Viability and infectivity of an ectomycorrhizal inoculum produced in an airlift bioreactor and immobilized in calcium alginate

The viability and infectivity of an ectomycorrhizal inoculum (isolate UFSC-Rh90, Rhizopogon nigrescens), produced by submerged cultivation in an airlift bioreactor and immobilized in beads of calcium alginate gel, was studied. Inoculum remained 100% viable after 18 months in a 0.85% NaCl solution at 8 ± 1ºC. Mycelium grew from the beads after 48 h when they were placed on a solid culture medium at 25 ± 1ºC. Viability of pellets of non-immobilized mycelium stored under the same conditions decreased gradually after the third month of storage, reaching 0% by the 12th month. These pellets presented a gradual darkening, which was more intense in those located near the surface of the NaCl solution. In culture medium, these dark pellets showed no viability. Gel immobilization helps to maintain mycelium viability during storage and offers a physical protection when the inoculum is applied to the planting substrate. After eight months refrigeration, the immobilized inoculum was still able to infect Pinus taeda seedlings, colonizing an average of 37% of the root tips when inoculated in the plant growth substrate under greenhouse conditions. This inoculum presents a commercial potential to be produced and applied in forest nurseries.

Estudou-se a viabilidade e a infectividade de inoculante fúngico ectomicorrízico (isolado UFSC-Rh90, Rhizopogon nigrescens), produzido através de cultivo submerso em biorreator airlift e encapsulado em gel de alginato de cálcio. O inoculante permaneceu viável após 18 meses em solução de NaCl (0,85%) a 8 ± 1ºC. O micélio emergiu dessas cápsulas após 48 h de incubação a 25 ± 1ºC em meio de cultura sólido. A viabilidade dos pellets de micélio não imobilizado, armazenados sob as mesmas condições, reduziu-se gradualmente após três meses de armazenamento e atingiu 0% aos 12 meses. Esses pellets apresentaram um escurecimento gradual que foi mais intenso naqueles localizados próximos à superfície da solução de NaCl. Em meio de cultura, os pellets escurecidos mostraram-se inviáveis. A imobilização em gel mantém a viabilidade do micélio durante o armazenamento, além de oferecer uma barreira física quando aplicado ao substrato de plantio. Após oito meses de armazenamento sob refrigeração, o inoculante imobilizado colonizou uma média de 37% das raízes curtas de mudas de Pinustaeda, quando aplicado ao substrato de plantio sob condições de casa-de-vegetação. Esse inoculante apresenta potencial para produção comercial e aplicação nos viveiros florestais.

Production of outer membrane vesicles (OMV) in batch cultivation of Neisseria meningitidis serogroup B

Meningococcal disease is an important cause of death and morbidity throughout the world. Nearly 330,000 cases and 35,000 deaths occur yearly. Neisseria meningitidis, serogroup B strain N.44/89, is prevalent in Brazil. Its outer membrane vesicles (OMV) with iron regulated proteins (IRP) are released to the culture medium and are used as antigen for vaccine production. In order to have knowledge about the kinetic parameters, especially the final OMV concentration values, 20-h batch cultivations were carried out in Catlin medium with iron restriction. Process conditions comprised: 7 L bioreactor, 36ºC, 0.5 atm, overlay air flowrate of 1 L/min, agitation varying from 250 rpm to 850 rpm and dissolved oxygen control set at 10% of saturation condition. Biomass was determined by optical density at 540 nm and dry weight. Glycerol, lactate, pH and dissolved oxygen were measured from samples taken during cultivation. Outer membrane vesicle (OMV) concentration was determined by Lowry's method after ultracentrifugation. IRP presence was verified by SDS-PAGE. Highest biomass value, corresponding to the highest initial lactate concentration (7.84 g/L) was achieved at the 9th hour process time corresponding to 1.0 g/L dry biomass and 2.3 optical density at 540 nm. Lactate consumption was directly related to cell growth (yield factor: 0.24 g dry biomass / g lactate). Glycerol concentration in the medium did not change significantly during the process. OMV concentration reached the highest value of 80 mg/L at end cultivation time. The obtained results suggest that lactate is a main limiting growth factor and the maximum amount of antigen is obtained during stationary growth and cell death phases.

A doença meningocócica é uma causa importante de morte a nível mundial. Aproximadamente 330.000 casos e 35.000 mortes ocorrem anualmente. A cepa N.44/89 do sorogrupo B de Neisseria meningitidis é prevalente no Brasil. Suas vesículas de membrana externa (OMV - "outer membrane vesicles"), com proteínas reguladoras de ferro (IRP - "iron regulated proteins") liberadas no meio de cultura, são empregadas como antígeno para a produção da vacina. A fim ter o conhecimento sobre os parâmetros cinéticos, especialmente os valores finais da concentração de OMV, cultivos batelada de 20 hs foram realizados no meio de Catlin com limitação do ferro. As condições de processo compreenderam: biorreator de 7 litros, 36ºC, 0,5 atm, vazão de ar de 1 L/min, agitação variando entre 250 a 850 rpm, controle do oxigênio dissolvido em 10% da condição de saturação. A biomassa foi determinada pela densidade ótica em 540 nm e peso seco. Glicerol, lactato, pH e oxigênio dissolvido foram medidos das amostras retiradas durante o cultivo. A concentração de OMV foi determinada pelo método de Lowry após ultracentrifugação. A presença de IRP foi verificada por SDS-PAGE. O valor mais elevado de biomassa, correspondendo à concentração inicial mais elevada de lactato (7,84 g/L) foi obtido no tempo de processo de 9 horas, o qual corresponde a biomassa seca de 1,0 g/L e a densidade ótica de 2,3 em 540 nm. O consumo de lactato. foi relacionado diretamente ao crescimento celular (fator de conversão de 0,24 biomassa por lactato g/g). A concentração do glicerol no meio não se alterou significativamente ao longo do processo. A concentração de OMV alcançou o valor mais elevado de 80 mg/L no tempo final de cultivo. Os resultados obtidos sugerem que o lactato é o principal fator limitante do crescimento e o máximo do antígeno é obtido durante a fase estacionária de crescimento e de morte celular.

Influence of initial L-asparagine and glycerol concentrations on the batch growth kinetics of Mycobacterium bovis BCG

The influences of the L-asparagine and glycerol initial concentrations in Sauton medium on the productivities of biomass and colony forming units were studied. The submerged batch cultivations of Mycobacterium bovis were carried out in a 20 L bioreactor. The L-asparagine and glycerol initial concentrations of 4.54 g/L and 25 mL/L, respectively, corresponded to the best biomass productivity, namely 2.5 g/L.day. On the other hand, the concentrations of 2.27 g/L and 25 mL/L, respectively, led to the highest productivity in terms of colony forming units, namely 2.7·10(6) colonies/mg.day. In addition, by means of the relative consumption analysis of L-asparagine and glycerol (50 and 26% respectively), it was concluded that the concentrations of such components could be reduced, with respect to the original Sauton medium composition, aiming the obtainment of an optimal BCG vaccine production in the bioreactor.

Estudou-se a influência das concentrações iniciais, no meio de Sauton, de asparagina e glicerol sobre as produtividades, expressas em unidades formadoras de colônias e biomassa microbiana, referentes aos cultivos submersos do Mycobacterium bovis, em biorreator de 20 mL. As concentrações iniciais de 2,27 e 25 mL/L de asparagina e glicerol, respectivamente, conduziram à maior produtividade, em unidades formadoras de colônias, a saber 2,7.10(6) colônias/mg.dia. Por outro lado, as concentrações de 4,54 e 25 mL/L dos mesmos componentes, corresponderam à melhor produtividade em biomassa, a saber: 2,5 g/dia. Através das análises dos consumos relativos de asparagina e glicerol (50 e 26% respectivamente), verificou-se também que as concentrações destes componentes podem ser reduzidas na composição original do meio de Sauton, com o objetivo de obter uma produção otimizada de vacina BCG em bioreator.

Metodologia para produção de Metarhizium anisopliae (METSCH.) sorokin em cultivo submerso: esporulação da biomassa, efeito da concentração de açúcar e custo do inoculant

A method of cultivation and a culture medium were developed aiming at the mass production of fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, with great concentration and purity of conidia. This method involved the M-61 strain of entomopathogenic fungus in liquid medium of rice, yeast extract, soybean bug extract (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), under six differents concentrations of sugar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), and the solid conventional medium of rice grains. The biomasses obtained were filtered and put in an incubator to promote sporulation. The treatments were evaluated through the parameters wet and dry-weight of micelium, number of conidia per gram of substrate, viability and pathogenicity of conidia against the bug. It was observed that the sugar concentration of 2.0g l-1 in extract of N. viridula produced two times more conidia per gram of substrate when compared to 10.0g l-1, and 51 times cheaper than the conventional process of production of fungus. Viability was not affected by the different culture media. Significant differences did not occur in the pathogenicity among culture media and cultivations methods.

Desenvolveram-se um método de cultivo e um meio de cultura para produção massal do fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, com maior pureza e concentração de conídios. Este método envolveu o cultivo submerso da linhagem M-61 do entomopatógeno em meio líquido de arroz parboilizado, extrato de levedura, extrato do percevejo da soja (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), sob seis diferentes níveis de concentração de açúcar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), além do meio convencional sólido de arroz em grão. As biomassas obtidas foram separadas através de tela de nylon (63 mesh) e dispostas em estufa para a esporulação. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados pelos parâmetros pesos fresco e seco do micélio, número de conídios por grama de substrato, viabilidade e patogenicidade dos conídios sobre o percevejo. Observou-se que 2.0g l-1 de açúcar em meio de cultura de extrato de N. viridula produziu o dobro do número de conídios por grama de substrato em relação à concentração de 10.0g l-1, a um custo 51 vezes inferior ao obtido no processo convencional de produção do fungo. A viabilidade não foi afetada nos diferentes meios utilizados. Não ocorreram diferenças significativas na patogenicidade em função dos meios de cultura e métodos de cultivo.

Metodologia para produção de Metarhizium anisopliae (METSCH.) sorokin em cultivo submerso: esporulação da biomassa, efeito da concentração de açúcar e custo do inoculant

A method of cultivation and a culture medium were developed aiming at the mass production of fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, with great concentration and purity of conidia. This method involved the M-61 strain of entomopathogenic fungus in liquid medium of rice, yeast extract, soybean bug extract (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), under six differents concentrations of sugar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), and the solid conventional medium of rice grains. The biomasses obtained were filtered and put in an incubator to promote sporulation. The treatments were evaluated through the parameters wet and dry-weight of micelium, number of conidia per gram of substrate, viability and pathogenicity of conidia against the bug. It was observed that the sugar concentration of 2.0g l-1 in extract of N. viridula produced two times more conidia per gram of substrate when compared to 10.0g l-1, and 51 times cheaper than the conventional process of production of fungus. Viability was not affected by the different culture media. Significant differences did not occur in the pathogenicity among culture media and cultivations methods.

Desenvolveram-se um método de cultivo e um meio de cultura para produção massal do fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, com maior pureza e concentração de conídios. Este método envolveu o cultivo submerso da linhagem M-61 do entomopatógeno em meio líquido de arroz parboilizado, extrato de levedura, extrato do percevejo da soja (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), sob seis diferentes níveis de concentração de açúcar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), além do meio convencional sólido de arroz em grão. As biomassas obtidas foram separadas através de tela de nylon (63 mesh) e dispostas em estufa para a esporulação. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados pelos parâmetros pesos fresco e seco do micélio, número de conídios por grama de substrato, viabilidade e patogenicidade dos conídios sobre o percevejo. Observou-se que 2.0g l-1 de açúcar em meio de cultura de extrato de N. viridula produziu o dobro do número de conídios por grama de substrato em relação à concentração de 10.0g l-1, a um custo 51 vezes inferior ao obtido no processo convencional de produção do fungo. A viabilidade não foi afetada nos diferentes meios utilizados. Não ocorreram diferenças significativas na patogenicidade em função dos meios de cultura e métodos de cultivo.