Studies on the recombinant production and anticancer activity of thermostable L- asparaginase I from Pyrococcus abyssi / Estudos sobre a produção recombinante e atividade anticancerígena da L asparaginase I termoestável de Pyrococcus abyssi

L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G – 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.

A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G – 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.

Studies on the recombinant production and anticancer activity of thermostable L- asparaginase I from Pyrococcus abyssi

Abstract L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.

Resumo A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.

Studies on the recombinant production and anticancer activity of thermostable L- asparaginase I from Pyrococcus abyssi / Estudos sobre a produção recombinante e atividade anticancerígena da L asparaginase I termoestável de Pyrococcus abyssi

L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.(AU)

A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.(AU)

Studies on the recombinant production and anticancer activity of thermostable L- asparaginase I from Pyrococcus abyssi / Estudos sobre a produção recombinante e atividade anticancerígena da L-asparaginase I termoestável de Pyrococcus abyssi

L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G ­ 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.

A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G ­ 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.

Current applications and different approaches for microbial L-asparaginase production

ABSTRACT L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is an enzyme that catalysis mainly the asparagine hydrolysis in L-aspartic acid and ammonium. This enzyme is presented in different organisms, such as microorganisms, vegetal, and some animals, including certain rodent's serum, but not unveiled in humans. It can be used as important chemotherapeutic agent for the treatment of a variety of lymphoproliferative disorders and lymphomas (particularly acute lymphoblastic leukemia (ALL) and Hodgkin's lymphoma), and has been a pivotal agent in chemotherapy protocols from around 30 years. Also, other important application is in food industry, by using the properties of this enzyme to reduce acrylamide levels in commercial fried foods, maintaining their characteristics (color, flavor, texture, security, etc.) Actually, L-asparaginase catalyzes the hydrolysis of L-asparagine, not allowing the reaction of reducing sugars with this aminoacid for the generation of acrylamide. Currently, production of L-asparaginase is mainly based in biotechnological production by using some bacteria. However, industrial production also needs research work aiming to obtain better production yields, as well as novel process by applying different microorganisms to increase the range of applications of the produced enzyme. Within this context, this mini-review presents L-asparaginase applications, production by different microorganisms and some limitations, current investigations, as well as some challenges to be achieved for profitable industrial production.

Current applications and different approaches for microbial L-asparaginase production

L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is an enzyme that catalysis mainly the asparagine hydrolysis in L-aspartic acid and ammonium. This enzyme is presented in different organisms, such as microorganisms, vegetal, and some animals, including certain rodent's serum, but not unveiled in humans. It can be used as important chemotherapeutic agent for the treatment of a variety of lymphoproliferative disorders and lymphomas (particularly acute lymphoblastic leukemia (ALL) and Hodgkin's lymphoma), and has been a pivotal agent in chemotherapy protocols from around 30 years. Also, other important application is in food industry, by using the properties of this enzyme to reduce acrylamide levels in commercial fried foods, maintaining their characteristics (color, flavor, texture, security, etc.) Actually, L-asparaginase catalyzes the hydrolysis of L-asparagine, not allowing the reaction of reducing sugars with this aminoacid for the generation of acrylamide. Currently, production of L-asparaginase is mainly based in biotechnological production by using some bacteria. However, industrial production also needs research work aiming to obtain better production yields, as well as novel process by applying different microorganisms to increase the range of applications of the produced enzyme. Within this context, this mini-review presents L-asparaginase applications, production by different microorganisms and some limitations, current investigations, as well as some challenges to be achieved for profitable industrial production.(AU)

PRODUÇÃO DE L-ASPARAGINASE E DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Mandevilla catimbauensis (APOCYNACEAE) DO PARQUE NACIONAL DO VALE DO CATIMBAU

A Caatinga, região exclusivamente brasileira, possui 47 unidades de conservação, entre estas, o Parque Nacional do Vale do Catimbau. O Parque é composto por inúmeras espécies endêmicas, entre elas, Mandevilla catimbauensis, uma espécie rara, pertencente à família Apocynaceae, e que está classificada como vulnerável à extinção. Os fungos endofíticos vivem no interior dos vegetais, sem lhes causar danos. Alguns endófitos possuem potencial para produzir substâncias bioativas como a enzima L-asparaginase. A L-asparaginase é utilizada no tratamento de diversos cânceres em humanos e outros animais. É também utilizada na indústria alimentícia para redução dos níveis de acrilamida dos alimentos. Pequisadores buscam fontes eucarióticas capazes de produzir L-asparaginase com menores efeitos colaterais. O objetivo desse estudo foi estimar a diversidade de fungos endofíticos presentes em M. catimbauensis e avaliar o potencial biotecnológico desses fungos na produção de L-asparaginase. Um total de 66 isolados foram obtidos e, a taxa de colonização dos fragmentos foi de 11,78%. As análises filogenéticas utilizando sequências de ITS e/ou LSU do DNAr revelaram a presença de sete ordens do filo Ascomycota. Um total de 18 táxons foi identificados. Os endófitos mais fequentemente isolados foram membros do gênero Phyllosticta (45,10%). A curva de acumulação de espécies não alcançou o ponto de estabilização. Uma nova espécie do gênero Phyllosticta foi descoberta, descrita e publicada como Phyllosticta catimbauensis. A produção de L-asparaginase foi estudada por 20 isolados. Um total de 14 fungos apresentou capacidade de produzir a enzima (0,48 U g-1 2,22 U g-1). A espécie P. catimbauensis exibiu capacidade significativa, e foi selecionada para realizar um planejamento fatorial 23. A melhor produção enzimática foi 2,25 U g-1, utilizando 1,5 g de L-asparagina, pH 5 e 1,5 g inóculo. Posteriormente, uma sequência experimental foi realizada e foi possível obter um aumento significativo na produção de L-asparaginase de 3,50 U g-1, utilizando 3,5 g de L-asparagina, pH 4,2 e 1 g de inóculo. Esse é o primeiro estudo sobre os fungos endofíticos de M. catimbauensis e também da produção de L-asparaginase por esses fungos. Essa pesquisa, poderá contribuir com o conhecimento da comunidade fúngica presente em M. catimbaunensis, além de auxiliar futuros estudos sobre a produção enzimática desses endófitos.

The Caatinga, an exclusively Brazilian region, has 47 conservation units, among them, the Catimbau Valley National Park. The park is compound of numerous endemic species, including Mandevilla catimbauensis, a rare species belonging to the family Apocynaceae, which is classified as vulnerable to extinction. Endophytic fungi live inside the plants without causing them harm. Some endophytes have the potential to produce bioactive substances like the enzyme L-asparaginase. L-asparaginase is used to treatment various cancers in humans and other animals. It is also used in the food industry to reduce the levels of acrylamide in food. Researchers pursue for eukaryotic sources capable of producing L-asparaginase with lower side effects. The aim of this study was to estimate the diversity of endophytic fungi present in M. catimbauensis and to evaluate the biotechnological potential of these fungi in the production of L-asparaginase. A total of 66 isolates were obtained and the rate of colonization of the fragments was 11.78%. Phylogenetic analyzes using ITS and / or LSU sequences of rDNA revealed the presence of seven orders of the Ascomycota phylum. A total of 18 taxa were identified. The most commonly isolated endophytes were members of the genus Phyllosticta (45.10%). The curve of species accumulation did not reach the point of stabilization. A new species of the genus Phyllosticta was discovered, described and published as Phyllosticta catimbauensis. The production of L-asparaginase was studied by 20 isolates. A total of 14 fungi were efficient to produce the enzyme (0,48 U g-1 2,22 U g-1). The species P. catimbauensis exhibited significant capacity and was selected to perform a factorial design 23. The best enzymatic production was 2,25 U g-1, using 1,5 g of L-asparagine, pH 5 and 1,5 g inoculum . Subsequently, an experimental sequence was performed and a significant increase in L-asparaginase production of 3,50 U g-1 was obtained using 3,5 g of L-asparagine, pH 4,2 and 1 g of inoculum. This is the first study on the endophytic fungi of M. catimbauensis and also on the production of L-asparaginase by these fungi. This research may contribute to the knowledge of the fungal community present in M. catimbaunensis, besides helping future studies on the enzymatic production of these endophytes.

Production, purification and characterization of L-asparaginase from Streptomyces gulbargensis

L-asparaginase is an anti-neoplastic agent used in the lymphoblastic leukaemia chemotherapy. In the present study a novel strain, Streptomyces gulbargensis was explored for the production of extra-cellular L-asparaginase using groundnut cake extract. The optimum pH, temperature, inoculum size and agitation speed for enzyme production were pH 8.5, 40ºC, 1x10(8)spores/ml and 200 rev/min respectively. Maltose (0.5%) and L-asparagine (0.5%) proved to be the best carbon and nitrogen sources respectively. The enzyme was purified 82.12 fold and the apparent molecular weight of the enzyme was found to be 85 kDa. The optima pH and temperature for the enzyme were 9.0 and 40ºC respectively. The enzyme was more stable at the alkaline pH than at the acidic one and it retained 55% of the activity at 80ºC for 60 min.

Uso de matérias primas da agroindústria: garapa e extrato de levedura: na produção de asparaginase por Zymomonas mobilis CP4 / Utilization of raw materials from agroindustry: sugar cane juice and yeast extract: for asparaginase production by Zymomonas mobilis CP4

Garapa e extrato de levedura foram usados na produção de asparaginase por Zymomonas mobilis CP4. Na otimização utilizou metodologia de superfície de resposta com 2 variáveis (extrato de levedura e asparagina) em 3 níveis (1,0; 5,5 e 10,0 g/L) e uma repetição do ponto central. A fermentação em batelada utilizou garapa diluída a 8 % (P/V) de Açúcares Totais e inóculo de Zymomonas mobilis CP4 na concentração de 2 mg/mL. Após a fermentação de 18 horas, a maior produção obtida de asparaginase foi de 9,75 U/L em extrato de levedura em 5,5 g/L e asparagina em 1,0 g/L.(AU)

Sugar cane juice and yeast extract have been used for asparaginase production by Z. mobilis CP4. A complete factorial design of two variables (yeast extract and asparagin) at three levels (1.0; 5.5 and 10.0 g/L) with one replication at the central point was used. Batch fermentation utilised sugar cane juice diluted at 8 % (W/V) of Total Sugars and an inoculum of 2 mg of cells/mL. After fermentation time of 18 hours, the highest production of asparaginase was 9.75 U/L using both yeast extract (5.5 g/L) and asparagin (1.0 g/l).(AU)

Asparaginase II-GFP fusion as a tool for studying the secretion of the enzyme under nitrogen starvation

Production of asparaginase II of Saccharomyces cerevisiae is regulated by nitrogen and can be used as a model system for studying other secreted proteins in yeast. Green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria was fused to the carboxy-terminus of the enzyme by genomic integration to the locus ASP3 of S. cerevisiae. We determined asparaginase II activity, mRNA ASP3, mRNA ASP3-GFP and GFP fluorescence. Nitrogen starvation in cells carrying the chimera ASP3-GFP caused an increase in fluorescence and in the expression of ASP3. We have shown that cells producing the chimera Asp3-GFPp displayed the same response to nitrogen starvation as control cells. We demonstrated that Asp3-GFPp can be used for studying asparaginase II secretion under nitrogen starvation in vivo.

A produção de asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae é regulada por nitrogênio e pode ser utilizada como um sistema modelo para estudar outras proteínas secretadas, em leveduras. A proteína "green fluorescent protein" (GFP) de Aequorea victoria foi fusionada à porção carboxi-terminal de Asp3p por integração genômica da sequência de GFP ao locus ASP3. Determinaram-se os níveis de atividade de asparaginase II, mRNA ASP3, mRNA ASP3-GFP e de fluorescência para GFP. A depleção para nitrogênio, em células portadoras do gene quimérico ASP3-GFP, fez aumentar a fluorescência, assim como a expressão de ASP3. Demonstramos que Asp3-GFPp pode ser utilizada para estudar a secreção de asparaginase II em células submetidas à privação de nitrogênio in vivo.