese e cicatrização cutânea, contudo, os mecanismos envolvidos ainda não são completamente compreendidos. Esse trabalho teve como objetivo investigar a influência de ADSCs no desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, seu efeito anti-inflamatório e o tempo de sobrevida das células após sua aplicação em um modelo de enxerto cutâneo de espessura completa. As ADSCs foram isoladas de ratos Wistar positivos para a proteína fluorescente verde (GFP). Os demais animais experimentais foram submetidos aos enxertos e posteriormente atribuídos de forma aleatória aos grupos ADSC, solução salina ou SHAM. Animais pertencentes ao grupo ADSC receberam 1 x 106 células ressuspendidas em 200 uL de solução salina, o grupo SS recebeu apenas 200 g de solução salina e o grupo SHAM não recebeu nenhum tratamento. Dezoito animais foram eutanasiados aos três dias, os demais aos cinco dias. A avaliação macroscópica analisou a taxa de contração, presença de sangramento ou exsudato. Os enxertos foram coletados para avaliação molecular e histopatológica, e aqueles pertencentes ao grupo ADSC foram corados com anticorpo anti-GFP para avaliar a presença e localização das células. O grupo ADSCs demonstrou menor taxa de contração e aumento da expressão de enzimas, fatores de crescimento e marcadores de superfície pró-angiogênicos. Marcadores de hipóxia, inflamação e estresse oxidativo tiveram expressão reduzida no grupo tratado com ADSCs. As células marcadas foram localizadas em ambos os dias de avaliação. Em conclusão, baseado nos dados obtidos, as células marcadas permanecem no local de aplicação ao terceiro e quinto dias de avaliação e podem promover a angiogênese precoce em enxertos cutâneos de espessura completa, reduzindo o tempo de exposição à hipóxia e podem aumentar as taxas de sucesso do enxerto.

Full-thickness skin grafts have the initial characteristic of graft nutrition without an autonomous blood supply, predicting to high necrosis rates. Adipose-derived stem cells supports angiogenesis development and wound healing, however, the mechanisms involved still not completely understood. In this study, we aimed to investigate ADSC influence in blood vessels growth, its anti-inflammatory effect and the remaining cell survival time on skin graft in full-thickness skin graft rat model. ADSCs were isolated from green-fluorescent protein positive Wistar rats. All the remaining experimental animals were submitted to skin graft and randomly assigned to ADSC, saline solution or SHAM groups. ADSC animals received 1x106 ADSCs GFP-positives resuspended in 200 g of saline solution. SS group only received 200 g of saline solution and SHAM group did not receive any treatment. Eighteen animals were euthanized at three days, the remaining at five days. Macroscopic evaluation was based on FTSG contraction rates, bleeding and exudate presence. Skin grafts were collected for molecular and histopathological assessment, and the ADSC group grafts were also immunostained with anti-GFP antibody for presence and location of cells. ADSC group have showed lower contraction rates and significant enhanced expression of proangiogenic enzymes, growth factors, surface markers. Expression of hypoxia, proinflammatory cell types and oxidative stress markers was decreased on ADSC treated group. The labeled ADSCs could be found on grafted tissue at both evaluation times. In conclusion, based on the obtained data, labeled ADSC remain on injected site at third and fifth evaluation days and can promote early angiogenesis development of FTSG, reducing hypoxia exposure and may increase the graft survival rates.