Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária.

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.(AU)

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária. (AU)

Padrão de metilação dos genes xist e igf2 em ovocitos de folículos antrais de vacas nelore

Modificações epigenéticas são eventos que controlam a expressão diferencial de genes, sendo a metilação do DNA um dos mais conhecidos, importante para a reprogramação epigenética durante a gametogênese. Entender como isso ocorre na ovogênese é importante para criar parâmetros para a competência ovocitária com o intuito de melhorar a produção in vitro de embriões. Nesse trabalho objetivou-se avaliar o padrão de metilação em ovócitos de duas categorias de folículos antrais: entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm. Para isso foram escolhidas duas ilhas CpGs, uma no éxon 1 do gene XIST – que está relacionado com a inativação do cromossomo X em fêmeas, e outra no último éxon do gene IGF2 – envolvido no desenvolvimento embrionário e placentação. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas Nelore provenientes de abatedouros usando o tissue chopper e sucessivas pipetagens para o isolamento dos ovócitos. A classificação dos ovócitos foi realizada de acordo com o seu diâmetro. O DNA extraído dos ovócitos foi tratado com bissulfito de sódio e os genes de interesse foram amplificados através de PCR nested. Os produtos purificados de gel de agarose 2% foram utilizados clonagem em células DH5α. Os clones foram sequenciados usando a metodologia dideoxi e analisados no programa BiQ Analyzer utilizando sequências controle do “GenBank”. Apenas sequências com mais de 90% de identidade e de conversão pelo bissulfito de sódio foram consideradas para análises. Os resultados mostraram que os ovócitos de folículos entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm possuem padrão de metilação iguais, tanto para o gene XIST (89,5% e 92,7%, respectivamente) quanto para o gene IGF2 (73,4% e 61,5%, respectivamente). Esses dados sugerem que, pelo menos para as regiões estudadas, o padrão de metilação já está estabelecido a partir da fase antral do folículo ovariano em ovócitos imaturos.

Padrão de metilação dos genes xist e igf2 em ovocitos de folículos antrais de vacas nelore

Modificações epigenéticas são eventos que controlam a expressão diferencial de genes, sendo a metilação do DNA um dos mais conhecidos, importante para a reprogramação epigenética durante a gametogênese. Entender como isso ocorre na ovogênese é importante para criar parâmetros para a competência ovocitária com o intuito de melhorar a produção in vitro de embriões. Nesse trabalho objetivou-se avaliar o padrão de metilação em ovócitos de duas categorias de folículos antrais: entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm. Para isso foram escolhidas duas ilhas CpGs, uma no éxon 1 do gene XIST que está relacionado com a inativação do cromossomo X em fêmeas, e outra no último éxon do gene IGF2 envolvido no desenvolvimento embrionário e placentação. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas Nelore provenientes de abatedouros usando o tissue chopper e sucessivas pipetagens para o isolamento dos ovócitos. A classificação dos ovócitos foi realizada de acordo com o seu diâmetro. O DNA extraído dos ovócitos foi tratado com bissulfito de sódio e os genes de interesse foram amplificados através de PCR nested. Os produtos purificados de gel de agarose 2% foram utilizados clonagem em células DH5α. Os clones foram sequenciados usando a metodologia dideoxi e analisados no programa BiQ Analyzer utilizando sequências controle do “GenBank”. Apenas sequências com mais de 90% de identidade e de conversão pelo bissulfito de sódio foram consideradas para análises. Os resultados mostraram que os ovócitos de folículos entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm possuem padrão de metilação iguais, tanto para o gene XIST (89,5% e 92,7%, respectivamente) quanto para o gene IGF2 (73,4% e 61,5%, respectivamente). Esses dados sugerem que, pelo menos para as regiões estudadas, o padrão de metilação já está estabelecido a partir da fase antral do folículo ovariano em ovócitos imaturos.(AU)

Interação Molecular entre Alfa-Ciclodextrina e Triptofano / Alfa-ciclodextrin and tryptophan molecular interaction / Interacción molecular entre alfa-ciclodextrina y triptófano

O objetivo deste trabalho foi determinar a constante de formação do complexo de inclusão entre a alfa-ciclodextrina e o aminoácido triptofano. Para a determinação da constante de inclusão, foi utilizado o método competitivo do alaranjado de metila. O triptofano realiza interações moleculares com a alfa-ciclodextrina com constante de inclusão de 36,16 M-1. Estes resultados embasam o desenvolvimento de trabalhos de entrega metabólica de triptofano e a redução de gostos indesejados de proteínas hidrolisadas utilizadas na alimentação animal(AU)

The objective of this research was to determine the inclusion constant between tryptophan and alpha-cyclodextrin (alpha-CD) by spectrophotometry based on methyl orange molecular probe. Tryptophan and alpha-CD showed molecular interaction with inclusion formation constants of 36.16 M-1. These results are important for the development of tryptophan metabolic delivery and reduction of the bitter taste from hydrolyzed proteins used to feed animals(AU)

El objetivo de esta investigación fue determinar la constante de formación del complejo de inclusión entre alfa-ciclodextrina y triptófano. Para la determinación de la constante de inclusión, fue utilizado el método competitivo del naranja de metilo. El triptófano realiza interacciones moleculares con el alfa-ciclodextrina con constante de inclusión de 36,16 M-1. Estos resultados fundamentan el desarrollo de trabajos de entrega metabólica de triptófano y la reducción de gustos indeseados de proteínas hidrolizadas utilizadas en la alimentación animal(AU)