Possibilidades do uso do RNA espermático como ferramenta na suinocultura / Possibilities of using sperm's RNA as a tool in pig farming

A seleção de macho mais férteis é essencial para a suinocultura moderna, a análise do transcriptoma espermático tem se mostrado como uma ferramenta interessante para podermos escolher animais com maior potencial de fertilidade ou congelabilidade de sêmen. O objetivo da presente revisão foi caracterizar os RNA encontrados em espermatozoides suínos e apresentar possíveis finalidades de seu uso na suinocultura. Por sofrer mudanças estruturais significativas, como meiose, compactação do DNA e perda de parte do citoplasma, as linhagens celulares que dão origem aos espermatozoides também apresentam uma população singular na população RNA. Os espermatozoides carregam um transcriptoma heterogêneo, com mRNA e muitos pequenos RNA truncados e de difícil avaliação. Eventos como congelamento, capacitação e estresse térmico causam alteração nos perfis de RNA espermático. Existem RNA que podemos relacionar como marcadores moleculares para diversas funções, além disso, há muitas evidências de que o RNA espermático contribua na modulação gênica durante a fertilização e desenvolvimento embrionário inicial, tornando estes em um importante alvo para estudos futuros.

The selection of fertile males is essential for modern pig farming, the sperm transcriptome analysis has been shown to be an interesting tool to be able to choose animals with greater fertility potential or semen freezeability. The aim of this review was to characterize the RNA found in boar spermatozoa and to present possible purposes for its use in pig farming. By undergoing significant structural changes, such as meiosis, DNA compaction and loss of part of the cytoplasm, spermatic cells also have a unique population in the RNA population. Sperm carry a heterogeneous transcriptome, with mRNA and many small and truncated RNAs. Events such as freezing, capacitation and heat stress cause changes in sperm RNA profiles. There are RNAs that we can relate as molecular markers for several functions, in addition, there is evidence that sperm RNA contributes to gene modulation during fertilization and early embryonic development, making these an important target for future studies.

Campylobacter jejuni and Campylobacter coli originated from chicken carcasses modulate their transcriptome to translate virulence genes in human cells / Campylobacter jejuni e Campylobacter coli originadas de carcaças de frango modulam seu transcriptoma para traduzir genes de virulência em células humanas

The aim was to determine the spread of genetically similar profiles of Campylobacter in chicken carcasses and evaluate their ability to produce transcripts for ciaB, dnaJ, p19 and sodB genes, before and after cultivation in Caco-2 cells. The strains used were isolated from 420 samples of chicken carcasses chilled and frozen ready for marketing. The species were identified by PCR-multiplex, the phylogeny was determined by RAPD-PCR and the presence of transcripts was performed by RT-PCR. We identified 74 (17.6%) of Campylobacter strains, being 55 (74.3%) C. jejuni and 19 (25.7%) C. coli. The phylogenetic relationship demonstrated heterogeneity between isolates of the same species, with absence of clones, indicating the high level of diversity of circulating genotypes. The gene transcription showed conflicting results before and after the culture in Caco-2 cell, so that before cultivation isolates showed greater capacity to transcribe genes related to survival and after the interaction with human cells, the strains showed higher potential to transcribe genes associated with virulence. The result of this study contributes to the understanding of how these seemingly fragile microorganisms are the most prevalent bacterial agents in human gastroenteritis.(AU)

O objetivo foi determinar a disseminação de perfis geneticamente semelhantes de Campylobacter em carcaças de frango e avaliar sua capacidade de produzir transcritos para os genes ciaB, dnaJ, p19 e sodB, antes e após o cultivo em células Caco-2. As cepas utilizadas foram isoladas de 420 amostras de carcaças de frango resfriadas e congeladas prontas para comercialização. As espécies foram identificadas por PCR-multiplex, a filogenia foi determinada por RAPD-PCR e a presença de transcritos foi realizada por RT-PCR. Identificamos 74 (17,6%) das cepas de Campylobacter, sendo 55 (74,3%) C. jejuni e 19 (25,7%) C. coli. A relação filogenética demonstrou heterogeneidade entre isolados da mesma espécie, com ausência de clones, indicando o alto nível de diversidade dos genótipos circulantes. A transcrição gênica mostrou resultados conflitantes antes e após a cultura em células Caco-2, de modo que, antes do cultivo, os isolados apresentaram maior capacidade de transcrever genes relacionados à sobrevivência e após a interação com células humanas, as linhagens apresentaram maior potencial para transcrever genes associados à virulência. O resultado deste estudo contribui para a compreensão de como esses microrganismos aparentemente frágeis são os agentes bacterianos mais prevalentes na gastroenterite humana.(AU)

Campylobacter jejuni and Campylobacter coli originated from chicken carcasses modulate their transcriptome to translate virulence genes in human cells / Campylobacter jejuni e Campylobacter coli originadas de carcaças de frango modulam seu transcriptoma para traduzir genes de virulência em células humanas

The aim was to determine the spread of genetically similar profiles of Campylobacter in chicken carcasses and evaluate their ability to produce transcripts for ciaB, dnaJ, p19 and sodB genes, before and after cultivation in Caco-2 cells. The strains used were isolated from 420 samples of chicken carcasses chilled and frozen ready for marketing. The species were identified by PCR-multiplex, the phylogeny was determined by RAPD-PCR and the presence of transcripts was performed by RT-PCR. We identified 74 (17.6%) of Campylobacter strains, being 55 (74.3%) C. jejuni and 19 (25.7%) C. coli. The phylogenetic relationship demonstrated heterogeneity between isolates of the same species, with absence of clones, indicating the high level of diversity of circulating genotypes. The gene transcription showed conflicting results before and after the culture in Caco-2 cell, so that before cultivation isolates showed greater capacity to transcribe genes related to survival and after the interaction with human cells, the strains showed higher potential to transcribe genes associated with virulence. The result of this study contributes to the understanding of how these seemingly fragile microorganisms are the most prevalent bacterial agents in human gastroenteritis.(AU)

O objetivo foi determinar a disseminação de perfis geneticamente semelhantes de Campylobacter em carcaças de frango e avaliar sua capacidade de produzir transcritos para os genes ciaB, dnaJ, p19 e sodB, antes e após o cultivo em células Caco-2. As cepas utilizadas foram isoladas de 420 amostras de carcaças de frango resfriadas e congeladas prontas para comercialização. As espécies foram identificadas por PCR-multiplex, a filogenia foi determinada por RAPD-PCR e a presença de transcritos foi realizada por RT-PCR. Identificamos 74 (17,6%) das cepas de Campylobacter, sendo 55 (74,3%) C. jejuni e 19 (25,7%) C. coli. A relação filogenética demonstrou heterogeneidade entre isolados da mesma espécie, com ausência de clones, indicando o alto nível de diversidade dos genótipos circulantes. A transcrição gênica mostrou resultados conflitantes antes e após a cultura em células Caco-2, de modo que, antes do cultivo, os isolados apresentaram maior capacidade de transcrever genes relacionados à sobrevivência e após a interação com células humanas, as linhagens apresentaram maior potencial para transcrever genes associados à virulência. O resultado deste estudo contribui para a compreensão de como esses microrganismos aparentemente frágeis são os agentes bacterianos mais prevalentes na gastroenterite humana.(AU)

Campylobacter jejuni and Campylobacter coli originated from chicken carcasses modulate their transcriptome to translate virulence genes in human cells

ABSTRACT: The aim was to determine the spread of genetically similar profiles of Campylobacter in chicken carcasses and evaluate their ability to produce transcripts for ciaB, dnaJ, p19 and sodB genes, before and after cultivation in Caco-2 cells. The strains used were isolated from 420 samples of chicken carcasses chilled and frozen ready for marketing. The species were identified by PCR-multiplex, the phylogeny was determined by RAPD-PCR and the presence of transcripts was performed by RT-PCR. We identified 74 (17.6%) of Campylobacter strains, being 55 (74.3%) C. jejuni and 19 (25.7%) C. coli. The phylogenetic relationship demonstrated heterogeneity between isolates of the same species, with absence of clones, indicating the high level of diversity of circulating genotypes. The gene transcription showed conflicting results before and after the culture in Caco-2 cell, so that before cultivation isolates showed greater capacity to transcribe genes related to survival and after the interaction with human cells, the strains showed higher potential to transcribe genes associated with virulence. The result of this study contributes to the understanding of how these seemingly fragile microorganisms are the most prevalent bacterial agents in human gastroenteritis.

RESUMO: O objetivo foi determinar a disseminação de perfis geneticamente semelhantes de Campylobacter em carcaças de frango e avaliar sua capacidade de produzir transcritos para os genes ciaB, dnaJ, p19 e sodB, antes e após o cultivo em células Caco-2. As cepas utilizadas foram isoladas de 420 amostras de carcaças de frango resfriadas e congeladas prontas para comercialização. As espécies foram identificadas por PCR-multiplex, a filogenia foi determinada por RAPD-PCR e a presença de transcritos foi realizada por RT-PCR. Identificamos 74 (17,6%) das cepas de Campylobacter, sendo 55 (74,3%) C. jejuni e 19 (25,7%) C. coli. A relação filogenética demonstrou heterogeneidade entre isolados da mesma espécie, com ausência de clones, indicando o alto nível de diversidade dos genótipos circulantes. A transcrição gênica mostrou resultados conflitantes antes e após a cultura em células Caco-2, de modo que, antes do cultivo, os isolados apresentaram maior capacidade de transcrever genes relacionados à sobrevivência e após a interação com células humanas, as linhagens apresentaram maior potencial para transcrever genes associados à virulência. O resultado deste estudo contribui para a compreensão de como esses microrganismos aparentemente frágeis são os agentes bacterianos mais prevalentes na gastroenterite humana.

Gut transcriptome analysis on females of Ornithodoros mimon (Acari: Argasidae) and phylogenetic inference of ticks / Transcriptoma do intestino de fêmeas de Ornithodoros mimon (Acari: Argasidae) e inferência filogenética de carrapatos

Ornithodoros mimon is an argasid tick that parasitizes bats, birds and opossums and is also harmful to humans. Knowledge of the transcripts present in the tick gut helps in understanding the role of vital molecules in the digestion process and parasite-host relationship, while also providing information about the evolution of arthropod hematophagy. Thus, the present study aimed to know and ascertain the main molecules expressed in the gut of argasid after their blood meal, through analysis on the gut transcriptome of engorged females of O. mimon using 454-based RNA sequencing. The gut transcriptome analysis reveals several transcripts associated with hemoglobin digestion, such as serine, cysteine, aspartic proteases and metalloenzymes. The phylogenetic analysis on the peptidases confirmed that most of them are clustered with other tick genes. We recorded the presence a cathepsin O peptidase-coding transcript in ticks. The topology of the phylogenetic inferences, based on transcripts of inferred families of homologues, was similar to that of previous reports based on mitochondrial genome and nuclear rRNA sequences. We deposited 2,213 sequence of O. mimon to the public databases. Our findings may help towards better understanding of important argasid metabolic processes, such as digestion, nutrition and immunity.(AU)

Ornithodoros mimon é um carrapato argasídeo parasita de morcegos, aves e marsupiais, além de ser bastante agressivo aos humanos. O conhecimento dos transcritos presentes no intestino dos carrapatos auxilia no entendimento do papel de moléculas vitais no processo de digestão e na relação parasito-hospedeiro, além de fornecer também informações sobre a evolução dos artrópodes hematófagos. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo conhecer e identificar as principais moléculas expressas no intestino de uma espécie de carrapato argasídeo após o repasto sanguíneo, através de uma análise transcritômica descritiva do intestino de fêmeas ingurgitadas de O. mimon, utilizando um sequenciamento de RNA de nova geração da plataforma 454. Além de inferir a relação filogenética de carrapatos através de um conjunto de dados transcritômicos. O transcriptoma do intestino revelou diversos transcritos associados com a digestão da hemoglobina, como proteinases das classes serino, cisteína, aspártica e metalo. Registramos a presença de um transcrito de uma cisteína peptidase do tipo catepsina O em carrapatos. A inferência filogenética baseada em conjunto de dados transcritos homólogos tem uma resolução topológica similar a de outros conjuntos de dados moleculares. Foram depositados no banco de dados gênico público 2213 transcritos de O. mimon. Os achados obtidos no presente estudo podem contribuir para compreensão dos importantes processos, como digestão, nutrição e imunidade dos carrapatos da família Argasidae, além de fornecer informações sobre a filogenia da ordem Ixodida.(AU)

Transcriptome analysis for the restrained stem development of the wheat mutant dms / Desenvolvimento e análise de transcriptoma de uma haste de trigo mutante dms

Wheat (Triticum aestivum L.) stem development significantly affects grain yield. The dwarf plants (D) of wheat mutant dms was less than 30cm. Here, we were to explore the molecular basis for the restrained stem development of the dwarf plants. The results were reached by compare the young spikes and stems transcriptomes of the tall (T) and D plants of mutant dms. We identified 663 genes highly expressed in stem tips. We identified 997 differentially expressed genes (DEGs) in stem tips between T and D, 403 DEGs were significantly related with stem development. Most biological processes in stem tips on dwarf plants were significantly suppressed, such as phytohormone signaling etc. The sequencing analysis results were confirmed by quantitatively analysis the expression profiles of fourteen key DEGs via real-time QRT-PCR. We identified a group genes related to wheat stem development, identified a group DEGs related to the restrained stem development of D plants of dms. The suppressed phytohormone signaling, carbohydrate transport and metabolism were the major causal factors leading to dwarf plants of D. Our dataset provides a useful resource for investigating wheat stem development.

O desenvolvimento da haste do trigo (Triticum aestivum L.) afeta significativamente o rendimento dos grãos. A partir disso, empregou-se a base molecular para o desenvolvimento de uma haste de variedade de trigo. Os resultados foram alcançados ao conferir as hastes de um mutante de trigo DMS. Identificou-se 663 genes altamente expressos na haste; 997 genes (DEGs) diferentemente expressos em hastes entre T e D e; 403 DEGs foram significativamente diferentes. A maioria dos processos biológicos de caule tipo nمo plantas foram significativamente suprimidas, com o fito hormônio de sinalização. Os resultados da análise de sequencia foram confirmados pela expressão quantitativa de perfis de catorze chave DEGs através de qRT-PCR em tempo real. Nota-se um grupo de genes relacionados com a haste de trigo de desenvolvimento. Identificou-se um grupo DEGs relacionados com o desenvolvimento de um tronco D plantas de DMS. O fito hormônio de sinalização, transporte e metabolismo de hidratos de carbono foram os principais fatores suscetíveis das plantas anão de D. Nosso conjunto de dados fornece um recurso ْtil para investigar o desenvolvimento do caule de trigo.

Transcriptome analysis for the restrained stem development of the wheat mutant dms / Desenvolvimento e análise de transcriptoma de uma haste de trigo mutante dms

Wheat (Triticum aestivum L.) stem development significantly affects grain yield. The dwarf plants (D) of wheat mutant dms was less than 30cm. Here, we were to explore the molecular basis for the restrained stem development of the dwarf plants. The results were reached by compare the young spikes and stems transcriptomes of the tall (T) and D plants of mutant dms. We identified 663 genes highly expressed in stem tips. We identified 997 differentially expressed genes (DEGs) in stem tips between T and D, 403 DEGs were significantly related with stem development. Most biological processes in stem tips on dwarf plants were significantly suppressed, such as phytohormone signaling etc. The sequencing analysis results were confirmed by quantitatively analysis the expression profiles of fourteen key DEGs via real-time QRT-PCR. We identified a group genes related to wheat stem development, identified a group DEGs related to the restrained stem development of D plants of dms. The suppressed phytohormone signaling, carbohydrate transport and metabolism were the major causal factors leading to dwarf plants of D. Our dataset provides a useful resource for investigating wheat stem development.(AU)

O desenvolvimento da haste do trigo (Triticum aestivum L.) afeta significativamente o rendimento dos grãos. A partir disso, empregou-se a base molecular para o desenvolvimento de uma haste de variedade de trigo. Os resultados foram alcançados ao conferir as hastes de um mutante de trigo DMS. Identificou-se 663 genes altamente expressos na haste; 997 genes (DEGs) diferentemente expressos em hastes entre T e D e; 403 DEGs foram significativamente diferentes. A maioria dos processos biológicos de caule tipo nمo plantas foram significativamente suprimidas, com o fito hormônio de sinalização. Os resultados da análise de sequencia foram confirmados pela expressão quantitativa de perfis de catorze chave DEGs através de qRT-PCR em tempo real. Nota-se um grupo de genes relacionados com a haste de trigo de desenvolvimento. Identificou-se um grupo DEGs relacionados com o desenvolvimento de um tronco D plantas de DMS. O fito hormônio de sinalização, transporte e metabolismo de hidratos de carbono foram os principais fatores suscetíveis das plantas anão de D. Nosso conjunto de dados fornece um recurso ْtil para investigar o desenvolvimento do caule de trigo.(AU)

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE miRNA EM FERIDAS TRATADAS COM ÓLEO DE COPAÍBA

Objetivou-se analisar o transcriptoma de miRNA de feridas cutâneas experimentais de equinos tratadas ou não com óleo de copaíba a partir de amostras anteriormente biopsiadas, fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). A cicatrização de feridas é um processo biológico que restaura a integridade física da pele. Biópsias obtidas e armazenadas há sete anos pelo método FFPE de feridas experimentais em região metacárpica de quatro animais foram utilizadas, sendo provenientes da borda da ferida e do tecido sadio subjacente equinos do grupo controle e do tratamento, que receberam óleo de copaíba a 10% topicamente. A extração de RNA, devidamente quantificado e qualificado foi realizada para processamento de miRNA. As amostras escaneadas pelo GeneAtlas (Affymetrix®) e genes identificados com auxílio do software Transcriptome Analysis Console (Affymetrix®), empregando-se a analise estatistica ANOVA (fold change ± 1,5; FDR corrigido P < 0,05). Comparando-se os grupos tratamento e controle, três miRNAs equinos diferencialmente expressos foram identificados: eca-miR-450c, eca-miR-98 e eca-miR-487b, todos supra regulados no grupo tratamento.

The aim was analyze the miRNA transcriptome of skin wound in horses treated or not with copaíba oil from fixed in formalin and embedded in paraffin (FFPE) samples previously biopsied. Wound healing is a biological process that restores skin physical integrity. Biopsies obtained and stored seven years ago by FFPE method of experimental wounds in the metacarpal region of four animals were used, coming from the wound margins and the underlying healthy tissue of the control and treatment group horses, which received 10% copaíba oil topically. The properly quantified and qualified RNA extraction was performed for miRNA processing. The samples scanted by GeneAtlas (Affymetrix®) and genes identified with the aid of the Transcriptome Analysis Console (Affymetrix® software), using the statistical analysis ANOVA (fold change ± 1.5; FDR corrected p < 0.05). Comparing the treatment and control groups, three differentially expressed equine miRNAs were identified: eca-miR-450c, eca-miR- 98 and eca-miR-487b, all superregulated in the treatment group.

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE ZINCO NO PERFIL PROTEÔMICO E METALÔMICO DA GELEIA REAL E NO TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera L.

As abelhas A. mellifera possuem necessidades específicas de nutrientes para que possam desenvolver todo o seu potencial produtivo e reprodutivo, visando a sobrevivência e manutenção da colônia. Neste projeto avaliamos duas fontes de zinco (orgânico e inorgânico), em diferentes concentrações e seus reflexos no perfil metaloproteômico da geleia real e no transcriptoma de abelhas com 6 dias de idade. Foram utilizadas 35 colônias de abelhas A. mellifera, distribuídas aleatoriamente nos seguintes tratamentos (05 colmeias por tratamento): controle: xarope de açúcar sem suplementação de zinco; ZNI25: xarope de açúcar suplementado com 25 ppm de Zn inorgânico; ZNI50: xarope de açúcar suplementado com 50 ppm de Zn inorgânico; ZNI75: xarope de açúcar suplementado com 75 ppm de Zn inorgânico; ZNO25: xarope de açúcar suplementado com 25 ppm de Zn orgânico; ZNO50: xarope de açúcar suplementado com 50 ppm de Zn orgânico; ZNO75: xarope de açúcar suplementado com 75 ppm de Zn orgânico. A fonte de zinco inorgânico foi o sulfato de zinco monohidratado (37,4% de zinco) e a fonte orgânica de zinco metionina (16% de zinco), diluída em xarope de açúcar. Os níveis reais de zinco foram determinados por espectrometria de absorção atômica (FAAS). As abelhas A. mellifera recém-emergidas foram marcadas ao final de 30 dias de suplementação com caneta atóxica, na região pronoto e suas coletas para análise do transcriptoma foram realizadas aos 6 dias de idade em sua fase de nutriz, com exatamente 36 dias de experimento. Para a análise do metaloproteoma da geleia real, foi induzido a produção de geleia real pelo método de transferência de larvas. Assim que coletada, o teor proteico das amostras era mensurado por espectrômetro de UV visível, as proteínas eram separadas pela eletroforese bidimensional (2D page) e as metaloproteínas separadas por espectrômetro de absorção atômica. Todas as funções biológicas associadas as metaloproteínas que continham zinco foram identificados por espectrômetro de absorção atômica. Nossos resultados sugerem que as menores concentrações de zinco orgânico (ZNO 25) alteram o maior número de expressão diferencial de proteínas da geleia real e também aumentam a concentração proteica das amostras. Em relação as análises do transcriptoma, nossos resultados sugerem que os maiores níveis de zinco inorgânico (ZNI 75) alteram a maior via de genes relacionados a importantes processos fisiológicos, entretanto, somente as menores concentrações de zinco de fonte orgânica (ZNO25) apresentaram grande aumento de genes diferencialmente expressos quando relacionados ao grupo controle (ZN0).

A. mellifera bees have specific nutrient needs so that they can develop their full productive and reproductive potential, aiming at colony survival and maintenance. In this project, we evaluated two sources of zinc (organic and inorganic), at different concentrations and their effects on the metalloproteomic profile of royal jelly and the transcriptome of 6-day-old bees. Thirty-five colonies of A. mellifera bees were used, randomly distributed in the following treatments (05 hives per treatment): control: sugar syrup without zinc supplementation; ZNI25: sugar syrup supplemented with 25 ppm inorganic Zn; ZNI50: sugar syrup supplemented with 50 ppm inorganic Zn; ZNI75: sugar syrup supplemented with 75 ppm inorganic Zn; ZNO25: sugar syrup supplemented with 25 ppm organic Zn; ZNO50: sugar syrup supplemented with 50 ppm organic Zn; ZNO75: Sugar syrup supplemented with 75 ppm organic Zn. The inorganic zinc source was zinc sulfate monohydrate (37.4% zinc) and the organic zinc source methionine (16% zinc), diluted in sugar syrup. Actual zinc levels were determined by atomic absorption spectrometry (FAAS). The newly emerged A. mellifera bees were tagged at the end of 30 days of supplementation with a non-toxic pen, in the pronotum region, and their collections for transcriptome analysis were carried out at 6 days of age in their nursing phase, with exactly 36 days of the experiment. . For the analysis of the royal jelly metalloproteome, royal jelly production was induced by the larval transfer method. Once collected, the protein content of the samples was measured by a visible UV spectrometer, the proteins were separated by two-dimensional electrophoresis (2D page) and the metalloproteins were separated by an atomic absorption spectrometer. All biological functions associated with zinc-containing metalloproteins were identified by an atomic absorption spectrometer. Our results suggest that the lower concentrations of organic zinc (ZNO 25) alter the greater number of differential expressions of royal jelly proteins and also increase the protein concentration of the samples. Regarding the transcriptome analyses, our results suggest that the highest levels of inorganic zinc (ZNI 75) alter the largest pathway of genes related to important physiological processes, however, only the lowest concentrations of zinc from an organic source (ZNO25) showed a large increase of differentially expressed genes when related to the control group (ZN0)

TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera L. CAMPEIRAS EXPOSTAS À DOSE AMBIENTALMENTE RELEVANTE DO FIPRONIL

No presente estudo, analisaram-se as alterações na expressão gênica de abelhas Apis mellifera na fase de campeiras expostas á dose ambientalmente relevante do agrotóxico fipronil. Para isso, abelhas operárias com 21 dias de idade, previamente marcadas na região do tórax, foram coletadas de suas respectivas colmeias, mantidas em jejum por 3 horas sendo, em seguida, expostas ao alimento contaminado ou não com fipronil na concentração 2,5 ppb/abelha. Após uma e quatro horas de exposição, 15 abelhas de cada tratamento foram encaminhadas para a análise do transcriptoma. Observou-se efeito na expressão gênica após quatro horas de exposição com redução na expressão de 11 genes, sendo relacionados com o sistema digestório das abelhas os genes: endoglucanase E-4, transcription activator MSS11, inositol monophosphatase 2 - transcript variant X1, ATP-binding cassette sub-family G member 5 e cuticular protein 28; relacionados com a composição do exoesqueleto: cuticular protein 28; relacionados com transporte de vitamina E e sistema antioxidante: alpha-tocopherol e relacionado com o ritmo circadiano e o relógio biológico endógeno das abelhas: circadian clock-controlled protein. Os resultados indicam que o inseticida fipronil provoca alterações na expressão de genes os quais podem acarretar modificações fisiológicas, morfológicas, no metabolismo, comportamento de abelhas Apis mellifera com consequente declínio da colônia.

In the present study, were analyzed the changes in gene expression of Apis mellifera bees during the forager phase exposed to an environmentally relevant dose of the pesticide fipronil. For this, 21-day-old worker bees, previously marked in the thorax region, were collected from their beehives, fasted for 3 hours and then exposed to food contaminated or not with fipronil at a concentration of 2.5 ppb/bee. After one and four hours of exposure, 15 bees from each treatment were referred for transcriptome analysis. Was observed reduction in the expression of 11 genes, after four hours of exposure, related to the digestive system of bees: endoglucanase E-4, transcription activator MSS11, inositol monophosphatase 2 - transcript variant X1, ATPbinding cassette, G subfamily, member 5 and cuticular protein 28; related to an exoskeleton composition: cuticular protein 28; related to vitamin E transport and antioxidant system: alphatocopherol and related to circadian rhythm and the endogenous biological clock of bees: protein controlled by the circadian clock. The results indicate that the insecticide fipronil causes changes in the expression of genes which can lead to physiological, morphological changes, metabolism and behavior in Apis mellifera bees with consequent colony decline.

SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO NA ELUCIDAÇÃO DE MECANISMOS GENÉTICOS ENVOLVIDOS NO ACOMETIMENTO DE HÉRNIA ESCROTAL EM SUÍNOS

A hérnia escrotal (HE), por se tratar de uma característica complexa, muitos genes podem influenciar este fenótipo, dessa maneira, a etiologia das HE permanece obscura. Com o intuito identificar potenciais marcadores que desempenham um papel importante no desenvolvimento da HE, foram realizadas duas análises com sequenciamento de nova geração. Na primeira análise, objetivamos identificar os mecanismos biológicos e genéticos envolvidos em sua ocorrência, através da análise do transcriptoma do anel inguinal de suínos afetados e não afetados por HE. De acordo com os resultados do transcriptoma, o perfil de expressão dos genes diferencialmente expressos foi associado à redução da diferenciação do músculo liso, seguida pelo baixo conteúdo de cálcio na célula, o que poderia levar a uma menor proporção de apoptose e diminuição da contração muscular da região do canal inguinal. Nessa perspectiva, os genes MYBPC1, BOK, SLC25A4, SLC8A3, DES, TPM2, MAP1CL3C e FGF1 foram considerados fortes candidatos para avaliação futura. Aditivamente, na segunda análise, por meio da utilização dos dados do transcriptoma e do exoma, objetivamos identificar possíveis novas mutações e genes envolvidos na ocorrência de HE em suínos. Neste estudo, uma análise funcional integrada dos dados, revelou genes importantes pertencentes a mecanismos moleculares relacionados à diferenciação do músculo liso, formação de colágeno, neurogênese, contração muscular e apoptose, os quais podem estar associados ao desenvolvimento de HE em suínos. Destacamos que as variantes, localizadas em regiões codificadoras e reguladoras dos genes C8B, P4HA2, PDSS1, MYRF, MPZ, NUDT22 e GAPDH, podem alterar sua expressão e função proteica, além de interferir na expressão de outros genes, controlando parcialmente o desenvolvimento de HE em suínos. Os resultados aqui obtidos, contribuem para maior entendimento a respeito dos mecanismos genéticos dos em suínos acometidos com HE, possibilitando futuramente o desenvolvimento de método de diagnóstico para identificação de animais portadores de HE.

Scrotal hernia (SH), as it is a complex trait, many genes can influence this phenotype, thus, the etiology of SH remains unclear. In order to identify potential markers that make an important role in the development of SH, two analyzes were performed with next generation sequencing. In the first analysis, we aim to identify the biological and genetic mechanisms involved in its occurrence, by analyzing the transcriptome of the inguinal ring of swine affected and not affected by SH. According to the results of the transcriptome, the expression profile of differentially expressed genes was associated with reduced smooth muscle differentiation, followed by the low calcium content in the cell, which could lead to a lower proportion of apoptosis and decreased muscle contraction in the inguinal canal region. In this perspective, the MYBPC1, BOK, SLC25A4, SLC8A3, DES, TPM2, MAP1CL3C and FGF1 genes were considered strong candidates for future evaluation. Additively, in the second analysis, using the transcriptome and exome data, we aim to identify possible new mutations and genes involved in the occurrence of SH in pigs. In this study, an integrated functional analysis of the data revealed important genes belonging to molecular mechanisms related to smooth muscle differentiation, collagen formation, neurogenesis, muscle contraction and apoptosis, which may be associated with the development of SH in pigs. We emphasize that the variants, located in coding and regulatory regions of the C8B, P4HA2, PDSS1, MYRF, MPZ, NUDT22 and GAPDH genes, can alter their expression and protein function, in addition to interfering in the expression of other genes, partially controlling the development of SH in pigs. The results obtained here, contribute to a better understanding of the genetic mechanisms of pigs affected by SH, enabling the future development of a diagnostic method to identify animals with SH.

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IN VITRO AO TRATAMENTO COM INIBIDOR DE RECEPTOR TIROSINA QUINASE (PALLADIA ®) E MTORC1 (RAPAMICINA) EM CÉLULAS DE CARCINOMA PROSTÁTICO CANINO

O carcinoma prostático canino possui prognóstico desfavorável e modalidades terapêuticas limitadas, principalmente em casos avançados. Devido à falta de tratamento eficaz para os carcinomas prostáticos caninos, esse estudo objetivou avaliar o efeito do toceranib (inibidor de receptor tirosina quinase) e da rapamicina (inibidor de mTORC1) em células de carcinoma prostático canino. As duas células de cultura primária advindas de carcinoma prostático canino, denominadas PC1 e PC2, apresentaram expressão proteica de VEGFR2 e PDGFR- e ausência da proteína c-KIT, os quais são alvos do fosfato de toceranib. Adicionalmente, após comparação do transcriptoma das células não tratadas e tratadas com fosfato de toceranib, observaram-se alterações em genes relacionados com a via PDGFR, angiogênese e resistência terapêutica. Além disso, realizou-se o tratamento das células PC1 e PC2 com rapamicina (inibidor de mTORC1) após a comparação do transcriptoma das células tumorais com células de próstata normal e identificação de genes envolvidos na via PI3K/AKT/mTOR. O tratamento com rapamicina diminuiu a expressão gênica de mTOR e 4E-BP1 e aumentou de AKT, podendo representar mecanismos de resistência. Após tratamento com fosfato de toceranib, apenas a PC1 reduziu a viabilidade celular, porém após tratamento com rapamicina, as células PC1 e PC2 reduziram a viabilidade celular de maneira dose dependente, havendo resposta biológica em ambas as terapias. Sendo assim, o bloqueio de múltiplos receptores tirosina quinase e inibição de mTOR representam alvos terapêuticos no carcinoma prostático canino, entretanto a resistência terapêutica ainda é desafiadora e, portanto, a medicina de precisão seria uma forma de superar o problema.

Canine prostatic carcinoma has a poor prognosis and limited therapeutic modalities, mainly in advanced cases. The aim of this study was to evaluate the effect of toceranib phosphate (receptor tyrosine kinase inhibitor) and rapamycin (mTORC1 inhibitor) in canine prostatic carcinoma cells due to the lack of efficient therapies. Two primary canine prostate cancer cell lines, PC1 and PC2, had protein expression of VEGFR2 and PDGFR- and absent c-KIT expression, which are target toceranib phosphate targets. Additionally, we compared transcriptome before and after toceranib phosphate treatment and we observed gene alterations related to PDGFR pathway, angiogenesis and therapeutic resistance. Besides, we treated PC1 and PC2 cells with rapamycin after transcriptome analysis comparing canine prostatic cells from normal prostate and neoplastic cells and identification of genes involved in PI3K/AKT/mTOR pathway. Gene expression of mTOR and 4E-BP1 decreased and AKT increased after rapamycin treatment, and could represent a resistency mechanism. A decrease only in PC1 cell viability was observed after toceranib phosphate treatment, however decreased cell viability in a dose-dependent manner was observed in PC1 and PC2 cells after rapamycin treatment. Therefore, we could observe biological response of canine prostatic carcinoma cells to both therapies. Thus, multiple receptor tyrosine kinase inhibition and mTOR inhibition represent target therapies to canine prostatic carcinoma. However, therapeutic resistance still remains a challenge and precision medicine could be a way to overcome this problem.

INFLUÊNCIA DO EXERCÍCIO DE CURTA DURAÇÃO E ALTA INTENSIDADE SOBRE A EXPRESSÃO TEMPORAL DO mRNA DE LEUCÓCITOS DE EQUINOS

A indústria do cavalo no Brasil movimenta bilhões de reais anualmente e é responsável por 3 milhões de postos de trabalho. O rebanho nacional supera 5 milhões de animais, sendo a raça Quarto de Milha a terceira em número de equinos e uma das que predomina nas atividades esportivas, demonstrando a importância da raça no país. Devido à importância do tema tanto na medicina quanto na fisiologia do exercício, muitos estudos têm focado sobre os efeitos do exercício nos leucócitos do sangue periférico e à recente introdução da técnica de microarranjo incrementou muito as pesquisas. Para avaliar o efeito do exercício será realizado um teste de esforço, onde os animais fizeram o aquecimento e uma sessão de exercício que mimetize a competição, seguido de desaquecimento. As colheitas das amostras de sangue aconteceram no momento uma hora antes do treino e no momento 4 horas após o treino de esforço. Para identificar os genes diferencialmente expressos a partir do microarranjo, utilizou-se o software Transcriptome Analysis Console (TAC). Assim para identificar os genes inflamatórios diferencialmente expresso a partir do TruSeq® Targeted RNA expression, foi realizada usando o aplicativo TruSeq Targeted RNA v1.1 no BaseSpace. Os perfis transcriptômicos em leucócitos isolados do sangue antes e após o treino de esforço foram identificados e os genes diferencialmentes expressos estão relacionados ao processo inflamatório, estrutura muscular e proteção óssea e articular.

The horse industry in Brazil moves billions of reais annually and is responsible for 3 million jobs. The national herd exceeds 5 million animals, with the Quarter Horse breed being the third in number of horses and one that predominates in sports activities, demonstrating the importance of the breed in country. Due your importance of the topic in both medicine and exercise physiology, many studies have focused on effects of exercise, on peripheral blood leukocytes and the recent introduction of the microarray technique has greatly increased research. To assess the effect of exercise, an exercise test will be performed, where the animals will warm up and an exercise session that mimics the competition, followed by a cool-down. The blood samples were collected at time one hour before training and at time 4 hours after exercise training. To identify the differentially expressed genes from the microarray, Transcriptome Analysis Console (TAC) software was used. Thus, to identify the inflammatory genes differentially expressed from TruSeq® Targeted RNA expression, it was performed using TruSeq Targeted RNA v1.1 application in BaseSpace. Transcriptomic profiles in leukocytes isolated from blood before and after exercise training were identified and differentially expressed genes are related to inflammatory process, muscle structure and bone and joint protection.

IDENTIFICAÇÃO DE GENES E POLIMORFISMOS ASSOCIADOS COM A MANIFESTAÇÃO DE HÉRNIA UMBILICAL EM SUÍNOS UTILIZANDO SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO

A hérnia umbilical (HU) é uma condição que afeta a produção de suínos, reduzindo o bemestar e o desempenho dos animais. As potenciais causas que podem levar à HU são os distúrbios associados ao metabolismo do colágeno, estrutura muscular e reparo do tecido conjuntivo, levando à uma maior fragilidade e flacidez da região umbilical, fazendo com que a abertura umbilical não feche corretamente e que os intestinos projetem-se pela parede abdominal formando o saco herniário. Contudo, os componentes genéticos envolvidos com a UH são pouco compreendidos. Portanto, o objetivo deste estudo foi identificar genes e polimorfismos associados com a manifestação de hérnia umbilical em suínos utilizando sequenciamento de nova geração. Para isso, 10 leitoas com 90 dias de idade, 5 herniadas e 5 não-herniadas foram selecionadas. A extração de DNA foi realizada com o Purelink Genomic Mini Kit (Invitrogen), as bibliotecas exômicas foram preparadas usando o kit SeqCap EZ Library SR (1.0) (NimbleGen / Roche) e o sequenciamento foi realizado no equipamento Illumina HiSeq 2500 (2x100pb). Além disso, também foram utilizados dados de transcriptoma do anel umbilical disponíveis no banco de dados SRA para identificação de variantes. As leituras exômicas e transcriptômicas foram submetidas ao controle de qualidade utilizando a ferramenta Trimmomatic e mapeadas contra o genoma suíno de referência (Sscrofa11.1) utilizando o software BWA-MEM para o sequenciamento exômico e o STAR para o transcriptômico. A identificação dos polimorfismos foi realizada usando o Genome Analysis Toolkit (GATK) e o Variant Effect Predictor (VEP) do Ensembl foi usado para anotar e predizer o efeito das variantes. Essas variantes foram também comparadas com resultados de um estudo de associação genômica (GWAS). No exoma foram identificadas 209 variantes, 5 localizadas em regiões intergênicas e 204 localizadas em 72 genes. No transcriptoma foram identificadas 81 variantes localizadas em 42 genes. Dessas, 29 variantes do tipo SNP (Polimorfismo de Nucleotídeo Único) foram classificadas através do VEP como variantes missense. Comparando as três metodologias, obtivemos 79 variantes concordantes entre o exoma e o transcriptoma, localizadas em 23 genes. Além disso, 8 genes também foram identificados pela análise de GWAS. Portanto, destacamos as variantes nos genes FYN, SPN, ITGB2, MYLPF, MYH13, MYH8, MYH2, MYH3, MYO19, VIM, ROCK2, RABGEF1 e UBASH3B como fortes candidatas no desenvolvimento de UH em suínos. Destaca-se também a importância da combinação das três abordagens para identificar genes e polimorfismos potencialmente envolvidos no desencadeamento da UH.

Umbilical hernia (UH) is a condition that affects pig production, which reduces welfare and performance. The potential causes that can lead to UH are disorders associated with collagen metabolism, muscle structure and connective tissue repair, leading to a weakness and flabbiness in the umbilical region. In consequence, umbilical opening do not close properly and the intestines project through the abdominal wall, forming the herniary sac. However, the genetic components involved with UH are poorly understood. Therefore, the aim of this study was to identify genes and polymorphisms associated with the manifestation of umbilical hernia in pigs using next generation sequencing. Therefore, 10 gilts with 90 days of age, 5 herniated and 5 non-herniated were selected. DNA extraction was performed with the Purelink Genomic Mini Kit (Invitrogen), the exomic libraries were prepared using the SeqCap EZ Library SR (1.0) kit (NimbleGen / Roche) and the sequencing was performed in the Illumina HiSeq 2500 (2x100pb) equipment. Moreover, transcriptome data available in the SRA database were also used to identify variants. The exomic and transcriptomic sequencies were subjected to quality control using the Trimmomatic tool and mapped against the swine reference genome (Sscrofa11.1) using the BWA-MEM software for the exomic and the STAR for the transcriptomic sequencing. Polymorphisms were identified using the Genome Analysis Toolkit (GATK). The Ensembl's Variant Effect Predictor (VEP) was used to annotate and predict the effect of the variants. These variants were also compared with results from a genome-wide association study (GWAS). In the exome, 209 variants were found, 5 located in intergenic regions and 204 located in 72 genes. In the transcriptome, 81 variants were identified, which were located in 42 genes. From those, 29 single nucleotide polymorphisms (SNP) were classified with the VEP tool as missense variants. Comparing the three methodologies, we obtained 79 concordant variants between the exome and the transcriptome, located in 23 genes. Moreover, 8 genes were also identified by GWAS analysis. Therefore, we highlight the variants in the FYN, SPN, ITGB2, MYLPF, MYH13, MYH8, MYH2, MYH3, MYO19, VIM, ROCK2, RABGEF1 and UBASH3B genes as strong candidates in the development of UH in pigs. We also highlight the importance of combining the three approaches to identify genes and polymorphisms potentially involved with the onset of UH.

APPLYING NEXT GENERATION SEQUENCE DATA IN ANIMAL BREEDING

No Melhoramento Animal existe um histórico de utilizar dados fenotípicos dos melhores animais de uma geração para produzir a próxima geração. Entretanto, é sabido que a herdabilidade das características de interesse depende de uma base genética e podem ser explicadas através do DNA. Na genética quantitativa é usado o modelo básico que diz que o fenótipo é a soma do genótipo (composição genética do indivíduo) e do ambiente, entretanto, genótipos diferentes podem desempenhar resultados superiores ou inferiores dependendo do ambiente em que estão inseridos, com isso, houve a necessidade de incluir o fator interação entre o genótipo e o ambiente. Com o desenvolvimento tecnológico, o sequenciamento de nova geração (NGS) tem trazido avanços no entendimento de características complexas no melhoramento animal, com o sequenciamento completo do genoma dos animais domésticos foi possível melhor entender como variantes causais e estruturais tem influenciado o fenótipo. Com o uso do NGS é possível quantificar o mRNA que está sendo expresso de um determinado gene que influencia determinada característica (transcriptoma RNA-Seq), descobrir alterações epigenéticas (ChIP-Seq) e, então, conhecer melhor os mecanismos moleculares que modulam a característica e tecido em questão; aumentar a densidade de marcadores de nucleotídeos simples (SNP) com o sequenciamento do genoma completo (WGS) e então, descobrir associações genômicas mais significativas e mais precisas. Com o advento do NGS veio a necessidade de o desenvolvimento poder computacional e novas ferramentas capazes de analisar e armazenar a quantidade de dados gerada. Em função disso, o desenvolvimento de softwares capazes de realizar o controle de qualidade, mapeamento das sequencias contra o genoma de referencia e, quantificar os transcritos (no caso de RNASeq) tem se tornado necessário e, lidar com esse tipo de análise pode ser difícil para aqueles que não tem familiaridade com sistemas computacionais. Visto isso foi desenvolvido um pipeline de uso amigável para analisar dados de RNA-Seq, realizando controle de qualidade, mapeamento e contagem de sequencias. O BAQCOM (Bioinformatics Analysis of Quality Control and Mapping) tem se mostrado eficiente e rápido. Utilizando dados de RNA-Seq objetivou-se conhecer o perfil global de expressão gênica envolvido em Condronecrose Bacteriana com Osteomielite em frangos (BCO), que é desenvolvida nas placas de crescimento ósseo do fêmur e tíbia e colonizada por bactérias oportunistas. Utilizando amostras de tíbia de seis frangos de linhagem comercial (três afetados por BCO e três sadios), foram encontrados 192 genes diferencialmente expressos (FDR < 0.05) divididos em 63 upregulados e 129 downregulados. 26 genes e sete fatores de transcrição foram encontrados downregulados explicando BCO em tíbia, podendo concluir que a BCO em frangos pode ser causada pela baixa expressão de genes relacionados ao crescimento ósseo e, que, a proliferação bacteriana parece ser um processo secundário. Outro cenário para o uso de NGS é o mapeamento fino de região de QTL (quantitative Traits Loci). Uma região de QTL no cromossomo 5 associada com espessura de toucinho foi encontrada em quatro linhagens comercial de suínos (sintético baseado em large-white, Pietrain, Landrace e Large-White). Espessura de toucinho é importante para eficiência alimentar e qualidade de carne, além de ser reservatório energético. Embora Genome Wide Association Study (GWAS) tem sido amplamente usada associada à fenótipos, ainda há a necessidade de reduzir a região de associação se o objetivo é achar mutações causais. Por essa razão objetivou-se reduzir esta região de QTL usando dados de WGS, RNA-Seq e ChIP-Seq. A partir do SNP mais significativo do GWAS (leadSNP SSC5:66103958), os haplótipos foram postos em fase e selecionados haplótipos de tamanho 41 SNPs (20 < leadSNP > 20). Foi selecionado o haplótipo mais frequente entre as linhagens utilizadas, então foi possível identificar uma região de 5 SNPs (2 < leadSNP > 2) presente em todas as linhagens. A partir desta região foi realizado o mapeamento fino, primeiro foi utilizado WGS e foi identificado três variantes candidatas (SSC5:66097445, SSC5:66099282 e SSC5c66103958). Nesta região entre SSC5:66097445-66103958 foram encontradas marcas epigenéticas H3K27me3 e H3K4me3 utilizado dados de ChIP-Seq de macrófagos alveolar de suínos, indicando regulação de expressão gênica durante período de desenvolvimento pre-natal. Em função disso foram utilizados RNA-Seq de embriões e fetos, onde foi possível encontrar alta expressão do gene CCND2, que está relacionado ao desenvolvimento e diferenciação de tecido adiposo, sendo um forte candidato a gene causal para espessura de toucinho. É possível, também, concluir que nesta região pode ter elementos regulatórios envolvidos na expressão do gene CCND2 no desenvolvimento embrionário e que, o impacto epigenético durante a vida embrionária pode impactar a produção de características na vida adulta. Nessa tese foi usado dados de sequenciamento, genotipagem, fenótipo, transcriptoma e ChIP-Seq, integrando todos para estreitar regiões de interesse no genoma, assim, resultando e propondo ferramentas para melhorar o melhoramento animal no futuro.

In Animal Breeding there is a history of using phenotypic data of the best animals from one generation to produce the next one. However, it is known that the heritability of interest traits depends on a genetic basis and can be explained by the DNA. In quantitative genetics, the basic model says that the phenotype is the sum of the genotype (genetic composition of the individual) and the environment, however, different genotypes can perform superior or inferior results depending on the environment in which they are inserted, with that, there was the need to include an interaction factor at the genotype and the environment. The development of Next Generation Sequencing (NGS) has brought advances in the understanding of complex traits in animal breeding, with the Whole Genome Sequencing (WGS) of the domestic animals it was possible to better understand how causal and structural variants have influenced the phenotype. With the use of NGS it is possible to quantify the mRNA that is being expressed of a certain gene that influences a certain trait (transcriptome - RNA-Seq), discover epigenetic changes (ChIP-Seq) and, then, better understand the molecular mechanisms that modulate the trait and tissue in question; increase the density of Simple Nucleotide Polymorphism Markers (SNP) with WGS and then discover more significant and more accurate genomic associations. With the advent of NGS came the need for the development of computational power and new tools capable of analyzing and storing the amount of data generated. As a result, the development of software capable of performing quality control, mapping sequences against the reference genome and quantifying the transcripts (in the case of RNA-Seq) has become necessary and, dealing with this type of analysis can be difficult for those unfamiliar with computer systems. For this reason, a userfriendly pipeline was developed to analyze RNA-Seq data, carrying out quality control, mapping and sequence counting. BAQCOM (Bioinformatics Analysis of Quality Control and Mapping) has been shown to be efficient and fast. Using RNA-Seq data, it was aimed to know the global gene expression profile involved in Bacterial Chondronecrosis with Osteomyelitis (BCO) in chicken, which is developed in the bone growth plates of the femur and tibia followed by opportunistic bacteria. Using tibia samples from six commercial broilers (three affected by BCO and three healthy), 192 differentially expressed genes (FDR <0.05) were found (63 upregulated and 129 downregulated). 26 genes and seven transcription factors were found downregulated, explaining BCO in tibia, concluding that BCO in chickens may be caused by the low expression of genes related to bone growth and that bacterial proliferation seems to be a secondary process. Another scenario for the use of NGS is the fine mapping of QTL (quantitative Traits Loci) regions. A QTL region on chromosome 5 associated with backfat thickness was found in four commercial pig lines (synthetic based on large-white, Pietrain, Landrace and Large-White). Backfat is important for feed efficiency and meat quality, as well as being a storage of energy. Although the Genome Wide Association Study (GWAS) has been widely used in association with phenotypes, there is still a need to reduce the associated region if the goal is to find causal mutations. For this reason, it was aimed to reduce this QTL region using data from WGS, RNA-Seq and ChIPSeq. From the most significant SNP of GWAS (leadSNP - SSC5:66103958), haplotypes were phased and haplotypes of size 41 SNPs (20 20) were selected. The most frequent haplotype was selected among the four breeds, so it was possible to identify a region of 5 SNPs (2 2) cross breed. Fine mapping was carried out using this region, first WGS was used and three candidate variants were identified (SSC5:66097445, SSC5:66099282 and SSC5:66103958). In this region between SSC5:66097445-66103958 epigenetic marks H3K27me3 and H3K4me3 were found using ChIP-Seq data from pig alveolar macrophages, indicating regulation of gene expression during the prenatal development period. From this result, RNA-Seq from embryos and fetuses were used, where it was possible to find high expression of the CCND2 gene, which is related to the development and differentiation of adipose tissue, being a strong candidate for a causal gene for backfat. It is also possible to conclude that in this region there may be regulatory elements involved in the expression of the CCND2 gene in embryonic development and that the epigenetic impact during embryonic life can impact the production of traits in adult life. In this thesis, sequencing, genotyping, phenotype, transcriptome and ChIP-Seq data were used, integrating them all to narrow down regions of interest in the genome, thus resulting and proposing tools to improve animal breeding in the future.

Contribuições para o estudo da heterogeneidade inter e intratumoral em neoplasias mamárias em cadelas

CORDEIRO, Y.G. Contribuições para o estudo da heterogeneidade inter e intratumoral em neoplasias mamárias em cadelas. 2020. 99f. Tese (Doutorado). Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos. Universidade de São Paulo. 2020. As neoplasias mamárias estão entre as mais frequentes em cães assim como em humanos. São consideradas excelentes modelos para o estudo da biologia do câncer, uma vez que algumas semelhanças, como sua apresentação espontânea, são difíceis de replicar em outros modelos animais. As diferenças entre os subtipos tumorais, bem como o alto grau de heterogeneidade inter e intratumoral, exigem marcadores mais precisos para melhorar o diagnóstico e prognóstico destas neoplasias. Além disso, novas informações sobre mecanismos moleculares podem levar a novos alvos terapêuticos, aprimorando o cuidado dado aos pacientes. Este trabalho teve como principais objetivos: (i) Associar a expressão gênica global à tumorigenicidade e potencial de invasão em linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários caninos, a fim de estabelecer um modelo in vitro para pesquisas básicas e aplicadas; e (ii) Caracterizar subpopulações tumorais, em tecidos primários e metástases, a partir de alterações morfológicas e moleculares utilizando a espectrometria de massas por imagem (MALDI-MSI) para a determinação de alterações em vias associadas ao câncer. No primeiro capítulo, mostramos diferenças na expressão gênica entre as duas culturas celulares em comparação com o tecido normal da glândula mamária. Também, observamos maior invasão e potencial tumorigênico in vivo na linhagem M25, associados à maior expressão de genes envolvidos na adesão focal e comunicação com a matriz extracelular. Nos capítulos 2 e 3, identificamos alterações nos perfis de expressão de proteínas em subpopulações tumorais e metastáticas utilizando tanto o fenótipo morfológico, quanto o fenótipo molecular das populações indistinguíveis microscopicamente, relacionadas principalmente à vias associadas ao processamento de proteínas, componentes da matriz extracelular, adesão focal e regulação epigenética. Estes resultados em conjunto com aqueles encontrados no experimento in vitro demonstram a importância e complexidade dos carcinomas mamários heterogêneos em cães e devem direcionar a busca para a determinação de biomarcadores dos diferentes estágios da progressão tumoral.

CORDEIRO, Y.G. Contribution to the study of inter and intratumor heterogeneity in canine mammary carcinomas. 2020. 99f. PhD Thesis. Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos. Universidade de São Paulo. 2020. Mammary tumors are among the most common types of cancer in dogs as well as in humans. Considered as excellent models for the study of cancer biology, similarities such as their spontaneous nature are difficult to be replicated in other animal models. Mammary tumors can be classified in many tumor subtypes, presenting a higher degree of inter and intratumoral heterogeneity. New insights on biomolecular mechanisms may lead to new therapeutic targets, improving diagnosis and prognosis and also improving patient care. Therefore, the main purposes of this work were: (i) To correlate global gene expression with tumorigenicity and invasion potential in canine mammary carcinoma cell lines, in order to establish an in vitro model for basic and applied oncology studies; and (ii) To characterize, using image mass spectrometry (MALDI-MSI), tumor subpopulations in primary tissues and metastasis through morphological and molecular features, in order to identify altered cancer-related pathways. In the first chapter, we showed differences regarding gene expression between two cell lines and a normal mammary gland tissue, as well as a higher invasion and in vivo tumorigenic potential of M25 cells associated to upregulation of genes involved in focal adhesion and extracellular matrix organization. In chapters 2 and 3, alterations in protein expression profiles of tumor and metastatic subpopulations were identified using both the morphological and the molecular phenotype of microscopically indistinguishable populations. Such differences were found mainly related to protein-processing pathways, extracellular matrix components, cell adhesion pathways and epigenetic regulations. These results should direct a search for the determination of biomarkers of populations in distinct levels of tumor progression.

Integração de métodos genômicos para seleção de genótipos de pacu (Piaractus mesopotamicus) resistentes à bactéria Aeromonas hydrophila

O pacu Piaractus mesopotamicus é considerado uma das mais importantes espécies de peixe cultivadas no Brasil. Apesar desta representatividade, esta espécie possui poucas informações genéticas disponíveis, principalmente em relação à resistência às enfermidades. A infecção por Aeromonas hydrophila é responsável por grandes prejuízos econômicos na produção de pacu. Experimentos de desafio, baseados em testes de sobrevivência por exposição dos organismos a patógenos específicos, têm sido realizados para buscar estimativas confiáveis para seleção de famílias geneticamente resistentes às enfermidades. Portanto, os principais objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a herdabilidade de resistência do pacu à infecção por A. hydrophila; 2) caracterizar a arquitetura genética com a identificação de QTLs (Quantitative Trait Loci) relacionados com resistência à A. hydrophila, por meio de sequenciamento/genotipagem de SNPs (RAD-Seq, restriction site associated DNA sequencing); 3) caracterizar genes do sistema imune, por meio de sequenciamento RNA-Seq, de indivíduos de pacu submetidos ao desafio de resistência à A. hydrophila. Moderados valores de herdabilidade foram encontrados para sobrevivência e tempo de morte, indicando que a resistência contra A. hydrophila em pacu pode ser melhorada por programas de melhoramento genético. 17.453 SNPs foram identificados pela técnica RAD-Seq, para investigar a arquitetura genética da resistência à infecção por A. hydrophila pelo estudo de associação genômica ampla (GWAS), e identificar loci associados à característica de resposta imune. Um mapa de ligação foi construído com 27 grupos de ligação (GLs). O comprimento dos grupos de ligação variou de 79,95 (GL 14) a 137,01 (GL 1) cM com um comprimento total de 2.755,60 cM. 22 QTLs em 17 GLs associados com resistência à A. hydrophila sugeriram uma arquitetura de resistência poligênica afetada por múltiplos loci com pequena variância genética aditiva. Com relação às análises de RNA-Seq, 57 genes pertencentes sistema imune do pacu foram significativamente expressos durante o período crítico da infecção, enquanto que 23 genes foram significativamente expressos quando a mortalidade atingiu o plateau. A prática de integração de métodos genômicos para aplicação de programas de melhoramento genético abordando a resistência do pacu à infecção por A. hydrophila é fundamental para acelerar a produção aquícola nacional de maneira sustentável.

Pacu Piaractus mesopotamicus is considered one of the most important cultivated fish species from Brazil. Despite this representativeness, few genetic information is available for P. mesopotamicus, especially regarding disease resistance. Aeromonas hydrophila infection is responsible for major economic losses in P. mesopotamicus production. Challenge experiments have been performed to evaluate reliable estimates on selection of families genetically resistant to diseases. Therefore, the main objectives of this study were: 1) evaluate the resistance heritability in 36 P. mesopotamicus families subjected to A. hydrophila challenge; 2) characterize the genetic architecture identifying QTLs (Quantitative Trait Loci) related to A. hydrophila resistance by SNP sequencing / genotyping; 3) characterize genes belonging to immune system of individuals submitted to the disease resistance challenge, by transcriptome analysis (RNA-Seq). Moderate heritability values were found for survival rate and time of death, indicating that resistance against A. hydrophila in P. mesopotamicus can be improved by breeding programs. 17,453 SNPs were identified by RAD-Seq technique to investigate the genetic architecture of resistance to A. hydrophila. When a linkage map was constructed, the length of linkage groups (27 linkage groups) varied from 79.95 (LG 14) to 137.01 (LG 1) cM, with a total integrated map length of 2,755.60 cM. 22 QTLs in 17 LGs associated with A. hydrophila resistance suggested a polygenic resistance architecture affected by multiple loci with small additive genetic variance. With respect to RNA-Seq analyzes, 57 genes belonging to the pacu immune system were significantly expressed during the critical period of infection, while 23 genes were significantly expressed when mortality reached the plateau. The practice of integrating genomic methods for the application of breeding programs addressing pacu resistance to A. hydrophila infection is essential to accelerate national aquaculture production in a sustainable manner.

Avaliação da resposta imune de gatos naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum

Os gatos são animais que podem se infectar por parasitos do gênero Leishmania spp. No entanto, pouco se conhece sobre a relação das manifestações clínicas da leishmaniose felina (LF) com as respostas imunológicas desses animais. Neste trabalho, nós realizamos diagnóstico laboratorial, clínico, quantificação de IgA, IgG e IgM anti-L. (L.) infantum, quantificação de linfócitos T CD4+ e CD8+ nas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e análise do transcriptoma afim de identificar as diferenças das resposta imune humoral e celular de gatos naturalmente infectados por L. (L.) infantum. Foi avaliado um total de 166 gatos, onde, 15,06% (25/166) apresentaram anticorpos anti-L. (L.) infantum pelo ELISA e 53,61% (89/166) pela RIFI, enquanto que pela PCR convencional (cPCR), 3,61% (6/166) apresentaram DNA do protozoário Leishmania no sangue, com 100% de identidade à espécie L. (L.) infantum (GenBank: KY379078.1). Desses seis animais, três apresentaram amastigotas de L. (L.) infantum em esfregaços do aspirado de linfonodo e/ou medula óssea no exame parasitológico e um teve a Leishmania isolada em cultura de aspirado de linfonodo. Assim, os gatos com testes sorológicos, parasitológicos, moleculares e de sequenciamento positivo para L. (L.) infantum, compuseram nosso grupo infectado (G1), enquanto que o grupo controle (G2) foi composto por seis gatos saudáveis. De acordo com anamnese clínica observamos que a magreza, alopecias e lesões de pele estavam entre os sinais clínicos mais frequentes entre os felinos. A quantificação de IgG, IgA e IgM totais anti-Leishmania foram significativamente maiores no G1 em comparação ao G2, (p = 2,966x10-6; p = 0,0002348 e p = 2,945x10-5, respectivamente). Nos exames hematológicos dos gatos detectamos a redução das plaquetas (p = 0,0062, p < 0,01) nos gatos G1 em relação ao G2, enquanto os leucócitos foram aumentados para gatos G2 (p = 0,014, p <0,05). Em relação aos parâmetros bioquímicos, os gatos infectados (G1) apresentaram aumento na concentração de proteína total (p = 4,4832e-06, p <0,01) com baixa albumina (p = 0,0065, p <0,01) e baixa aspartato aminotransferase (p = 0,0025, p <0,01) fora do intervalo de referência para a espécie. Pela citometria de fluxo observamos diferença significativa entre os linfócitos T CD4+ do G1 em relação ao G2 (p = 0.0427), entretanto, o mesmo não aconteceu para as subpopulações de linfócitos T CD8+ (p = 0.06199). Pela análise do transcriptoma destacamos a down regulação das vias metabólicas que controlam a atividade da proteína arginina desaminase (PAD), o processo de hemopoiese, a resposta ao estresse e o desenvolvimento do sistema imunológico e a up regulação da via sinalizadora do fator de crescimento dos fibroblastos (FGF) e do gene CXCR6 que participa da via sinalizadora da inflamação mediada pela sinalização de quimiocinas e citocinas. Possivelmente, a regulação negativa ou positiva dessas vias pode indicar a imunorregulação, por parte do parasita, como mecanismo de evasão do sistema imune do hospedeiro. Em contrapartida, a down regulação das vias sinalizadoras de ativação das células B (gene MAP3k2) de ativação das células T (gene LCP2), dos receptores Toll (gene TLR4) associado a down regulação dos genes IFNAR1, IFNGR2, IL13RA1, IL10 e IL1B nos gatos infectados (G1) do nosso estudo, indicam imunorregulação por parte do sistema imune felino em controlar o parasitismo intracelular por L. (L.) infantum, mas que não foram suficientes para controlar a progressão da doença. Esses resultados trazem as primeiras informações para elucidação da resposta imunológica às infecções por L. (L.) infantum em felinos.

Cats are animals that can be infected by parasites of the genus Leishmania spp. However, little is known about the relationship of the clinical manifestations of feline leishmaniasis (FL) with the immunological responses of these animals. In this work, we performed laboratory, clinical, quantification of IgA, IgG and IgM anti-L. (L.) infantum, quantification of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and transcriptome analysis in order to identify differences in the humoral and cellular immune responses of cats naturally infected by L. (L.) infantum. A total of 166 cats were evaluated, where 15.06% (25/166) presented antibodies anti-L. (L.) infantum by ELISA and 53.61% (89/166) by RIFI, whereas by conventional PCR (cPCR), 3.61% (6/166) presented Leishmania protozoal DNA in the blood, with 100% identity to the species L. (L.) infantum (GenBank: KY379078.1). Of these six animals, three presented amastigotes of L. (L.) infantum in smears of the lymph node aspirate and/or bone marrow in parasitological examination and one had Leishmania isolated in lymph node aspirate culture. Thus, cats with serological, parasitological, molecular and positive sequencing tests for L. (L.) infantum, composed our infected group (G1), while the control group (G2) was composed of six healthy cats. According to clinical anamnesis we observed that thinness, alopecias and skin lesions were among the most frequent clinical signs among felines. Quantification of total anti-L. (L.) infantum IgG, IgA and IgM were significantly higher in G1 than in G2, (p = 2,966x10-6, p = 0,0002348 and p = 2,945x10-5, respectively). In the hematological examinations of cats, we detected the reduction of platelets (p = 0.0062, p <0.01) in G1 cats compared to G2, whereas leukocytes were increased for G2 cats (p = 0.014, p <0.05). In relation to the biochemical parameters, infected cats (G1) showed an increase in the total protein concentration (p = 4.4832e-06, p <0.01) with low albumin (p = 0.0065, p <0.01) and low aspartate aminotransferase (p = 0.0025, p <0.01) all outside the reference range for the species. By flow cytometry we observed a significant difference between G1 CD4+ T lymphocytes compared to G2 (p = 0.0427); however, the same did not occur for the CD8+ T lymphocyte subpopulations (p = 0.06199). By the analysis of the transcriptome we highlight the down regulation of the metabolic pathways that control the activity of the protein arginine deaminase (PAD), the hemopoiesis process, the response to stress and the development of the immune system and the up regulation of the signaling pathway fibroblast growth factor (FGF) and the CXCR6 gene that participate in the signaling pathway of inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling. Possibly, the negative or positive regulation of these pathways may indicate the immunoregulation, by the parasite, as a mechanism to evade the immune system of the host. In contrast, down regulation of B cell activation (MAP3k2 gene) activation cells of T cells (LCP2 gene), Toll receptors (TLR4 gene) associated with down regulation of the genes IFNAR1, IFNGR2, IL13RA1 , IL10 and IL1B in the infected (G1) cats of our study indicate immunoregulation by the feline immune system to control intracellular parasitism by L. (L.) infantum but not sufficient to control the progression of the disease. These results provide the first information to elucidate the immunological response to L. (L.) infantum infections in felines.

TRANSCRIÇÃO EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

O processo transcricional em embriões extremamente complexo, nosso trabalho estimou o impacto de perturbações nos processos de transcricionais, durante as fases de ativação do genoma embrionário sobre o desenvolvimento embrionário in vitro de embriões; analisamos dados de sequenciamento de rna (RNA-seq) depositados nos bancos públicos (GEO) desde o estágio de oóocito até o dia 19 do desenvolvimento embrionário; Isolamos e caracterizamos a massa celular interna (ICM) e a trofectoderma (TE) do sexo masculino e feminino, oriundos de um mesmo blastocisto produzido in vitro com espermatozoides sexados (X e Y) e com sêmen convencional e caracterizamos e exploramos o transcriptoma desses isolados celulares. Concluímos então que a EGA menor é essencial para o desenvolvimento embrionário bovino, blastocistos possuem a maior atividade transcricional de um total de 6457 genes diferentemente expressos entre os contrastes avaliado encontramos; 2065 genes diferencialmente expressos entre a ICM e a TE, enquanto a ICM está voltada para a manutenção da pluripotência, a TE está voltada ao metabolismo energético. Os nossos dados sugerem que os embriões fêmeas são mais sensíveis ao cultivo in vitro.

Transcription process in embryos is a complex process, our work estimated the impact of perturbations in the transcriptional processes during genome activation of vitro produced bovine embryos on their development; we analyzed public data (GEO) from rna sequencing data (RNA-seq) of oocyte up to the 19th day of embryonic development; Wed performed isolation and characterization of male and female inner cell mass (ICM) and trofectoderma (TE) from the same blastocyst produced in vitro with sorted semen (X and Y) and with conventional semen. We did the characterization and exploratory analysis of the transcriptome of these cells. We conclude that minor EGA is essential for bovine embryonic development. Blastocysts possess the highest transcriptional activity of 6457 differentially expressed genes among analyzed contrasts. We found 2065 genes differentially expressed between ICM and TE, while ICM is maintaining pluripotency, TE is focused on energy metabolism. Our data suggest that female embryos are more sensitive to in vitro culture.

AVALIAÇÃO DE GENES DE REFERÊNCIA EM TECIDOS DE BOVINOS DE CORTE

O presente estudo teve como objetivo avaliar a estabilidade dos genes candidatos a referência Cancer Susceptibility Candidate 3 (CASC3), Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 2 (EEF1A2), Hydroxymethylbilane Synthase (HMBS), 18S Ribosomal RNA (18S), Actin Beta (ACTB), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) e Ubiquitin C (UBC), e selecionar os genes mais estáveis nos tecidos: fígado, músculo esquelético e jejuno de novilhos puros (Nelore) ou cruzados (Nelore x Angus) sob diferentes dietas para serem utilizados em análises de RT-qPCR. Além disso, para validar a seleção de genes de referência candidatos, a expressão dos genes alvos Maltase-Glucoamylase 2 (MGAM), Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD), Acyl-CoA Oxidase 1 (ACOX1) e Fatty Acid Synthase (FAS) foram avaliadas usando os diferentes genes. Foram utilizados 14 novilhos puros e 14 cruzados, sendo que metade dos animais de cada grupo genético recebeu uma dieta contendo grãos de milho inteiro (GMI) e a outra metade grãos de milho inteiro e bagaço de cana de açúcar (GMIB). A análise de estabilidade foi realizada por meio do programa online RefFinder, que combina os algoritmos GeNorm, NormFinder, Bestkeeper e Delta-Cq. A ACTB esteve entre os três genes mais estáveis para cada tecido avaliado, já para os demais genes a estabilidade e a inclusão dos genes se alteraram a depender do tecido e raça. Os genes mais estáveis foram o 18S, ACTB e CASC3 para o músculo; para o fígado, HMBS, ACTB e 18S; e para o jejuno GAPDH, ACTB e CASC3, independente de raça e dieta. Ao se comparar os genes mais estáveis e menos estáveis como referência para normalização dos genes alvos FAS, ACOX1, MGAM e SCD, elucidou-se possíveis erros causados na análise dos dados. A utilização dos conjuntos de genes de referência mais estáveis e menos estáveis podem levar a diferentes conclusões a respeito do perfil de expressão do gene alvo estudado. Os resultados encontrados na validação dos genes de referência reforça o fato de que a seleção dos genes de referência mais adequados para cada experimento é de suma importância para garantir a confiabilidade dos estudos de expressão gênica para que possam ser aplicados na prática. Assim, o estudo demonstra a importância de se fazer análises prévias para cada condição experimental a ser estudada.

The objective of the present study was to evaluate the stability of reference candidate genes Cancer Susceptibility Candidate 3 (CASC3), Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 2 (EEF1A2), Hydroxymethylbilane Synthase (HMBS), 18S Ribosomal RNA (18S), Actin Beta ), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) and Ubiquitin C (UBC), and to select the most stable genes in the tissues: liver, muscle and jejunum of purebred (Nellore) or crossbred (Nellore x Angus) steers under different diets to be used in RT-qPCR analyses. In addition, to validate the selection of candidate reference genes, expression of the target genes Maltase-Glucoamylase 2 (MGAM), Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD), Acyl-CoA Oxidase 1 ( ACOX1) and Fatty Acid Synthase (FAS) were evaluated using the different genes. Fourteen Nellore steers and fourteen crossbred steers were used, with half of the animals in each genetic group were fed a diet containing whole shelled corn (GMI) and the other half whole shelled corn and sugarcane bagasse (GMIB). Stability analyses was performed through the online program RefFinder, which combines the algorithms GeNorm, NormFinder, Bestkeeper and Delta-Cq. The ACTB was among the three most stable genes for each tissue evaluated, and for the other genes the stability and inclusion of the genes have changed depending on tissue and breed. For the muscle, the most stable genes were 18S, ACTB and CASC3; for the liver, HMBS, ACTB and 18S; and for the jejunum GAPDH, ACTB and CASC3, regardless of breed and diet. The use of the most stable and less stable genes as reference for normalization of the target genes FAS, ACOX1, MGAM and SCD may change RT-qPCR results causing errors in the analyses of the data. The use of more stable and less stable reference gene sets may lead to different conclusions about the expression profile of the target gene studied. The results found in the validation of the reference genes reinforce the fact that the selection of the most suitable reference genes for each experiment is of paramount importance to ensure the reliability of the gene expression studies so that they can be applied in practice. Thus, the study demonstrates the importance of making previous analyzes for each experimental condition to be studied.