Caracterização física e estrutural de espermatozoides no ejaculado de Caprinos Azul, Canindé, Moxotó e Repartido / Physical and structural characterization of sperm in the ejaculate from Azul, Caninde, Moxotó and Repartido goat races

This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.(AU)

Análise da integridade de membrana de espermatozoides extraídos de fragmentos frescos de testículos de cães / Sperm membrane integrity analysis from dog fresh testis

To evaluate testicular tissue before cryopreservation is important to quantify and qualify losses ofsperm during the freezing/thawing of testicular tissue. The aim of this study was to analyze the sperm plasmamembrane structural and functional integrity on post-pubertal dogs (n = 7) fresh testis. The sperm fromtesticular tissue were submitted to plasma membrane structural and functional integrity analysis by fluorescentmicroscopy using SYBR 14 and Propidium Iodide and the hiposmotic test, respectively. For statistical analysis,it was used normality test (Shapiro Wilk) and Wilcoxon test (R 3.3.1; P > 0.05). It was observed 94.9% and91.8% spermatozoa presenting structural and functional integrity, respectively. Thus, analysis of the membraneintegrity is an important tool to analyze spermatozoa extracted from testicles. Despite the fluorescence be apractical method, it has a high cost.(AU)

Caracterização física e estrutural de espermatozoides no ejaculado de Caprinos Azul, Canindé, Moxotó e Repartido / Physical and structural characterization of sperm in the ejaculate from Azul, Caninde, Moxotó and Repartido goat races

This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.

Análise da integridade de membrana de espermatozoides extraídos de fragmentos frescos de testículos de cães / Sperm membrane integrity analysis from dog fresh testis

To evaluate testicular tissue before cryopreservation is important to quantify and qualify losses ofsperm during the freezing/thawing of testicular tissue. The aim of this study was to analyze the sperm plasmamembrane structural and functional integrity on post-pubertal dogs (n = 7) fresh testis. The sperm fromtesticular tissue were submitted to plasma membrane structural and functional integrity analysis by fluorescentmicroscopy using SYBR 14 and Propidium Iodide and the hiposmotic test, respectively. For statistical analysis,it was used normality test (Shapiro Wilk) and Wilcoxon test (R 3.3.1; P > 0.05). It was observed 94.9% and91.8% spermatozoa presenting structural and functional integrity, respectively. Thus, analysis of the membraneintegrity is an important tool to analyze spermatozoa extracted from testicles. Despite the fluorescence be apractical method, it has a high cost.

Facial nerve identification with fluorescent dye in rats

PURPOSEThe parotidectomy technique still has an elevated paresis and paralysis index, lowering patient life's quality. The correct identification of the facial nerve can prevent nerve damage. Fluorescent dye identifies nerves in experimental studies but only few articles focused its use on facial nerve study in parotidectomies. We aimed to stain the rat facial nerve with fluorescent dye to facilitate visualization and dissection in order to prevent injuries.METHODSForty adult male Wistar rats were submitted to facial injection of saline solution (Gsf-control group, 10) or fluorescent dye solution (Gdye group, 30) followed by parotidectomy preserving the facial nerve, measuring the time for localization and facility of localization (LocTime and LFN). Nerve function was assessed using the Vibrissae Movements (PMV) and Eyelid Closure Motion (PFP) scores.RESULTSNerve localization was faster in Gdye group, with 83% Easy LFN rate. The Gdye group presented with low nerve injury degree and better PMV and PFP scores, with high sensitivity and accuracy.CONCLUSIONSThis experimental method of facial nerve fluorescence was effective for intraoperative nerve visualization, identification and preservation. The technique may be used in future facial nerve studies, translated to humans, contributing to the optimization of parotid surgery in the near future.(AU)

Produção in vitro de embriões utilizando-se sêmen sexado de touros 5/8 Girolando / Production of in vitro embryo using sexed sperm of 5/8 Girolando bulls

We evaluated the "in vitro" blastocyst rate production using bovine sexed semen. Semen from three bulls was used to verify the individual"s semen variation, cleavage rates and embryo production. In this study, we employed reproductive biotechnologies, computer analysis of post-thawed semen and fluorescent probes for sperm cells integrity analysis (plasma membrane, acrosome membrane and mitochondrial potential). A total of 959 oocysts went through in vitro maturation steps for in vitro fertilization and cultivation, being 473 with sexed semen and 486 with conventional semen. The cleavage rate was observed in blastocysts on D2 and D7. Data were analyzed by SPSS 16.0 software using analysis of variance (ANOVA), Student"s t-test was used to detect differences between groups, and chi-square analysis for in vitro production results (P 0.05 ). The results differed between conventional (31.06%) and sexed semen (21.10%) in the obtainment of blastocyst. When the blastocyst production was individually compared in sexed semen samples (27.69%, 17.93% and 25.56%, bulls 1, 2 and 3, respectively) we verified T2 T1 and T1 = T3 and T2 = T3. [...]

Avaliou-se a taxa de produção de blastocisto in vitro utilizando-se o sêmen bovino sexado. Foram utilizados três reprodutores para verificar a variação individual do sêmen, taxas de clivagem e produção embrionária. O trabalho utilizou-se de biotécnicas reprodutivas, análise computadorizada do sêmen pós-descongelação e sondas fluorescentes para análises de integridade da célula espermática (membrana plasmática, membrana acrossomal e potencial mitocondrial). Um total de 959 oócitos passou por etapas de maturação in vitro, fertilização in vitro (sexado, n= 473; convencional, n = 486) e cultivo in vitro. A taxa de clivagem foi observada no D2 e a de blastocistos no D7. Os dados foram analisados pelo programa SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA), sendo o teste t-Student usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado  para análise dos resultados da produção in vitro (P 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06%) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparada a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3, respectivamente), percebeu-se que T2 T1 e T1=T3 e T2=T3. Quanto às análises de cinética espermática, as amostras de sêmen sexado mostraram diferençasentre os touros nas variáveis velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade do trajeto em que o T1(117,7±1,6 µm/s; 60,0±0,3 µm/s; 73,6±0,4 µm/s, respectivamente) quando comparado aostouros T2 (80,2±2,3 µm/s; 47,0±2,0 µm/s; 57,7±0,9 µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7 µm/s; 46,2±2,7 µm/s; 53,8±2,8 µm/s, respectivamente) obteve valores mais elevados. As análises daintegridade da célula espermática não diferiram entre as amostras de sêmen convencional, já no sêmen sexado a integridade de membrana foi a variável que diferiu estatisticamente entre os touros, em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3(53,8± 1,8) (P=0,009), mas não divergiu do T2 (44,1±4,4).[...]

Produção in vitro de embriões utilizando-se sêmen sexado de touros 5/8 Girolando / Production of in vitro embryo using sexed sperm of 5/8 Girolando bulls

We evaluated the "in vitro" blastocyst rate production using bovine sexed semen. Semen from three bulls was used to verify the individual"s semen variation, cleavage rates and embryo production. In this study, we employed reproductive biotechnologies, computer analysis of post-thawed semen and fluorescent probes for sperm cells integrity analysis (plasma membrane, acrosome membrane and mitochondrial potential). A total of 959 oocysts went through in vitro maturation steps for in vitro fertilization and cultivation, being 473 with sexed semen and 486 with conventional semen. The cleavage rate was observed in blastocysts on D2 and D7. Data were analyzed by SPSS 16.0 software using analysis of variance (ANOVA), Student"s t-test was used to detect differences between groups, and chi-square analysis for in vitro production results (P 0.05 ). The results differed between conventional (31.06%) and sexed semen (21.10%) in the obtainment of blastocyst. When the blastocyst production was individually compared in sexed semen samples (27.69%, 17.93% and 25.56%, bulls 1, 2 and 3, respectively) we verified T2 T1 and T1 = T3 and T2 = T3. [...](AU)

Avaliou-se a taxa de produção de blastocisto in vitro utilizando-se o sêmen bovino sexado. Foram utilizados três reprodutores para verificar a variação individual do sêmen, taxas de clivagem e produção embrionária. O trabalho utilizou-se de biotécnicas reprodutivas, análise computadorizada do sêmen pós-descongelação e sondas fluorescentes para análises de integridade da célula espermática (membrana plasmática, membrana acrossomal e potencial mitocondrial). Um total de 959 oócitos passou por etapas de maturação in vitro, fertilização in vitro (sexado, n= 473; convencional, n = 486) e cultivo in vitro. A taxa de clivagem foi observada no D2 e a de blastocistos no D7. Os dados foram analisados pelo programa SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA), sendo o teste t-Student usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado  para análise dos resultados da produção in vitro (P 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06%) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparada a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3, respectivamente), percebeu-se que T2 T1 e T1=T3 e T2=T3. Quanto às análises de cinética espermática, as amostras de sêmen sexado mostraram diferençasentre os touros nas variáveis velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade do trajeto em que o T1(117,7±1,6 µm/s; 60,0±0,3 µm/s; 73,6±0,4 µm/s, respectivamente) quando comparado aostouros T2 (80,2±2,3 µm/s; 47,0±2,0 µm/s; 57,7±0,9 µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7 µm/s; 46,2±2,7 µm/s; 53,8±2,8 µm/s, respectivamente) obteve valores mais elevados. As análises daintegridade da célula espermática não diferiram entre as amostras de sêmen convencional, já no sêmen sexado a integridade de membrana foi a variável que diferiu estatisticamente entre os touros, em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3(53,8± 1,8) (P=0,009), mas não divergiu do T2 (44,1±4,4).[...](AU)

Techniques for sperm evaluation using fluorescent probes / Técnicas para avaliação espermática utilizando sondas fluorescentes

A variety of laboratory tests were developed to obtain more reliable results of sperm evaluation and increase the accuracy of sperm fertility predictions. These tests detected damage of sperm specific compartments or organelles, which cannot be detected in routine sperm analysis. The use of fluorescent probes and detection using fluorescent microscopy or flow cytometry is an important tool but a more precise and accurate laboratory test is needed. Propidium iodide and 6-carboxyfluorescein diacetate are used for evaluations of plasmatic membrane integrity. Fluorescein isothiocyanate, associated with conjugated lecithin Psium sativum or Arachis hypogaea, are used for evaluations of acrosome integrity. Two probes, MitoTracker or Rhodamine123, are generally used to measure the absence or presence of mitochondrial potential. However, a better option is 5,5; 6,6 - tetrachloro - 1,1; 3,3 -tetraetilbenzimidazolil-carbocyanine (JC-1) dye, which assesses not only the presence of mitochondrial potential and distinguished spermatozoa with poorly and highly functional mitochondria. Two techniques, TUNEL or COMETA, and the Acridine Orange Test (AOT) dye are used to evaluate chromatin integrity. A fluorescence technique based on chlortetracycline (CTC) or Merocyanine 540 is used to estimate whether sperm pass by or through the capacitation process. This review focuses on the fluorescent probes that are most widely used to evaluate plasma membrane integrity, capacitation, acrosome integrity, chromatin integrity and mitochondrial potential.(AU)

Diversos testes laboratoriais têm sido desenvolvidos com o intuito de obter resultados confiáveis nas avaliações espermáticas, aumentando a qualidade e a confiabilidade do sêmen utilizado em técnicas de reprodução assistida. Esses testes têm permitido detectar danos em compartimentos e organelas específicas da célula espermática, que não são detectados nas análises de rotina. Dentre esses testes, o uso de sondas fluorescentes e sua detecção em microscópio de epifluorescência ou citometria de fluxo se tornaram ferramenta importante quando uma avaliação mais acurada é necessária. Para a avaliação da integridade de membrana plasmática, pode ser utilizado o iodeto de propídio, associado ao diacetato de 6-carboxifluoresceína. As avaliações de integridade acrossomal podem ser feitas através do isotiocianato de fluoresceína, associado às lecitinas conjugadas, como a Psium sativum ou Arachis hypogaea. O potencial mitocondrial pode ser avaliado quanto à ausência ou presença através da sonda Mitotracker ou Rodamina 123. Outra opção ainda melhor pode ser observada utilizando o corante iodeto de 5,5; 6,6 tetracloro 1,1; 3,3 tetraetilbenzimidazolil-carbocianina (JC-1), este corante avalia a presença do potencial mitocondrial e avalia quanto à classificação do grau. Para avaliar a integridade de cromatina, pode ser empregado o uso de duas técnicas conhecidas como TUNEL ou COMETA, ou pode ser utilizado o corante Acridine Orange Test (AOT). Para avaliar se o espermatozoide está passando ou passou pelo processo de capacitação, pode ser utilizada a técnica de fluorescência a base de clortetraciclina, o CTC, quelante do cálcio, ou a Merocianina 540. Esta revisão enfatiza as principais sondas fluorescentes disponíveis para avaliar a integridade de membrana plasmática, capacitação, integridade acrossomal, integridade da cromatina, e potencial mitocondrial.(AU)

Techniques for sperm evaluation using fluorescent probes / Técnicas para avaliação espermática utilizando sondas fluorescentes

A variety of laboratory tests were developed to obtain more reliable results of sperm evaluation and increase the accuracy of sperm fertility predictions. These tests detected damage of sperm specific compartments or organelles, which cannot be detected in routine sperm analysis. The use of fluorescent probes and detection using fluorescent microscopy or flow cytometry is an important tool but a more precise and accurate laboratory test is needed. Propidium iodide and 6-carboxyfluorescein diacetate are used for evaluations of plasmatic membrane integrity. Fluorescein isothiocyanate, associated with conjugated lecithin Psium sativum or Arachis hypogaea, are used for evaluations of acrosome integrity. Two probes, MitoTracker or Rhodamine123, are generally used to measure the absence or presence of mitochondrial potential. However, a better option is 5,5; 6,6 - tetrachloro - 1,1; 3,3 -tetraetilbenzimidazolil-carbocyanine (JC-1) dye, which assesses not only the presence of mitochondrial potential and distinguished spermatozoa with poorly and highly functional mitochondria. Two techniques, TUNEL or COMETA, and the Acridine Orange Test (AOT) dye are used to evaluate chromatin integrity. A fluorescence technique based on chlortetracycline (CTC) or Merocyanine 540 is used to estimate whether sperm pass by or through the capacitation process. This review focuses on the fluorescent probes that are most widely used to evaluate plasma membrane integrity, capacitation, acrosome integrity, chromatin integrity and mitochondrial potential.

Diversos testes laboratoriais têm sido desenvolvidos com o intuito de obter resultados confiáveis nas avaliações espermáticas, aumentando a qualidade e a confiabilidade do sêmen utilizado em técnicas de reprodução assistida. Esses testes têm permitido detectar danos em compartimentos e organelas específicas da célula espermática, que não são detectados nas análises de rotina. Dentre esses testes, o uso de sondas fluorescentes e sua detecção em microscópio de epifluorescência ou citometria de fluxo se tornaram ferramenta importante quando uma avaliação mais acurada é necessária. Para a avaliação da integridade de membrana plasmática, pode ser utilizado o iodeto de propídio, associado ao diacetato de 6-carboxifluoresceína. As avaliações de integridade acrossomal podem ser feitas através do isotiocianato de fluoresceína, associado às lecitinas conjugadas, como a Psium sativum ou Arachis hypogaea. O potencial mitocondrial pode ser avaliado quanto à ausência ou presença através da sonda Mitotracker ou Rodamina 123. Outra opção ainda melhor pode ser observada utilizando o corante iodeto de 5,5; 6,6 tetracloro 1,1; 3,3 tetraetilbenzimidazolil-carbocianina (JC-1), este corante avalia a presença do potencial mitocondrial e avalia quanto à classificação do grau. Para avaliar a integridade de cromatina, pode ser empregado o uso de duas técnicas conhecidas como TUNEL ou COMETA, ou pode ser utilizado o corante Acridine Orange Test (AOT). Para avaliar se o espermatozoide está passando ou passou pelo processo de capacitação, pode ser utilizada a técnica de fluorescência a base de clortetraciclina, o CTC, quelante do cálcio, ou a Merocianina 540. Esta revisão enfatiza as principais sondas fluorescentes disponíveis para avaliar a integridade de membrana plasmática, capacitação, integridade acrossomal, integridade da cromatina, e potencial mitocondrial.