Resumo
Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.
Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.
Assuntos
Animais , Ratos , Células-Tronco Mesenquimais , Osteogênese , Poliésteres , Análise Espectral Raman , Meios de Cultivo Condicionados , Proliferação de Células , Alicerces TeciduaisResumo
The treatment of acute lymphoblastic leukemia is challenging due to side effects, efficacy of the available drugs, and costs. Utilization of L-asparaginase as a therapeutic agent is essential to increase survival of patients. However, costs are elevated and the bacterial forms of the enzyme cause reactions that result in its inhibition by the immune system. Therapeutics alternatives may be searched among eukaryote producers, like fungi. Twelve strains of filamentous fungi were evaluated regarding expression of L-asparaginase activity. The profile of nitrogen assimilation and radial growth were determined for strains which showed higher production ratios. Three media were formulated after selection of the carbon source and carbon/nitrogen ratio that better induced L-asparaginase expression by Penicillium sp. and Fusarium sp. The enzyme activity produced in liquid media reached 8.3 U min.-1 mL-1 (Penicillium sp. T6.2) and 11.4 U min.-1 mL-1 (Fusarium sp.) after 72 hours of cultivation in Bacelar-1 medium. These data show that good producers can be found among fungi, and adjustment of productive processes may offer an alternative to implement eukaryote L-asparaginase production.(AU)
O tratamento da leucemia linfoblástica aguda é desafiador devido aos efeitos adversos, à eficácia dos fármacos disponíveis e aos custos envolvidos. A utilização de L-asparaginase como agente terapêutico é fundamental para aumentar a sobrevida do paciente. Porém, seu custo é elevado e as formas bacterianas da enzima causam reações que resultam na sua inibição pelo sistema imune. Alternativas terapêuticas podem ser buscadas entre produtores eucariontes, como os fungos. Doze linhagens de fungos filamentosos foram avaliadas quanto à expressão de atividade de L-asparaginase. O perfil de assimilação de nitrogênio e o crescimento radial foram determinados para as linhagens com maior razão de produção. Três meios foram formulados após a seleção da fonte de carbono e da razão carbono/nitrogênio que melhor induziram a expressão de L-asparaginase por Penicillium sp. e Fusarium sp. A atividade enzimática produzida em meio líquido alcançou 8,32 U min.-1 mL-1 (Penicillium sp. T6.2) e 11,45 U min.-1 mL-1 (Fusarium sp.) após 72 horas de cultivo no meio Bacelar-1. Esses dados mostram que bons produtores podem ser encontrados entre os fungos e que ajustes nos processos produtivos podem oferecer uma alternativa para a implementação da produção de L-asparaginase eucarionte.(AU)
Assuntos
Asparaginase/análise , Asparaginase/provisão & distribuição , Meios de Cultivo Condicionados/análise , Penicillium , FusariumResumo
Growth rate and medium parameters between two bench scale volumes (13-L and 250-L) were compared. Experiments were maintained batch mode and culture parameters were periodically measured during a 13-day period. Culture growth during the cultivation of algae Haematococcus pluvialis was determined qualitatively by cell counting, optical density, dry weight, ash content, amount of chlorophyll-a, total organic carbon content and by direct measuring of medium nutrients and some abiotic aspects. Vegetative cell growth was higher when cultured in 13-L with 1.33 x 105 cells.mL1 on the 12th day than when cultured in 250-L. Significant difference (p 0.05) in the biology and water culture of H. pluvialis, with the exception of dry weight, ash, nitrite and ammonia, was reported between the volumes. Data obtained in current study for the upscale culture maintenance of H. pluvialis in laboratory conditions shows that it should be undertaken in a 13-L volume due to a greater time span of cells in a vegetative state, greater cell density, lipids and chlorophyll-a contents. Light was of paramount importance on the direct performance of H. pluvialis on the algal biological conditions.(AU)
Foram avaliadas a taxa de crescimento e condições do meio de cultura em volumes de 13-L e 250-L em sistema estático, durante o período de 13 dias para a microalga Haematococcus pluvialis. Foi determinada qualitativamente a contagem de células, densidade, peso seco, teor de cinzas, clorofila-a, teor de carbono orgânico total e avaliação de nutrientes e fatores abióticos do meio de cultura. O crescimento foi mais elevado em volume de 13-L com 1,33 x 105 células.mL1 no décimo segundo dia, do que em volume de 250-L. Em relação ao meio de cultivo e aspectos biológicos de H. pluvialis, foram observadas diferenças significativas (p 0,05) entre os dois volumes com exceção do peso seco, cinzas, nitrito e amônia. Para cultivo em larga escale de H. pluvialis é recomendado nestas condições laboratoriais, o volume de 13-L devido ao maior tempo das células em estado vegetativo, maior densidade celular e elevados teores de lipídios e clorofila-a. A luz interferiu diretamente nas condições biológicas de H. pluvialis.(AU)
Assuntos
Microalgas/crescimento & desenvolvimento , Microalgas/efeitos da radiação , Meios de Cultivo CondicionadosResumo
This work describes the gametogenic cycle of the scallop Nodipecten nodosus kept in a culture system. To this end, during one year, samples were taken from the broodstocks every 30 days to be submitted to macroscopic and microscopic analyses and to measure the amount of astaxanthin. To perform the microscopic evaluation, 5 μ slices from the median portion of the female part of the gonad were submitted to the pattern methodology for histological analyses with paraffin and HE coloration. The remaining portion of the female gonad was lyophilised to extract and quantify the levels of astaxanthin using HPLC. The microscopic analyses revealed four well defined stages for the reproductive cycle. Analyses of data taken throughout the year indicated preferential spawning periods from December to January and from July to September. The astaxanthin analyses showed higher amounts of this carotenoid during the advanced pre-spawning and the initial spawning periods than during gametogenesis, initial pre-spawning, advanced spawning, and the spent stages. According to these results, it was possible to establish a descriptive table of the sexual stages of the female portion of the gonad and the amount of astaxanthin in the sexual stage of the scallop Nodipecten nodosus.(AU)
Este trabalho descreve o ciclo gametogênico da vieira Nodipecten nodosus mantida em ambiente de cultivo. Para isto, durante um ano, amostras de indivíduos reprodutores foram coletadas a cada 30 dias e submetidas à avaliação macroscópica e microscópica e à quantificação de astaxantina. Para a avaliação microscópica, secções de 5 μ da porção mediana feminina da gônada foram submetidas à metodologia de análise histológica padrão em parafina e coloração HE. O restante da porção feminina da gônada foi liofilizado para extração e quantificação de astaxantina em HPLC. A avaliação microscópica permitiu a descrição de quatro estágios bem definidos para o ciclo reprodutivo. Na análise ao longo do ano, foram observados períodos preferenciais de desova em dezembro e janeiro e de julho a setembro. A análise da quantidade de astaxantina, mostrou, nos estádios de pré-desova avançada e de desova inicial, uma maior quantidade desse carotenoide em comparação aos estádios de gametogênese, pré-desova inicial, desova avançada e repouso. Em função desses resultados, foi possível estabelecer um quadro descritivo dos estágios sexuais da porção feminina da gônada e quantidade de astaxantina em cada estágio sexual da vieira Nodipecten nodosus.(AU)
Assuntos
Animais , Comportamento Reprodutivo/fisiologia , Gônadas/crescimento & desenvolvimento , Pectinidae/crescimento & desenvolvimento , Reprodução/fisiologia , Meios de Cultivo Condicionados/efeitos adversosResumo
A renina é um complexo natural de enzimas (endopeptidases aspárticas) utilizada na produção de queijos, extraída principalmente de estômagos de bezerros jovens. A maior demanda por queijos e o alto custo da renina têm incentivado a procura de fontes alternativas de proteases. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi verificar as condições de tempo e temperatura para a produção de biomassa, exopolissacarídeos (EPS) e proteases por Pleurotus ostreatus em cultivo líquido. O micélio foi crescido em meio Pontecorvo, enriquecido com proteína isolada a 22, 25 ou 28oC, com amostragens aos 3, 6, 9, 14 e 17 dias de cultivo. A biomassa foi separada por centrifugação; EPS foram determinados por precipitação com etanol e a atividade proteolítica determinada pela ação do extrato enzimático sobre caseína solúvel alcalina 1% (m/v). Verificou-se que tanto o tempo quanto à temperatura afetaram (p?0,05) a produção de biomassa, EPS e proteases. Concluiu-se que a maior produção de biomassa de P. ostreatus ocorre após nove dias de cultivo a 25ºC; a produção de EPS aumenta com a ampliação do tempo de cultivo, com maior produção a 22ºC; e a máxima produção de proteases ocorre aos 14 dias de cultivo a 28ºC.(AU)
Rennet is a natural complex of enzymes (aspartic endopeptidases) and is often used in the production of cheese. Those enzymes (proteases) are extracted from abomasums of young ruminant animals. The high cheese demand associated with the high curdle cost have been stimulated the searching for alternative protease sources. The objective of this study was to verify the time and temperature conditions for biomass, exopolysaccharide (EPS) and protease production by Pleurotus ostreatus in liquid cultivation. The mycelium was grown in Pontecorvo medium added with isolated soy protein (5%) and maintained at 22, 25 or 28oC, with samplings at 3, 6, 9, 14 or 17 days of cultivation. The biomass was separated by centrifugation, EPS were separated by ethanol precipitation and the proteolytic activity was determined by enzymatic extract action on alkaline soluble casein 1% (m/v). It was verified that time and temperature affect (p?0.05) biomass, EPS and protease production. Most of P. ostreatus biomass production occurs after nine days of cultivation at 25ºC. EPS production rise with increasing of cultivation time, with higher production at 22ºC. Higher protease activity occurs at 28ºC on 14 days of cultivation.(AU)
La renina es un complejo natural de enzimas (endopeptidasas aspárticas) utilizada en la producción de quesos, extraída principalmente de estómagos de becerros jóvenes. La mayor demanda por quesos y el alto costo de la renina ha incentivado la búsqueda de fuentes alternativas de proteasas. Así que, el objetivo de esta investigación fue verificar las condiciones de tiempo y temperatura para la producción de biomasa, exopolisacáridos (EPS) y proteasas por Pleurotus ostreatus en cultivo líquido. El micelio creció en medio a Ponte corvo, enriquecido con proteína aislada a 22, 25 o 28ºC, con muestras a los 3, 6, 9, 14 y 17 días de cultivo. Se separó la biomasa por centrifugación; EPS fueron determinados por precipitación con etanol y la actividad proteolítica determinada por la acción del estrato enzimático sobre caseína soluble alcalina 1% (m/v). Se verificó que tanto el tiempo como la temperatura afectaron (p?0,05) a la producción de biomasa, EPS y proteasas. Se concluye que la mayor producción de biomasa de P. ostreatus ocurre tras nueve días de cultivo a 25ºC; la producción de EPS aumenta con la ampliación del tiempo de cultivo, con mayor producción a 22ºC; y la máxima producción de proteasas ocurre a los 14 días de cultivo a 28ºC.(AU)
Assuntos
Biomassa , Ácido Aspártico Endopeptidases/provisão & distribuição , Pleurotus/enzimologia , Peptídeo Hidrolases/biossíntese , Polissacarídeos/biossíntese , Meios de Cultivo Condicionados/análise , Meios de Cultura/análiseResumo
Este estudo objetivou quantificar as perdas de sementes (jovens mexilhões) no cultivo e discutir as principais causas, especialmente as ocasionadas por predadores e parasitas. O experimento ocorreu na Praia da Ponta do Sambaqui, no período de dezembro de 2004 a agosto de 2005. Foram confeccionadas 54 cordas de mexilhões, contendo 600 sementes cada. Metade das cordas foi disposta em um espinhel de cultivo e protegidas com malha de traineira, sendo mensalmente retirada essa proteção de três delas. As outras 27 cordas permaneceram em um tanque-rede. Por mês, eram coletadas três cordas de cada tratamento e feitas as contagens. Foram fixadas amostras de 30 animais de cada tratamento, sendo realizados procedimentos clássicos de histologia, com coloração HE. A salinidade e temperatura da água do mar foram medidas, respectivamente, de forma semanal e diária. As sementes das cordas no espinhel sofreram intensa predação no verão. Nos meses seguintes não houve diferença significativa na perda de animais entre os 2 tratamentos. Os mexilhões Perna perna jovens são mais vulneráveis ao ataque dos predadores que indivíduos adultos. Além da predação, podem ser causas de perdas questões relacionadas às técnicas de manejo e excesso de sementes por corda. A prevalência do trematódeo Bucephalus sp. foi baixa (5,11%), não havendo relação direta com as perdas observadas(AU)/
This study had the objective of quantifying seed loss in the culture of young mussels as well as discussing the main causes of this loss, especially that derived from predators and parasites. The experiment was carried out in Ponta do Sambaqui beach, between December of 2004 and August of 2005. Fifty four mussel ropes were prepared, containing 600 seeds/m each. Half the ropes were disposed in a long line and protected with fishing net. This protection was removed from three of them every month. The other 27 ropes remained in a net-tank. Every month three ropes from each treatment were collected and the mussels counted. Thirty animals from each treatment were fixed and classical histology procedures were carried out, with stain HE. The salinity and the water temperature of the sea were measured weekly and diary, respectively. The seeds from the ropes of the long line suffered intense predation in the summer. In the following months there was no significant difference in the loss of animals between both treatments. The young Perna perna mussels are more vulnerable to predators than adult individuals. Besides predation, questions related with handling techniques and the excess of seeds in each rope can be causes for loss of animals. The prevalence of the trematod Bucephalus sp. was low (5.11%), there was no directly relation with the observed losses (AU)
Assuntos
Animais , Mytilus edulis/anatomia & histologia , Mytilus edulis/crescimento & desenvolvimento , Meios de Cultivo Condicionados/análise , Meios de Cultivo Condicionados , MoluscosResumo
Este estudo objetivou quantificar as perdas de sementes (jovens mexilhões) no cultivo e discutir as principais causas, especialmente as ocasionadas por predadores e parasitas. O experimento ocorreu na Praia da Ponta do Sambaqui, no período de dezembro de 2004 a agosto de 2005. Foram confeccionadas 54 cordas de mexilhões, contendo 600 sementes cada. Metade das cordas foi disposta em um espinhel de cultivo e protegidas com malha de traineira, sendo mensalmente retirada essa proteção de três delas. As outras 27 cordas permaneceram em um tanque-rede. Por mês, eram coletadas três cordas de cada tratamento e feitas as contagens. Foram fixadas amostras de 30 animais de cada tratamento, sendo realizados procedimentos clássicos de histologia, com coloração HE. A salinidade e temperatura da água do mar foram medidas, respectivamente, de forma semanal e diária. As sementes das cordas no espinhel sofreram intensa predação no verão. Nos meses seguintes não houve diferença significativa na perda de animais entre os 2 tratamentos. Os mexilhões Perna perna jovens são mais vulneráveis ao ataque dos predadores que indivíduos adultos. Além da predação, podem ser causas de perdas questões relacionadas às técnicas de manejo e excesso de sementes por corda. A prevalência do trematódeo Bucephalus sp. foi baixa (5,11%), não havendo relação direta com as perdas observadas/
This study had the objective of quantifying seed loss in the culture of young mussels as well as discussing the main causes of this loss, especially that derived from predators and parasites. The experiment was carried out in Ponta do Sambaqui beach, between December of 2004 and August of 2005. Fifty four mussel ropes were prepared, containing 600 seeds/m each. Half the ropes were disposed in a long line and protected with fishing net. This protection was removed from three of them every month. The other 27 ropes remained in a net-tank. Every month three ropes from each treatment were collected and the mussels counted. Thirty animals from each treatment were fixed and classical histology procedures were carried out, with stain HE. The salinity and the water temperature of the sea were measured weekly and diary, respectively. The seeds from the ropes of the long line suffered intense predation in the summer. In the following months there was no significant difference in the loss of animals between both treatments. The young Perna perna mussels are more vulnerable to predators than adult individuals. Besides predation, questions related with handling techniques and the excess of seeds in each rope can be causes for loss of animals. The prevalence of the trematod Bucephalus sp. was low (5.11%), there was no directly relation with the observed losses
Assuntos
Animais , Meios de Cultivo Condicionados , Meios de Cultivo Condicionados/análise , Mytilus edulis/anatomia & histologia , Mytilus edulis/crescimento & desenvolvimento , MoluscosResumo
O objetivo deste estudo foi aplicar diferentes sistemas de cultivo in vitro para folículos pré-antrais de fetos bovinos da raça Nelore no último trimestre de gestação e para identificar o sistema mais eficiente durante o crescimento dos folículos isolados. Para isso, folículos pré antrais foram isolados mecanicamente e submetidos ao cultivo individual, por 9 dias, em meio não suplementado ou suplementado com soro fetal bovino (SFB), albumina sérica bovina (BSA) ou suplemento definido sintético substituto do soro KnockoutSR(KNO). Avaliou-se ainda, o efeito do gel de colágeno ou monocamada de fibroblastos fetais bovinos como substrato para o cultivo in vitro. A avaliação do aumento de diâmetro folicular foi realizada no dia da colheita (0 hora) e a cada 72 horas de cultivo. A associação entre meio suplementado com SFB e uso de gel de colágeno como substrato foram significativamente mais efetivos sobre o aumento do diâmetro folicular quando comparados aos demais tratamentos. Quando fragmentos de tecido ovariano foram submetidos ao cultivo in vitro, não houve preservação da ultraestrutura folicular por mais de 3 dias de cultivo, em qualquer dos tratamentos utilizados. Ainda não está estabelecido um sistema de cultivo adequado que sustente a diferenciação e multiplicação das células da granulosa e que mantenha o contato das mesmas com o oócito para prover moléculas e fatores que supram a demanda metabólica. Entendemos que esta pesquisa apresentou avanços promissores na busca pelo estabelecimento um sistema de cultivo in vitro de folículos pré-antrais em bovinos.(AU)
The objective of this study is to use different in vitro culture systems of preantral follicles from Nelore breed bovine fetuses in the last gestation quarter. The evaluation of treatments considered the time of growth of isolated follicles. Preantral follicles were mechanically isolated and submitted to the individual culture, for 9 days, in mediano supplemented or supplemented with fetal calf serum (FCS), bovine serum albumin (BSA) or synthetic defined supplement substitute of serum KnockoutSR (KNO). We have also evaluated the effects of collagen gel or fetal calf fibroblast monolayer as substratum for in vitro cultures. The increase on the follicular diameter was followed in the first day (0 h), at the 72 h, 144 h and 216 h. Considering cultures of isolated follicles, the results have shown that the association between media supplemented with FCS and collagengel was significantly more efficient on the increase of the follicular diameter than other treatments. It is not still established a system ofappropriate cultivation that sustains the differentiation and multiplication of the granular cells and that maintains the contact of the same ones with the oocyte to provide molecules and factors that supply the metabolic demand. We also under stand that our results also represent another promising step on the search for the ultimate system of in vitro culture of preantral follicles from bovines.(AU)