New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs’ whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each technique’s performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each techniques performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.(AU)

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.(AU)

Molecular diagnosis of Ehrlichia canis infection in dogs with uveitis / Diagnóstico molecular da infecção por Ehrlichia canis em cães com uveíte

Canine monocytic ehrlichiosis (CME) is an infectious disease caused by a gram-negative bacterium Ehrlichia canis that has a high global prevalence that leads to high rates of morbidity and mortality in dogs. Among the clinical changes, ophthalmic diseases can lead to permanent blindness and it can be an important clinical sign. The objective of this study was to perform nested polymerase chain reaction (PCR) to diagnose E. canis infection in dogs with bilateral uveitis from the Veterinary Hospital of the Santa Cruz State University. Blood samples were collected and DNA for the molecular diagnosis was extracted from 66 adult dogs of both genders and mixed breeds diagnosed with bilateral uveitis. Thirty-five (53%) dogs showed positive results and presented with iridocyclitis, posterior uveitis, panuveitis, or uveitis with secondary glaucoma. This study demonstrates that nested PCR is an important tool for the differential diagnosis of dogs with bilateral uveitis, as it provides evidence of the infectious agent in the animal.(AU)

Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença infecciosa causada por uma bactéria gram negativa da espécie Ehrlichia canis, que possui alta prevalência mundial e conduz a elevadas taxas de morbidade e mortalidade em cães. Dentre as alterações clínicas, as oftalmopatias podem levar a cegueira permanente e é ser um importante sinal clínico. Objetivou-se realizar nested-PCR para diagnosticar infecção por E. canis em cães portadores de uveíte bilateral provenientes da casuística do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz. Sessenta e seis cães adultos, de ambos sexos e raças variadas, diagnosticados com uveíte bilateral foram submetidos a coleta de sangue e o DNA para realização do diagnóstico molecular foi extraído destas amostras. Foram positivos no teste 35 (53%) cães, que apresentaram iridociclite, uveíte posterior, panuveíte ou uveíte com glaucoma secundário. Esse estudo demonstra a nested-PCR como ferramenta importante no diagnóstico diferencial de cães com uveíte bilateral, por proporcionar a comprovação do agente infeccioso no organismo do animal.(AU)

Molecular diagnosis of Ehrlichia canis infection in dogs with uveitis / Diagnóstico molecular da infecção por Ehrlichia canis em cães com uveíte

Canine monocytic ehrlichiosis (CME) is an infectious disease caused by a gram-negative bacterium Ehrlichia canis that has a high global prevalence that leads to high rates of morbidity and mortality in dogs. Among the clinical changes, ophthalmic diseases can lead to permanent blindness and it can be an important clinical sign. The objective of this study was to perform nested polymerase chain reaction (PCR) to diagnose E. canis infection in dogs with bilateral uveitis from the Veterinary Hospital of the Santa Cruz State University. Blood samples were collected and DNA for the molecular diagnosis was extracted from 66 adult dogs of both genders and mixed breeds diagnosed with bilateral uveitis. Thirty-five (53%) dogs showed positive results and presented with iridocyclitis, posterior uveitis, panuveitis, or uveitis with secondary glaucoma. This study demonstrates that nested PCR is an important tool for the differential diagnosis of dogs with bilateral uveitis, as it provides evidence of the infectious agent in the animal.

Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença infecciosa causada por uma bactéria gram negativa da espécie Ehrlichia canis, que possui alta prevalência mundial e conduz a elevadas taxas de morbidade e mortalidade em cães. Dentre as alterações clínicas, as oftalmopatias podem levar a cegueira permanente e é ser um importante sinal clínico. Objetivou-se realizar nested-PCR para diagnosticar infecção por E. canis em cães portadores de uveíte bilateral provenientes da casuística do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz. Sessenta e seis cães adultos, de ambos sexos e raças variadas, diagnosticados com uveíte bilateral foram submetidos a coleta de sangue e o DNA para realização do diagnóstico molecular foi extraído destas amostras. Foram positivos no teste 35 (53%) cães, que apresentaram iridociclite, uveíte posterior, panuveíte ou uveíte com glaucoma secundário. Esse estudo demonstra a nested-PCR como ferramenta importante no diagnóstico diferencial de cães com uveíte bilateral, por proporcionar a comprovação do agente infeccioso no organismo do animal.