Resumo
Este estudo verificou o desempenho de três técnicas de PCR quantitativa (Real-Time) para o diagnóstico de Peste Suína Africana, uma doença exótica no Brasil, a partir de amostras de tecidos. As três técnicas escolhidas baseiam-se na amplificação de sequências do gene da proteína viral VP72 e são preconizadas, cada uma, por laboratórios oficiais da OIE (PSA-OIE), dos Estados Unidos (PSA-USDA) e da União Europeia (PSA-EU), respectivamente. Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise marcadas com fluoróforos foram sintetizados conforme a literatura de referência consultada. Sequências-alvo do DNA viral foram inseridos em plasmídeo sintético, os quais serviram de controle positivo para a padronização das técnicas e otimização de reagentes, determinação dos limites de detecção e testes de verificação de desempenho. Para aferição de repetibilidade e reprodutibilidade das técnicas, as técnicas padronizadas foram repetidas em dias diferentes, por um segundo analista, com alteração no mix comercial de reagentes utilizado e em um equipamento diferente, e também por outro laboratório. Realizaram-se, ainda, provas de sensibilidade analítica com amostras de DNA viral de referência e especificidade analítica e diagnóstica, com amostras negativas. As técnicas de PSA-EU e PSA-USDA apresentaram-se mais vantajosas quanto ao consumo de iniciadores. Não houve diferenças significativas nos resultados quantitativos variando-se os dias dos ensaios, os analistas, os equipamentos e o mix de reagentes. As três técnicas apresentaram alta especificidade analítica e diagnóstica e sensibilidade diagnóstica. As três técnicas de qPCR mostraram-se eficazes para serem adotadas por um mesmo laboratório para emissão de diagnósticos oficiais de Peste Suína Africana.(AU)
This study evaluated the performance of three real time PCR techniques (qPCR) for the diagnosis of African Swine Fever in tissue samples. The three chosen techniques are based on amplification of viral protein VP72 gene sequences and are recommended by OIE (PSA-OIE), the United States official laboratories (PSA-USDA) and the European Union (PSA-EU). Target sequences of the viral DNA were inserted into synthetic plasmid, which served as a positive control for the standardization of techniques and optimization of reagents, determination of limits of detection and performance verification testing. To gauge repeatability and reproducibility of techniques, standard procedures were repeated on different days by two analysts and by changing mix reagents and equipment, and also by another laboratory. Analytical sensitivity tests were done with reference samples provided by an OIE reference laboratory and analytical and diagnostic specificity were tested with negative samples. The PSA-EU and PSA-USDA techniques were more advantageous to use because of lower concentration of oligos used. There were no significant differences in quantitative results varying the days of tests, analysts, equipment and the mix of reagents. The three techniques had high analytical and diagnostic specificity and sensitivity. The three qPCR techniques were considered equivalent and effective and can be adopted by any laboratory for issuing official diagnosis of African Swine Fever.(AU)
Assuntos
Animais , Peste Suína Clássica/diagnóstico , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/métodos , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/veterinária , Técnicas e Procedimentos Diagnósticos/veterinária , Agências Internacionais/normasResumo
O vírus da peste suína clássica causa doença altamente contagiosa em suínos domésticos e selvagens, caracterizada por levar a grandes perdas econômicas, tanto para a suinocultura de grande porte como também para os pequenos produtores. A doença pode se apresentar de forma aguda, crônica, tardia, assintomática ou persistente, que dependem da virulência da cepa, idade do animal, estado imunológico, período de estação. A doença é de notificação obrigatória, e as medidas de controle estão listadas no Programa Nacional de Sanidade Suidea do Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento. Quanto à divisão sanitária atualmente adotada, o Brasil conta com uma zona considerada com livre de peste suína clássica que é constituída pelos principais estados produtores de suínos e pelas fronteiras de expansão da atividade e uma zona não livre, que engloba a maioria dos estados das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Fora da área considerada livre focos de peste suína clássica continuam acontecendo de forma esporádica, porém a proposta do Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento é erradicar a enfermidade em todo o território nacional. O diagnóstico de suspeitas da infecção pode ser feito através do isolamento e identificação viral em cultivos celulares, considerado o teste ouro, por meio das técnicas de imunofluorescência e imunoperoxidase. Foram analisadas por estas técnicas no Laboratório Nacional Agropecuário em Pernambuco amostras de órgãos e sangue de 149 suínos com suspeita de PSC, no período compreendido entre 1999 e 2009, provenientes dos estados do Pará e Amapá da região norte e Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco da região nordeste. Dos suínos analisados, 51 estavam infectados com o vírus da peste suína clássica. Nos achados clínicos e de necropsia eram predominantes de alterações hemorrágicas, típicas da forma clássica da doença. As criações afetadas eram predominantemente de baixo nível de tecnificação. Os resultados obtidos evidenciaram que a presença de animais positivos é alta, estando o agente presente na maioria dos Estados das regiões Nordeste e Norte, e que a aplicação de medidas preventivas a campo de forma efetiva podem diminuir ou evitar o aparecimento de casos e focos da enfermidade
The classical swine fever virus causes a highly contagious dis ease in domestic and wild pigs, characterized by leading to great economic losses, for both large and small farming. The disease may present as acute, chronic, delayed, or persistent a symptomatic, which depend on the virulence of the strain, animal age, immune status, gestation period. The disease is notifiable and control measures are listed in the National Program to Swine Health from Ministry of Agriculture, Livestock and Supply. Brazil has an area considered as free of classical swine fever which is composed of the major part of states and non-free zone, which has the majority of states in the North and Northeast Brazil . Outside the area considered free of classical swine fever outbreaks continue to occur sporadically, but the proposal of the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply is to eradicate the disease throughout the country. The diagnosis of infection may be done by viral isolation and virus identification in cell culture, wich is considered the gold standard, using the immunofluorescence and immunoperoxidase technics. Samples were analyzed by this methods in the National Agriculture and Livestock Laboratory of Pernambuco State, from 149 swines with clinical suspicion of classical swine fever during the period from 1999 to 2009, from the stat es of Pará and Amapá North region, and Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraí ba e Pernambuco of Northeast region, Among the swines analyzed, 51 were infected with the classical swine fever virus. The necropsial findings were mostly hemorragic, tipical of the classical form of the disease. The afected farms were in mo t low-level technificated. The results showed that the presence of positive animals is high, with the agent present in most states in the Northeast and North, and that the application of effective preventive measures in the field can reduce or prevent the emergence of cases and outbreaks of disease.
Assuntos
Animais , Doenças Transmissíveis/veterinária , Peste Suína Clássica/diagnóstico , Peste Suína Clássica/epidemiologiaResumo
O vírus da peste suína clássica causa doença altamente contagiosa em suínos domésticos e selvagens, caracterizada por levar a grandes perdas econômicas, tanto para a suinocultura de grande porte como também para os pequenos produtores. A doença pode se apresentar de forma aguda, crônica, tardia, assintomática ou persistente, que dependem da virulência da cepa, idade do animal, estado imunológico, período de estação. A doença é de notificação obrigatória, e as medidas de controle estão listadas no Programa Nacional de Sanidade Suidea do Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento. Quanto à divisão sanitária atualmente adotada, o Brasil conta com uma zona considerada com livre de peste suína clássica que é constituída pelos principais estados produtores de suínos e pelas fronteiras de expansão da atividade e uma zona não livre, que engloba a maioria dos estados das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Fora da área considerada livre focos de peste suína clássica continuam acontecendo de forma esporádica, porém a proposta do Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento é erradicar a enfermidade em todo o território nacional. O diagnóstico de suspeitas da infecção pode ser feito através do isolamento e identificação viral em cultivos celulares, considerado o teste ouro, por meio das técnicas de imunofluorescência e imunoperoxidase. Foram analisadas por estas técnicas no Laboratório Nacional Agropecuário em Pernambuco amostras de órgãos e sangue de 149 suínos com suspeita de PSC, no período compreendido entre 1999 e 2009, provenientes dos estados do Pará e Amapá da região norte e Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco da região nordeste. Dos suínos analisados, 51 estavam infectados com o vírus da peste suína clássica. Nos achados clínicos e de necropsia eram predominantes de alterações hemorrágicas, típicas da forma clássica da doença. As criações afetadas eram predominantemente de baixo nível de tecnificação. Os resultados obtidos evidenciaram que a presença de animais positivos é alta, estando o agente presente na maioria dos Estados das regiões Nordeste e Norte, e que a aplicação de medidas preventivas a campo de forma efetiva podem diminuir ou evitar o aparecimento de casos e focos da enfermidade
The classical swine fever virus causes a highly contagious dis ease in domestic and wild pigs, characterized by leading to great economic losses, for both large and small farming. The disease may present as acute, chronic, delayed, or persistent a symptomatic, which depend on the virulence of the strain, animal age, immune status, gestation period. The disease is notifiable and control measures are listed in the National Program to Swine Health from Ministry of Agriculture, Livestock and Supply. Brazil has an area considered as free of classical swine fever which is composed of the major part of states and non-free zone, which has the majority of states in the North and Northeast Brazil . Outside the area considered free of classical swine fever outbreaks continue to occur sporadically, but the proposal of the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply is to eradicate the disease throughout the country. The diagnosis of infection may be done by viral isolation and virus identification in cell culture, wich is considered the gold standard, using the immunofluorescence and immunoperoxidase technics. Samples were analyzed by this methods in the National Agriculture and Livestock Laboratory of Pernambuco State, from 149 swines with clinical suspicion of classical swine fever during the period from 1999 to 2009, from the stat es of Pará and Amapá North region, and Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraí ba e Pernambuco of Northeast region, Among the swines analyzed, 51 were infected with the classical swine fever virus. The necropsial findings were mostly hemorragic, tipical of the classical form of the disease. The afected farms were in mo t low-level technificated. The results showed that the presence of positive animals is high, with the agent present in most states in the Northeast and North, and that the application of effective preventive measures in the field can reduce or prevent the emergence of cases and outbreaks of disease.(AU)
Assuntos
Animais , Peste Suína Clássica/diagnóstico , Doenças Transmissíveis/veterinária , Peste Suína Clássica/epidemiologiaResumo
Um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA indireto (ELISA-I) foi desenvolvido e padronizado para o diagnóstico sorológico de peste suína clássica. Na comparação foram utilizadas novecentas e trinta e sete amostras de soros suínos, as quais foram testadas pelo teste de soroneutralização seguido de revelação por imunoperoxidase (NPLA), tomado como padrão, resultando em 223 amostras positivas e 714 negativas. Em relação ao NPLA, o ELISA-I apresentou sensibilidade de 98,21 por cento, especificidade de 92,86 por cento, valor preditivo positivo de 81,11 por cento, valor preditivo negativo de 99,4 por cento e precisão de 94,1 por cento. A análise estatística dos resultados revelou uma correlação muito forte (r=0,94) entre os dois testes. Quando comparado com um "kit" de ELISA disponível comercialmente, a performance de ambos em relação ao NPLA foi similar. Concluiu-se que o ELISA-I é um teste apropriado para triagem em larga escala de soros para a detecção de anticorpos contra o Vírus da Peste Suína Clássica (VPSC), embora não seja capaz de diferenciar entre anticorpos induzidos pelo VPSC ou outros pestivírus (AU)