Resumo
Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37ºC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.
As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a [...].
Assuntos
Animais , Ratos , Análise Espectral Raman/métodos , Células-Tronco Mesenquimais , Fenômenos BioquímicosResumo
Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.
Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.
Resumo
Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.
Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.
Assuntos
Animais , Ratos , Células-Tronco Mesenquimais , Osteogênese , Poliésteres , Análise Espectral Raman , Meios de Cultivo Condicionados , Proliferação de Células , Alicerces TeciduaisResumo
Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37ºC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.(AU)
As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a [...].(AU)
Assuntos
Animais , Ratos , Células-Tronco Mesenquimais , Fenômenos Bioquímicos , Análise Espectral Raman/métodosResumo
Purpose: This study assessed the regeneration potential of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue associated with platelet-rich plasma (PRP) in bone regeneration. Methods: Thirty Wistar rats (Rattus norvegicus albinos) were divided into five groups (according to the grafting material and time to euthanasia): (1) autograft - 14 days (control), (2) autograft - 28 days (control), (3) MSC + PRP - 14 days, (4) MSC + PRP + papaverine - 14 days and (5) MSC + PRP + papaverine - 28 days. After euthanasia, the graft was removed and histological slides were prepared. They were assessed by a blinded pathologist using a previously published histological scale as parameter. Results: There was some degree of neoformed bone trabeculae (NBT) in 93.3% of the samples, as well as osteoblastic activity (OA). The autograft groups (14 and 28 days) had higher levels in the formation of bone trabeculae. Nonparametric data were analyzed using the Wilcoxon-Mann-Whitney test and proved not to be statistically significant at p 0.05. Conclusions: Experimental parietal bone reconstruction, combining MSC, PRP and papaverine presented regeneration in all groups with no significant difference among them.(AU)
Assuntos
Animais , Ratos , Osso Parietal/anormalidades , Células-Tronco Mesenquimais , Regeneração Óssea , Plasma Rico em PlaquetasResumo
The elastic cartilage is composed by chondroblasts and chondrocytes, extracellular matrix and surrounded by perichondrium. It has a low regeneration capacity and is a challenge in surgical repair. One of obstacles in engineering a structurally sound and long-lasting tissue is selecting the most appropriate scaffold material. One of the techniques for obtaining biomaterials from animal tissues is the decellularization that decreases antigenicity. In this work, alkaline solution was used in bovine ear elastic cartilages to evaluate the decellularization and the architecture of the extracellular matrix. The cartilages were treated in alkaline solution (pH13) for 72 hours and lyophilized to be compared with untreated cartilages by histological analysis (hematoxylin-eosin, Masson's trichrome and Verhoeff slides). Areas of interest for cell counting and elastic fiber quantification were delineated, and the distribution of collagen and elastic fibers and the presence of non-fibrous proteins were observed. The results demonstrated that the alkaline solution caused 90% decellularization in the middle and 13% in the peripheral region, and maintenance of the histological characteristics of the collagen and elastic fibers and non-fibrous protein removal. It was concluded that the alkaline solution was efficient in the decellularization and removal of non-fibrous proteins from the elastic cartilages of the bovine ear.(AU)
A cartilagem elástica é composta por condroblastos e condrócitos, matriz extracelular e envolta por pericôndrio. Possui uma baixa capacidade de regeneração e é um desafio em reparos cirúrgicos. Um dos obstáculos na engenharia de tecido estruturalmente sólido e de longa duração é a seleção do material de arcabouço mais adequado. Uma das técnicas para obtenção de biomateriais oriundos de tecidos animais é a descelularização, que diminui a antigenicidade. Neste trabalho, foi utilizada solução alcalina em cartilagem elástica auricular bovina para avaliar a descelularização e a arquitetura da matriz extracelular. As cartilagens foram tratadas em solução alcalina (pH13) durante 72 horas e liofilizadas, e comparadas com cartilagens não tratadas por análise histológica (hematoxilina-eosina, tricrômio de Masson e Verhoeff). Foram determinadas as áreas de interesse para contagem celular e quantificação de fibras elásticas, observada a distribuição de colágeno e fibras elásticas e a presença de proteínas não fibrosas. Os resultados demonstraram que a solução alcalina causou 90% de descelularização na região central e 13% na região periférica, manutenção das características histológicas do colágeno e fibras elásticas e remoção das proteínas não fibrosas. Concluiu-se que a solução alcalina foi eficiente na descelularização e retirada de proteínas não fibrosas de cartilagens elásticas da orelha de bovinos.(AU)
Assuntos
Materiais Biocompatíveis , Condrócitos , Engenharia Tecidual/veterinária , Cartilagem Elástica , Matriz Extracelular , Bovinos , Cartilagem , Amarelo de Eosina-(YS) , ÁlcalisResumo
The elastic cartilage is composed by chondroblasts and chondrocytes, extracellular matrix and surrounded by perichondrium. It has a low regeneration capacity and is a challenge in surgical repair. One of obstacles in engineering a structurally sound and long-lasting tissue is selecting the most appropriate scaffold material. One of the techniques for obtaining biomaterials from animal tissues is the decellularization that decreases antigenicity. In this work, alkaline solution was used in bovine ear elastic cartilages to evaluate the decellularization and the architecture of the extracellular matrix. The cartilages were treated in alkaline solution (pH13) for 72 hours and lyophilized to be compared with untreated cartilages by histological analysis (hematoxylin-eosin, Masson's trichrome and Verhoeff slides). Areas of interest for cell counting and elastic fiber quantification were delineated, and the distribution of collagen and elastic fibers and the presence of non-fibrous proteins were observed. The results demonstrated that the alkaline solution caused 90% decellularization in the middle and 13% in the peripheral region, and maintenance of the histological characteristics of the collagen and elastic fibers and non-fibrous protein removal. It was concluded that the alkaline solution was efficient in the decellularization and removal of non-fibrous proteins from the elastic cartilages of the bovine ear.(AU)
A cartilagem elástica é composta por condroblastos e condrócitos, matriz extracelular e envolta por pericôndrio. Possui uma baixa capacidade de regeneração e é um desafio em reparos cirúrgicos. Um dos obstáculos na engenharia de tecido estruturalmente sólido e de longa duração é a seleção do material de arcabouço mais adequado. Uma das técnicas para obtenção de biomateriais oriundos de tecidos animais é a descelularização, que diminui a antigenicidade. Neste trabalho, foi utilizada solução alcalina em cartilagem elástica auricular bovina para avaliar a descelularização e a arquitetura da matriz extracelular. As cartilagens foram tratadas em solução alcalina (pH13) durante 72 horas e liofilizadas, e comparadas com cartilagens não tratadas por análise histológica (hematoxilina-eosina, tricrômio de Masson e Verhoeff). Foram determinadas as áreas de interesse para contagem celular e quantificação de fibras elásticas, observada a distribuição de colágeno e fibras elásticas e a presença de proteínas não fibrosas. Os resultados demonstraram que a solução alcalina causou 90% de descelularização na região central e 13% na região periférica, manutenção das características histológicas do colágeno e fibras elásticas e remoção das proteínas não fibrosas. Concluiu-se que a solução alcalina foi eficiente na descelularização e retirada de proteínas não fibrosas de cartilagens elásticas da orelha de bovinos.(AU)
Assuntos
Materiais Biocompatíveis , Condrócitos , Engenharia Tecidual/veterinária , Cartilagem Elástica , Matriz Extracelular , Bovinos , Cartilagem , Amarelo de Eosina-(YS) , ÁlcalisResumo
Different bioengineering strategies can be presently adopted and have been shown to have great potential in the treatment of female infertility and ovarian dysfunction deriving from chemotherapy, congenital malformations, massive adhesions as well as aging and lifestyle. One option is transplantation of fresh or cryopreserved organs/fragments into the patient. A further possibility uses tissue engineering approaches that involve a combination of cells, biomaterials and factors that stimulate local ability to regenerate/ repair the reproductive organ. Organ transplant has shown promising results in large animal models. However, the source of the organ needs to be identified and the immunogenic effects of allografts remain still to be solved before the technology may enter the clinical practice. Decellularization/ repopulation of ovary with autologous cells or follicles could represent an interesting, still very experimental alternative. Here we summarize the recent advancements in the bioengineering strategies applied to the ovary, we present the principles for these systems and discuss the advantages of these emerging opportunities to preserve or improve female fertility.
Assuntos
Feminino , Animais , Bioengenharia/tendências , Criopreservação/veterinária , Fertilidade , OvárioResumo
Different bioengineering strategies can be presently adopted and have been shown to have great potential in the treatment of female infertility and ovarian dysfunction deriving from chemotherapy, congenital malformations, massive adhesions as well as aging and lifestyle. One option is transplantation of fresh or cryopreserved organs/fragments into the patient. A further possibility uses tissue engineering approaches that involve a combination of cells, biomaterials and factors that stimulate local ability to regenerate/ repair the reproductive organ. Organ transplant has shown promising results in large animal models. However, the source of the organ needs to be identified and the immunogenic effects of allografts remain still to be solved before the technology may enter the clinical practice. Decellularization/ repopulation of ovary with autologous cells or follicles could represent an interesting, still very experimental alternative. Here we summarize the recent advancements in the bioengineering strategies applied to the ovary, we present the principles for these systems and discuss the advantages of these emerging opportunities to preserve or improve female fertility.(AU)
Assuntos
Animais , Feminino , Bioengenharia/tendências , Ovário , Fertilidade , Criopreservação/veterináriaResumo
The importance of the hoof to the horse health is clear, and the current knowledge regarding the cellular aspects of hoof keratinocytes is poor. Studies on equine keratinocyte culture are scarce. Developing keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods have already been established, such as those for skin keratinocyte culture. However, few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The objective of this study was to standardize the equine hoof keratinocyte isolation and cultivation, and then characterize the cell immunophenotype. For this, the primary culture method used was through explants obtained from three regions of the equine hoof (medial dorsal, dorsal, and lateral dorsal). After the cell isolation and cultivation, the cell culture and its explants were stained with anti-pan cytokeratin (pan-CK) (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4), and Ki-67 (MIB-1) antibodies. Cells were grown to third passage, were positive for pan-CK, p63 and Ki-67, and few cells had vimentin positive expression. As for the explants, the epidermal laminae were not stained for vimentin or Ki-67. However, some cells presented positive pan-CK and p63 expression. This study demonstrated the viability of lamellar explants of equine hooves as a form of isolating keratinocytes in primary cultures, as well as characterized the proliferation ability of such keratinocytes in monolayers.(AU)
É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenientes de casco equino visando futuramente associar ao estudo da medicina regenerativa para assim estabelecer um modelo experimental in vitro e indicar o uso criterioso de terapias regenerativas para a laminite equina. Desta forma, o cultivo em monocamada e a caracterização de queratinócitos lamelares foram realizados. Para isso, o método de cultura primária utilizado foi através de explantes obtidos de três regiões do casco (dorso-medial, dorsal e dorso-lateral). As células foram caracterizadas para os marcadores anti pan-cytokeratin (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4) e Ki-67 (MIB-1) nos cultivos e nos explantes. As células foram cultivadas até terceira passagem, tendo marcação positiva para pan-CK, p63 e Ki-67 e fraca marcação para vimentina. Já as lâminas epidermais não tiveram marcação de vimentin e Ki-67, porém marcaram acentuadamente para pan-CK e p63. Este estudo demonstrou a exiquibilidade do uso de explantes lamelares do casco de equinos, como forma de isolamento de queratinócitos em cultivos primários, bem como caracterizou a habilidade de proliferação desses queratinócitos em monocamada.(AU)
Assuntos
Animais , Cultura Primária de Células/veterinária , Doenças do Pé/veterinária , Casco e Garras/patologia , Doenças dos Cavalos/patologia , Doenças dos Cavalos/terapia , Queratinócitos/citologiaResumo
The importance of the hoof to the horse health is clear, and the current knowledge regarding the cellular aspects of hoof keratinocytes is poor. Studies on equine keratinocyte culture are scarce. Developing keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods have already been established, such as those for skin keratinocyte culture. However, few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The objective of this study was to standardize the equine hoof keratinocyte isolation and cultivation, and then characterize the cell immunophenotype. For this, the primary culture method used was through explants obtained from three regions of the equine hoof (medial dorsal, dorsal, and lateral dorsal). After the cell isolation and cultivation, the cell culture and its explants were stained with anti-pan cytokeratin (pan-CK) (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4), and Ki-67 (MIB-1) antibodies. Cells were grown to third passage, were positive for pan-CK, p63 and Ki-67, and few cells had vimentin positive expression. As for the explants, the epidermal laminae were not stained for vimentin or Ki-67. However, some cells presented positive pan-CK and p63 expression. This study demonstrated the viability of lamellar explants of equine hooves as a form of isolating keratinocytes in primary cultures, as well as characterized the proliferation ability of such keratinocytes in monolayers.(AU)
É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenientes de casco equino visando futuramente associar ao estudo da medicina regenerativa para assim estabelecer um modelo experimental in vitro e indicar o uso criterioso de terapias regenerativas para a laminite equina. Desta forma, o cultivo em monocamada e a caracterização de queratinócitos lamelares foram realizados. Para isso, o método de cultura primária utilizado foi através de explantes obtidos de três regiões do casco (dorso-medial, dorsal e dorso-lateral). As células foram caracterizadas para os marcadores anti pan-cytokeratin (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4) e Ki-67 (MIB-1) nos cultivos e nos explantes. As células foram cultivadas até terceira passagem, tendo marcação positiva para pan-CK, p63 e Ki-67 e fraca marcação para vimentina. Já as lâminas epidermais não tiveram marcação de vimentin e Ki-67, porém marcaram acentuadamente para pan-CK e p63. Este estudo demonstrou a exiquibilidade do uso de explantes lamelares do casco de equinos, como forma de isolamento de queratinócitos em cultivos primários, bem como caracterizou a habilidade de proliferação desses queratinócitos em monocamada.(AU)
Assuntos
Animais , Cultura Primária de Células/veterinária , Doenças do Pé/veterinária , Casco e Garras/patologia , Doenças dos Cavalos/patologia , Doenças dos Cavalos/terapia , Queratinócitos/citologiaResumo
Purpose: To investigate the ultrastructural characteristics and analysis of residual DNA in scaffold models, produced with decellularized vena cava in an experimental model with rabbits. Methods: Three groups were created for ultrastructural and residual DNA analysis: group 1 - control, consisting of samples of vena cava in natura; group 2 - SD, consisting of vein fragments submitted to 2% sodium deoxycholate decellularization by shaking (160rpm - Shaker News Brunswick Scientific®) for 1 hour at controlled temperature shaker at 37°C; group 3 - SDS, consisting of vein fragments submitted to 1% sodium dodecyl sulfate decellularization under the same previous condition, for 2 hours. Results: The ultrastructural matrix of the blood vessel maintained its vintegrity after either decellularization models. The results of the two quantification methods demonstrated a significant decrease in the DNA content of the decellularized vena cava samples as compared to the control samples and, differed statistically from each other, p 0.05. Conclusion: The 2% DS protocol for vein decellularization, in this experimental model, was considered the best protocol because it presented less amount of residual DNA without causing substantial destruction of the extracellular matrix.(AU)
Assuntos
Animais , Coelhos , Análise de Sequência de DNA , Coelhos/sangue , Coelhos/genéticaResumo
Os reparos de perdas ósseas, como no caso de fraturas, representam um desafio na rotina cirúrgica ortopédica, uma vez que exige o desenvolvimento de sistemas que contribuem para promoção da regeneração do tecido perdido, permitindo o completo retorno à função. A utilização de enxertos autógenos e alógenos é uma alternativa de tratamento para essas situações, entretanto existem os riscos de infecções cirúrgicas, dificuldade para reposicionamento do animal no trans-cirúgico, da dor pós-operatória, e a quantidade do material coletado, na maioria das vezes, torna-se insuficiente para realização do procedimento. Por isso, as pesquisas e novos métodos, como a engenharia de tecidos ósseos e medicina regenerativa, visam aumentar sua disponibilidade, reduzir o tempo de recuperação, os custos relacionados e melhorar a regeneração tecidual. Neste contexto, as terapias com biomateriais sintéticos e biodegradáveis como biocerâmicas e polímeros demonstram um grande potencial para a regeneração óssea. Entretanto, existe um grande desafio ao se combinar diferentes materiais a fim de obter a interação desses com o meio biológico e minimizar reações indesejáveis, adequando o tempo de degradação e a taxa de crescimento tecidual no local de implantação. Além da combinação adequada dos materiais, o método de processamento para a obtenção de matrizes porosas é importante. Os materiais de fosfato de cálcio são comumente usados na engenharia de tecidos ósseos, e desses materiais, a hidroxiapatita (HAP) é frequentemente usada, pois é o principal componente dos ossos, com capacidade osseocondutora. Já a policaprolactona (PCL) é um dos polímeros mais atraentes para regeneração óssea, com excelentes propriedades mecânicas, biocompatibilidade e biodegradabilidade. Dessa forma, pretendeu-se com esse trabalho realizar três capítulos: O primeiro que é avaliar a influência dos tipos de tratamentos e fatores predisponentes a complicações na consolidação de fraturas de rádio e ulna em cães por meio de uma revisão sistemática; O segundo, obter o perfil epidemiológico de cães com fraturas de rádio e ulna atendidos no hospital veterinário-ufv; e por último, desenvolver e caracterizar uma membrana de hidroxiapatita e policaprolactona e analisar sua utilização na regeneração óssea em modelo experimental de ostectomia de rádio em coelhos.
The repair of bone loss represent a challenge in the orthopedic surgical routine, as it requires the development of systems that contribute to promoting the regeneration lost tissue, allowing complete return to function. The use of autogenous and allogeneic grafts is an alternative treatment for these situations, however there are risks of surgical infections, difficulty in repositioning the animal in the trans-surgical period, postoperative pain, and the amount of material collected in most cases becomes insufficient to perform the procedure.Therefore, research and new methods, such as bone tissue engineering and regenerative medicine, aim to increase its availability, reduce recovery time, related costs and improve tissue regeneration. In this context, therapies with synthetic and biodegradable biomaterials such as bioceramics and polymers demonstrate a great potential for bone regeneration. However, there is a major challenge by combining different materials in order to get (to obtain) their interaction with the biological environment and minimize undesirable reactions, adjusting the degradation time and tissue growth rate at the implantation site.In addition to the appropriate combination of materials, the processing method for obtaining porous matrices is important. Calcium phosphate materials are commonly used in bone tissue engineering, and of these materials, hydroxyapatite (HAP) is often used as it is the main component of bone with an osteoconductive capacity. Polycaprolactone (PCL) is one of the most attractive polymers for bone regeneration, with excellent mechanical properties, good biocompatibility and biodegradability. Thus, this work intended to carry out three chapters: The first is to assess the influence of types of treatments and predisposing factors to complications in the healing of fractures of the radius and ulna in dogs through a systematic review; The second is to obtain the epidemiological profile of dogs with radius and ulna fractures treated at the ufv-veterinary hospital; and finally, to develop and characterize a hydroxyapatite and polycaprolactone membrane and analyze its use in bone regeneration in an experimental model of radium ostectomy in rabbits.
Resumo
A pele apresenta inúmeras funções entre elas, barreira contra produtos químicos e radiação, proteção contra traumas, entre outras. É composta por uma camada de epitélio estratificado externo (epiderme) e uma camada fibrosa (derme). A quebra ou perda da integridade anatômica, fisiológica e funcional da pele é denominada ferida cutânea. Essas aparecem em alta incidência na rotina clínico-cirúrgico veterinária, exigindo do cirurgião além do conhecimento anatômico, o domínio das diferentes técnicas reconstrutivas disponíveis para um planejamento cirúrgico adequado. Existem inúmeras técnicas cirúrgicas reconstrutivas voltadas ao propósito de acelerar o processo cicatricial, devolvendo à pele sua integridade, reestabelecendo suas funções e minimizando complicações. O tema vem sendo objeto de estudo de muitos pesquisadores, que se concentram na criação de um material sintético semelhante à matriz extracelular (MEC) da derme, combinada com a utilização de células-tronco. A engenharia biomédica tem possibilitado elaborar novas abordagens terapêuticas, para minimizar e tratar feridas de difícil cicatrização, constituindo deste modo avanços significativos nos últimos anos. Estes melhoraram a compreensão dos processos de cicatrização de feridas e de regeneração de tecidos. O estudo em pauta visa trazer uma contribuição ao tema valendo-se da utilização da Bioengenharia de Tecidos (scaffolds biológicos), como técnica reconstrutiva alternativa, no que se refere ao tratamento de feridas complexas, com grandes perdas teciduais e superfícies articulares, favorecendo o processo cicatricial e anulando as possíveis complicações em especial a rejeição. Para tanto, amostras de derme canina foram descelularizadas por processo químico/físico e recelularizadas com células tronco mesenquimais, onde após validação das técnicas, foram utilizados como tratamento nos pacientes dos Grupos 1 e 2 respectivamente, avaliando o processo cicatricial desses grupos em relação aos pacientes do Grupo controle, feridas tratadas por segunda intenção. Os resultados do presente trabalho comprovaram as propriedades biocompatíveis e biodegradáveis do scaffold descelularizado e recelularizado caracterizada pela integração, ausência de complicações cicatriciais, de rejeição, e/ou contaminação, demostraram segurança, facilidade de aplicação da técnica de enxertia, capacidade regenerativa pela presença de tecido cicatricial maturo e organizado (histopatológico), aspecto cosmético final da ferida desejável e observou-se que os três tratamentos se diferem entre si e que tanto o tipo de tratamento quanto o tamanho da ferida, afetam o tempo de cicatrização, constituindo-se uma ferramenta inovadora e funcionalmente promissora no tratamento de feridas cutâneas em modelos caninos.
The skin has numerous functions, including a barrier against chemicals and radiation, protection against trauma, among others. It consists of a layer of external stratified epithelium (epidermis) and a fibrous layer (dermis). The breakdown or loss of the anatomical, physiological and functional integrity of the skin is called a cutaneous wound. These appear in high incidence in the veterinary clinical-surgical routine, demanding from the surgeon in addition to anatomical knowledge, the mastery of the different reconstructive techniques available for an adequate surgical planning. There are numerous reconstructive surgical techniques aimed at accelerating the healing process, restoring integrity to the skin, restoring its functions and minimizing complications. The subject has been the subject of study by many researchers, who are concentrating on creating a synthetic material similar to the extracellular matrix (ECM) of the dermis, combined with the use of stem cells. Biomedical engineering has made it possible to develop new therapeutic approaches to minimize and treat wounds that are difficult to heal, thus constituting significant advances in recent years. These improved understanding of wound healing and tissue regeneration processes. The study in question aims to bring a contribution to the theme using the Bioengineering of Tissues (biological scaffolds), as an alternative reconstructive technique, with regard to the treatment of complex wounds, with great tissue losses and joint surfaces, favoring the process healing and canceling possible complications, especially rejection. For that, samples of canine dermis were decellularized by chemical / physical process and recellularized with mesenchymal stem cells, where after validation of the techniques, they were used as treatment in patients in Groups 1 and 2 respectively, evaluating the healing process of these groups in relation to patients control group, wounds treated by second intention. The results of the present study proved the biocompatible and biodegradable properties of the decellularized and recelularized scaffold characterized by integration, absence of scar complications, rejection, and / or contamination, demonstrated safety, ease of application of the grafting technique, regenerative capacity due to the presence of tissue mature and organized healing (histopathological), final cosmetic aspect of the desirable wound and it was observed that the three treatments differ from each other and that both the type of treatment and the size of the wound affect the healing time, constituting a tool innovative and functionally promising in the treatment of skin wounds in canine models.
Resumo
As lesões tendíneas são causas importantes de claudicação e afastamento do esporte em equinos e no homem. A incidência de lesões é variada de acordo com a modalidade e intensidade atlética, compreendendo cerca de 30% das lesões musculoesqueléticas de ambas as espécies. Os tratamentos convencionais são pouco eficazes em reparar com qualidade a matriz extracelular (MEC), o que determina o elevado índice de recidivas. As células-tronco mesenquimais (CTM) ganharam destaque no tratamento das tendinopatias e demonstram resultados favoráveis nas características histológicas e mecânicas teciduais, bem como redução do tempo de reparação tendínea. Estas caracteristicas terapeuticas das CTM são atribuidas à sua habilidade de imunomodulação, característica anti-inflamatória, promotora da reorganização tecidual e capacidade de diferenciação em linhagens mesodermais. Já é conhecida a possibilidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro das CTM, no entanto a diferenciação tenogênica ainda não possui uma metodologia padronizada e eficaz. A modalidade de cultivo tridimensional (3D) de CTM em materiais sintéticos ou biológicos é capaz de estimular a diferenciação celular de acordo com a composição do arcabouço, além de oferecer proteção e potencializar o desempenho terapêutico. Objetivo: Determinar qual melhor fonte de CTM equinas dentre: tecido adiposo (CTMad); medula óssea (CTMmo); e tendão obtidos por isolamento (CTMtd ISO) ou explante (CTMtd EXPL), que possui a melhor capacidade de proliferação in vitro, diferenciação tenogênia em cultura 3D em hidrogel de MEC tendinea equina (HgMECTdEq) e cultivo 2D em membrana Transwell® revestida de colágeno I e III (1:1). Objetivamos também avaliar a eficácia de uma nova metodologia de diferenciação tenogênica. Métodos: As quatro diferentes fontes de CTM foram obtidas de um mesmo equino com 10 meses de idade. As amostras foram processadas e as CTM, isoladas e cultivadas. As células foram caracterizadas através de sua morfologia fibroblastóide, aderência ao plástico, expansão clonal, expressão de receptores de superficie CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- e diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. A capacidade de proliferação in vitro de cada origem foi avaliada pelos testes de Taxa de Proliferação Celular (TPC) e Tempo de Cuplicação da População Celular (TDPC), cultavas por 72 horas em três diferentes concentrações iniciais (1x104, 3x104 e 1x105). Foi avaliada a habilidade de diferenciação tenogênica de cada origem celular através da produção de colágeno pela coloração de Picrosirius Red quando cultivadas em membrana Transwell® revestida com COL1:COL3 e meio de diferenciação tenogênica (50 ng/ml de Proteína Óssea Morfogenética-12 (BMP-12), 50 g/ml de Ácido Ascórbico e 5 g/ml de ITS). O HgMECTdEq foi produzido de acordo com protocolo desenvolvido pelo Laboratório de Terapias Regenerativas da FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Posteriormente 2x105 CTM de cada origem foram adicionadas em cultivo 3D imersas em 0,5 mL de hidrogel e cultivadas por 7 dias em meio de cultivo padrão e de diferenciação tenogênica. Foi determinada a concentração de metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) pelo ensaio de zimografia e em análise quantitativa por PCR a expressão gênica dos marcadores de tenogênese Scleraxis, Mohawk, Biglicana, Decorin, Tenascina C, Colágeno I e Colágeno III, além do fator osteogênico RunX2 do cultivo 3D em HgMECTdEq e em cultivo 2D em membrana COL1:COL3, com meio padrão e de diferenciação tenogênica. Resultados: Todas as células apresentaram características similares quanto à morfologia fibroblastoide, aderência ao plástico e expansão clonal. Houve baixa expressão dos receptores de superfície CD105 para CTMtd ISO e CD44 para as CTMad e positiva expressão de MHC-II para as CTMtd EXPL. Superior habilidade de proliferação in vitro foi identificada para a CTMad e inferior capacidade de diferenciação adipogênica e condrogênica foi observada para as CTMtd EXPL. A nova metodologia de diferenciação tenogênica foi capaz de produzir a diferenciação tenogênica das quatro origens de CTM, com inferior produção de colágeno para as CTMmo. O meio de diferenciação tenogênico foi capaz de aumentar a concentração de MMP-2 e MMP-9 e também aumentar a expressão dos marcadores tenogênicos Sclerax, Mohawk, Biglicana, Decorin, COL1, COL3, Tenascina C e o fator esteogênico Runx2. Conclusão: A nova metodologia de diferenciação tenogênica proposta pelo estudo foi eficaz em induzir a tenogênese de todas as fontes de CTM avaliadas. De acordo com nossos resultados a melhor fonte em capacidade de proliferação, diferenciação tenogênica in vitro e seguridade para aplicações clínicas são as CTMad. As CTMtd ISO e EXPL, apesar de sua evidente capacidade de tenogênese, apresentam população heterogênia em cultivo e resultados de caracterização que desencorajam sua aplicação clínica, especialmente de forma alogênica.
Tendon injuries are important causes of lameness and withdrawal from sport in horses and men. The incidence of injuries varies according to the sport and athletic intensity, comprising about 30% of musculoskeletal injuries of both species. Conventional treatments are ineffective in repairing the extracellular matrix (ECM) with quality, which contributes to the high rate of recurrence. Mesenchymal stem cells (MSC) gained prominence in the treatment of tendinopathies and showed favorable results in the histological and mechanical tissue characteristics, as well as a reduction in the tendon repair time. These therapeutic characteristics of MSCs are attributed to their ability to immunomodulate, anti-inflammatory, promote tissue reorganization and differentiate into mesodermal lineages. The possibility of osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation in vitro of MSCs is already known, however tenogenic differentiation still does not have a standardized and effective methodology. The modality of three-dimensional (3D) culture of MSC in synthetic or biological materials is capable of stimulating cell differentiation according to the composition of the framework, in addition to offering protection and enhancing therapeutic performance. Objective: To determine the best source of equine MSCs among adipose tissue (MSCad), bone marrow (MSCmo) and tendon obtained by isolation (MSCtd ISO) or tendon explant (MSCtd EXPL), for in vitro proliferation and tenogenic differentiation under two different conditions: 3D hydrogel cultivation of equine tendon ECM (HgMECTdEq); and 2D cultivation on a type I and III collagen-coated membrane. We also aim to evaluate the effectiveness of a new formulation of a means inducing tenogenic differentiation. Methods: The four different sources of MSC were obtained from the same 10-month-old horse. Samples were processed and MSCs isolated and cultivated. The cells were characterized by their fibroblastoid morphology, plastic adherence, clonal expansion, expression of CD13-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD106-, MHC-II- surface receptors and osteogenic, adipogenic and differentiation. chondrogenic. The in vitro proliferation capacity of each source was evaluated by the Cell Proliferation Rate (CPT) and Population Doubling Time (PDT) tests, grown for 72 hours at three different initial concentrations (1x104, 3x104 and 1x105). The tenogenic differentiation ability of each cell origin was evaluated through the production of collagen by Picrosirius Red staining when cultivated on a Transwell® membrane coated with COL1:COL3 and tenogenic differentiation medium (50 ng/ml of Morphogenetic Bone Protein-12 (BMP) -12), 50 g/ml Ascorbic Acid and 5 g/ml ITS). The HgMECTdEq was produced according to a protocol developed by the Laboratory of Regenerative Therapies at FMVZ Unesp, Botucatu-SP. Afterwards, 2x105 CTM of each origin were added in 3D culture immersed in 0.5 mL of hydrogel and cultivated for 7 days in standard culture medium and tenogenic differentiation. The concentration of matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) was determined by zymography assay and in quantitative analysis by PCR the gene expression of tenogenesis markers Scleraxis, Mohawk, Biglican, Decorin, Tenascin C, Collagen I and Collagen III, in addition to the osteogenic factor RunX2 from 3D culture in HgMECTdEq and in 2D culture in COL1:COL3 membrane, with standard culture medium and tenogenic differentiation. Results: All cells showed similar characteristics regarding fibroblastoid morphology, plastic adherence and clonal expansion. There was low expression of surface receptors CD105 for CTMtd ISO and CD44 for CTMad and positive expression of MHC-II for CTMtd EXPL. Superior in vitro proliferation ability was identified for MSCad and inferior capacity for adipogenic and chondrogenic differentiation was observed for MSCtd EXPL. The new tenogenic differentiation methodology demonstrated efficacy in the four MSC origins, with lower collagen production for MSCmo. The tenogenic differentiation medium was able to increase the concentration of MMP-2 and MMP-9 and also increase the expression of tenogenic markers Sclerax, Mohawk, Biglican, Decorin, COL1, COL3, Tenascin C and the osteogenic factor Runx2. Conclusion: According to our results, we determined that the best source of proliferation capacity and tenogenic differentiation in vitro are MSCad. MSCtd ISO showed an evident in vitro tenogenesis capacity, being a promising source of CTM. The new tenogenic differentiation methodology proposed by the study was effective in inducing tenogenesis of all MSC sources evaluated.
Resumo
Tissue engineering has been a fundamental technique in the regenerative medicine field, once it permits to build tri-dimensional tissue constructs associating undifferentiated mesenchymal cells (or mesenchymal stromal cells - MSCs) and scaffolds in vitro. Therefore, many studies have been carried out using these cells from different animal species, and rabbits are often used as animal model for in vivo tissue repair studies. However, most of the information available about MSCs harvesting and characterization is about human and murine cells, which brings some doubts to researchers who desire to work with a rabbit model in tissue repair studies based on MSCs. In this context, this study aimed to add and improve the information available in the scientific literature providing a complete technique for isolation, expansion and differentiation of MSCs from rabbits. Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) from humerus and femur of rabbits were obtained and to evaluate their proliferation rate, three different culture media were tested, here referred as DMEM-P, DMEM´S and α-MEM. The BMMCs were also cultured in osteogenic, chondrogenic and adipogenic induction media to prove their multipotentiality. It was concluded that the techniques suggested in this study can provide a guideline to harvest and isolate MSCs from bone marrow of rabbits in enough amount to allow their expansion and, based on the laboratory experience where the study was developed, it is also suggested a culture media formulation to provide a better cell proliferation rate with multipotentiality preservation.(AU)
A engenharia de tecidos tem sido uma técnica fundamental no campo da medicina regenerativa, uma vez que permite a criação de peças teciduais tri-dimensionais por meio da associação de células mesenquimais indiferenciadas (ou células estromais mesenquimais - CEMs) e moldes de biomateriais in vitro. Assim, muitos estudos têm sido realizados utilizando estas células oriundas de diferentes espécies animais, e os coelhos são frequentemente utilizados como um modelo animal para estudos in vivo de reparação tecidual. No entanto, a maioria das informações disponíveis sobre a coleta e caracterização de CEMs referem-se às células humanas e murinas, o que traz algumas dúvidas para pesquisadores que desejam trabalhar com coelhos em estudos de reparação de tecidos baseados em CEMs. Neste contexto, o presente estudo objetivou contribuir e aprimorar as informações disponíveis na literatura científica fornecendo uma técnica completa para o isolamento, expansão e diferenciação das MSCs de coelhos. Células mononucleares da medula óssea (CMMOs) do úmero e fêmur de coelhos foram obtidas e, para avaliar sua taxa de proliferação, três meios de cultura diferentes foram testadas, aqui referidos como DMEM-P, DMEM'S e α-MEM. As CMMOs também foram cultivadas em meios de indução osteogênico, condrogênico, e linhagens adipogênico para provar a sua multipotencialidade. Concluiu-se que as técnicas sugeridas neste estudo podem fornecer um guia para a coleta e isolamento de CEMs da medula óssea de coelhos em quantidade suficiente para permitir a sua expansão e, com base na experiência de laboratório onde o estudo foi desenvolvido, é também sugerida uma formulação de meio de cultivo para proporcionar uma melhor taxa de proliferação celular com preservação da multipotencialidade.(AU)
Assuntos
Animais , Coelhos , Regeneração Tecidual Guiada/veterinária , Células da Medula Óssea , Engenharia Tecidual/veterinária , Úmero/transplante , Fêmur/transplante , Transplante de Células-Tronco Mesenquimais/veterinária , Regeneração , Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos/veterinária , Proliferação de Células , Células-Tronco AdultasResumo
In order to test the performance of bacterial cellulose/polycaprolactone composite (BC/PCL) and pure bacterial cellulose (BC) as tissue substitutes in rabbits' cornea, a superficial ulcer containing 5mm in diameter and 0.2mm deep was made in the right cornea of 36 rabbits, then a interlayer pocket was created from the basis of this ulcer. Twelve rabbits received BC/PCL membrane and 12 were treated with BC membranes, both membranes with 8mm in diameter. The remaining rabbits received no membrane constituting the control group. The animals were clinically followed up for 45 days. Three animals of each group were euthanized at three, seven, 21, and 45 days after implantation for histological examination of the cornea along with the implant. Clinical observation revealed signs of moderate inflammatory process, decreasing from day 20th in the implanted groups. Histology showed absence of epithelium on the membranes, fibroplasia close to the implants, lymph inflammatory infiltrate with giant cells, collagen disorganization, with a predominance of immature collagen fibers in both groups with implants. Although inflammatory response is acceptable, the membranes used does not satisfactorily played the role of tissue substitute for the cornea during the study period.(AU)
Com objetivo de testar o desempenho do compósito celulose bacteriana/policaprolactona (CB/PCL) e da celulose bacteriana pura (CB) como substitutos teciduais em córnea de coelhos, foi realizada uma úlcera superficial de 5 mm de diâmetro e 0,2 mm de profundidade na córnea direita de 36 coelhos, criando-se um bolso interlamelar a partir da base dessa úlcera. Doze animais receberam a membrana do compósito CB/PCL e 12 foram tratados com membranas de CB, ambas com 8 mm de diâmetro, os coelhos restantes não receberam nenhuma membrana, constituindo o grupo controle. Os animais foram acompanhados clinicamente até 45 dias. Três animais de cada grupo sofreram eutanásia aos três, sete, 21 e 45 dias após o implante das membranas para análise histológica da córnea juntamente com o implante. À observação clínica, houve sinais de processo inflamatório moderado, diminuindo a partir do 20º dia nos grupos implantados. A histologia demonstrou ausência de epitélio sobre as membranas, fibroplasia próxima aos implantes, infiltrado inflamatório linfo-histiocitário com células gigantes, desorganização do colágeno, com predominância de fibras imaturas de colágeno em ambos os grupos com implantes. Embora a resposta inflamatória seja aceitável, as membranas utilizadas não desempenharam satisfatoriamente o papel de substituto tecidual para a córnea, no período estudado.(AU)
Assuntos
Animais , Coelhos , Órgãos Artificiais/estatística & dados numéricos , Órgãos Artificiais/veterinária , Biopolímeros/análise , Celulose/análise , Córnea/cirurgia , Gluconacetobacter xylinus , Aloenxertos , Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos/métodos , Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos/veterináriaResumo
In order to test the performance of bacterial cellulose/polycaprolactone composite (BC/PCL) and pure bacterial cellulose (BC) as tissue substitutes in rabbits' cornea, a superficial ulcer containing 5mm in diameter and 0.2mm deep was made in the right cornea of 36 rabbits, then a interlayer pocket was created from the basis of this ulcer. Twelve rabbits received BC/PCL membrane and 12 were treated with BC membranes, both membranes with 8mm in diameter. The remaining rabbits received no membrane constituting the control group. The animals were clinically followed up for 45 days. Three animals of each group were euthanized at three, seven, 21, and 45 days after implantation for histological examination of the cornea along with the implant. Clinical observation revealed signs of moderate inflammatory process, decreasing from day 20th in the implanted groups. Histology showed absence of epithelium on the membranes, fibroplasia close to the implants, lymph inflammatory infiltrate with giant cells, collagen disorganization, with a predominance of immature collagen fibers in both groups with implants. Although inflammatory response is acceptable, the membranes used does not satisfactorily played the role of tissue substitute for the cornea during the study period.(AU)
Com objetivo de testar o desempenho do compósito celulose bacteriana/policaprolactona (CB/PCL) e da celulose bacteriana pura (CB) como substitutos teciduais em córnea de coelhos, foi realizada uma úlcera superficial de 5 mm de diâmetro e 0,2 mm de profundidade na córnea direita de 36 coelhos, criando-se um bolso interlamelar a partir da base dessa úlcera. Doze animais receberam a membrana do compósito CB/PCL e 12 foram tratados com membranas de CB, ambas com 8 mm de diâmetro, os coelhos restantes não receberam nenhuma membrana, constituindo o grupo controle. Os animais foram acompanhados clinicamente até 45 dias. Três animais de cada grupo sofreram eutanásia aos três, sete, 21 e 45 dias após o implante das membranas para análise histológica da córnea juntamente com o implante. À observação clínica, houve sinais de processo inflamatório moderado, diminuindo a partir do 20º dia nos grupos implantados. A histologia demonstrou ausência de epitélio sobre as membranas, fibroplasia próxima aos implantes, infiltrado inflamatório linfo-histiocitário com células gigantes, desorganização do colágeno, com predominância de fibras imaturas de colágeno em ambos os grupos com implantes. Embora a resposta inflamatória seja aceitável, as membranas utilizadas não desempenharam satisfatoriamente o papel de substituto tecidual para a córnea, no período estudado.(AU)
Assuntos
Animais , Coelhos , Celulose/análise , Órgãos Artificiais , Órgãos Artificiais/veterinária , Córnea/cirurgia , Biopolímeros/análise , Gluconacetobacter xylinus , Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos/métodos , Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos/veterinária , AloenxertosResumo
To compare the reconstruction of corpus cavernosum segments when seeded with mesenchymal stem cells and when stem cells are infused intravenously.METHODS: Sixteen New Zealand rabbits were submitted to reconstruction of the corpus cavernosum and distributed in Group A - decellularized matrices, Group B - decellularized matrices seeded with mesenchymal stem cells Group C - decellularized matrices submitted to intravenous infusion of mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cells were obtained by bone marrow aspiration. The venous filling aspect of the distal end of the corpus cavernosum was evaluated and the specimens were submitted to histological analisis and to immunohistochemistry. Cavernosometry was done in one animal of each groupRESULTS: Three animals on B and three animals on C presented full filling of distal end of the corpus cavernosum. No animals in A presented filling of the distal end of corpus cavernosum. At cavernosometry the animal on B attained 50 cmH2O, on C 110 cmH2O and on A 20 cmH2O. Trabeculae forming cavernous sinuses were found in groups B and C.CONCLUSION: The reconstruction of corpus cavernosum using descellularized matrices and mesenchymal stem cells, either by intravenous injection or directly seeded is possible, with growth of corpus cavernosum-like tissue.(AU)
Assuntos
Animais , Masculino , Coelhos , Transplante de Células-Tronco Mesenquimais/métodos , Pênis/cirurgia , Procedimentos de Cirurgia Plástica/métodos , Células Cultivadas , Colágeno , Imuno-Histoquímica , Injeções Intravenosas , Ilustração Médica , Período Pós-Operatório , Reprodutibilidade dos Testes , Resultado do TratamentoResumo
A tecnologia de células-tronco e as ciências de biomateriais obtiveram um grande avanço nas últimas décadas e se tornaram mais populares em todo o mundo. Pesquisadores buscam investigar e avaliar diferentes fontes de células e de biomateriais que, em combinação, possam fornecer uma plataforma de engenharia tecidual de baixo custo e produzida em larga escala, para serem utilizadas em testes de drogas, terapias celulares e transplantes, com objetivo de fornecer suporte terapêutico à lesões e regeneração de tecidos danificados. Em geral, os três componentes mais importantes da engenharia de tecidos são: a escolha do tipo de célula, a fonte do biomaterial (scaffold), criação e manutenção de um ambiente propício à formação tecidual. Quando esses três componentes são gerenciados com sucesso, o microambiente celular in vitro é mais semelhante ao que a célula está exposta in vivo, permitindo que o crescimento e diferenciação celular ocorra de maneira mais fidedigna e eficiente. A placenta bovina descelularizada demonstrou ter uma rica matriz extracelular, vasos bem desenvolvidos, sendo um biomaterial com alta disponibilidade e baixo custo. No entanto, não há informação sobre o potencial dos scaffolds placentários em serem repovoados com células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas do tecido adiposo, processo chamado recelularização. Ainda, também não há informação sobre a capacidade dos scaffolds placentários, de após recelularização, oferecer um ambiente adequado para diferenciação dessas células em diferentes linhagens. Assim, a fim de fornecer informações sobre a capacidade do complexo MSC - scaffold placentário em ser usado com sucesso na engenharia tecidual, os objetivos desta tese foram: estudar o potencial dos scaffolds placentários bovinos em oferecer suporte para recelularização por células-tronco derivadas do tecido adiposo bovino, bem como avaliar a capacidade de diferenciação celular em linhagens osteogênica e condrogênica. O primeiro artigo desta tese trata-se de uma revisão de literatura, que discute a natureza das células-tronco mesenquimais, suas aplicações na medicina regenerativa, a importância da tecnologia com células- tronco na indústria pecuária e o uso da espécie bovina na medicina translacional. O segundo artigo consiste na avaliação da recelularização e da diferenciação celular. As placentas bovinas foram decelularizadas por perfusão de SDS do vaso umbilical e as linhas celulares estabelecidas após digestão enzimática do tecido adiposo de seisxiv vacas e seleção por adesão rápida à placa de cultivo. Em seguida, as células foram cultivadas com os scaffolds em um sistema de agitação 2D por 21 dias em meio de diferenciação ou manutenção. Quando cultivadas na placa de cultivo, as células isoladas exibiram morfologia semelhante ao fibroblasto, expressão de CD90, CD73 e CD105, enquanto não expressaram os marcadores CD34 e CD45. Além disso, as células foram capazes de se diferenciar em linhagens condrogênicas e osteogênicas, fornecendo evidências de sua natureza mesenquimal. Posteriormente, quando cultivadas com os scaffolds, as células aderiram-se aos mesmos por projeções celulares, estabeleceram comunicação célula-scaffold e se proliferaram, fato evidenciado por análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (SEM). Em seguida, o potencial das células em se diferenciarem em linhagem osteogênica quando cultivadas com scaffold foi avaliado. Durante um período de cultivo de 21 dias no meio osteogênico, as células se proliferaram e diferenciaram de maneira dependente do tempo, ou seja, a cada semana pode ser observado maior abundância de células, evidenciada pela coloração dos núcleos celulares e aumento da intensidade da coloração para COLAGENO 1 (COL1), que também foi expresso por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). O mesmo padrão foi observado pela análise histológica; acúmulos generalizados de cálcio também foram mais abundantes nos scaffolds na terceira semana de cultivo, evidenciado pela coloração de Von Kossa. A análise SEM revelou que as células secretaram estruturas globulares quando cultivadas sob condições de indução osteogênica, condizente com a secreção observada pela análise histológica. Em relação à diferenciação condrogênica, os corantes Safranina e Fast Green revelaram sucesso na diferenciação, através da coloração de proteoglicanos, células semelhantes aos condrócitos e colágeno tipo II. A análise SEM mostrou que as células mudaram sua morfologia de fibroblastos para globulares quando cultivadas com meio de indução condrogênica por 21 dias. Além disso, os complexos célulasscaffold expressaram um marcador de linhagem cartilaginosa, COLAGENO 2 (COL2), que são condizentes com as observações histológicas e SEM. Considerando os resultados, este estudo demonstrou que os scaffolds placentários bovinos cultivados com células-tronco derivadas de tecido adiposo bovino possuem potencial para serem utilizados na engenharia de tecidos ósseos e cartilaginosos.
Stem cell technologies and biomaterial sciences have advanced and grown more popular all over the world. The researchers aim to investigate and evaluate different sources of cells and biomaterials that, in combination, could provide a low cost, highly scalable tissue engineering platform that could be used in drug tests, cell therapies and cell transplantation. The three most important components of tissue engineering systems in general are cell source, biomaterial source (scaffolding system), and the creation and maintenance of an environment that is conducive to tissue formation. When these three components are successfully managed, the tissue engineering treatment achieves a faithful imitation of the in vivo environment, allowing for the differentiation of cells into the desirable cell types. Decellularized bovine placenta has been demonstrated to be rich in extracellular matrix (ECM) and to have well-developed vasculature, representing a highly available, low cost, practically scalable biomaterial. However, it is not known if placental scaffolds have the potential to support recellularization with adipose-derived cells and their subsequent differentiation into different lineages. Thus, in order to provide information on the ability of the mesenchymal stem cell (MSC) - placental scaffold complex to be used in tissue engineering approaches, the objectives of this thesis were: to study the potential of bovine placental scaffolds to support adipose-derived cell recellularization and their differentiation into osteogenic and chondrogenic lineages. The first article of this thesis is a literature review that discusses the nature of mesenchymal stem cells, their applications in regenerative medicine, the importance of stem cell technologies to the livestock industry and the use of bovine species for translational medicine. The second article consists of an evaluation of scaffold recellularization and the differentiation of cells on the scaffolds. The bovine placentae were decellularized by umbilical vessel sodium dodecyl sulfate (SDS) perfusion and cell lines were established after the enzymatic digestion of adipose tissue from six cows and cell selection by rapid adherence to the culture plate. Then, cells were seeded onto the scaffolds and cultured in a 2D rocker system for 21 days in either differentiation or maintenance medium. The isolated cells, when cultured in the plastic dish, exhibited fibroblast-like morphology, CD90, CD73 and CD105 expression, and lacked CD34 and CD45 expression. Moreover, the cells were able to undergo differentiation into chondrogenic and osteogenic lineages, providing evidence of their mesenchymalxii nature. Subsequently, the cells adhered to the scaffolds by cell projections, established cell-scaffold communication, and proliferated while maintaining cell-cell communication, which was evidenced by histological and scanning electron microscopy (SEM) assays. Throughout a 21-day culture period in the osteogenic medium, the cells exhibited proliferation and differentiation in a time-dependent manner, which can be observed by the greater abundance of cells in later periods, evidenced by cell nuclei staining (4,6-diamidino-2-phenylindole - DAPI) and increased intensity of staining for COLLAGEN 1 (COL1) in the immunohistochemical assay, and by its expression as measured by real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). This same pattern was observed by histological analysis. Widespread calcium accumulations were also more abundant on the scaffolds as time progressed, as evidenced by Von Kossa staining. The SEM analysis revealed that cells secreted globular/round structures when seeded under osteogenic induction conditions, in accordance with histological findings. Regarding chondrogenic differentiation, Safranin O and Fast Green staining revealed successful differentiation through staining of proteoglycans, chondrocyte-like cells and type II collagen on the scaffold. The SEM analysis showed that the cells changed morphology from fibroblast-like to globular when cultured with chondrogenic induction medium for 21 days. Additionally, cellscaffold complexes expressed a cartilage marker, COLLAGEN 2 (COL2), which is conducive to the histological and SEM observations. Considering the results as a whole, this study demonstrated that placental scaffolds seeded with adipose-derived cells have the potential to be used in bone and cartilage tissue-engineering applications.