Anti-herpes activity of the total alkaloid fraction from the branches of Fusaea longifolia (Annonaceae) / Atividade anti-herpes da fração total de alcaloides dos ramos da Fusaea longifolia (Annonaceae)

The herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2) occur worldwide. Infections caused by these viruses have great public health importance due to the growing resistance to the first-choice drug, acyclovir, especially in immunosuppressed patients. Alkaloids derived from species of Annonaceae have been reported as antiviral agents against HSV and others viruses. Within this context, we evaluated the antiviral activity of the total alkaloid fraction (TAF) extracted from the branches of Fusaea longifolia (Aubl.) Saff. (Annonaceae), a species native to the Amazon region, against the HSV-1 and HSV-2 viruses. The antiviral activity was evaluated through the plate reduction assay and the mode of action was investigated by a set of other assays. The TAF was active against the HSV-2 strain 333 and against the HSV-1 strains KOS and 29R (acyclovir resistant), with selectivity index values (SI = 50% cytotoxic concentration/50% effective concentration) of 5, 4 and 3, respectively. In the preliminary study of the anti-HSV-2 mode of action, TAF showed viral inhibitory effects if added up to 12 h post-infection, had virucidal activity and did not present viral inhibition in pre-treatment. Our results showed that the TAF exhibited anti-HSV activity. Regarding HSV-2, TAF acted after the viral infection and had virucidal activity. A mass spectrometry analysis revealed the presence of nine alkaloids in the TAF that had previously been reported for Annonaceae, including liriodenine, lysicamine and isoboldine, which have been described as potential anti-HSV-1 agents.(AU)

Os vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2) têm ampla ocorrência global. As infecções causadas por esses vírus têm grande importância em saúde pública devido à crescente resistência ao fármaco de primeira linha, aciclovir, principalmente em pacientes imunossuprimidos. Alcaloides derivados de espécies de Annonaceae têm sido relatados como agentes antivirais contra o HSV e outros vírus. Neste contexto, nós avaliamos a atividade antiviral da fração alcaloide total (TAF) dos ramos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff. (Annonaceae), uma espécie nativa da região amazônica, contra os vírus HSV-1 e HSV-2. A atividade antiviral foi avaliada através do ensaio de redução em placa e o modo de ação foi investigado por um conjunto de ensaios. O TAF foi ativo contra a cepa HSV-2 333 e contra as cepas HSV-1 KOS e 29R (resistente ao aciclovir), com valores de índice de seletividade (IS = 50% concentração citotóxica/50% concentração efetiva) de 5, 4 e 3, respectivamente. No estudo preliminar do modo de ação da atividade anti-HSV-2, o TAF inibiu a replicação viral quando adicionados até 12 h pós-infecção, apresentou atividade virucida e não apresentou inibição viral no pré-tratamento. Nossos resultados mostraram que o TAF exibiu atividade anti-HSV. Em relação ao HSV-2, o TAF atuou após a infecção viral e apresentou atividade virucida. Uma análise do TAF por espectrometria de massas identificou a presença de nove alcaloides, incluindo liriodenina, lisicamina e isoboldina, que já foram descritos como potenciais agentes anti-HSV-1.(AU)

Anti-equine arteritis virus activity of ethanolic extract and compounds from Origanum vulgare / Atividade do extrato etanólico e compostos de Origanum vulgare contra o virus da arterite equina

The equine arteritis virus (EAV) is responsible by an important respiratory and reproductive disease in equine populations and there is no specific antiviral treatment available. The objective of this study was to investigate the activity of an ethanolic crude extract of Origanum vulgare (EEO) and of isolated compound caffeic acid, p-coumaric acid, rosmarinic acid, quercetin, luteolin, carnosol, carnosic acid, kaempferol and apigenin against EAV. The assays were performed using non-cytotoxic concentrations. The antiviral activity was monitored initially by cytopathic effect inhibition (CPE) assay in RK13 cells in the presence or absence of EEO. Pre-incubated cells with EEO were also examined to show prophylactic effect. Direct viral inactivation by EEO and isolated compounds was evaluated by incubation at 37C or 20C. After the incubation period, the infectivity was immediately determined by virus titrations on cell cultures and expressed as 50% tissue culture infective dose (TCID50)/100 µL. There was significant virucidal activity of EEO and of the compounds caffeic acid, p-coumaric acid, quercetin, carnosic acid and kaempferol. When EEO was added after infection, EEO inhibited the virus growth in infected cells, as evidenced by significant reduction of the viral titre. The results provide evidence that the EEO exhibit an inhibitory effect anti-EAV. Among the main compounds evaluated, caffeic acid, p-coumaric acid,carnosic acid, kaempferol and mainly quercetin, contributed to the activity of EEO. EEO may represent a good prototype for the development of a new antiviral agent, presenting promising for combating arteriviruses infections.(AU)

O virus da arterite equine (EAV) é responsável por uma importante doença respiratória e reprodutiva na população de equinos e não há tratamento antiviral específico disponível. O objetivo desse estudo foi investigar a atividade de um extrato etanólico de Origanum vulgare (EEO) e dos compostos isolados ácido caféico, ácido p-cumarico, ácido rosmarínico, quercetina, luteolina, carnosol, ácido carnósico, campferol e apigenina contra o EAV. Os ensaios foram realizados com concentrações não citotóxicas. A atividade antiviral foi monitorada inicialmente por um ensaio de inibição de efeito citopático (CPE) em células RK13 na presença ou ausência do EEO. Células pré-incubadas com o EEO foram também examinadas para a presença de efeito profilático. Inativação direta do EAV pelo EEO e pelos compostos isolados foi avaliada mediante incubação a 37C ou 20C. Após o período de incubação, a infectividade foi imediatamente determinada por titulação viral em cultivo celular sendo expresso como dose infectiva a 50% (TCID50)/100 µL. Houve significativa atividade virucida do EEO e dos compostos ácido caféico, ácido p-cumarico, quercetina, ácido carnósico e campferol. Quando o EEO foi adicionado após a infecção, o EEO inibiu a replicação do vírus nas células infectadas, o que foi evidenciado pela redução significativa do título viral. Os resultados fornecem evidências de que o EEO possui efeito anti-EAV.Entre os principais compostos presentes avaliados, ácido caféico, ácido p-cumarico, ácido carnósico, campferol e, principalmente, quercetina, contribuíram para a atividade antiviral do extrato. O EEO pode representar um bom protótipo para o desenvolvimento de um novo agente antiviral, sendo promissor para combater infecções por arterivírus.(AU)

Inhibition of equine arteritis virus by an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34 / Inibição do vírus da arterite equina por um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34

P34 is an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34, isolated from the intestinal contents of a fish from the Amazon basin. This peptide showed antibacterial properties against Gram-positive and Gram-negative bacteria and was characterized as a bacteriocin like substance. It was demonstrated that the peptide P34 exhibited antiviral activity against feline herpesvirus type 1 in vitro. The aim of this work was to evaluate P34 for its antiviral properties in vitro, using RK 13 cells, against the equine arteritis virus, since it has no specific treatment and a variable proportion of stallions may become persistently infected. The results obtained show that P34 exerts antiviral and virucidal activities against equine arteritis virus, probably in the viral envelope. The antiviral assays performed showed that P34 reduces significantly the viral titers of treated cell cultures. The mechanism of action of P34 seems to be time/temperature-dependent. This peptide tends to be a promising antiviral compound for the prevention and treatment of arteriviral infections since it has a high therapeutic index. However, more detailed studies must be performed to address the exact step of viral infection where P34 acts, in order to use this peptide as an antiviral drug in vivo in the future.(AU)

P34 é um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34, isolado do conteúdo intestinal de um peixe na Bacia Amazônica. Esse peptídeo demonstrou propriedades antibacterianas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e foi caracterizado como uma substância do tipo bacteriocina. Foi demonstrado que o peptídeo P34 exibiu atividade antiviral contra o herpesvírus felino tipo 1 in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o P34 in vitro, em cultivo de células RK 13, contra o vírus da arterite equina, uma vez que não há tratamento específico e uma variável proporção de garanhões pode permanecer persistentemente infectada. Os resultados obtidos mostram que o peptídeo exerce atividade antiviral e virucida contra o vírus da arterite equina, agindo provavelmente no envelope viral. Os ensaios antivirais realizados demonstraram que o P34 reduz significativamente os títulos do vírus nas células infectadas e tratadas. O mecanismo de ação do P34 parece ser tempo/temperatura dependente. Esse peptídeo tende a ser um antiviral promissor para o tratamento e a prevenção das infecções por arterivírus, tendo em vista que ele possui um alto índice terapêutico. Contudo, estudos mais detalhados devem ser realizados para precisar a etapa exata da infecção viral em que o P34 age, para que ele possa ser usado como antiviral in vivo no futuro.(AU)

Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV) / Antiviral and virucidal activity of hydroalcoholic extracts of propolis brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula) against Bovine Herpesvirus Type-1 (BoHV-1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)

Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57µg/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78µg/mL) e marrom (0,39µg/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.(AU)

Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.(AU)

Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV) / Antiviral and virucidal activity of hydroalcoholic extracts of propolis brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula) against Bovine Herpesvirus Type-1 (BoHV-1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)

Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57µg/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78µg/mL) e marrom (0,39µg/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.(AU)

Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.(AU)

Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV)

ABSTRACT: Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.

RESUMO: Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57g/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78g/mL) e marrom (0,39g/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.

ATIVIDADE VIRUCIDA DE PORFIRINAS TETRA-PLATINADAS FRENTE A VÍRUS DE BOVINOS

As porfirinas são substâncias fotossensibilizadoras, ou seja, compostos que absorvem a energia da luz para a produção de espécies reativas de oxigênio que podem alterar moléculas e mecanismos celulares. A utilização de porfirinas para a inativação viral vem sendo investigada e possui potenciais aplicações tanto in vitro quanto in vivo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade virucida de duas porfirinas tetra-platinadas (3 e 4-PtTPyP) em alguns vírus de bovinos. A citotoxicidade dos compostos foi inicialmente determinada pelo teste de MTT e, a partir da maior concentração não tóxica, foram utilizadas concentrações inferiores das porfirinas nos testes de atividade virucida. Foram realizados ensaios com vírus de genoma DNA ou RNA, com envelope (herpesvírus bovino tipo 1, BoHV-1, e vírus da diarreia viral bovina, BVDV) e não envelopados (adenovírus bovino, BAV, e enterovírus bovino, BEV). Além disso, a atividade virucida foi investigada frente aos vírus vaccínia (VACV) e da estomatite vesicular (VSV), que são vírus epiteliotrópicos de grande impacto na bovinocultura. Para isso, suspensões virais foram incubadas com as porfirinas e expostas à luz por diferentes períodos de tempo (0, 15, 30 e 60 min). Após esse período, os títulos virais foram determinados por diluição limitante e comparados ao controle viral. Os ensaios de atividade virucida utilizando a porfirina 3-PtTPyP na maior concentração (9,1µM) resultou na inativação total dos vírus envelopados mesmo quando não expostos à luz. A utilização de 1/10 da dose da mesma porfirina (0,91 µM) resultou em redução no título do BVDV e VSV após 15 min de exposição à luz, sendo que a partir de 30 min houve inativação completa. Para o BoHV-1 e VACV, a inativação total ocorreu a partir de 60 min de foto-ativação. O uso da 4-PtTPyP a 9,1 µM também resultou em inativação completa dos vírus envelopados BVDV, BoHV-1 e VSV, mesmo sem foto-ativação. Para o VACV houve inativação viral total a partir dos 15 min de exposição à luz. Além disso, houve perda significativa da infectividade viral quando o vírus foi incubado com o composto sem fotoativação, porém a inativação foi parcial. Quando a 4-PtTPyP foi utilizada em menor concentração (0,91 µM), foi verificada redução gradual nos títulos de vírus envelopados conforme o tempo de exposição à luz. Não foi detectada atividade virucida de nenhuma das porfirinas contra os vírus não-envelopados. Os resultados indicaram que ambas porfirinas possuem atividade virucida sobre vírus envelopados, e podem agir diretamente sobre a infectividade viral mesmo quando não ativadas pela luz, se utilizadas em concentrações elevadas.

Porphyrins are photosensitizing (PS) substances, that is, compounds that are activated when exposed to light, reacting with oxygen molecules and producing reactive oxygen species (ROS). The porphyrins are composed of four pyrrole rings joined together by methenyl bridges, forming an aromatic tetrapyrrole macrocycle. Photodynamic inactivation is a simple and controllable method, and is based on ROS production, which can be free radicals and/or singlet oxygen (1O2). This process requires the combined action of oxygen, light and a photosensitizer (PS). Photodynamic therapy has been used in the treatment of tumors and infectious disease. Due to microbial resistance to many commercial drugs, the search for new drugs has become a necessity and the use of porphyrins has gained prominence. The objective of this work was to evaluate the virucidal activity of two tetra-platinized porphyrins (3 and 4-PtTPyP) in different animal viruses. The cytotoxicity of the compounds was determined by the MTT test and, from the higher non-toxic concentration for cultured cells, lower concentrations of porphyrins were used in the virucidal tests. Virucidal tests were performed with DNA viruses with envelope (bovine herpesvirus type 1, BoHV-1) or non-enveloped (bovine adenovirus, BAV) and RNA viruses with envelope (and bovine viral diarrhea virus, BVDV) and non-enveloped (bovine enterovirus, BEV). In addition, virucidal activity was investigated against vaccinia virus (VACV, DNA virus enveloped) and vesicular stomatitis (VSV, RNA virus enveloped), which are epitheliotropic viruses that cause important economic and sanitary impact on bovine production. For this, viral suspensions of known viral concentration were incubated with the porphyrins and exposed to light for different time periods (0, 15, 30 and 60 min). After this, viral titers were determined by limiting dilution and compared to viral control. Virucidal assays using 3-PtTPyP porphyrin at the highest concentration (9.1M) resulted in total inactivation of enveloped viruses even when not exposed to light. The use of 1/10 of the dose of the same porphyrin (0.91 M) resulted in a reduction in the titer of BVDV and VSV virus after 15 min of light exposure, and total inactivation was observed after 30 min. For BoHV-1 and VACV, total inactivation occurred after 60 min of photoactivation. The use of 9.1 M 4-PtTPyP also resulted in total inactivation of the enveloped BoHV-1, BVDV and VSV, even without photoactivation. For the enveloped VACV complete inactivation occurred after 15 min of light exposure. When 4-PtTPyP was used in a lower concentration (0.91 M) gradual reduction in infectivity of enveloped virus was observed according to the time of light exposure. In addition, there was a significant loss of viral infectivity when the virus were incubated with the compound without photoactivation, but viral inactivation was only partial. None of the porphyrins had virucidal activity on non-enveloped viruses. The results indicated that both porphyrins have virucidal activity on enveloped viruses, and can act directly on viral infectivity even when not activated by light, if used in high concentrations.

Prospecção de atividades biológicas da apamina e melitina

A busca por novos fármacos têm levado as pesquisas ao encontro dos produtos naturais que oferecem uma quantidade inimaginável de princípios ativos ainda desconhecidos. A apicultura moderna é um segmento da agropecuária que fornece alguns produtos naturais como a própolis, o mel, a cera, a geleia real e a apitoxina, que vêm sendo alvo de pesquisas devido às diversas atividades biológicas já apresentadas. A apitoxina (veneno de abelhas) é uma complexa mistura de substâncias bioativas, entre elas os peptídeos apamina e melitina. O primeiro trata se da menor neurotoxina conhecida e com apenas 18 aminoácidos em sua composição representa 2% do peso seco do veneno. Já melitina, composta de 26 aminoácidos, corresponde a 50% do peso seco do veneno e é um conhecido peptídeo tóxico capaz de causar lise em diversos tipos celulares. Neste sentido, este estudo objetivou caracterizar estes dois peptídeos quanto à sua citotoxicidade e seu poder antimicrobiano. Através do ensaio de redução do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol- 2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) foi possível determinar as concentrações citotóxicas de melitina para 50% dos cultivos celulares (CC50), que variou de 2,3 a 4,1 µg/mL e a CC90, que variou de 2,7 a 4,7 µg/mL para diferentes linhagens celulares e, ao expor estas células frente à melitina por diferentes períodos pôde-se observar que com apenas 5 minutos de exposição, houve queda nas viabilidades celulares. Já os ensaios de toxicidade realizados em citometria de fluxo demonstram que, com concentrações de melitina abaixo das consideradas tóxicas pelo ensaio de redução do MTT, as células já apresentavam sinais de toxicidade da melitina, alterando os padrões de apoptose e necrose, aumentando a peroxidação das membranas lipídicas (LPO), assim como a produção intracelular de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e da fragmentação de seu DNA. Por microscopia confocal foi possível a observação de focos de apoptose e necrose e do aumento da fluidez das membranas das células proporcional ao aumento da concentração de melitina em que essas foram expostas. Houve correlação positiva entre LPO e ROS (r=0,3158, p<0,05), taxa de apoptose (r= 0,4978, p<0,05) e com a funcionalidade das mitocôndrias (r= 0,3149, p<0,05). LPO parece iniciar os demais eventos de toxicidade celular avaliados e aumentar a funcionalidade mitocondrial em resposta ao estresse sofrido pelas células. Sendo assim, a citometria de fluxo e a microscopia confocal demonstraram eficiência em auxiliar a desvendar os mecanismos de toxicidade de melitina e se portam como técnicas complementares ao ensaio MTT, que avalia a viabilidade celular apenas através da funcionalidade mitocondrial. Quanto à atividade antiviral da melitina, houve a inativação de herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), especialmente na concentração 2µg/ml. Apamina atuandoisoladamente não apresentou poder antiviral, porém quando aliada à melitina, apresentou efeito antiviral contra o vírus da diarreia viaral bovina (BVDV). Resultados com padrões semelhantes ocorreram ao analisar o poder virucida das substâncias, quando melitina inativou BoHV-1 em 2 horas de incubação com este vírus mas não apresentou ação contra o BVDV, assim como a apamina, mas a associação potencializou o efeito virucida contra BVDV. Já quanto à atividade antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM) de melitina foram, respectivamente (em µg/ml), frente a Staphylococcus aureus (6-7 e 32-64), Escherichia coli (40-42,5 e 64-128) e Pseudomonas aeruginosa (65-70 e 64-128). Biofilmes de S. aureus foram mais sensíveis à ação da melitina quanto comparados aos biofilmes produzidos pelas Gram negativas. Melitina foi capaz de destruir biofilmes pré-formados pelas três espécies bacterianas estudadas além de inibir a formação dos biofilmes por estas espécies quando foram previamente incubadas com melitina em concentrações abaixo da CIM. Os resultados são promissores quanto à capacidade antimicrobiana das substâncias apresentando potencial para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou sanitizantes e, os mecanismos de toxicidade avaliados podem auxiliar nesse desenvolvimento.

The search for new drugs leads the researchs to meeting the natural products that offers an unimaginable amount of still unknown active principles. The modern apiculture is a segment of agriculture that provides some natural products such as propolis, honey, wax, royal jelly and apitoxin, which have been the subject of research due to the various biological activities already presented. Apitoxin (bee venom) is a complex mixture of bioactive substances, and between them the peptides apamin and melittin. The first is the smaller known neurotoxin and, with only 18 amino acids in its composition, represent 2% of the dry weight of the venom. Melitin, composed of 26 amino acids, corresponds to 50% of the dry weight of the venom and is a known toxic peptide capable of causing lysis in several cell types. In this sense, this study aims to characterize these two peptides as to their cytotoxicity and their antimicrobial power. By the reduction of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2-5-diphenyl-2H-tetrazolate bromide) test, it was possible to determine the cytotoxic concentrations of melittin to 50% of the cell cultures (CC50) which ranged from 2.3 to 4.1 g / mL and CC90, ranging from 2.7 to 4.7 g / mL for different cell lines, and by expose these cells to melina for different periods it was observed that only 5 minutes of exposure, there was decrease in cellular viability. The toxicity tests performed in flow cytometry shows that, with melittin concentrations below the toxic concentration considerated by the MTT reduction test, the cells showed signs of melittin toxicity, altering the patterns of apoptosis and necrosis, increasing the peroxidation of membranes (LPO), as well as an intracellular production of oxygen reactive species (ROS) and the fragmentation of their DNA. By confocal microscopy it was possible to observe foci of apoptosis, necrosis and the increase of cell membranes fluidity proportional to the increase in the concentration of melittin in which they were exposed. There was a positive correlation between LPO and ROS (r = 0.3158, p <0.05), apoptosis rate (r = 0.4978, p <0.05) and mitochondrial functionality (r = 0.3149, P0.05). LPO seems to initiate the other evaluated events of cellular toxicity and increase mitochondrial functionality in response to the stress undergone by the cells. Therefore, the flow cytometry and confocal microscopy have demonstrated efficiency in helping to unravel the mechanisms of melittin toxicity and behave as complementary techniques to the MTT assay, which evaluates the cellular viability by mitochondrial functionality. As for the antiviral activity of melittin, there was inactivation of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), especially at 2g / ml concentration. Apamin acting alone did not present antiviral power, but when allied to melittin, presented antiviral effect against bovine viral diarrhea virus (BVDV). Results with similar patterns ocurred when analyzing the virucidal power of the substances,when melittin inactivated BoHV-1 with 2 hours of incubation with this virus but showed no action against BVDV, as well as apamine, but the association potentiated their virucidal effect against BVDV. As for antibacterial activity, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) of melittin were, respectively (in g / mL), against Staphylococcus aureus (6-7 and 32- 64), Escherichia coli (40- 42,5 and 64-128) and Pseudomonas aeruginosa (65-70 and 64-128). Biofilms of S. aureus were more sensitive to the action of melitin compared to biofilms produced by Gram negative bacteria. Melittin was able to destroy preformed biofilms by the three bacterial species studied and inhibited the formation of biofilms by these species when they were previously incubated with melittin at concentrations below MIC. The results are promising as to the antimicrobial capacity of the substances presenting potential for the development of new drugs and / or sanitizers and the mechanisms of toxicity can aid in the development

Atividade antimicrobiana de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente a micro-organismos infecciosos de interesse em Medicina Veterinária e Humana

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana (antibacteriana, antifúngica e antiviral), toxicidade celular e composição química de extratos hidroalcoólicos da própolis marrom (PM), verde (PV) e de abelhas nativas jataí (PJ). A atividade antibacteriana da própolis foi analisada pelo método de Microdiluição frente à Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli. Para a atividade antifúngica, foi utilizada metodologia semelhante, frente à Candida lipolytica, Candida parapsilosis, Sporothrix schenckii e Sporothrix brasiliensis. A atividade antiviral foi avaliada através de dois métodos distintos de tratamento das células com os extratos: antes e depois da inoculação viral, frente ao Herpes Vírus Bovino (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) e quantificado pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol2yl)- 2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) e a atividade virucida, avaliada através de diferentes diluições dos vírus, temperaturas e tempos de incubações e analisadas por observação microscópica e quantificadas através da Dose Infectante (D.I.) 50%. A toxicidade foi avaliada através de diferentes concentrações e a viabilidade celular quantificada por MTT. À composição química das própolis foi determinada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os resultados da atividade antibacteriana demonstraram que PM obteve valores menores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), quando testados frente à S. aureus (6,7 mg/mL; 13,4 mg/mL, respectivamente), e E. coli (29,4 mg/mL; 54,3 mg/mL) quando comparados ao PV e PJ. Contudo frente Streptococcus sp., os menores valores de CIM e CBM encontrados foram da PV (p<0,01). Na atividade antifúngica as PM, PV e PJ apresentaram eficácia à Candida sp. eSporotrix sp. A PJ apresentou menor toxicidade, em sequência PV e PM. Na atividade antiviral, os extratos foram mais eficazes quando acrescentados no pré-tratamento e a PM e PV foram mais eficazes ao BoHV-1, enquanto a PJ ao BVDV. Na virucida, a PVa 37°C obteve valores diferentes e menores (log = 2,67) em relação a PM (log = 3,5) e PJ (log = 3,76). No entanto, para BVDV a PJ apresentou os melhores resultados para ambas temperaturas. Os resultados demonstram o potencial da própolis como antimicrobiano no tratamento de doenças em Medicina Veterinária e Humana.

The objective of this study was to evaluate the antimicrobial activity (antibacterial, antifungal and antiviral), cell toxicity and chemical composition of hydroalcoholic extracts of brown propolis (PM), green (PV) and native bees jataí (PJ). The antibacterial activity of propolis was analyzed by microdilution method against the Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli. For the antifungal activity, similar methodology was used, compared to Candida lipolytica, Candida parapsilosis, Sporothrix schenckii and Sporothrix brasiliensis. The antiviral activity was measured using two different methods of treatment of the cells with the extracts: before and after the viral inoculation against Bovine Herpes virus (bovine herpesvirus type 1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and quantitated by assaying MTT (3- (4,5 dimethylthiazol-2yl) - 2,5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine) and virucidal activity, measured using different dilutions of virus, temperatures and incubation times and analyzed by microscopic observation and quantified by the infective dose (ID) 50%. Toxicity was evaluated using different concentrations and cell viability measured by MTT. In the chemical composition of propolis was determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods. The results demonstrated that the antibacterial activity had lower values PM Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) when tested against S. aureus (6.7 mg/mL; 13.4 mg/mL, respectively) and E. coli (29.4 mg/mL, 54.3 mg/mL) compared to the PV and PJ. However front Streptococcus sp., the lowest values of MIC and MBC were found of PV (p <0.01). In the antifungal activity PM, PV and PJ showed efficacy to Candida sp. and Sporotrix spp. The PJ showed lower toxicity in PV and PM sequence. In the antiviral activity, the extracts were more effective when added in the pre treatment and the PM and PV were more effective in BoHV-1, while the PJ to BVDV. In virucidal, PV obtained at 37°C and under different values (log = 2.67) compared to PM (log = 3.5) and PJ (log = 3.76). However, for BVDV PJ showed the best results for both temperatures. Results show the potential of propolis as an antimicrobial in the treatment of diseases in Veterinary Medicine and Human.

Anti-equine arteritis virus activity of ethanolic extract and compounds from Origanum vulgare / Atividade do extrato etanólico e compostos de Origanum vulgare contra o virus da arterite equina

The equine arteritis virus (EAV) is responsible by an important respiratory and reproductive disease in equine populations and there is no specific antiviral treatment available. The objective of this study was to investigate the activity of an ethanolic crude extract of Origanum vulgare (EEO) and of isolated compound caffeic acid, p-coumaric acid, rosmarinic acid, quercetin, luteolin, carnosol, carnosic acid, kaempferol and apigenin against EAV. The assays were performed using non-cytotoxic concentrations. The antiviral activity was monitored initially by cytopathic effect inhibition (CPE) assay in RK13 cells in the presence or absence of EEO. Pre-incubated cells with EEO were also examined to show prophylactic effect. Direct viral inactivation by EEO and isolated compounds was evaluated by incubation at 37C or 20C. After the incubation period, the infectivity was immediately determined by virus titrations on cell cultures and expressed as 50% tissue culture infective dose (TCID50)/100 µL. There was significant virucidal activity of EEO and of the compounds caffeic acid, p-coumaric acid, quercetin, carnosic acid and kaempferol. When EEO was added after infection, EEO inhibited the virus growth in infected cells, as evidenced by significant reduction of the viral titre. The results provide evidence that the EEO exhibit an inhibitory effect anti-EAV. Among the main compounds evaluated, caffeic acid, p-coumaric acid,carnosic acid, kaempferol and mainly quercetin, contributed to the activity of EEO. EEO may represent a good prototype for the development of a new antiviral agent, presenting promising for combating arteriviruses infections.

O virus da arterite equine (EAV) é responsável por uma importante doença respiratória e reprodutiva na população de equinos e não há tratamento antiviral específico disponível. O objetivo desse estudo foi investigar a atividade de um extrato etanólico de Origanum vulgare (EEO) e dos compostos isolados ácido caféico, ácido p-cumarico, ácido rosmarínico, quercetina, luteolina, carnosol, ácido carnósico, campferol e apigenina contra o EAV. Os ensaios foram realizados com concentrações não citotóxicas. A atividade antiviral foi monitorada inicialmente por um ensaio de inibição de efeito citopático (CPE) em células RK13 na presença ou ausência do EEO. Células pré-incubadas com o EEO foram também examinadas para a presença de efeito profilático. Inativação direta do EAV pelo EEO e pelos compostos isolados foi avaliada mediante incubação a 37C ou 20C. Após o período de incubação, a infectividade foi imediatamente determinada por titulação viral em cultivo celular sendo expresso como dose infectiva a 50% (TCID50)/100 µL. Houve significativa atividade virucida do EEO e dos compostos ácido caféico, ácido p-cumarico, quercetina, ácido carnósico e campferol. Quando o EEO foi adicionado após a infecção, o EEO inibiu a replicação do vírus nas células infectadas, o que foi evidenciado pela redução significativa do título viral. Os resultados fornecem evidências de que o EEO possui efeito anti-EAV.Entre os principais compostos presentes avaliados, ácido caféico, ácido p-cumarico, ácido carnósico, campferol e, principalmente, quercetina, contribuíram para a atividade antiviral do extrato. O EEO pode representar um bom protótipo para o desenvolvimento de um novo agente antiviral, sendo promissor para combater infecções por arterivírus.