Spermatozoon head size - the main differentiating feature between spermatozoa of blue and white Arctic fox (Vulpes lagopus)

Abstract Morphology and sperm morphometry, this is an important determinant of male reproductive capacity. Morphometric data may provide relevant information in studies focused on evolutionary biology, sperm quality assessment, including prediction of the potential fertility, semen cryopreservation, or the effect of reprotoxicants. The paper presents the morphometric analysis of spermatozoa from two colour morphs of Arctic fox (Vulpes lagopus), and attempts to determine the relationship between selected quality indicators and dimensions and shape of spermatozoa. The research material consisted of ejaculates collected once by manual stimulation from 20 one-year-old Arctic foxes (10 individuals of the blue morph and 10 of the white morph). Ejaculates were analysed for standard parameters (volume, sperm concentration, total number of spermatozoa in the ejaculate) and used for the preparation of microscopic specimens. It was found that, the dimensions of spermatozoa from Arctic foxes depend on the male colour morphs. Spermatozoa from white Arctic foxes were significantly longer (by 1.82 µm) and had larger heads (0.32 µm longer and 0.15 µm wider) compared to spermatozoa from blue Arctic foxes (P<0.05). The interactions between particular sperm dimensions indicated the occurrence of gametes differing in shape. The all correlation coefficients between the morphometric traits of spermatozoa were statistically significant. Our research proved that in the blue Arctic foxes, sperm dimensions (tail length and total sperm length) can be related to the percentage of spermatozoa with primary changes (respectively: r = -0.68 and r = -0.75; at P <0.05). However, in the case of white Arctic foxes, these characteristics depend on the ejaculate volume (respectively: r = 0.65 and r = 0.68; at P <0.05).

CARACTERIZAÇÃO E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE ONÇA-PINTADA (Panthera onca)

Um dos principais pontos da biotecnologia reprodutiva é a criopreservação de sêmen, que possibilita a criação de um banco genético de fácil acesso, bem como permite maximizar a utilização dos gametas masculinos. Portanto, objetivou-se primeiramente descrever as características morfológicas e ultraestruturais do sêmen fresco de onça-pintada e, posteriormente, comparar a qualidade do sêmen pós-descongelação, utilizando-se os diluidores à base de TRIS ou água de coco em pó (ACP-117c). Para tanto, foram utilizados cinco machos de onça-pintada que foram submetidos a duas coletas seminais por eletroejaculação. O sêmen foi avaliado quanto à motilidade total, vigor, funcionalidade da membrana espermática, atividade mitocondrial por meio do 3,3-diaminobenzidina (DAB) e morfologia dos espermatozoides, além das avaliações ultraestruturais por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e transmissão (MET), como também a análise morfométrica por meio do software Image J. Em seguida, foi realizado o processamento das amostras para criopreservação. Após o término das coletas, as amostras foram descongeladas e, realizadas as mesmas análises feitas nas amostras frescas, exceto a morfometria, além da avaliação computadorizada do sêmen (CASA), como também análise da integridade das membranas celulares por meio de análise de fluorescência e o teste de interação com membrana perivitelínea de ovo de galinha. Os resultados estão expressos na forma de média ± erro médio padrão. Os principais resultados do sêmen fresco foram: motilidade; vigor. As principais alterações morfológicas encontradas foram: na cabeça dos espermatozoides (9,0 ± 1,7%) e defeitos de cauda (12,5 ± 3,3%). A largura e o comprimento da cabeça foram 3,60 ± 0,03 m e 4,9 ± 0,02 m, respectivamente, peça intermediária 9,7 ± 0,3 m, cauda 54,5 ± 4,4 m, e o comprimento total do espermatozoide foi de 59,5 ± 0,1 m. Regiões electronlucentes foram encontradas na região do núcleo e aproximadamente 54 espirais mitocondriais na peça intermediária foram identificadas usando microscopia eletrônica. As maiores porcentagens de células foram classificadas como DAB I (46,6 ± 4,9%) e DAB II (38,0 ± 4,4%). No tocante à criopreservação, as amostras preservadas no TRIS apresentaram melhor resultado do que as preservadas no ACP-117c: maior motilidade pós-descongelação (46,0 ± 7,7% vs 20,9 ± 5,4% de espermatozoides móveis; p=), melhor funcionalidade da membrana (60,5 ± 4,2% vs 47,1 ± 2,5% de membrana funcional; p=) e maior atividade mitocondrial (21,5 ± 3,7% vs 11,8 ± 1,7%; p=). Em relação às avaliações ultraestruturais, a MEV mostrou que ambos os diluidores foram capazes de preservar o plasmalema espermático, mas a MET revelou a ocorrência de pontos electronlucentes, especialmente em amostras preservadas em ACP-117c. Além disso, um maior número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina foi observado com as amostras diluídas em TRIS em comparação com o ACP-117c (29,5 ± 3,3% vs 18,6 ± 1,5%; p=). Em conclusão, o diluidor TRIS apresentou melhores resultados do que o diluidor ACP-117c, para a criopreservação de sêmen de onça-pintada.

One of the main points of reproductive biotechnology is semen cryopreservation, which allows the creation of an easily accessible genetic bank, as well as maximizing the use of male gametes. Therefore, the objective was first to describe the morphological and ultrastructural characteristics of jaguar fresh semen, and then to compare the quality of the post-thawed semen using TRIS or powdered coconut water (ACP-117c) extender. For this, five male jaguars were submitted to two seminal collections by electroejaculation. Semen was evaluated for total motility, vigor, sperm membrane functionality, mitochondrial activity by 3,3'-diaminobenzidine (DAB) and sperm morphology, plus ultrastructural evaluation by scanning electron microscopy (SEM) and transmission (TEM), as well as morphometric analysis using a software (Image J). Then, the samples were cryopreserved. After the end of all collections, the samples were thawed and first performed the same analyzes made on fresh samples, except for morphometry, as well as computerized semen evaluation (CASA), as well as analysis of cell membrane integrity by fluorescence, and the interaction test with perivitelline chicken egg membrane. The main results of fresh semen were morphological abnormalities in sperm head (9 ± 1.7%) and tail defects (12.5 ± 3.3%). Head width and length were 3.6 ± 0.03 m and 4.9 ± 0.02 m, respectively, middle piece 9.7 ± 0.3 m, tail 54.5 ± 4.4 m, and the total sperm length was 59.5 ± 0.1 m. Electronlucent regions were found in the nucleus region and approximately 54 mitochondrial spirals in the middle piece were identified using TEM. The highest cell percentages were classified as DAB I (46.6 ± 4.9%) and DAB II (38 ± 4.4%). Regarding cryopreservation, samples preserved in TRIS showed better post-thaw motility (46.0 ± 7.7%) and membrane functionality (60.5 ± 4.2%) and greater mitochondrial activity (21.5 ± 3.7, respectively) than those preserved in ACP-117c (20.9 ± 5.4% mobile sperm; 47.1 ± 2.5% functional membrane; 11.8 ± 1.7% mitochondrial activity). Regarding ultrastructural evaluations, SEM showed that both extenders were able to preserve sperm membrane, but MET revealed electronlucent points, especially in samples preserved in ACP-117c. In addition, a higher number of perivitelline membrane-bound sperm (29.5 ± 3.3%) was observed with samples diluted in TRIS compared with ACP-117c (18.6 ± 1.5%). In conclusion, we suggest the TRIS extender for jaguar semen cryopreservation.

Sperm morphological and morphometric evaluation in captive collared peccaries (Pecari tajacu) / Avaliação morfológica e morfométrica de espermatozoides de catetos (Pecari tajacu)

The aim of this study was to compare different staining methods for the evaluation of sperm morphology by light microscopy and also to describe the morphometry of the entire sperm in collared peccaries (Pecari tajacu). Semen from 10 males was obtained by electroejaculation and evaluated for sperm motility, vigor, and concentration. Semen smears were prepared through three different staining methods: Bengal rose, brome-phenol blue, and eosin-nigrosin. Smears were evaluated under light microscopy and sperm morphologic alterations were determined in percentage. In addition, sperm morphometric analysis was conducted by light microscopy coupled to image analyzer software. The smears stained with Bengal Rose provide the best results for the visualization of the sperm tail, midpiece, and head. The use of eosin-nigrosin stain did not allow an adequate impregnation, and some sperm presented a few contrasts with the background. A higher incidence of bent coiled tails was verified in the use of brome-phenol blue staining (P<0.05). Through morphometric evaluation, it was observed that the tail occupies the greatest proportion (89%) of the sperm which presents a discretely elongated head. According to the results, the use of the Bengal Rose stain is recommended for the morphologic evaluation of the collared peccary sperm.(AU)

O objetivo deste estudo foi comparar diferentes métodos de coloração para avaliação da morfologia espermática por microscopia de luz e também descrever a morfometria completa de espermatozoides de catetos (Pecari tajacu). Sêmen de 10 machos foi obtido por eletroejaculação e avaliado quanto à motilidade espermática, vigor e concentração. Foram preparados por três diferentes métodos de coloração: Rosa de Bengala, Azul de Bromofenol e Eosina-Nigrosina. Os esfregaços foram avaliados por microscopia de luz, e determinado o percentual das alterações morfológicas. Ainda, a análise da morfometria espermática foi realizada por microscópio de luz acoplado a um softwere de análise de imagens. Os esfregaços corados com Rosa de Bengala apresentaram melhores resultados de visualização da cauda, peça intermediária e cabeça dos espermatozoides. O uso do corante Eosina-Nigrosina não permitiu uma adequada impregnação e alguns dos espermatozoides apresentaram pouco contraste com o fundo da lâmina. Uma maior incidência de cauda fortemente enrolada foi verificada com o uso do corante Azul de Bromofenol (P<0.05). Através da avaliação morfométrica foi observada que a cauda ocupa a maior proporção (89%) do espermatozoide, e a cabeça apresenta-se discretamente alongada. De acordo com os resultados, o uso do corante Rosa de Bengala é recomendado para a avaliação morfológica de espermatozoides de catetos.(AU)

PRESENÇA DE GOTA CITOPLASMÁTICA E SEUS EFEITOS NA MORFOMETRIA, CROMATINA E MOTILIDADE ESPERMÁTICA E IDENTIFICAÇÃO DE GENES CANDIDATOS À SELEÇÃO DE PARÂMETROS SEMINAIS DE SUÍNOS

O principal desafio do desempenho reprodutivo de machos suínos está relacionado a duas grandes frentes de estudo que englobam a qualidade do ejaculado/doses inseminantes e fertilidade dos reprodutores. A fim de elucidar alguns pontos relacionados a estas frentes de estudo, foram realizadas três pesquisas com o objetivo de a) verificar se a presença de gota citoplasmática está associada a características morfométricas e a cromatina espermática; b) verificar se a reprovação de ejaculados devido à alta ocorrência de gota citoplasmática distal interfere em parâmetros relacionados ao movimento espermático e; c) averiguar se há correlação entre parâmetros seminais com marcadores genéticos específicos em reprodutores. No primeiro estudo, foram avaliados 1 207 espermatozoides normais e 725 com presença de gota citoplasmática em relação à morfometria da cabeça e a estabilidade da cromatina espermática. As cabeças dos espermatozoides do grupo com gota citoplasmática apresentaram-se mais alongadas, simétricas lateralmente, com maior porcentagem de descompactação e maior heterogeneidade da cromatina do que células sem alteração morfológica. Isto indica que alterações morfológicas que não ocorrem diretamente na cabeça do espermatozoide estão associadas com características da conformação da cabeça e da estrutura do material genético da célula. No segundo estudo, foi realizada a comparação de parâmetros relacionados ao movimento espermático em ejaculados considerados aprovados (n=144) e reprovados (n=25) exclusivamente por terem alta ocorrência de gota citoplasmática distal no exame morfológico. O grupo reprovado apresentou espermatozoides com menor velocidade em linha reta, menor motilidade total e progressiva quando comparado ao grupo aprovado no exame morfológico. A reprovação por gota citoplasmática distal, que para diversos autores é considerada sem significado patológico, influenciou negativamente os parâmetros relacionados ao movimento espermático, o que sugere que a reprovação, por esta causa, passe a ser considerada nas avaliações de morfologia espermática. Na terceira pesquisa, foi realizado um estudo de associação de regiões genômicas com os parâmetros volume do ejaculado, concentração espermática, motilidade total e progressiva do espermatozoide, utilizando 113 reprodutores suínos da raça Duroc genotipados pelo Illumina PorcineSNP60 BeadChip. Um total de 57 janelas de SNPs (polimorfismo de nucleotídeos únicos) que explicaram mais de 1% de variância genética aditiva foram identificadas para volume (22), concentração (14), motilidade total (10) e progressiva (11). Treze genes de oito janelas de SNPs foram considerados candidatos para as características estudadas. O gene ABCC3 foi relacionado ao volume do ejaculado, os genes KCNA3, RBM15 e ITGB1 à concentração espermática, o gene WRNIP1 à motilidade total, os genes FAM189A2, C9orf135, FXN e FAM83D à motilidade progressiva e os genes HSD17B11 e HSD17B13 à motilidade total e progressiva. A identificação de possíveis genes candidatos para as diferentes características seminais de reprodutores pode contribuir para a evolução do conhecimento da base genética de suínos e ainda aperfeiçoar o processo de seleção de animais a serem utilizados em Centrais de Inseminação Artificial.

The main challenge of boars reproductive performance is related with two major lines of study that include the quality of the ejaculate/inseminating doses and boars fertility. In order to elucidate some points related to these lines, three studies were carried out with the aim of a) verify if the cytoplasmic droplet presence in sperm is associated with morphometric and chromatin characteristics; b) verify if reprobation of ejaculates due to high occurrence of distal cytoplasmic droplets interferes in spermatic movement parameters; c) investigate if there is a correlation among seminal parameters with specific genetic markers in boars. In the first study, 1,207 normal sperm and 725 sperm with cytoplasmic droplet were evaluated in relation to head morphometry and chromatin stability. Heads of sperm with cytoplasmic droplets were more elongated, laterally symmetrical, had higher percentage of decondensed chromatin and more heterogeneous chromatin than heads of normal sperm. These results indicate that morphological changes that do not occur directly on sperm head are associated with the conformation of the head and the structure of cell genetic material. In the second study it was compared parameters related to sperm movement in ejaculates considered approved (n=144) and rejected (n=25) exclusively due the high occurrence of distal cytoplasmic droplets on morphological exam. Sperm of rejected group presented lower velocity straight line, lower total and progressive motility than sperm of approved group. The reprobation due distal cytoplasmic droplet, which by several authors is considered without pathological significance, had a negative influence on sperm motion parameters. It suggests that reprobation for this cause should be considered in sperm morphology assessments. In the third research, a genome-wide association study was performed with ejaculate volume, sperm concentration and total and progressive sperm motility, using 113 Duroc boars genotyped by Illumina PorcineSNP60 BeadChip. A total of 57 SNPs (single nucleotide polymorphism) windows that explained more than 1% of genetic variance were identified for ejaculate volume (22), sperm concentration (14), total (10) and progressive (11) motility. Thirteen genes of eight SNPs windows were considered candidates for those characteristics. Gene ABCC3 was related to volume, genes KCNA3, RBM15 and ITGB1 to sperm concentration, gene WRNIP1 to total motility, genes FAM189A2, C9orf135, FXN and FAM83D to progressive motility and genes HSD17B11 and HSD17B13 to total and progressive motility. The identification of possible candidate genes for the different seminal characteristics of boars can contribute to knowledge of the genetic background of swine production and also to improve the selection process of boars to be used in boar studs.

Avaliação computacional da compactação da cromatina e de características morfométricas da cabeça de espermatozoides de coelho (Oryctolagus cuniculus) / Computational evaluation of chromatin condensation and morphometric characteristics of rabbit (Oryctolagus cuniculus) sperm head

Investigou-se a correlação entre a morfometria da cabeça e a intensidade da condensação e heterogeneidade da cromatina em espermatozoides de coelho (Oryctolagus cuniculus). Para tal, utilizaram-se 35 esfregaços de sêmen de coelhos da raça Nova Zelândia, corados com azul de toluidina e avaliados por análise de imagem computacional. As imagens foram obtidas digitalmente em tons de cinza e avaliadas por algoritmos desenvolvidos em ambiente de programação Scilab. As mensurações obtidas da cabeça dos espermatozoides foram área, perímetro, comprimento, largura, relação comprimento largura, elipsidade, fator de forma, descritores Fourier e simetria lateral e anteroposterior. Também foram avaliadas a intensidade da compactação e a heterogeneidade da cromatina espermática. Os espermatozoides de coelho apresentaram compactação e heterogeneidade cromatínica mais intensas do que os de touro e observou-se correlação significativa entre características morfométricas da cabeça e compactação e heterogeneidade cromatínica. Conclui-se que a cromatina é importante para a constituição morfológica da cabeça de espermatozoides de coelho e que a cromatina espermática de coelho é naturalmente mais heterogênea e menos compactada que a de touro.(AU)

The correlation between the head morphometry and the intensity of condensation and heterogeneity of sperm chromatin were investigated in rabbit (Oryctolagus cuniculus). To this, 35 semen smears from New Zealand rabbits were stained with toluidine blue and evaluated by computer image analysis. The images were obtained in digital grayscale and analyzed by algorithms developed in the Scilab programming environment. The measurements obtained from the sperm heads were area, perimeter, length, width, length:width ratio, ellipticity, shape factor, lateral and anterior-posterior symmetries, and Fourier descriptors. The intensity and heterogeneity of the compaction of sperm chromatin was also evaluated. The rabbit spermatozoa showed chromatin heterogeneity and condensation more intense than the bull spermatozoa, and it was observed correlation between morphometric characteristics of the head and chromatin compaction and heterogeneity. The results suggest that chromatin is important for the morphological constitution of the head morphology spermatozoa head, as well as, rabbit sperm chromatin is inherently more heterogeneous and less condensed than the bull sperm chromatin.(AU)