Inhibition of equine arteritis virus by an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34 / Inibição do vírus da arterite equina por um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34

P34 is an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34, isolated from the intestinal contents of a fish from the Amazon basin. This peptide showed antibacterial properties against Gram-positive and Gram-negative bacteria and was characterized as a bacteriocin like substance. It was demonstrated that the peptide P34 exhibited antiviral activity against feline herpesvirus type 1 in vitro. The aim of this work was to evaluate P34 for its antiviral properties in vitro, using RK 13 cells, against the equine arteritis virus, since it has no specific treatment and a variable proportion of stallions may become persistently infected. The results obtained show that P34 exerts antiviral and virucidal activities against equine arteritis virus, probably in the viral envelope. The antiviral assays performed showed that P34 reduces significantly the viral titers of treated cell cultures. The mechanism of action of P34 seems to be time/temperature-dependent. This peptide tends to be a promising antiviral compound for the prevention and treatment of arteriviral infections since it has a high therapeutic index. However, more detailed studies must be performed to address the exact step of viral infection where P34 acts, in order to use this peptide as an antiviral drug in vivo in the future.(AU)

P34 é um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34, isolado do conteúdo intestinal de um peixe na Bacia Amazônica. Esse peptídeo demonstrou propriedades antibacterianas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e foi caracterizado como uma substância do tipo bacteriocina. Foi demonstrado que o peptídeo P34 exibiu atividade antiviral contra o herpesvírus felino tipo 1 in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o P34 in vitro, em cultivo de células RK 13, contra o vírus da arterite equina, uma vez que não há tratamento específico e uma variável proporção de garanhões pode permanecer persistentemente infectada. Os resultados obtidos mostram que o peptídeo exerce atividade antiviral e virucida contra o vírus da arterite equina, agindo provavelmente no envelope viral. Os ensaios antivirais realizados demonstraram que o P34 reduz significativamente os títulos do vírus nas células infectadas e tratadas. O mecanismo de ação do P34 parece ser tempo/temperatura dependente. Esse peptídeo tende a ser um antiviral promissor para o tratamento e a prevenção das infecções por arterivírus, tendo em vista que ele possui um alto índice terapêutico. Contudo, estudos mais detalhados devem ser realizados para precisar a etapa exata da infecção viral em que o P34 age, para que ele possa ser usado como antiviral in vivo no futuro.(AU)

USO DO PEPTÍDEO Ctn[1-9], DERIVADO DA TOXINA CROTALICIDINA, NA ATIVAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS

Em mamíferos, o influxo do cálcio é fator primordial para a ativação oocitária após ovulação de um oócito maturado e com competência ao desenvolvimento. Biotecnologias da reprodução, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide e tranferência nuclear de células somáticas necessitam da ativação oocitária artificial para dar continuidade ao desenvolvimento embrionário. Os estudos com as catelicidinas, presentes no veneno de cascavéis, mostraram propriedades antimicrobianas, antitumorais e antifúngicas. Além disso, o peptídeo sintético de crotalicidina (Ctn1-9), uma vipericidina relacionado à família das catelicidinas, possui capacidade de promover influxo de cálcio em células cancerígenas. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do (Ctn1-9), ligado covalentemente com a Rodamina B (RhoB-Ctn1-9), na ativação oocitária e no posterior desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por partenogênese. Ovários bovinos foram colhidos em abatedouro local e foram puncionados os folículos medindo entre 2-8 mm. Os complexos cumulus-oócito obtidos (n = 1599) foram submetidos à maturação in vitro por 26 h e então divididos (n= 1178) nos diferentes grupos experimentais: Ctn1-9 (0, 1, 10 e 40 M) e grupo controle (ionomicina 5 M), com tempo de exposição de 4 min em todos os grupos. Posteriormente, os oócitos foram incubados por 4 h com 6-DMAP em meio SOF, seguido de cultivo in vitro em meio SOF por sete dias. A análise estatística foi realizada utilizando o software Minitab. Os dados são apresentados como porcentagem e comparados através do teste exato de Fisher. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05. No dia dois de cultivo, em relação à taxa de clivagem, não houve diferença estatística (P > 0,05) entre as concentrações 1 M (19,6%), 10 M (22,4%) e 40 M (14,7%), entretanto o grupo 1 M e 10 M foram significativamente maiores (P < 0,05) do que o grupo 0 M (8,4%). Para a taxa de formação de blastocisto, grupos 0 M (0,6%), 10 M (1,8%) e 40 M (2,2%) não demonstraram diferença significativa (P > 0,05) entre eles, porém o grupo 40 M foi significativamente maior (P < 0,05) do que o grupo 1 M (0%). Em conclusão, o RhoB-Ctn[1-9] demonstrou ser capaz de induzir a clivagem em oócitos bovinos. Além disso, a ativação e o desenvolvimento até o estádio de blastocisto mostram pouca ou nenhuma toxicidade deste peptídeo como agente ativador de oócitos bovinos.

In mammals, calcium influx is critical to oocyte activation post-ovulation of a matured oocyte with competence to development. Reproductive biotechnologies such as intracytoplasmic sperm injection and somatic cell nuclear transfer necessarily use artificial oocyte activation to continue embryo development. The studies on cathelicidins, present in pit rattlesnake venom, showed antimicrobial, antitumor and antifungal properties. In addition, the synthetic peptide from crotalicidin (Ctn1-9), a vipericidin related to the cathelicidin family, has the capacity to promote calcium influx in cancer cells. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of Ctn[1-9], covalently conjugated with Rhodamine B (RhoB-Ctn1-9), on oocyte activation and development of bovine embryos produced by parthenogenesis. Bovine ovaries were collected in local abattoir and follicles measuring 2-8 mm were punctured. Cumulus-oocyte complexes (n = 1599) were subjected to in vitro maturation for 26 h and then divided (n= 1178) to different experimental groups: Ctn1-9 (0; 1; 10 and 40 M) and control group (ionomycin 5 M), with 4 min exposure time for all groups. Then, oocytes were incubated for 4 h in 6-DMAP in SOF medium and followed for in vitro culture in SOF medium for seven days. Statistical analysis were performed using Minitab software. Data are shown as percentage and compared by Fishers exact test. Results were significant when P < 0.05. In day two of culture, concerning cleavage rate, there was no statistical difference (P > 0.05) between concentration 1 M (19.6%), 10 M (22.4%) and 40 M (14.7%), however group 1 M and 10 M were significantly higher (P < 0.05) than group 0 M (8.4%). For the blastocyst formation rate, groups with 0 M (0.6%), 10 M (1.8%) and 40 M (2.2%) showed no significant difference (P > 0.05) among them, yet group 40 M was significantly higher (P < 0.05) than group 1 M (0%). In conclusion, RhoB-Ctn[1-9] showed to be able to induced cleavage in bovine oocytes. In addition, the activation and development to the blastocyst stage show little or no toxicity of this peptide as an activating agent for bovine oocytes.

Avaliação do papel de proteases secretadas por Leptospira na degradação e inativação do peptídeo antimicrobiano LL-37

Leptospiras são bactérias espiroquetas com grande capacidade invasiva, dotadas de estratégias eficientes para disseminação no hospedeiro. Recentemente, nosso grupo demonstrou que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano. Neste projeto pretende-se ampliar o leque de investigação de possíveis alvos das proteases secretadas por leptospiras patogênicas. O novo alvo a ser estudado é a catelicidina humana (LL-37), um peptídeo antimicrobiano que possui 37 aminoácidos, cuja proteína precursora é denominada hCAP18, devido à sua massa molecular de 18 kDa. Peptídeos antimicrobianos são moléculas pequenas, solúveis, que desempenham um papel importante na resposta imune inata. Porém, alguns patógenos de importância médica conseguem sobreviver à ação dessas moléculas através de mecanismos de resistência. Dentro deste contexto, este estudo tem como objetivo avaliar a atividade de proteases secretadas por estirpes patogênicas, virulentas ou atenuadas em cultura, bem como por estirpes saprófitas da bactéria Leptospira quanto à capacidade de degradar o peptídeo antimicrobiano LL-37. Os resultados apontam a existência de proteases presentes nos sobrenadantes das estirpes patogênicas capazes de degradar o LL-37 de forma tempo-dependente, fato não observado com os sobrenadantes das estirpes saprófitas. Ensaios subsequentes realizados com inibidores de proteases demonstraram que a atividade proteolítica dos sobrenadantes é impossibilitada com o uso do inibidor 1,10-fenantrolina, sugerindo assim que tais proteases pertençam à classe das metaloproteases. De posse desta informação, avaliamos a atividade de duas metaloproteases recombinantes candidatas, a termolisina (codificada pela LIC13322) e a papalisina, secretadas por estirpes patogênicas de Leptospira. Entretanto, o peptídeo foi resistente à ação proteolítica de ambas, e o envolvimento destas metaloproteases neste processo foi descartado. Além disto, a atividade antibacteriana do LL-37 foi avaliada frente a duas estirpes de Leptospira. Os achados apontaram uma maior resistência da estirpe patogênica à ação peptídeo quando comparado à estirpe saprófita. Nossos dados sugerem que a secreção de proteases por estirpes patogênicas pode integrar o arsenal de virulência dessas espiroquetas, tendo em vista que tais proteases foram capazes de inativar a catelicidina humana nos ensaios realizados. Acredita-se que a caracterização de mecanismos relacionados à patogênese da bactéria Leptospira possam, eventualmente, contribuir para o futuro desenvolvimento de estratégias terapêuticas e/ou preventivas que interferiram no processo de invasão e destruição tecidual observados na leptospirose.

Leptospires are highly invasive spirochetes equipped with efficient strategies for dissemination in the host. Recently, our group demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system. This project aims to broaden the scope of investigation of possible targets of proteases secreted by pathogenic leptospires. The new target to be studied is human cathelicidin (LL-37), an antimicrobial peptide that has 37 amino acids, whose precursor protein is called hCAP18, because of its molecular mass of 18 kDa. Antimicrobial peptides are small, soluble molecules that play an important role in the innate immune response. However, some pathogens of medical importance can survive the action of these molecules through mechanisms of resistance. In this context, this study aims to evaluate the activity of proteases secreted by pathogenic, and saprophytic Leptospira strains with regard to their ability to degrade the antimicrobial peptide LL-37. The results obtained so far point to the existence of proteases present in the supernatants of pathogenic strains capable of degrading LL-37 in a time-dependent manner, a fact not observed with the supernatants of the saprophytic strains. Subsequent assays performed with protease inhibitors demonstrated that the proteolytic activity of the supernatants is prevented by the use of the 1,10-phenanthroline inhibitor, thus suggesting that such proteases belong to the class of metalloproteases. Based on this information, we evaluated the activity of two candidate recombinant metalloproteases, thermolysin (encoded by LIC13322) and pappalysin, both secreted by pathogenic Leptospira strains. However, the peptide proved to be resistant to the proteolytic action of both, thus ruling out the involvement of these metalloproteases in this process. In addition, the antibacterial activity of LL-37 was evaluated against two Leptospira strains. Our findings showed a greater resistance of the pathogenic strain to the peptide action when compared to the saprophytic strain. Our data suggest that the secretion of proteases by pathogenic strains can integrate the virulence arsenal of these spirochetes, considering that such proteases were able to inactivate human cathelicidin in the assays performed. It is believed that the characterization of mechanisms related to the pathogenesis of Leptospira may eventually contribute to the future development of therapeutic and / or preventive strategies that may interfere in the process of invasion and tissue destruction observed in leptospirosis.

Interaction of antimicrobial peptide Plantaricin149a and four analogs with lipid bilayers and bacterial membranes

The amidated analog of Plantaricin149, an antimicrobial peptide from Lactobacillus plantarum NRIC 149, directly interacts with negatively charged liposomes and bacterial membranes, leading to their lysis. In this study, four Pln149-analogs were synthesized with different hydrophobic groups at their N-terminus with the goal of evaluating the effect of the modifications at this region in the peptide's antimicrobial properties. The interaction of these peptides with membrane models, surface activity, their hemolytic effect on red blood cells, and antibacterial activity against microorganisms were evaluated. The analogs presented similar action of Plantaricin149a; three of them with no hemolytic effect ( 5%) until 0.5 mM, in addition to the induction of a helical element when binding to negative liposomes. The N-terminus difference between the analogs and Plantaricin149a retained the antibacterial effect on S. aureus and P. aeruginosa for all peptides (MIC50 of 19 µM and 155 µM to Plantaricin149a, respectively) but resulted in a different mechanism of action against the microorganisms, that was bactericidal for Plantaricin149a and bacteriostatic for the analogs. This difference was confirmed by a reduction in leakage action for the analogs. The lytic activity of Plantaricin149a is suggested to be a result of the peptide-lipid interactions from the amphipathic helix and the hydrophobic residues at the N-terminus of the antimicrobial peptide.

Interaction of antimicrobial peptide Plantaricin149a and four analogs with lipid bilayers and bacterial membranes

The amidated analog of Plantaricin149, an antimicrobial peptide from Lactobacillus plantarum NRIC 149, directly interacts with negatively charged liposomes and bacterial membranes, leading to their lysis. In this study, four Pln149-analogs were synthesized with different hydrophobic groups at their N-terminus with the goal of evaluating the effect of the modifications at this region in the peptide's antimicrobial properties. The interaction of these peptides with membrane models, surface activity, their hemolytic effect on red blood cells, and antibacterial activity against microorganisms were evaluated. The analogs presented similar action of Plantaricin149a; three of them with no hemolytic effect ( 5%) until 0.5 mM, in addition to the induction of a helical element when binding to negative liposomes. The N-terminus difference between the analogs and Plantaricin149a retained the antibacterial effect on S. aureus and P. aeruginosa for all peptides (MIC50 of 19 µM and 155 µM to Plantaricin149a, respectively) but resulted in a different mechanism of action against the microorganisms, that was bactericidal for Plantaricin149a and bacteriostatic for the analogs. This difference was confirmed by a reduction in leakage action for the analogs. The lytic activity of Plantaricin149a is suggested to be a result of the peptide-lipid interactions from the amphipathic helix and the hydrophobic residues at the N-terminus of the antimicrobial peptide.