Partial characterization of digestive proteases in juveniles of Microphis brachyurus (short-tailed pipefish) (Syngnathiformes: Syngnathidae)

Short-tailed pipe fish (Microphis brachyurus) is a freshwater organism with high economic potential for the aquarium hobby, so it is necessary to implement methods to promote its culture through studies of digestive physiology. General activities of acid and alkaline proteases were evaluated, as well as the effect of pH, temperature and inhibitors. The optimal pH of stomach proteases was 2, while the optimal pH of intestinal proteases was 10. Optimal temperature for the acidic proteases was 35 ºC, while for alkaline proteases it was 45 ºC. Thermal stability showed high resistance at 35 ºC for both acid and alkaline proteases (above 100% residual activity). Acid proteases are resistant at pH 2 (50% of residual activity), meanwhile alkaline proteases were highly resistant at pH 10 (90% of residual activity). Acid proteases were inhibited by 80% with pepstatin A and alkaline proteases were inhibited with TLCK and TPCK for trypsin (75%) and chymotrypsin (80%), respectively. Finally, metallo-proteases were 75% partially inhibited some serine proteases by 75% with EDTA. In conclusion, M. brachyurus has a good digestive capacity, since they can degrade a wide variety of proteins due to their greater proteolytic activity.(AU)

El pez pipa (Microphis brachyurus) es un organismo dulceacuícola con alto potencial económico para la acuarofilia; sin embargo, es necesario implementar su cultivo a través de estudios de fisiología digestiva. Se evaluó el efecto del pH, temperatura e inhibidores sobre las actividades enzimáticas de proteasas ácidas y alcalinas. El pH óptimo de proteasas estomacales es de 2, mientras que el de proteases intestinales es de 10. La temperatura óptima de proteasas ácidas es de 35 ºC y las alcalinas de 45 ºC. La estabilidad térmica para proteasas ácidas y alcalinas es a los 35 ºC (más de 100% de actividad residual). La estabilidad a los diferentes pH de las proteasas ácidas es en 2 (50 % de la actividad residual), mientras que para las proteasas alcalinas es en 10 (90 % de la actividad residual). Las proteasas ácidas fueron inhibidas en 80% con pepstatina A y las proteasas alcalinas fueron altamente inhibidas con TLCK para tripsina (75%) y TPCK quimitripsina (80%). Finalmente, las metaloproteasas fueron inactivadas con EDTA en 70%. En conclusión, M. brachyurus tiene una buena capacidad digestiva al degradar una amplia variedad de proteinas debido a su alta actividad proteolítica.(AU)

Partial characterization of digestive proteases in juveniles of Microphis brachyurus (short-tailed pipefish) (Syngnathiformes: Syngnathidae)

RESUMEN El pez pipa (Microphis brachyurus) es un organismo dulceacuícola con alto potencial económico para la acuarofilia; sin embargo, es necesario implementar su cultivo a través de estudios de fisiología digestiva. Se evaluó el efecto del pH, temperatura e inhibidores sobre las actividades enzimáticas de proteasas ácidas y alcalinas. El pH óptimo de proteasas estomacales es de 2, mientras que el de proteases intestinales es de 10. La temperatura óptima de proteasas ácidas es de 35 ºC y las alcalinas de 45 ºC. La estabilidad térmica para proteasas ácidas y alcalinas es a los 35 ºC (más de 100% de actividad residual). La estabilidad a los diferentes pH de las proteasas ácidas es en 2 (50 % de la actividad residual), mientras que para las proteasas alcalinas es en 10 (90 % de la actividad residual). Las proteasas ácidas fueron inhibidas en 80% con pepstatina A y las proteasas alcalinas fueron altamente inhibidas con TLCK para tripsina (75%) y TPCK quimitripsina (80%). Finalmente, las metaloproteasas fueron inactivadas con EDTA en 70%. En conclusión, M. brachyurus tiene una buena capacidad digestiva al degradar una amplia variedad de proteinas debido a su alta actividad proteolítica.

ABSTRACT Short-tailed pipe fish (Microphis brachyurus) is a freshwater organism with high economic potential for the aquarium hobby, so it is necessary to implement methods to promote its culture through studies of digestive physiology. General activities of acid and alkaline proteases were evaluated, as well as the effect of pH, temperature and inhibitors. The optimal pH of stomach proteases was 2, while the optimal pH of intestinal proteases was 10. Optimal temperature for the acidic proteases was 35 ºC, while for alkaline proteases it was 45 ºC. Thermal stability showed high resistance at 35 ºC for both acid and alkaline proteases (above 100% residual activity). Acid proteases are resistant at pH 2 (50% of residual activity), meanwhile alkaline proteases were highly resistant at pH 10 (90% of residual activity). Acid proteases were inhibited by 80% with pepstatin A and alkaline proteases were inhibited with TLCK and TPCK for trypsin (75%) and chymotrypsin (80%), respectively. Finally, metallo-proteases were 75% partially inhibited some serine proteases by 75% with EDTA. In conclusion, M. brachyurus has a good digestive capacity, since they can degrade a wide variety of proteins due to their greater proteolytic activity.

Plasminogen activator inhibitor 1 and Antipain preserve acrosome integrity of bovine spermatozoa during cryopreservation / Inibidor do ativador do plasminogênio 1 e antipaína preservam a integridade do acrossoma de espermatozoides bovinos durante a criopreservação

Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

Plasminogen activator inhibitor 1 and Antipain preserve acrosome integrity of bovine spermatozoa during cryopreservation / Inibidor do ativador do plasminogênio 1 e antipaína preservam a integridade do acrossoma de espermatozoides bovinos durante a criopreservação

Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

Plant antiherbivore defenses in Fabaceae species of the Chaco / Defesas das plantas anti-herbivoria em espécies de Fabaceae do Chaco

The establishment and maintenance of plant species in the Chaco, one of the widest continuous areas of forests in the South American with sharp climatic variations, are possibly related to biological features favoring plants with particular defenses. This study assesses the physical and chemical defenses mechanisms against herbivores of vegetative and reproductive organs. Its analyses of 12 species of Fabaceae (Leguminosae) collected in remnants of Brazilian Chaco shows that 75% present structural defense characters and 50% have chemical defense defense proteins in their seeds, like protease inhibitors and lectins. Physical defenses occur mainly on branches (78% of the species), leaves (67%), and reproductive organs (56%). The most common physical characters are trichomes and thorns, whose color represents a cryptic character since it does not contrast with the other plant structures. Defense proteins occur in different concentrations and molecular weight classes in the seeds of most species. Protease inhibitors are reported for the first time in seeds of: Albizia niopoides, Anadenanthera colubrina, Mimosa glutinosa, Prosopis rubriflora, and Poincianella pluviosa. The occurrence of physical and chemical defenses in members of Fabaceae indicate no associations between defense characters in these plant species of the Chaco.(AU)

O estabelecimento e a manutenção de espécies no Chaco, uma planície semi-árida da América do Sul com variações climáticas importantes, possivelmente estão relacionados a características biológicas que favorecem as plantas detentoras de defesas particulares. Este estudo teve como objetivos avaliar os mecanismos de defesa física e química anti-herbivoria em órgãos vegetativos e reprodutivos. Analisamos 12 espécies da família Fabaceae (Leguminosae) obtidas em remanescentes de Chaco brasileiro. Observamos que 75% das espécies estudadas apresentam atributo de defesa física e 50% possuem defesa química proteínas de defesa nas sementes, como inibidores de protease e lectinas. As defesas físicas ocorrem principalmente nos ramos (78% das espécies), nos órgãos reprodutivos (56% das espécies) e nas folhas (67%). Os atributos físicos mais frequentes são tricomas e espinhos, cuja coloração não contrastante com as demais estruturas das plantas representa um caráter críptico. Proteínas de defesa ocorrem nas sementes da maioria das espécies, com diferentes concentrações e classes de pesos moleculares. Inibidores de protease nas sementes estão sendo relatados pela primeira vez em: Albizia niopoides, Anadenanthera colubrina, Mimosa glutinosa, Prosopis rubriflora e Poincianella pluviosa. A ocorrência de defesas física e química entre os membros de Fabaceae indica que não há associações entre as características de defesa das espécies de plantas avaliadas no Chaco.(AU)

Assessment and partial purification of serine protease inhibitors from Rhipicephalus (Boophilus) annulatus larvae / Avaliação e purificação parcial dos inibidores da serina protease de larvas do Rhipicephalus (Boophilus) annulatus

Ticks are rich sources of serine protease inhibitors, particularly those that prevent blood clotting and inflammatory responses during blood feeding. The tick Rhipicephalus (Boophlus) annulatus is an important ectoparasite of cattle. The aims of this study were to characterize and purify the serine protease inhibitors present in R. (B.) annulatus larval extract. The inhibitors were characterized by means of one and two-dimensional reverse zymography, and purified using affinity chromatography on a trypsin-Sepharose column. The analysis on one and two-dimensional reverse zymography of the larval extract showed trypsin inhibitory activity at between 13 and 40 kDa. Through non-reducing SDS-PAGE and reverse zymography for proteins purified by trypsin-Sepharose affinity chromatography, some protein bands with molecular weights between 13 and 34 kDa were detected. Western blotting showed that five protein bands at 48, 70, 110, 130 and 250 kDa reacted positively with immune serum, whereas there was no positive reaction in the range of 13-40 kDa. Serine protease inhibitors from R. (B.) annulatus have anti-trypsin activity similar to inhibitors belonging to several other hard tick species, thus suggesting that these proteins may be useful as targets in anti-tick vaccines.

Carrapatos são uma rica fonte de inibidores da serina protease, particularmente aqueles que previnem coagulação e respostas inflamatórias durante a alimentação com sangue. O carrapato Rhipicephalus (B.) annulatus é um ectoparasita importante de bovinos. O objetivo deste estudo foi caracterizar e purificar os inibidores da serina protease presentes no extrato de larva do R. (B.) annulatus. Os inibidores foram caracterizados através de zimografia reversa uni e bidimensional e purificados com cromatografia de afinidade em uma coluna de sepharose-tripsina. A análise do extrato de larva pela zimografia reversa uni e bidimensional mostrou atividade inibitória de tripsina entre 13 e 40 kDa. Através de SDS-PAGE e zimografia reversa para proteínas purificadas pela cromatografia por sepharose-tripsina, algumas bandas de proteínas com pesos moleculares entre 13 e 34 kDa foram detectadas. Western blotting mostrou que cinco bandas de proteínas a 48, 70, 110, 130 e 250 kDa reagiram positivamente com o soro imune, enquanto não houve reação positiva nas bandas 13-40 kDa. Inibidores da serina protease do R. (B.) annulatus têm atividade antitripsina semelhante àquelas dos inibidores de outras espécies de carrapatos duros, sugerindo, assim, que essas proteínas podem ser úteis como alvo de vacinas contra carrapatos.

Lectin, hemolysin and protease inhibitors in seed fractions with ovicidal activity against Haemonchus contortus / Lectina, hemolisina e inibidores de protease em frações de sementes com atividade ovicida contra Haemonchus contortus

Bioactive molecules of plant species are promising alternatives for the chemical control of gastrointestinal nematodes in ruminants. Extracts of native and exotic seed species from Brazil's semi-arid region were tested in vitro in an egg hatch assay and the bioactivity of their proteins was investigated. Each seed species was subjected to three extractions with three types of solvents. All the seeds showed ovicidal activity, which varied according to the solvents. Higher ovicidal activity was found in the molecule fractions of low molecular weight (<12 kDa) for Albizia lebbeck, Ipomoea asarifolia, Jatropha curcas, Libidibia ferrea, Moringa oleifera and Ricinus communis (P<0.05, Bonferroni test). The two fractions of Crotalaria spectabilis showed the same ovicidal activity (P>0.05, Bonferroni test). Hemagglutinating activity was detected in the fractions of C. spectabilis and M. oleifera fractions, hemolysin activity in the A. lebbeck and M. oleifera fractions, serine protease inhibitory activity in the A. lebbeck, I. asarifolia, J. curcas, M. oleifera and R. communis fractions, cysteine protease inhibitor activity in the M. oleifera fraction, and no protein activity in the L. ferrea fraction. The results of this work reveal new plant species with a potential for use in controlling nematode parasites in goats, thus opening a new field of research involving plant protein molecules with ovicidal properties.

Moléculas bioativas de espécies vegetais são alternativas promissoras ao controle químico dos nematoides gastrintestinais em ruminantes. Extratos de sementes de espécies nativas e exóticas do Semiárido Brasileiro foram testados in vitro em ensaio de eclosão de ovos e investigada a natureza proteica da bioatividade. Três extrações com três solventes foram feitas para cada semente estudada. Todas as sementes apresentaram atividade ovicida, variando com o solvente utilizado. Maior taxa de inibição da eclosão concentrou-se nas frações de moléculas de baixa massa molecular (<12 kDa) para Albizia lebbeck, Ipomoea asarifolia, Jatropha curcas, Libidibia ferrea, Moringa oleifera e Ricinus communis (P<0,05, teste de Bonferroni). Crotalaria spectabilis mostrou atividade nas duas frações, sem diferença entre elas (P>0,05, teste de Bonferroni). Observou-se atividade hemaglutinante nas frações de C. spectabilis e M. oleifera, de hemolisina em A. lebbeck e M. oleifera, de atividade inibidora de protease da serina em A. lebbeck, I. asarifolia, J. curcas, M. oleifera e R. communis, de atividade inibidora de protease da cisteína em M. oleifera e nenhuma atividade proteica na fração de L. ferrea. Os resultados revelaram novas espécies botânicas com potencial de controle de nematoides em caprinos e um novo campo de pesquisa, o estudo de moléculas de origem proteica com atividade ovicida.

BTCI enhances guanylin-induced natriuresis and promotes renal glomerular and tubular effects

Guanylin and uroguanylin are small cysteine-rich peptides involved in the regulation of fluid and electrolyte homeostasis through binding and activation of guanylyl cyclases signaling molecules expressed in intestine and kidney. Guanylin is less potent than uroguanylin as a natriuretic agent and is degraded in vitro by chymotrypsin due to unique structural features in the bioactive moiety of the peptide. Thus, the aim of this study was to verify whether or not guanylin is degraded by chymotrypsin-like proteases present in the kidney brush-border membranes. The isolated perfused rat kidney assay was used in this regard. Guanylin (0.2 µM) induced no changes in kidney function. However, when pretreated by the black-eyed pea trypsin and chymotrypsin inhibitor (BTCI - 1.0 µM; guanylin - 0.2 µM) it promoted increases in urine flow (deltaUF of 0.25 ± 0.09 mL.g-1/min, P 0.05) and Na+ excretion (% delta ENa+ of 18.20 ± 2.17, P 0.05). BTCI (1.0 µM) also increased %ENa+ (from 22.8 ± 1.30 to 34.4 ± 3.48, P 0.05, 90 minutes). Furthermore, BTCI (3.0 µM) induced increases in glomerular filtration rate (GFR; from 0.96 ± 0.02 to 1.28 0.02 mL.g-1/min, P 0.05, 60 minutes). The present paper strongly suggests that chymotrypsin-like proteases play a role in renal metabolism of guanylin and describes for the first time renal effects induced by a member of the Bowman-Birk family of protease inhibitors.

Guanilina e uroguanilina são peptídeos pequenos, ricos em cisteína, envolvidos na regulação da homeostase de fluidos e eletrólitos através da ligação e ativação da guanilato ciclase expressa no intestino e nos rins. A guanilina é menos potente do que a uroguanilina como agente natriurético e é degradada in vitro pela quimiotripsina devido a características estruturais únicas no domínio bioativo do peptídeo. Portanto o objetivo deste trabalho foi verificar se a guanilina é degradada por proteases tipo quimiotripsina, presentes na membrana da borda em escova dos rins. Para esta investigação, foi usado o modelo do rim isolado de rato perfundido. A Guanilina (0,2 µM) não induziu mudanças na função renal. Entretanto, quando pré-tratada com inibidor de tripsina e de quimiotripsina de black-eyed pea (BTCI - 1,0 µM; guanilina - 0,2 µM) promoveu um aumento no fluxo urinário (deltaUF de 0,25 ± 0,09 mL.g-1/min, P 0,05) e na excreção de Na+ (%DENa+ de 18,20 ± 2,17, P 0,05). BTCI (1,0 µM) também aumenta %ENa+ (de 22,8 ± 1,30 a 34,4 ± 3,48, P 0,0590 minutos). Além disto, BTCI (3,0 µM) induziu um aumento da taxa de filtração glomerular (GFR; de 0,96 ± 0,02 para 1,28 ± 0,02 mL.g-1/min, P 0,05, 60 minutos). O presente trabalho sugere fortemente que proteases semelhantes à quimiotripsina desempenham um papel no metabolismo renal de guanilinas e descreve, pela primeira vez, os efeitos renais induzidos por um membro da família de inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk.