Detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in semen of naturally infected rams

Background: Neospora caninum and Toxoplasma gondii are closely related cyst-forming apicomplexan parasites identified as important causes of reproductive failure in cattle. Moreover, abortion cases attributed to N. caninum and T. gondiiinfection have been occasionally reported in sheep. Due to the relatively scarce information on the molecular detection ofN. caninum in the semen of naturally infected rams, this study aimed to detect parasitic DNA in fresh semen samples andin frozen extended semen straws from male sheep from artificial inseminations centers in Southern Brazil.Materials, Methods & Results: Semen samples of 38 rams from artificial insemination centers were evaluated. Eleven ramswere naturally infected (seropositive for anti-N. caninum and/or anti-T. gondii IgG) and were selected for fresh semen collection.We tested all the samples for the closely related protozoan T. gondii to detect a possible cross-reaction and co-infection, due tothe close similarity with N. caninum. The indirect fluorescent antibody test was used to detect IgG antibodies in the 11 serumsamples from rams. Fresh semen samples were collected from 11 rams on days 1, 50, 55, and 58 using an artificial vaginaand ewe in estrus. Other 27 rams had their frozen extended semen straws analyzed. A total of 20 fresh semen samples and27 frozen extended semen straws samples were used to detect the presence of N. caninum and T. gondii DNA by polymerasechain reaction (PCR). Nc-5 and B1 genes were used as target regions to detect N. caninum and T. gondii DNA, respectively.The presence of N. caninum DNA was confirmed in the third collection of a fresh semen sample of one seropositive ram. T.gondii DNA was detected in a fresh semen sample of one seropositive ram. The DNA sequences of 186 bp from N. caninum(GenBank accession: MH806393) and 492 bp from T. gondii (GenBank accession: MH793503)...

Detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in semen of naturally infected rams

Background: Neospora caninum and Toxoplasma gondii are closely related cyst-forming apicomplexan parasites identified as important causes of reproductive failure in cattle. Moreover, abortion cases attributed to N. caninum and T. gondiiinfection have been occasionally reported in sheep. Due to the relatively scarce information on the molecular detection ofN. caninum in the semen of naturally infected rams, this study aimed to detect parasitic DNA in fresh semen samples andin frozen extended semen straws from male sheep from artificial inseminations centers in Southern Brazil.Materials, Methods & Results: Semen samples of 38 rams from artificial insemination centers were evaluated. Eleven ramswere naturally infected (seropositive for anti-N. caninum and/or anti-T. gondii IgG) and were selected for fresh semen collection.We tested all the samples for the closely related protozoan T. gondii to detect a possible cross-reaction and co-infection, due tothe close similarity with N. caninum. The indirect fluorescent antibody test was used to detect IgG antibodies in the 11 serumsamples from rams. Fresh semen samples were collected from 11 rams on days 1, 50, 55, and 58 using an artificial vaginaand ewe in estrus. Other 27 rams had their frozen extended semen straws analyzed. A total of 20 fresh semen samples and27 frozen extended semen straws samples were used to detect the presence of N. caninum and T. gondii DNA by polymerasechain reaction (PCR). Nc-5 and B1 genes were used as target regions to detect N. caninum and T. gondii DNA, respectively.The presence of N. caninum DNA was confirmed in the third collection of a fresh semen sample of one seropositive ram. T.gondii DNA was detected in a fresh semen sample of one seropositive ram. The DNA sequences of 186 bp from N. caninum(GenBank accession: MH806393) and 492 bp from T. gondii (GenBank accession: MH793503)...(AU)

Virulência e multiplicação de isolados de Toxoplasma gondii da região central do Rio Grande do Sul / Virulence and multiplication of Toxoplasma gondii isolates from the central region of Rio Grande do Sul, Brazil

O protozoário Toxoplasma gondii possui a capacidade de infectar diversas espécies animais, geralmente causando distúrbios reprodutivos. Quatro diferentes isolados de T. gondii - Pains #1 (P1), Pains #2 (P2), Santa Flora #1 (SF1) e Santa Flora #306 (SF306) - foram avaliados, após prévia genotipagem. A capacidade de multiplicação e virulência destes isolados foi analisada in vitro (células Vero) e in vivo (camundongos), sendo realizadas 3 passagens para cada isolado em cada modo avaliado, sendo sempre inoculada a dose de 1x104 taquizoítos em todas as passagens. Os camundongos eram observados diariamente, quanto à presença de sinais clínicos e ocorrência de mortalidade após inoculação dos taquizoítos. Os isolados SF1 e SF306, foram os que apresentaram maior multiplicação média do número total de taquizoítos em cada uma das 3 diferentes passagens realizadas para cada um dos isolados tanto in vitro quanto in vivo. Os primeiros sinais clínicos observados nos camundongos ocorreram entre os dias 5 a 11, após inoculação, com mortalidade acontecendo entre os dias 6 a 15, após inoculação. Assim, a multiplicação parasitária in vitro é semelhante à multiplicação in vivo destes isolados de T. gondii; diferentes isolados com o mesmo genótipo apresentam comportamento de virulência semelhante, caracterizando o isolado SF1 como mais virulento para camundongos.(AU)

The protozoan Toxoplasma gondii has the ability to infect several animal species, usually causing reproductive disorders. Four different isolates of T. gondii - Pains #1 (P1), Pains #2 (P2), Santa Flora #1 (SF1) and Santa Flora #306 (SF306) were evaluated with prior genotyping. Their virulence and multiplication capacity were analyzed in vitro (Vero cells) and in vivo (mice). For each isolate, three passages were performed with dose inoculation 1x104 tachyzoites at each passage. The mice were daily observed to verify of clinical signs and occurrence of mortality after tachyzoites inoculation. The SF1 isolate and SF306 isolate, presented the highest multiplication of the total tachyzoites number in each of the 3 different passages performed in vitro and in vivo. The initial clinical signs in mice were observed between 5 and 11 days, and occurring mortality between 6 and 15 days, after inoculation. Thus, the parasitic multiplication of theses isolates is similar in vitro and in vivo; different isolates within the same genotype have a similar virulence and the SF1 isolate is the most virulent for mice.(AU)

Virulência e multiplicação de isolados de Toxoplasma gondii da região central do Rio Grande do Sul / Virulence and multiplication of Toxoplasma gondii isolates from the central region of Rio Grande do Sul, Brazil

O protozoário Toxoplasma gondii possui a capacidade de infectar diversas espécies animais, geralmente causando distúrbios reprodutivos. Quatro diferentes isolados de T. gondii - Pains #1 (P1), Pains #2 (P2), Santa Flora #1 (SF1) e Santa Flora #306 (SF306) - foram avaliados, após prévia genotipagem. A capacidade de multiplicação e virulência destes isolados foi analisada in vitro (células Vero) e in vivo (camundongos), sendo realizadas 3 passagens para cada isolado em cada modo avaliado, sendo sempre inoculada a dose de 1x104 taquizoítos em todas as passagens. Os camundongos eram observados diariamente, quanto à presença de sinais clínicos e ocorrência de mortalidade após inoculação dos taquizoítos. Os isolados SF1 e SF306, foram os que apresentaram maior multiplicação média do número total de taquizoítos em cada uma das 3 diferentes passagens realizadas para cada um dos isolados tanto in vitro quanto in vivo. Os primeiros sinais clínicos observados nos camundongos ocorreram entre os dias 5 a 11, após inoculação, com mortalidade acontecendo entre os dias 6 a 15, após inoculação. Assim, a multiplicação parasitária in vitro é semelhante à multiplicação in vivo destes isolados de T. gondii; diferentes isolados com o mesmo genótipo apresentam comportamento de virulência semelhante, caracterizando o isolado SF1 como mais virulento para camundongos.(AU)

The protozoan Toxoplasma gondii has the ability to infect several animal species, usually causing reproductive disorders. Four different isolates of T. gondii - Pains #1 (P1), Pains #2 (P2), Santa Flora #1 (SF1) and Santa Flora #306 (SF306) were evaluated with prior genotyping. Their virulence and multiplication capacity were analyzed in vitro (Vero cells) and in vivo (mice). For each isolate, three passages were performed with dose inoculation 1x104 tachyzoites at each passage. The mice were daily observed to verify of clinical signs and occurrence of mortality after tachyzoites inoculation. The SF1 isolate and SF306 isolate, presented the highest multiplication of the total tachyzoites number in each of the 3 different passages performed in vitro and in vivo. The initial clinical signs in mice were observed between 5 and 11 days, and occurring mortality between 6 and 15 days, after inoculation. Thus, the parasitic multiplication of theses isolates is similar in vitro and in vivo; different isolates within the same genotype have a similar virulence and the SF1 isolate is the most virulent for mice.(AU)

Virulência e multiplicação de isolados de Toxoplasma gondii da região central do Rio Grande do Sul

ABSTRACT: The protozoan Toxoplasma gondii has the ability to infect several animal species, usually causing reproductive disorders. Four different isolates of T. gondii - Pains /1 (P1), Pains /2 (P2), Santa Flora /1 (SF1) and Santa Flora /306 (SF306) were evaluated with prior genotyping. Their virulence and multiplication capacity were analyzed in vitro (Vero cells) and in vivo (mice). For each isolate, three passages were performed with dose inoculation 1x104 tachyzoites at each passage. The mice were daily observed to verify of clinical signs and occurrence of mortality after tachyzoites inoculation. The SF1 isolate and SF306 isolate, presented the highest multiplication of the total tachyzoites number in each of the 3 different passages performed in vitro and in vivo. The initial clinical signs in mice were observed between 5 and 11 days, and occurring mortality between 6 and 15 days, after inoculation. Thus, the parasitic multiplication of theses isolates is similar in vitro and in vivo; different isolates within the same genotype have a similar virulence and the SF1 isolate is the most virulent for mice.

RESUMO: O protozoário Toxoplasma gondii possui a capacidade de infectar diversas espécies animais, geralmente causando distúrbios reprodutivos. Quatro diferentes isolados de T. gondii - Pains /1 (P1), Pains /2 (P2), Santa Flora /1 (SF1) e Santa Flora /306 (SF306) - foram avaliados, após prévia genotipagem. A capacidade de multiplicação e virulência destes isolados foi analisada in vitro (células Vero) e in vivo (camundongos), sendo realizadas 3 passagens para cada isolado em cada modo avaliado, sendo sempre inoculada a dose de 1x104 taquizoítos em todas as passagens. Os camundongos eram observados diariamente, quanto à presença de sinais clínicos e ocorrência de mortalidade após inoculação dos taquizoítos. Os isolados SF1 e SF306, foram os que apresentaram maior multiplicação média do número total de taquizoítos em cada uma das 3 diferentes passagens realizadas para cada um dos isolados tanto in vitro quanto in vivo. Os primeiros sinais clínicos observados nos camundongos ocorreram entre os dias 5 a 11, após inoculação, com mortalidade acontecendo entre os dias 6 a 15, após inoculação. Assim, a multiplicação parasitária in vitro é semelhante à multiplicação in vivo destes isolados de T. gondii; diferentes isolados com o mesmo genótipo apresentam comportamento de virulência semelhante, caracterizando o isolado SF1 como mais virulento para camundongos.

Verificação da transmissão vertical de Neospora spp. em equinos / Verification of vertical transmission of Neospora spp. in horses.

O gênero protozoário Neospora é reconhecido como causador de desordens reprodutivas e abortos em bovinos. Entre os equinos pouco se sabe sobre os efeitos da infecção por estes protozoários. Atualmente é admitido que os efeitos da infecção por Neospora hughesi em equinos possam ocorrer no sistema nervoso central e, os efeitos provocados pela infecção por Neospora caninum recaiam sobre o sistema reprodutor de éguas. O presente trabalho verificou a presença de imunoglobulinas da classe G no soro sanguíneo de uma população de éguas de cria e, em seus respectivos potros antes da ingestão do colostro. Para execução deste trabalho foi empregada técnica de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando como antígeno taquizoítos de Neospora caninum, a diluição inicial dos soros das éguas foi de 1:50 e a diluição do soro dos potros empregada foi de 1:16. Foram assistidos 78 partos e todos os potros tiveram seu soro sanguíneo coletado imediatamente após o nascimento. A pesquisa de anticorpos contra Neospora spp. apontou que 50 (64%) éguas e 32 (41%) potros foram positivos. Das 50 éguas que apresentaram anticorpos contra Neospora spp. 24 geraram potros positivos. Entre as 28 éguas que não reagiram, oito deram a luz a potros positivos. De posse dos resultados encontrados podemos concluir que ocorreu a transmissão vertical de Neospora spp. nos equinos pesquisados.(AU)

The genre protozoan Neospora is recognized as causing reproductive disorders and miscarriages in cattle. Among the horses little is known about the effects of infection by these protozoa. It is currently accepted that the effects of infection by Neospora hughesi in horses may occur in the central nervous system, and effects of Neospora caninum infection occur in the reproductive system of mares. The present study examined the presence of class immunoglobulin G in blood serum of a population of brood mares and their foals before colostrum ingestion. For this assignment was employed indirect immunofluorescence assay (IFA) using as antigen tachyzoites of Neospora caninum, the initial dilution employed in sera of the mares was 1:50 and dilution in the serum of foals was 1:16. Were assisted 78 deliveries and all foals had their blood serum collected immediately after birth. The presence of antibodies against Neospora spp. found in mares was 50 (64%) and 32 (41%) foals were positive. Of the 50 mares that had antibodies to Neospora spp. 24 generated positive foals. Among the 28 mares unreacted eight gave birth to foals positive. Having the results we can conclude that vertical transmission occurred Neospora spp. researched in horses.(AU)

Detection of Neospora Caninum and Toxoplasma Gondii in semen of naturally infected rams, and detection of antibodies against Sarcocystis Neurona, Neospora Caninum and Toxoplasma Gondii in horses, dogs and cats from Paraná state, Brazil

A presente tese de doutorado é composta de dois artigos científicos distintos. O primeiro artigo refere-se à detecção de Neospora caninum e Toxoplasma gondii no sêmen de ovinos naturalmente infectados, onde o objetivo foi detectar o DNA de N. caninum e T. gondii em amostras de sêmen fresco e palhetas de sêmen congeladas de ovinos naturalmente infectados utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Os genes Nc-5 e B1 foram usados como regiões alvo para detectar DNA de N. caninum e T. gondii, respectivamente. Foi detectado o DNA de N. caninum em amostra de sêmen fresco, obtido na terceira coleta de um ovino soropositivo para N. caninum e T. gondii, e o DNA de T. gondii foi detectado em uma amostra de sêmen fresco de ovino soropositivo para T. gondii. O segundo artigo estuda a prevalência de anticorpos contra Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Toxoplasma gondii em cavalos, cães e gatos da região de Curitiba, no estado do Paraná, Brasil. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência e distribuição de anticorpos contra os três protozoários em cavalos, cães e gatos de Curitiba no Paraná. Foram selecionadas amostras de soro de 100 cavalos, 100 cães e 100 gatos da rotina do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade do Paraná (UFPR). Os anticorpos contra S. neurona, N. caninum e T. gondii foram encontrados amplamente distribuídos entre cavalos, cães e gatos na região de Curitiba, estado do Paraná, Brasil.

This thesis is composed of two distinct scientific articles. The first article refers to the detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in semen of naturally infected rams, where the objective was to detect the DNA of N. caninum and T. gondii in fresh and frozen semen samples from naturally infected sheep using polymerase chain reaction (PCR). The Nc-5 and B1 genes were used as target regions to detect N. caninum and T. gondii DNA, respectively. N. caninum DNA was detected in a fresh semen sample obtained from the third collection of a seropositive ram for N. caninum and T. gondii, and T. gondii DNA was detected in a sample of fresh sheep semen seropositive for T. gondii. The second article studies the prevalence of antibodies against Sarcocystis neurona, Neospora caninum and Toxoplasma gondii in horses, dogs and cats of the Curitiba region, in the state of Paraná, Brazil. The objective of this study was to investigate the occurrence and distribution of antibodies against the three protozoa in horses, dogs and cats of Curitiba, Paraná. Serum samples of 100 horses, 100 dogs and 100 cats from the routine of the Veterinary Clinical Pathology Laboratory of the Veterinary Hospital in the University of Paraná (UFPR) were selected. The antibodies against S. neurona, N. caninum and T. gondii were found widely distributed among horses, dogs and cats in the region of Curitiba, state of Paraná, Brazil.

Infecção crônica por Toxoplasma gondii induzindo hipertrofia de neurônios do plexo mientérico do cólon descendente de Rattus norvegicus

The effects of the chronic infection due to Toxoplasma gondii tachyzoites on the myenteric neurons of the adult rat descending colon were assessed in this study. Ten male, 60-day-old, Wistar rats, divided into control and experimental group were orally inoculated with 10(5) tachyzoites from Toxoplasma gondii genotype I strain. After 30 days, the animals were anesthetized and submitted to laparotomy. The descending colon was removed, dissected, and the whole-mounts were staining by Giemsa, in order to observe neurons of the myenteric plexus, followed by quantitative and morphometric analysis. It was verified that the infection caused alterations neither with respect to the dimensions of the organ nor the neuronal population; however, there was a significant increase of the perikarion area and the cytoplasm.

Neste estudo, foram avaliados os efeitos da infecção crônica por taquizoítos de Toxoplasma gondii sobre os neurônios mientéricos do cólon descendente de ratos adultos. Utilizaram-se 10 ratos Wistar machos, com 60 dias de idade, divididos em grupo controle e experimental, que foram inoculados por via oral com 10(5) taquizoítos do genótipo I de T. gondii. Após 30 dias, os animais foram anestesiados e submetidos à laparatomia. O cólon descendente foi retirado, mensurado, dissecado e seus preparados de membrana submetidos à técnica de Giemsa, para coloração dos neurônios do plexo mientérico, seguido por análise morfométrica e quantitativa. Verificou-se que a infecção não causou alterações nas dimensões do órgão ou na população neuronal, porém houve um aumento significativo da área do pericário e citoplasma.