Response and tolerance mechanism of food crops under high temperature stress: a review

Abstract High temperature stress events are critical factors inhibiting crop yield. Meanwhile, world population is growing very rapidly and will be reached up to 9 billion by 2050. To feed increasing world population, it is challenging task to increase about 70% global food productions. Food crops have significant contribution toward global food demand and food security. However, consequences from increasing heat stress events are demolishing their abilities to survive and sustain yield when subjected to extreme high temperature stress. Therefore, there is dire need to better understand response and tolerance mechanism of food crops following exposure to heat stress. Here, we aimed to provide recent update on impact of high temperature stress on crop yield of food crops, pollination, pollinators, and novel strategies for improving tolerance of food crop under high temperature stress. Importantly, development of heat-resistant transgenic food crops can grant food security through transformation of superior genes into current germplasm, which are associated with various signaling pathways as well as epigenetic regulation in response to extreme high temperature stress.

Resumo Eventos de estresse de alta temperatura são fatores críticos que inibem o rendimento das culturas. Enquanto isso, a população mundial está crescendo muito rapidamente e atingirá até 9 bilhões em 2050. Para alimentar a crescente população mundial, é uma tarefa desafiadora aumentar cerca de 70% da produção global de alimentos. As culturas alimentares têm uma contribuição significativa para a procura global de alimentos e a segurança alimentar. No entanto, as consequências do aumento de eventos de estresse por calor estão destruindo suas habilidades de sobreviver e manter a produção quando submetidos a estresse de alta temperatura. Portanto, há uma necessidade urgente de entender melhor o mecanismo de resposta e tolerância das safras de alimentos após a exposição ao estresse por calor. Aqui, nosso objetivo foi fornecer atualizações recentes sobre o impacto do estresse de alta temperatura no rendimento de culturas de alimentos, polinização, polinizadores e novas estratégias para melhorar a tolerância de culturas de alimentos sob estresse de alta temperatura. É importante ressaltar que o desenvolvimento de culturas alimentares transgênicas resistentes ao calor pode garantir segurança alimentar por meio da transformação de genes superiores em germoplasma atual, que estão associados a várias vias de sinalização, bem como à regulação epigenética em resposta ao estresse de alta temperatura extrema.

Response and tolerance mechanism of food crops under high temperature stress: a review / Mecanismo de resposta e tolerância de culturas alimentares sob estresse de alta temperatura: uma revisão

High temperature stress events are critical factors inhibiting crop yield. Meanwhile, world population is growing very rapidly and will be reached up to 9 billion by 2050. To feed increasing world population, it is challenging task to increase about 70% global food productions. Food crops have significant contribution toward global food demand and food security. However, consequences from increasing heat stress events are demolishing their abilities to survive and sustain yield when subjected to extreme high temperature stress. Therefore, there is dire need to better understand response and tolerance mechanism of food crops following exposure to heat stress. Here, we aimed to provide recent update on impact of high temperature stress on crop yield of food crops, pollination, pollinators, and novel strategies for improving tolerance of food crop under high temperature stress. Importantly, development of heat-resistant transgenic food crops can grant food security through transformation of superior genes into current germplasm, which are associated with various signaling pathways as well as epigenetic regulation in response to extreme high temperature stress.

Eventos de estresse de alta temperatura são fatores críticos que inibem o rendimento das culturas. Enquanto isso, a população mundial está crescendo muito rapidamente e atingirá até 9 bilhões em 2050. Para alimentar a crescente população mundial, é uma tarefa desafiadora aumentar cerca de 70% da produção global de alimentos. As culturas alimentares têm uma contribuição significativa para a procura global de alimentos e a segurança alimentar. No entanto, as consequências do aumento de eventos de estresse por calor estão destruindo suas habilidades de sobreviver e manter a produção quando submetidos a estresse de alta temperatura. Portanto, há uma necessidade urgente de entender melhor o mecanismo de resposta e tolerância das safras de alimentos após a exposição ao estresse por calor. Aqui, nosso objetivo foi fornecer atualizações recentes sobre o impacto do estresse de alta temperatura no rendimento de culturas de alimentos, polinização, polinizadores e novas estratégias para melhorar a tolerância de culturas de alimentos sob estresse de alta temperatura. É importante ressaltar que o desenvolvimento de culturas alimentares transgênicas resistentes ao calor pode garantir segurança alimentar por meio da transformação de genes superiores em germoplasma atual, que estão associados a várias vias de sinalização, bem como à regulação epigenética em resposta ao estresse de alta temperatura extrema.

Determinação da Protamina 1 e Protamina 2 em touros de alta e de baixa fertilidade a campo

Os touros que são utilizados nas centrais de reprodução são considerados como normospérmicos, mas o rendimento a campo entre eles pode diferir em até 40%. Sugere-se que análises convencionais de sêmen não sejam capazes de predizer a capacidade fecundante real dos gametas, criando a necessidade de avaliar outros parâmetros que permitam identificar a fertilidade real dos touros. O status da cromatina espermática é relevante para a manutenção da fertilidade do espermatozoide, pois este carrega a informação genética paterna necessária para uma correta fertilização e o desenvolvimento embrionário subsequente. A cromatina espermática trata-se de uma estrutura composta por DNA ligada fortemente à PRM1 e PRM2. Entre os mamíferos, existe uma relação ideal (PRM1:PRM2) para uma adequada compactação do DNA espermático, caso contrário a fertilidade é comprometida. Em espermatozoides humanos e murinos, a expressão da PRM1 e PRM2 é relacionada com o nível de fertilidade. A protaminação dos espermatozoides bovinos era atribuída somente à Protamina 1 até a recente identificação da Protamina 2 em espermatozoides maduros. Portanto, este trabalho objetivou determinar as possíveis relações entre PRM1 e PRM2 em touros Nelore e Angus de diferente fertilidade a campo. Cada unidade experimental (touro) foi representada por um pool de 4 partidas diferentes e submetida ao ensaio de suscetibilidade da cromatina espermática (SCSA modificado), teste de Cromomicina A3 (CMA3) e quantificação absoluta dos transcritos para os genes PRM1, PRM2 e TNP1 por meio de qPCR. Os resultados demonstraram que não houve diferença significante entre os grupos de alta e baixa fertilidade para nenhuma das raças para as análises consideradas. Dentro do grupo dos Nelore, a quantificação absoluta do número de cópias dos transcritos da PRM1 e PRM2 permitiu estabelecer uma relação PRM1:PRM2 de 1: 0,079 para o grupo de alta fertilidade e 1: 0,007 para os de baixa fertilidade. Nos Angus, foi observado uma relação 1: 0,27 para os touros de alta fertilidade e 1: 0,016 para os de baixa. Na sequência, foi realizada uma análise de interação entre raças, na qual os ejaculados dos touros Nelore apresentaram maior número de cópias de transcritos de PRM1 (Nelore=0,986±0,39; Angus=0,052±0,012) e de células com deficiência de protaminação (Nelore=0,259 ±0,033; Angus= 0,078 ±0,019). Contraditoriamente, os ejaculados dos touros Angus apresentaram maior quantidade de espermatozoides com suscetibilidade à fragmentação (Nelore=0,338±0,292; Angus= 1,7505±0,185). Foi observada uma relação entre PRM1:PRM2 de 1: 0,074 para os ejaculados dos touros Nelore e 1: 0,23 para os Angus. Os resultados observados neste trabalho não permitiram explicar a diferença de fertilidade entre touros de diferentes raças agrupados por fertilidade; no entanto, foram observadas diferenças na relação de transcritos de protamina (PRM1 e 2) nos espermatozoides de touros Nelore e Angus, que podem refletir no aparecimento de células com deficiência de protaminação e mais susceptíveis à fragmentação de DNA.

Bulls that are used in breeding centers are considered normospermic, despite the fertility rates can differ up to 40%. It is suggested that conventional semen analyzes are not able to predict the real fertilizing capacity of the spermatozoa, creating the need to evaluate other parameters that allow the identification of fertile bulls. The status of sperm chromatin is relevant for the maintenance of sperm fertility, as it carries the paternal genetic information, which is necessary for correct fertilization and subsequent embryonic development. Sperm chromatin is a structure composed of DNA tightly bound to PRM1 and PRM2. Among mammals, there is an ideal ratio (PRM1:PRM2) for an adequate compaction of sperm DNA, otherwise fertility is compromised. In human and murine sperm, the expression of PRM1 and PRM2 is related to the level of fertility. Protamine in bovine sperm was attributed only to Protamine 1 until the recent identification of Protamine 2 in mature sperm. Therefore, this work aimed to determine the possible relationships between PRM1 and PRM2 in Nellore and Angus bulls of different sire conception rates (SCR). Each experimental unit (bull) was represented by a "pool" of 4 different batches and submitted to the sperm chromatin susceptibility test (SCSA adapted), Chromomycin A3 analysis (CMA3) and absolute quantification of transcripts for PRM1, PRM2 and TNP1 genes through qPCR. High and low fertility groups were similar (p> 0,05) for all analysis considered, regardless of breed. Within the Nellore group, the absolute quantification of the copy number of the PRM1 and PRM2 transcripts allowed us to establish a PRM1:PRM2 ratio of 1:0.079 for the high fertility group and 1:0.007 for the low fertility group. In Angus, a ratio of 1:0.27 was observed for bulls with high fertility and 1:0.016 for the low fertility. Also, an interaction analysis between breeds was performed, in which the ejaculates of Nellore bulls had a higher number of copies of PRM1 transcripts (Nellore=0.986±0.396; Angus=0.052±0.012) and more cells with protamine deficiency (Nellore =0.259 ±0.033; Angus=0.078 ±0.019). In contrast, the ejaculates of Angus bulls had a greater amount of sperm with susceptibility to fragmentation (Nellore=0.338 ±0.292; Angus= 1.7505±0.185). A relationship between PRM1:PRM2 of 1:0.074 for the ejaculates from Nellore bulls and 1:0.23 from Angus bulls was observed. The results from this work could not explain the difference in fertility between bulls of different breeds grouped by fertility rate; however, we observed differences in the ratio of protamine transcripts (PRM1 and 2) in spermatozoa from Nellore and Angus bulls, which could reflect in the appearance of cells with protamine deficiency and more susceptible to DNA fragmentation.

Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls / Deficiências de protaminação e danos de DNA no sêmen de um touro Nelore com elevada porcentagem de patologias espermáticas em comparação a touros normospérmicos

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.(AU)

O exame de rotina de sêmen, o qual avalia a concentração de espermatozoides, a motilidade e a morfologia, pode não identificar defeitos sutis na arquitetura da cromatina de espermatozoides. Os touros parecem ter cromatina estável com baixos níveis de fragmentação do DNA. No entanto, a natureza da fragmentação e o seu impacto sobre a fertilidade ainda não estão claros e não há relatos que caracterizam a organização do DNA e os danos nessa espécie com mais detalhes. A seleção genética intensiva e o uso da inseminação artificial e da produção in vitro de embriões, além do processo de criopreservação, podem contribuir para o dano da cromatina, e sabe-se a importância da integridade do DNA espermático para o sucesso dessas tecnologias. Amostras de sêmen de três ejaculados de um touro Nelore com altos níveis de alterações morfológicas (55,8±5,1%) foram selecionadas para realização de exames complementares. Os danos de acrossoma (76,9±8,9%) e das membranas plasmáticas (75,7±9,3%), bem como quebras de fita de DNA de espermatozoides (13,8±9,5) e deficiência de protamina (3,7±0,6) foram significativamente maiores em comparação aos valores avaliados no sêmen de cinco touros Nelore com normospermia (24,3±3,3%; 24,5±6,1%; 0,6±0,5%; 0,4±0,6% para acrossoma, membrana plasmática, quebras de DNA e deficiência de protamina, respectivamente) (p<0,05). Motilidade e porcentagem de espermatozoides com baixo potencial mitocondrial não diferiram estatisticamente. Essas avaliações mostram que análises de sêmen de rotina (neste caso, morfologia) podem apontar para a extensão e a complexidade dos danos na célula espermática, o que indica que a deficiência de protamina e os danos no DNA podem ocorrer simultaneamente a defeitos morfológicos. Tal ocorrência enfatiza a importância das análises de sêmen clássicas e dos testes complementares.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.(AU)

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.(AU)

Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls / Deficiências de protaminação e danos de DNA no sêmen de um touro Nelore com elevada porcentagem de patologias espermáticas em comparação a touros normospérmicos

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.(AU)

O exame de rotina de sêmen, o qual avalia a concentração de espermatozoides, a motilidade e a morfologia, pode não identificar defeitos sutis na arquitetura da cromatina de espermatozoides. Os touros parecem ter cromatina estável com baixos níveis de fragmentação do DNA. No entanto, a natureza da fragmentação e o seu impacto sobre a fertilidade ainda não estão claros e não há relatos que caracterizam a organização do DNA e os danos nessa espécie com mais detalhes. A seleção genética intensiva e o uso da inseminação artificial e da produção in vitro de embriões, além do processo de criopreservação, podem contribuir para o dano da cromatina, e sabe-se a importância da integridade do DNA espermático para o sucesso dessas tecnologias. Amostras de sêmen de três ejaculados de um touro Nelore com altos níveis de alterações morfológicas (55,8±5,1%) foram selecionadas para realização de exames complementares. Os danos de acrossoma (76,9±8,9%) e das membranas plasmáticas (75,7±9,3%), bem como quebras de fita de DNA de espermatozoides (13,8±9,5) e deficiência de protamina (3,7±0,6) foram significativamente maiores em comparação aos valores avaliados no sêmen de cinco touros Nelore com normospermia (24,3±3,3%; 24,5±6,1%; 0,6±0,5%; 0,4±0,6% para acrossoma, membrana plasmática, quebras de DNA e deficiência de protamina, respectivamente) (p<0,05). Motilidade e porcentagem de espermatozoides com baixo potencial mitocondrial não diferiram estatisticamente. Essas avaliações mostram que análises de sêmen de rotina (neste caso, morfologia) podem apontar para a extensão e a complexidade dos danos na célula espermática, o que indica que a deficiência de protamina e os danos no DNA podem ocorrer simultaneamente a defeitos morfológicos. Tal ocorrência enfatiza a importância das análises de sêmen clássicas e dos testes complementares.(AU)

Investigando a compactação e a fragmentação não induzida do DNA espermático: refinamento da avaliação espermática – parte 1 / Investigating condensation and not induced fragmentation of sperm DNA: Refinement of sperm evaluation – first part

O DNA espermático possui papel essencial na reprodução, visto que danos no material genético podemprejudicar os processos de fecundação e desenvolvimento embrionário. Ademais, há evidências de que danos aoDNA podem ser causados por alterações epigenéticas. Entretanto, embora ainda não seja aplicada nas avaliaçõesandrológicas de rotina, faz-se essencial a avaliação do status de integridade do DNA espermático. Existemdiversas técnicas de avaliação com diferentes princípios e objetivos. A aplicação destas irá depender dosequipamentos disponíveis, do treinamento da equipe e das respostas a serem obtidas. Ainda, para a interpretaçãodos resultados obtidos, é necessário o conhecimento do princípio de análise de cada técnica. Assim, a presenterevisão, dividida em duas partes, tem por objetivo abordar diferentes técnicas de avaliação. As técnicasabordadas na parte 1 estão relacionadas às avaliações de compactação da cromatina (azul de toluidina, azul deanilina e cromomicina A3) e à avaliação direta da fragmentação de DNA (ensaio Cometa e teste de dispersão dacromatina modificado). Na parte 2, serão abordadas as técnicas de TUNEL, laranja de acridina e “SpermChromatin Structure Assay” (SCSA). Nesta revisão, serão abordados os princípios dos testes e a interpretaçãodos resultados baseados na literatura e nas pesquisas do grupo.

Sperm DNA has an important role on reproduction. Injuries in genetic material can impair thefertilization processes and embryonic development. Furthermore, there is evidence that DNA damage can becaused by epigenetic alterations. Although DNA evaluation in sperm analysis routine assessments is essential, itis not yet performed. There are numerous techniques of DNA evaluation with different principles and objectives.Application of these techniques will depend on the equipment available, the staff training and answers to berequired. To interpret the results, however, knowledge of each analysis technique is required. Therefore, thisreview, divided in two parts, aims to consider different techniques. The techniques that will be consideredthroughout the first part of review are: toluidine blue, aniline blue, A3 chromomycyn, Comet assay anddispersion test of modified chromatin. In the second part, it will be approached TUNEL, acridine orange andSperm Chromatin Structure Assay (SCSA) techniques. We will discuss the testes and the main results based onliterature and researches of our group.

ESTUDO ULTRASSONOGRÁFICO DA PERFUSÃO RENAL EM CADELAS COM CARCINOMA MAMÁRIO TRATADAS COM CARPROFENO POR LONGOS PERÍODOS

A córnea atua como principal elemento refrativo do olho, para tal tem que manter-se transparente. O endotélio corneal é um peça chave para essa manutenção, possuindo mecanismos como a bomba de Na+ e K+ que ajudam a garantir a desturgescência corneal. Descompensações endoteliais constituem uma importante indicação de transplante da córnea, uma vez que as células endoteliais corneais apresentam limitada capacidade proliferativa. Entretanto, transplantes são procedimentos cirúrgicos complicados e de elevado custo. Alternativas e coadjuvantes medicamentosos vêm sendo estudadas. O fucoidam é uma substância que, dentre outras propriedades, promove migração e proliferação celular, portanto objetivou-se, com a presente pesquisa, avaliar seus efeitos sobre a morfologia, a ploidia e o metabolismo de células endoteliais da córnea de coelhos, após criolesão experimental. Para tal, foram realizadas avaliações quanto à morfologia e viabilidade celular empregando-se dupla marcação com corantes vitais (alizarina vermelha e azul de tripan) e ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Outrossim, avaliou-se a morfometria in vivo e in vitro de seguintes parâmetros: número de células, densidade, hexagonalidade e coeficiente de variação celulares. Estudou- se o metabolismo dessas células empregando-se a imunofluorescência com observação em confocal dos anticorpos Ki-67, Na+K+/ATPase, n-Caderina e Zo-1, conjugados com Alexafluor-488. Visando-se a conseguirem conhecimentos adicionais relativos à atividade nuclear durante o processo de cicatrização do endotélio corneal na presença de fucoidam foram analisados, a partir da reação de feulgen, perímetro e área nucleares, além da supraorganização da cromatina. A criolesão ensejou piora de todos parâmetros morfométricos, com diminuição das células, densidade celular, do percentagem de células padrão com 6 lados e aumento no coeficiente de variação, a retomada aos valores normais com o decorrer do tempo foi melhor em olhos tratados com fucoidam. Nas córneas que não receberam fucoidam observou-se células desvitalizadas em todo decorer do tempo de avaliação. Houve diminuição da expressão das proteínas de junção celular (n-Caderina e Zo-1) logo após a lesão e aumento progressivo no decorrer do tempo, em contrapartida o contrário ocorreu com Ki-67, revelando aumento na proliferação celular após lesão e baixa das expressão das demais proteínas, com notável estimulação na presença do fucoidam. As características do comportamento nuclear, como descompactação da cromatina na presença do fucoidam puderam ratificar essa proliferação. O fucoidam atuou na modulação à reparação cicatricial, revelando cicatrizes menos opacas, estimulando a proliferação celular e mediando a expressão das proteínas de ligação e atuando na proteção contra morte celular.

The cornea as the main refractive element of the eye, which has to remain transparent. The corneal endothelium is a key piece for this maintenance, having mechanisms such as the Na + and K + pump that help to ensure corneal dysurgescence. Endothelial decompensations are an important indication for corneal transplantation, since the corneal endothelial cells have limited proliferative capacity. However, transplants are complicated and expensive surgical procedures. Alternatives and drug coadjuvants have been studied. Fucoidam is a substance that, among other properties, promotes cell migration and proliferation, therefore, the objective of this research was to evaluate its effects on the morphology, ploidy and metabolism of rabbit cornea endothelial cells after experimental cryoinjury. For this, evaluations were made for morphology and cell viability using double labeling with vital dye (alizarin red and tripan blue) and ultrastructural analysis by transmission and scanning electron microscopy. Morphometry (in vivo and in vitro) of the following parameters were also evaluated: cell number, cell density, hexagonality and coefficient of variation. The metabolism of these cells was studied using immunofluorescence with confocal observation of the Ki-67, Na + K + / ATPase, n- Caderin and Zo-1 antibodies, conjugated to Alexafluor-488. In order to obtain additional knowledge regarding the nuclear activity during the healing process of the corneal endothelium in the presence of fucoidam were analyzed, from the feulgen reaction, nuclear perimeter and area, in addition to the chromatin supraorganization. Cryoinjury resulted in worsening of all morphometric parameters, with cell decrease, cell density, the percentage of standard cells with 6 sides and increase in coefficient of variation, the recovery to normal values with time was better in eyes treated with fucoidam. In the corneas that did not receive fucoidam devitalised cells were observed throughout the evaluation time. There was a decrease in the expression of the cellular junction proteins (n-Caderin and Zo-1) shortly after injury and progressive increase over time, whereas the opposite occurred with Ki-67, revealing increased cell proliferation after injury and low expression of the other proteins, with remarkable stimulation in the presence of fucoidam. The characteristics of nuclear behavior, such as the decomposition of chromatin in the presence of fucoidam, could confirm this proliferation. Fucoidam has been involved in modulation of scar repair, revealing less opaque scars, stimulating cell proliferation and mediating the expression of binding proteins, and acting to protect against cell death.

Cytochemical study of Rhodnius neglectus and Rhodnius prolixus salivary gland cells (Hemiptera, Triatominae) / Estudo citoquímico de células da glândula salivar de Rhodnius neglectus e Rhodnius prolixus (Hemiptera, Triatominae)

Triatomines are hematophagous bugs of medical interest in South and Central America, where they may act as invertebrate hosts of the hemoflagellate protozoa Trypanosoma cruzi (the causative of Chagas disease) and Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920). Triatomines of Rhodnius genus have salivary gland formed by two close and independent units: the principal and the accessory. This gland secretes saliva that abounds in substances that facilitate and permit feeding. Despite this importance, there are few reports on its cytochemistry. In purpose of amplifying this understanding, in this work it was investigated the nuclear structures (chromatin and nucleolar corpuscles) of salivary gland cells of Rhodnius neglectus (Lent, 1954) and Rhodnius prolixus (Stål, 1859). The salivary glands were removed from adult insects, fixed and submitted to different cytochemical methods: lacto-acetic orcein, silver ion impregnation, Feulgen reaction, Toluidine Blue, Variant method of critical electrolyte concentration and C-banding. The results evidenced predominance of binucleated cells, with bulky and polyploid nucleus, decondensed chromatin and a large nucleolar area. In addition, cytoplasmic metachromasy and a clear association between nucleolar and heterochromatic corpuscles were observed. Such characteristics were associated with intense synthesis activity to produce saliva. Besides, the heterochromatic corpuscles observed with C Banding permitted the differentiation of sexes and species.(AU)

Os triatomíneos são insetos hematófagos que apresentam interesse médico nas América do Sul e Central por serem hospedeiros invertebrados dos protozoários hemoflagelados Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas) e Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920). Os triatomíneos do gênero Rhodnius possuem glândula salivar formada por duas unidades próximas e independentes: a principal e a acessória. Esta glândula secreta uma saliva que contém substâncias que facilitam e permitem a hematofagia. Entretanto, apesar da sua importância, poucos estudos realizaram sua análise citoquímica. No propósito de ampliar esse entendimento, neste trabalho foram investigadas as estruturas nucleares (cromatina e corpúsculos nucleolares) das células da glândula salivar de Rhodnius neglectus (Lent, 1954) e Rhodnius prolixus (Stål, 1859). As glândulas foram removidas de insetos adultos, fixadas e submetidas a diferentes métodos citoquímicos: Orceína Lacto-Acética, Impregnação por Íons de Prata, Reação de Feulgen, Azul de Toluidina, Variante da Concentração Eletrolítica Crítica e Bandamento C. Os resultados evidenciaram predomínio de células binucleadas, com núcleos volumosos e poliplóides, cromatina descondensada e uma grande área nucleolar. Além disso, foi observada metacromasia citoplasmática e uma clara associação entre os corpúsculos nucleolares e heterocromáticos. Tais características foram associadas às atividades de intensa síntese proteica para a produção de saliva. Além disso, os corpúsculos heterocromáticos observados no Bandamento C permitiram a diferenciação dos sexos e das espécies.(AU)

Cytochemical study of Rhodnius neglectus and Rhodnius prolixus salivary gland cells (Hemiptera, Triatominae) / Estudo citoquímico de células da glândula salivar de Rhodnius neglectus e Rhodnius prolixus (Hemiptera, Triatominae)

Triatomines are hematophagous bugs of medical interest in South and Central America, where they may act as invertebrate hosts of the hemoflagellate protozoa Trypanosoma cruzi (the causative of Chagas’ disease) and Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920). Triatomines of Rhodnius genus have salivary gland formed by two close and independent units: the principal and the accessory. This gland secretes saliva that abounds in substances that facilitate and permit feeding. Despite this importance, there are few reports on its cytochemistry. In purpose of amplifying this understanding, in this work it was investigated the nuclear structures (chromatin and nucleolar corpuscles) of salivary gland cells of Rhodnius neglectus (Lent, 1954) and Rhodnius prolixus (Stål, 1859). The salivary glands were removed from adult insects, fixed and submitted to different cytochemical methods: lacto-acetic orcein, silver ion impregnation, Feulgen reaction, Toluidine Blue, Variant method of critical electrolyte concentration and C-banding. The results evidenced predominance of binucleated cells, with bulky and polyploid nucleus, decondensed chromatin and a large nucleolar area. In addition, cytoplasmic metachromasy and a clear association between nucleolar and heterochromatic corpuscles were observed. Such characteristics were associated with intense synthesis activity to produce saliva. Besides, the heterochromatic corpuscles observed with C Banding permitted the differentiation of sexes and species.

Os triatomíneos são insetos hematófagos que apresentam interesse médico nas América do Sul e Central por serem hospedeiros invertebrados dos protozoários hemoflagelados Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas) e Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920). Os triatomíneos do gênero Rhodnius possuem glândula salivar formada por duas unidades próximas e independentes: a principal e a acessória. Esta glândula secreta uma saliva que contém substâncias que facilitam e permitem a hematofagia. Entretanto, apesar da sua importância, poucos estudos realizaram sua análise citoquímica. No propósito de ampliar esse entendimento, neste trabalho foram investigadas as estruturas nucleares (cromatina e corpúsculos nucleolares) das células da glândula salivar de Rhodnius neglectus (Lent, 1954) e Rhodnius prolixus (Stål, 1859). As glândulas foram removidas de insetos adultos, fixadas e submetidas a diferentes métodos citoquímicos: Orceína Lacto-Acética, Impregnação por Íons de Prata, Reação de Feulgen, Azul de Toluidina, Variante da Concentração Eletrolítica Crítica e Bandamento C. Os resultados evidenciaram predomínio de células binucleadas, com núcleos volumosos e poliplóides, cromatina descondensada e uma grande área nucleolar. Além disso, foi observada metacromasia citoplasmática e uma clara associação entre os corpúsculos nucleolares e heterocromáticos. Tais características foram associadas às atividades de intensa síntese proteica para a produção de saliva. Além disso, os corpúsculos heterocromáticos observados no Bandamento C permitiram a diferenciação dos sexos e das espécies.

Cromatina espermática: quebrando paradigmas / Sperm chromatin: breaking paradigms

Há algumas décadas, pensava-se que espermatozoides maduros possuíssem uma cromatina não funcional, inerte, sem a capacidade de transcrição. Acreditava-se que a matriz nuclear não existisse e que a presença de histonas no núcleo seria um erro no processo de compactação cromatínica, o que poderia interferir na fertilidade do macho. Hoje se sabe que, entre as estruturas toroidais, unidades básicas da cromatina espermática altamente compactada, há algumas poucas regiões que contêm sequências de nucleossomos, e estas geralmente estão anexadas a uma matriz nuclear proteica. Os espermatozoides possuem cromatina altamente organizada e são condutores metabolicamente funcionais do genoma masculino, carreando RNAs de diferentes tipos, os quais, tanto quanto os nucleossomos, são importantes sinalizadores epigenéticos paternos e, logo,influenciam o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, alterações cromatínicas podem não somente interferir no processo de fecundação, como principalmente no desenvolvimento embrionário, o que reforça a necessidade da análise da cromatina na avaliação de reprodutores machos.(AU)

Decades ago, it was thought thatspermatozoa had a chromatin nonfunctional, inert, without the abilityto transcription. It was believed in the absence of nuclear matrix and the presence of the core histones would be an error in the chromatin packaging, which could interfere with male fertility. Today we know that between thetoroidal structures, basic units of highly compacted sperm chromatin, there are a few regions containing nucleosome sequences, these usually being attached to a nuclear protein matrix. The sperm chromatin is highly organized and is metabolically functional carrier of male genome, carrying different RNA types, which, along with the nucleosomes are important paternal epigenetic signaling, and influencing early embryonic development. Therefore, chromatin alterations not only interfere with the fertilization process, but also influencethe embryonic development, which reinforces the need for chromatin analysis in the evaluation of breeding males.(AU)

Influence of stages anestrous and diestrus in chromatin configuration in germinal vesicle of canine oocytes / Influência das fases de anestro e diestro sobre a configuração da cromatina em vesícula germinativa de oócitos caninos

In canine specie, oocyte maturation rates are low and the percentage of oocytes that remain in the stage of germinal vesicle (GV) regardless of culture conditions is high. During maturation oocyte undergoes modification and the GV chromatin remodeling manifested by changes in the configuration and positioning. The objective of this work is to evaluate the configuration and positioning of chromatin of oocytes in GV stage during anestrus and diestrus bitches. The ovaries of 33 females (20 bitches in anestrous and 13 in diestrus) were isolated, sliced and only cumulus-oocyte complexes (COCs) grade 1 were subjected to solution of 0.2% hyaluronidase for release in cumulus cells. After this process, the selected oocytes were stained and evaluated. From a total of 920 oocytes, 566 were classified as grade 1 and the stages of chromatin configuration identified as GV-1, GV-2, GV-3 and GV-4. The observed changes in chromatin configuration been characterized as a transition dispersed chromatin (GV-1, GV-2) for partially condensed (GV-3) until it reaches a fully condensed stage (GV-4). The data analyzed from the chromatin configuration showed a significant difference between the stages with a higher proportion of GV-1 and GV-2 for the anoestrus and GV-3 and GV-4 during diestrus. There is need for further studies to be able to have a proper understanding of the influence of chromatin configuration of oocytes in GV stage in resumption of meiosis and consequently in oocyte meiotic competence(AU)

Na espécie canina as taxas de maturação oocitária são baixas e a porcentagem de oócitos que permanecem em estagio de vesícula germinativa (VG), independente das condições de cultivo, e alta. Durante a maturação oocitária, a VG sofre modificação e remodelamento da cromatina, que se manifesta por alterações na sua configuração e posicionamento. Assim, o objetivo deste trabalho e avaliar a configuração e o posicionamento da cromatina de oócitos em estagio de VG durante o anestro e diestro de cadelas. Os ovários de 33 fêmeas (20 cadelas em anestro e 13 em diestro) foram isolados, fatiados e os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram submetidos à solução de hialuronidase 0,2% para a liberação das células do cumulus. Apos esse processo, os oócitos selecionados foram corados, avaliados e apenas COCs grau 1 foram utilizados. De um total de 920 oócitos, 566 foram classificados como grau 1 e os estágios de configuração da cromatina identificados como VG-1, VG-2, VG-3 e VG-4. As alterações observadas na configuração da cromatina foram caracterizadas como transição de uma cromatina dispersa (VG-1, VG-2) para parcialmente condensada (VG-3) ate atingir um estagio totalmente condensado (VG-4). Os dados analisados da configuração da cromatina mostraram uma diferença significativa entre as fases de anestro e diestro, com maior proporção de VG-1 e VG-2 durante o anestro e de VG-3 e VG-4 durante o diestro. Ha necessidade de novos estudos para uma compreensão adequada da influencia da configuração da cromatina de oócitos no estagio de VG na retomada da meiose e na competência meiótica do oócito(AU)

Cromatina espermática: quebrando paradigmas / Sperm chromatin: breaking paradigms

Há algumas décadas, pensava-se que espermatozoides maduros possuíssem uma cromatina não funcional, inerte, sem a capacidade de transcrição. Acreditava-se que a matriz nuclear não existisse e que a presença de histonas no núcleo seria um erro no processo de compactação cromatínica, o que poderia interferir na fertilidade do macho. Hoje se sabe que, entre as estruturas toroidais, unidades básicas da cromatina espermática altamente compactada, há algumas poucas regiões que contêm sequências de nucleossomos, e estas geralmente estão anexadas a uma matriz nuclear proteica. Os espermatozoides possuem cromatina altamente organizada e são condutores metabolicamente funcionais do genoma masculino, carreando RNAs de diferentes tipos, os quais, tanto quanto os nucleossomos, são importantes sinalizadores epigenéticos paternos e, logo,influenciam o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, alterações cromatínicas podem não somente interferir no processo de fecundação, como principalmente no desenvolvimento embrionário, o que reforça a necessidade da análise da cromatina na avaliação de reprodutores machos.

Decades ago, it was thought thatspermatozoa had a chromatin nonfunctional, inert, without the abilityto transcription. It was believed in the absence of nuclear matrix and the presence of the core histones would be an error in the chromatin packaging, which could interfere with male fertility. Today we know that between thetoroidal structures, basic units of highly compacted sperm chromatin, there are a few regions containing nucleosome sequences, these usually being attached to a nuclear protein matrix. The sperm chromatin is highly organized and is metabolically functional carrier of male genome, carrying different RNA types, which, along with the nucleosomes are important paternal epigenetic signaling, and influencing early embryonic development. Therefore, chromatin alterations not only interfere with the fertilization process, but also influencethe embryonic development, which reinforces the need for chromatin analysis in the evaluation of breeding males.

PROTEOMA NUCLEAR E MICRO-RNAS DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINOS FÉRTEIS E SUBFÉRTEIS

A compreensão da composição e fisiologia do espermatozoide é importante para compreender a subfertilidade transitória ou permanente em touros. Assim, objetivou-se com este trabalho avaliar as proteínas nucleares e micro-RNAs de espermatozoides de bovinos férteis e subférteis, na tentativa de se identificar marcadores moleculares de fertilidade e subfertilidade em touros. Para a avaliação de micro-RNAs foi utilizada a metodologia de RNA-seq e para as proteínas nucleares foi utilizada a espectrometria de massas avançada de amostras de sêmen de touros férteis e subférteis. Foram identificados 1306 micro-RNAs nas amostras de sêmen avaliadas. Identificou-se por análises computacionais os genes bta-miR- 380-5p, bta-miR-155, bta-miR-122, bta-miR-30c e bta-miR-34a como sendo diferencialmente expressos em touros férteis e subférteis, indicando que estes podem configurar possíveis marcadores de fertilidade. No entanto, ficou claro que não existe um micro-RNA único que marque diferentes tipos e causas de subfertilidade. Quanto às proteínas nucleares, foi possível verificar que espermatozoides de touro possuem na constituição de sua cromatina protamina 1 e 2, assim como as variações de histona subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A.Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Dentre proteínas nucleares, contaminantes de outros compartimentos do espermatozoide e do plasma seminal, identificou-se a proteína Acil-tioesterase 1 (APT-1), o fator beta de crescimento do nervo (Beta-NGF), a proteína do plasma seminal A3 (BSP-3), a Histona H2A.J, a proteína FAM71D, as proteínas ribossomais 40S-S8 e a 60S-L9, o inibidor de serina protease plasmática (Protein C inhibitor) (PCI) (Serpin A5) e a subunidade alfa catalítica da proteína quinase dependente de cAMP como tendo potencial para serem utilizadas como marcadoras de fertilidade. Já a proteína ATPase do reticulo endoplasmático transicional, a subunidade 5 da NADH desidrogenase (ubiquinona) do subcomplexo 1 alfa, a proteína de choque térmico beta-9, as proteínas ribossomais 60S-L12 e 40S-S7 e a proteína acetiltransferase do acetil-CoA apresentaram potencial para serem utilizadas como marcadoras de subfertilidade.

Understanding the composition and physiology of spermatozoa is important to understand transient or permanent subfertility in bulls. Thus, the objective of this work was to evaluate the nuclear and micro-RNA spermatozoa of fertile and subfertile cattle, in an attempt to identify molecular markers of fertility and subfertility in bulls. For the evaluation of micro- RNAs the RNA-seq methodology was used and for nuclear proteins the advanced mass spectrometry of semen samples from fertile and subfertile bulls was used. A total of 1306 micro-RNAs were identified in the semen samples evaluated. The bta-miR-380-5p, bta-miR- 155, bta-miR-122, bta-miR-30c and bta-miR-34a genes were identified by computational analysis as being differentially expressed in fertile and subfertile bulls, indicating that they can set up possible fertility markers. However, it was clear that there is no single micro-RNA that marks different types and causes of subfertility. As for the nuclear proteins, it was possible to verify that spermatozoa of bull have in the constitution of their protamine chromatin 1 and 2, as well as the histone variations subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A .Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Among nuclear proteins and contaminants from other sperm and seminal plasma compartments, the acyl thioesterase 1 protein (APT-1), nerve growth factor beta (Beta-NGF), seminal plasma protein A3 ( BSP-3), Histone H2A.J, FAM71D protein, 40S-S8 and 60S-L9 ribosomal proteins, the plasma serine protease inhibitor (Protein C inhibitor) (Serpin A5) and the catalytic alpha subunit of the cAMP-dependent protein kinase as having potential to be used as a fertility marker. On the other hand, the ATPase protein of the transitional endoplasmic reticulum, subunit 5 of NADH dehydrogenase (ubiquinone) of subcomplex 1 alpha, beta-9 heat shock protein, ribosomal proteins 60S-L12 and 40S-S7 and acetyl-CoA protein acetyltransferase presented potential to be used as subfertility markers.

AVALIAÇÃO DA COMPACTAÇÃO DA CROMATINA DURANTE A MATURAÇÃO EPIDIDIMÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE DE TOURO

Os exames andrológicos atuais avaliam a concentração, vigor, motilidade, turbilhonamento e patologias morfológicas dos espermatozoides; porém, mesmo aprovados em exames andrológicos, alguns touros não respondem de maneira eficaz, seja na monta natural ou em processos de fertilização in vitro. Alterações na cromatina dos espermatozoides pode ser um fator que influência o desempenho dos touros e que geralmente não é avaliada em exames andrológicos. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a compactação da cromatina durante a maturação do espermatozoide no epidídimo, correlacionando características morfométricas da cabeça dos espermatozoides, a compactação da cromatina e a maturação epididimária. Para isso foram coletados espermatozoides do túbulo seminífero, cabeça, corpo e cauda do epidídimo, além do ducto deferente de cinco touros. Esses espermatozoides foram avaliados por análise de imagem computacional de esfregaços corados com azul de toluidina. No geral, espermatozoides do túbulo seminífero apresentaram menor área, perímetro, largura, comprimento, elipsidade, e harmônicas Fourier (F0, F1 e F2) quando comparados aos do epidídimo (cabeça, corpo e cauda) e ducto deferente. A análise da descompactação e heterogeneidade da cromatina demonstrou que ambos os parâmetros decresceram no decorrer do processo de maturação espermática. A proporção de espermatozoides normais (com ausência de áreas de descompactação de cromatina) foi menor nos túbulos seminíferos em relação às demais regiões. Além disso, porcentagem superior de espermatozoides com descompactação de cromatina na base (DB), metade basal (DMB) e no eixo central (DEC) da cabeça foi observado nos túbulos seminíferos quando comparado as outras regiões analisadas. Observou-se que o tipo de descompactação da cromatina influencia parâmetros morfométricos da cabeça de espermatozoide. Cabeças que possuem descompactação total apresentam menor área quando avaliada por análise de imagem bidimensional, por outro lado, os que apresentam descompactação dispersas têm uma área maior, pois as cabeças com maior descompactação tendem a ser esféricas, com maior volume, mas com menor área quando observado bidimensionalmente e as de maior compactação são muito achatadas, com menor volume, mas com maior área. Foi possível verificar que na maturação espermática, inicialmente os espermatozoides apresentam descompactação cromatínica total, em seguidas as bordas laterais iniciam o processo de compactação, logo após, temos compactação da região apical, depois da central e finalmente da região basal da cabeça. Enfim, ficou demonstrado que a maturação epididimária é importante para a compactação da cromatina e consequentemente, para a morfologia final dos espermatozoides.

The current andrological exams evaluate the concentration, vigor, motility, swirling and morphological pathologies of spermatozoa. However, even when approved for andrological examinations, some bulls do not respond effectively, either in natural mating or in vitro fertilization processes. Alterations in the sperm chromatin can be a factor that influence the performance of bulls and is usually not evaluate in andrological exams. This study aims to evaluate the condensation of chromatin during sperm maturation in the epididymis, correlating morphometric characteristics of spermatozoa, chromatin condensation and epididymal maturation. For this, spermatozoa were collected from the seminiferous tubule, head, body and tail of the epididymis, as well as the ductus deferens of five bulls. These spermatozoa were evaluated by computational image analysis of toluidine blue stained smears. In general, spermatozoa of the seminiferous tubule presented smaller area, perimeter, width, length, ellipticity, and Fourier harmonics (F0, F1 and F2) when compared to the epididymis (head, body and tail) and ductus deferens. The analysis of decondensation and heterogeneity of chromatin showed that both parameters decreased during the process of sperm maturation. The proportion of normal spermatozoa (with absence of chromatin decondensation areas) was lower in the seminiferous tubules in relation to the other regions. In addition, superior percentage of spermatozoa with chromatin decondensation in the base (DB), basal half (DBH) and central axis (DCA) of the head was observed in the seminiferous tubules when compared to the other analyzed regions. The type of chromatin decondensation influences morphometric parameters of the spermatozoa head. Heads that possess total decondensation have smaller area when evaluated by two-dimensional image analysis, conversely, heads with disperse decondensation have a larger area. Heads with larger decondensation tend to be spherical, with greater volume, but with smaller area when observed two-dimensionally, and those with dsipersed decondensation are quite flattened, with smaller volume, but larger area. During sperm maturation, the spermatozoa initially present total chromatin decondensation. Then, the lateral borders begin the condensation process, followed by condensation of the apical region, central region, and the basal region of the head, respectively. Therefore, it has been demonstrated that epididymal maturation is important for the chromatin condensation, consequently, for the final morphology of the spermatozoa.

Avaliação da descompactação cromática em espermatozoides suínos utilizando dois métodos avaliativos

Para um aumento da viabilidade econômica da suinocultura é necessário que se busque contínuo melhoramento reprodutivo do rebanho desses animais. O que se refere à reprodução desse tipo de rebanho é necessário que o macho apresente uma alta capacidade de fertilidade. Geralmente os exames de rotina, como o espermograma, são capazes de avaliar a fertilidade desses animais, analisando parâmetros seminais como volume, concentração, motilidade, vigor e anormalidades morfológicas. No entanto, é comprovado que tais métodos a não identificam importantes alterações na estrutura espermática, como alterações cromatínicas, as quais influenciam negativamente a fertilidade. Com isso, conduziu-se este trabalho com o objetivo de testar de forma inédita a análise computacional de esfregaços de sêmen suíno corados com azul de toluidina (AT) para identificação de alterações cromatínicas e correlacionar o SCSA (sperm chromatin structure assay), considerado o método padrão para avaliação de alterações da cromatina espermática. Foram analisados 13 ejaculados de varões férteis coletados na cidade de Rio Verde-Goiás utilizando-se os dois métodos avaliativos. Nos esfregaços de sêmen corados com AT foram avaliadas a descompactação e heterogeneidade da cromatina. Já com o SCSA avaliou-se a proporção de cabeças com e sem alterações cromatínicas. Através do coeficiente de correlação de Pearson foi possível observar que só houve relação significativa entre a descompactação e heterogeneidade cromatínicas identificadas por AT. Isto significa que as alterações identificadas pelo SCSA e AT em sêmen de suíno não são semelhantes ou houve interferência devido aos animais utilizados serem altamente férteis. Com a realização deste trabalho, sugere-se o uso do método de análise computacional de esfregaços de sêmen suíno corados com AT, para avaliação da compactação da cromatina, pelo mesmo dispor de vantagens técnicas e financeiras aos pesquisadores da área. Contudo, o AT não deve ser considerado substituto do SCSA por identificarem alterações cromatínicas diferentes

Avaliação da descompactação cromática em espermatozoides suínos utilizando dois métodos avaliativos

Para um aumento da viabilidade econômica da suinocultura é necessário que se busque contínuo melhoramento reprodutivo do rebanho desses animais. O que se refere à reprodução desse tipo de rebanho é necessário que o macho apresente uma alta capacidade de fertilidade. Geralmente os exames de rotina, como o espermograma, são capazes de avaliar a fertilidade desses animais, analisando parâmetros seminais como volume, concentração, motilidade, vigor e anormalidades morfológicas. No entanto, é comprovado que tais métodos a não identificam importantes alterações na estrutura espermática, como alterações cromatínicas, as quais influenciam negativamente a fertilidade. Com isso, conduziu-se este trabalho com o objetivo de testar de forma inédita a análise computacional de esfregaços de sêmen suíno corados com azul de toluidina (AT) para identificação de alterações cromatínicas e correlacionar o SCSA (sperm chromatin structure assay), considerado o método padrão para avaliação de alterações da cromatina espermática. Foram analisados 13 ejaculados de varões férteis coletados na cidade de Rio Verde-Goiás utilizando-se os dois métodos avaliativos. Nos esfregaços de sêmen corados com AT foram avaliadas a descompactação e heterogeneidade da cromatina. Já com o SCSA avaliou-se a proporção de cabeças com e sem alterações cromatínicas. Através do coeficiente de correlação de Pearson foi possível observar que só houve relação significativa entre a descompactação e heterogeneidade cromatínicas identificadas por AT. Isto significa que as alterações identificadas pelo SCSA e AT em sêmen de suíno não são semelhantes ou houve interferência devido aos animais utilizados serem altamente férteis. Com a realização deste trabalho, sugere-se o uso do método de análise computacional de esfregaços de sêmen suíno corados com AT, para avaliação da compactação da cromatina, pelo mesmo dispor de vantagens técnicas e financeiras aos pesquisadores da área. Contudo, o AT não deve ser considerado substituto do SCSA por identificarem alterações cromatínicas diferentes(AU)

Análise da intensidade de descompactação de cromatina em espermatozoides bovinos por comparação entre dois métodos avaliativos

Reprodutores que possuem espermograma normal podem ser classificados como subférteis ou passarem por períodos de subfertilidade. As alterações na descompactação da cromatina dos espermatozoides em bovinos são possíveis explicações encontradas para tais comportamentos. Diante disso, conduziu-se este trabalho com o objetivo de correlacionar dois métodos de identificação de alterações na cromatina em espermatozoides de bovinos, sendo eles: análise computacional de esfregaços de sêmen corados com azul de toluidina (AT) e o SCSA (sperm chromatin structure assay). Quatorze amostras de sêmen de bovinos sabidamente subférteis foram avaliadas utilizando-se os dois métodos. Nos esfregaços de sêmen corados com AT foram avaliadas a descompactação e heterogeneidade da cromatina. Com o SCSA avaliou-se a proporção de cabeças de espermatozoides coradas em vermelho (com alterações na cromatina) e em verde (normais). Posteriormente foi realizado o teste de correlação de Pearson entre as características avaliadas. A heterogeneidade da cromatina identificada por AT não possui qualquer correlação com as alterações identificadas por SCSA. Já a descompactação identificada por AT possui correlação positiva significativa com as alterações identificadas por SCSA. Concluiu-se que a descompactação cromatínica identificada pela avaliação computacional de esfregaços de sêmen corados com AT é semelhante à alteração identificada por SCSA, porém não idêntica. O método SCSA considerado padrão para avaliação da cromatina espermática possui alto custo, ao contrário da avaliação computacional de esfregaços de sêmen corados com AT, que como demonstrado no presente trabalho pode ser um método alternativo.

Análise da intensidade de descompactação de cromatina em espermatozoides bovinos por comparação entre dois métodos avaliativos

Reprodutores que possuem espermograma normal podem ser classificados como subférteis ou passarem por períodos de subfertilidade. As alterações na descompactação da cromatina dos espermatozoides em bovinos são possíveis explicações encontradas para tais comportamentos. Diante disso, conduziu-se este trabalho com o objetivo de correlacionar dois métodos de identificação de alterações na cromatina em espermatozoides de bovinos, sendo eles: análise computacional de esfregaços de sêmen corados com azul de toluidina (AT) e o SCSA (sperm chromatin structure assay). Quatorze amostras de sêmen de bovinos sabidamente subférteis foram avaliadas utilizando-se os dois métodos. Nos esfregaços de sêmen corados com AT foram avaliadas a descompactação e heterogeneidade da cromatina. Com o SCSA avaliou-se a proporção de cabeças de espermatozoides coradas em vermelho (com alterações na cromatina) e em verde (normais). Posteriormente foi realizado o teste de correlação de Pearson entre as características avaliadas. A heterogeneidade da cromatina identificada por AT não possui qualquer correlação com as alterações identificadas por SCSA. Já a descompactação identificada por AT possui correlação positiva significativa com as alterações identificadas por SCSA. Concluiu-se que a descompactação cromatínica identificada pela avaliação computacional de esfregaços de sêmen corados com AT é semelhante à alteração identificada por SCSA, porém não idêntica. O método SCSA considerado padrão para avaliação da cromatina espermática possui alto custo, ao contrário da avaliação computacional de esfregaços de sêmen corados com AT, que como demonstrado no presente trabalho pode ser um método alternativo.(AU)

PRESENÇA DE GOTA CITOPLASMÁTICA E SEUS EFEITOS NA MORFOMETRIA, CROMATINA E MOTILIDADE ESPERMÁTICA E IDENTIFICAÇÃO DE GENES CANDIDATOS À SELEÇÃO DE PARÂMETROS SEMINAIS DE SUÍNOS

O principal desafio do desempenho reprodutivo de machos suínos está relacionado a duas grandes frentes de estudo que englobam a qualidade do ejaculado/doses inseminantes e fertilidade dos reprodutores. A fim de elucidar alguns pontos relacionados a estas frentes de estudo, foram realizadas três pesquisas com o objetivo de a) verificar se a presença de gota citoplasmática está associada a características morfométricas e a cromatina espermática; b) verificar se a reprovação de ejaculados devido à alta ocorrência de gota citoplasmática distal interfere em parâmetros relacionados ao movimento espermático e; c) averiguar se há correlação entre parâmetros seminais com marcadores genéticos específicos em reprodutores. No primeiro estudo, foram avaliados 1 207 espermatozoides normais e 725 com presença de gota citoplasmática em relação à morfometria da cabeça e a estabilidade da cromatina espermática. As cabeças dos espermatozoides do grupo com gota citoplasmática apresentaram-se mais alongadas, simétricas lateralmente, com maior porcentagem de descompactação e maior heterogeneidade da cromatina do que células sem alteração morfológica. Isto indica que alterações morfológicas que não ocorrem diretamente na cabeça do espermatozoide estão associadas com características da conformação da cabeça e da estrutura do material genético da célula. No segundo estudo, foi realizada a comparação de parâmetros relacionados ao movimento espermático em ejaculados considerados aprovados (n=144) e reprovados (n=25) exclusivamente por terem alta ocorrência de gota citoplasmática distal no exame morfológico. O grupo reprovado apresentou espermatozoides com menor velocidade em linha reta, menor motilidade total e progressiva quando comparado ao grupo aprovado no exame morfológico. A reprovação por gota citoplasmática distal, que para diversos autores é considerada sem significado patológico, influenciou negativamente os parâmetros relacionados ao movimento espermático, o que sugere que a reprovação, por esta causa, passe a ser considerada nas avaliações de morfologia espermática. Na terceira pesquisa, foi realizado um estudo de associação de regiões genômicas com os parâmetros volume do ejaculado, concentração espermática, motilidade total e progressiva do espermatozoide, utilizando 113 reprodutores suínos da raça Duroc genotipados pelo Illumina PorcineSNP60 BeadChip. Um total de 57 janelas de SNPs (polimorfismo de nucleotídeos únicos) que explicaram mais de 1% de variância genética aditiva foram identificadas para volume (22), concentração (14), motilidade total (10) e progressiva (11). Treze genes de oito janelas de SNPs foram considerados candidatos para as características estudadas. O gene ABCC3 foi relacionado ao volume do ejaculado, os genes KCNA3, RBM15 e ITGB1 à concentração espermática, o gene WRNIP1 à motilidade total, os genes FAM189A2, C9orf135, FXN e FAM83D à motilidade progressiva e os genes HSD17B11 e HSD17B13 à motilidade total e progressiva. A identificação de possíveis genes candidatos para as diferentes características seminais de reprodutores pode contribuir para a evolução do conhecimento da base genética de suínos e ainda aperfeiçoar o processo de seleção de animais a serem utilizados em Centrais de Inseminação Artificial.

The main challenge of boars reproductive performance is related with two major lines of study that include the quality of the ejaculate/inseminating doses and boars fertility. In order to elucidate some points related to these lines, three studies were carried out with the aim of a) verify if the cytoplasmic droplet presence in sperm is associated with morphometric and chromatin characteristics; b) verify if reprobation of ejaculates due to high occurrence of distal cytoplasmic droplets interferes in spermatic movement parameters; c) investigate if there is a correlation among seminal parameters with specific genetic markers in boars. In the first study, 1,207 normal sperm and 725 sperm with cytoplasmic droplet were evaluated in relation to head morphometry and chromatin stability. Heads of sperm with cytoplasmic droplets were more elongated, laterally symmetrical, had higher percentage of decondensed chromatin and more heterogeneous chromatin than heads of normal sperm. These results indicate that morphological changes that do not occur directly on sperm head are associated with the conformation of the head and the structure of cell genetic material. In the second study it was compared parameters related to sperm movement in ejaculates considered approved (n=144) and rejected (n=25) exclusively due the high occurrence of distal cytoplasmic droplets on morphological exam. Sperm of rejected group presented lower velocity straight line, lower total and progressive motility than sperm of approved group. The reprobation due distal cytoplasmic droplet, which by several authors is considered without pathological significance, had a negative influence on sperm motion parameters. It suggests that reprobation for this cause should be considered in sperm morphology assessments. In the third research, a genome-wide association study was performed with ejaculate volume, sperm concentration and total and progressive sperm motility, using 113 Duroc boars genotyped by Illumina PorcineSNP60 BeadChip. A total of 57 SNPs (single nucleotide polymorphism) windows that explained more than 1% of genetic variance were identified for ejaculate volume (22), sperm concentration (14), total (10) and progressive (11) motility. Thirteen genes of eight SNPs windows were considered candidates for those characteristics. Gene ABCC3 was related to volume, genes KCNA3, RBM15 and ITGB1 to sperm concentration, gene WRNIP1 to total motility, genes FAM189A2, C9orf135, FXN and FAM83D to progressive motility and genes HSD17B11 and HSD17B13 to total and progressive motility. The identification of possible candidate genes for the different seminal characteristics of boars can contribute to knowledge of the genetic background of swine production and also to improve the selection process of boars to be used in boar studs.