Dynamics of nuclear and cytoplasm maturation of bovine oocytes cultivated in vitro in medium supplemented with fulerol / Dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos cultivados in vitro em meio suplementado com fulerol

The aim of this work was to evaluate, in vitro, the dynamics of nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in traditional IVM medium (CT) and supplemented with fullerol (MF50), for 36 hours. The nuclear maturation of CT (n=300) and MF50 (n=270) every 6 hours, stained with Hoechst33342 and cytoplasmic, the mitochondrial distribution of CT (n=197) and MF50 (n=159) at every 12 hours, stained with Mitotracker Orange. At 6 hours, CT oocytes (19%) were in MI (metaphase I), while in MF50 they were in GV (germ vesicle) or GVB (GV breakeage), repeating at 12 hours. At 18 hours, 46.3% were matured in CT, and 20% in MF50. At 24 hours, 43.9% of maturation was observed in the MF50 group, and 63.8% in the CT. At 30 and 36 hours, the maturation pattern was stable, but with the onset of oocyte degeneration. There was a delay in cytoplasmic maturation with 36 hours (P < 0.05) in MF50 (53.9% of mature gametes), compared to CT (69.8%). With immature cytoplasm, they were 10.4% and 31.7% for CT and MF50 (P< 0.05), respectively. It was concluded that fullerol possibly interfered in the expansion of cumulus oophorus cells, as well as delayed the meiotic progression and cytoplasmic maturation.

O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos em meio MIV tradicional (TC) e suplementado com fulerol (MF50), durante 36 horas. Na maturação nuclear do TC (n=300) e do MF50 (n=270) a cada seis horas, corados com Hoechst 33342, e na citoplasmática, avaliou-se a distribuição mitocondrial do TC (n=197) e do MF50 (n=159) a cada 12 horas, corados com Mitotracker Orange (Life® Technologies). Às seis horas, oócitos do TC (19%) se encontravam em MI (metáfase I), enquanto no MF50 estavam em VG (vesícula germinativa) ou QVG (quebra VG), repetindo com 12 horas. Às 18 horas, 46,3% estavam maturados no TC, e 20% no MF50. Com 24 horas, verificaram-se 43,9% de maturação no grupo MF50, e 63,8% no TC. Às 30 e 36 horas, o padrão de maturação foi estável, mas com início de degeneração oócitária. Houve retardo na maturação citoplasmática com 36 horas (P<0,05) no MF50 (53,9% de gametas maduros), comparado ao TC (69,8%). Com citoplasma imaturo, foram 10,4% e 31,7% para TC e MF50 (P<0,05), respectivamente. Conclui-se que o fulerol possivelmente interferiu na expansão das células do cumulus oophorus, bem como retardou a progressão meiótica e a maturação citoplasmática dos oócitos.

Avaliação da atividade da proteína quinase P34Cdc2 na maturação in vitro de oócitos caninos / Evaluation of p34cdc2 kinase activity in the in vitro maturation of canine oocytes

O controle do ciclo celular é regulado por uma cascata de eventos coordenados que podem atuar influenciando na expressão ou repressão da atividade de proteínas relacionadas a retomada da meiose. Estudos indicam que a atividade dessas proteínas mostra-se tempo-dependente no processo de maturação in vitro (MIV). Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a cinética da atividade quinase p34cdc2 durante a MIV de oócitos caninos. Ciência Animal 27(1), 2017. Os ovários foram obtidos de 40 cadelas submetidas à ovário-salpingo-histerectomia (OSH) eletiva. Após a OSH, os ovários foram imediatamente transportados a uma temperatura de 4 ºC. No laboratório, os ovários foram seccionados em fatias finas ("slicing"), para a liberação dos complexos cumulus-oócito (COCs). Apenas os COCs grau 1 foram selecionados e colocados em meio de maturação por um período de 24, 48 e 72 h de maturação. Após o cultivo, os COCs foram colocados em placas contendo solução de hialuronidase 0.2% para a retirada completa das células do Cumulus. A atividade da proteína p34cdc2 foi detectada por ELISA. Com base nos resultados verifica-se que a atividade da proteína mostra-se tempo-dependente, atingindo o pico após 48h de MIV (p<0,01). Após 72h, a atividade demonstrou um decréscimo. Com base neste estudo pode-se concluir que a proteína quinase p34cdc2 desempenha uma função de suma importância na progressão da meiose em cadelas. Dessa forma, a compreensão melhor dessa proteína assim como de outra que participam do processo de maturação poderá contribuir para o estabelecimento de meios mais adequados que melhorem significativamente as taxas dematuração.

The control of the cell cycle is regulated by a cascade of coordinated events that can act by influencing the expression or repression of the activity of proteins related to meiosis resumption. Studies have indicated that the activity of these proteins is time-dependent in the in vitro maturation process (IVM). This work aimed to evaluate the kinetics of the p34cdc2 kinase activity during IVM of canine oocytes. Ovaries were obtained from 40 bitches submitted to elective ovary-salpingo-hysterectomy (OSH). After OSH, ovaries were immediately transported at temperature of 4 °C. In the laboratory, ovaries were sliced for the release of cumulus-oocyte complexes (COCs). Only grade 1 COCs were selected and placed in maturation medium for a period of 24, 48 and 72 h of maturation. After culturing, COCs were plated of 0.2% hyaluronidase solution for complete removal of cumulus cells. The activity of the p34cdc2 protein was detected by ELISA. Based on the results, it was observed that the activity of the protein is time-dependent, peaking after 48 hours of IVM (p 0.01). After 72 hours, activity declined. Based on this study, it could be concluded that the p34cdc2 protein kinase plays a very important role in the meiosis progression in bitches. Thus, a better understanding of this protein as well as of others that participate in the maturation process may contribute to the establishment of more adequate media to significantly improve maturation rates.

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Avaliação da atividade da proteína quinase P34Cdc2 na maturação in vitro de oócitos caninos / Evaluation of p34cdc2 kinase activity in the in vitro maturation of canine oocytes

O controle do ciclo celular é regulado por uma cascata de eventos coordenados que podem atuar influenciando na expressão ou repressão da atividade de proteínas relacionadas a retomada da meiose. Estudos indicam que a atividade dessas proteínas mostra-se tempo-dependente no processo de maturação in vitro (MIV). Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a cinética da atividade quinase p34cdc2 durante a MIV de oócitos caninos. Ciência Animal 27(1), 2017. Os ovários foram obtidos de 40 cadelas submetidas à ovário-salpingo-histerectomia (OSH) eletiva. Após a OSH, os ovários foram imediatamente transportados a uma temperatura de 4 ºC. No laboratório, os ovários foram seccionados em fatias finas ("slicing"), para a liberação dos complexos cumulus-oócito (COCs). Apenas os COCs grau 1 foram selecionados e colocados em meio de maturação por um período de 24, 48 e 72 h de maturação. Após o cultivo, os COCs foram colocados em placas contendo solução de hialuronidase 0.2% para a retirada completa das células do Cumulus. A atividade da proteína p34cdc2 foi detectada por ELISA. Com base nos resultados verifica-se que a atividade da proteína mostra-se tempo-dependente, atingindo o pico após 48h de MIV (p<0,01). Após 72h, a atividade demonstrou um decréscimo. Com base neste estudo pode-se concluir que a proteína quinase p34cdc2 desempenha uma função de suma importância na progressão da meiose em cadelas. Dessa forma, a compreensão melhor dessa proteína assim como de outra que participam do processo de maturação poderá contribuir para o estabelecimento de meios mais adequados que melhorem significativamente as taxas dematuração.(AU)

The control of the cell cycle is regulated by a cascade of coordinated events that can act by influencing the expression or repression of the activity of proteins related to meiosis resumption. Studies have indicated that the activity of these proteins is time-dependent in the in vitro maturation process (IVM). This work aimed to evaluate the kinetics of the p34cdc2 kinase activity during IVM of canine oocytes. Ovaries were obtained from 40 bitches submitted to elective ovary-salpingo-hysterectomy (OSH). After OSH, ovaries were immediately transported at temperature of 4 °C. In the laboratory, ovaries were sliced for the release of cumulus-oocyte complexes (COCs). Only grade 1 COCs were selected and placed in maturation medium for a period of 24, 48 and 72 h of maturation. After culturing, COCs were plated of 0.2% hyaluronidase solution for complete removal of cumulus cells. The activity of the p34cdc2 protein was detected by ELISA. Based on the results, it was observed that the activity of the protein is time-dependent, peaking after 48 hours of IVM (p 0.01). After 72 hours, activity declined. Based on this study, it could be concluded that the p34cdc2 protein kinase plays a very important role in the meiosis progression in bitches. Thus, a better understanding of this protein as well as of others that participate in the maturation process may contribute to the establishment of more adequate media to significantly improve maturation rates.(AU)

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.(AU)

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.(AU)

Interspecific hybrids between Paspalum plicatulum and P. oteroi: a key tool for forage breeding

Grama-tio-pedro (Paspalum oteroi Swallen) is a rare stoloniferous grass of the Plicatula group of Paspalum, well adapted to continuous grazing in areas subject to seasonal flooding in the Pantanal region, in central western Brazil. The species is a facultative apomictic (asexual reproduction by seed) tetraploid, sporadically cultivated on Pantanal farms, propagated either by cuttings or seed. Due to its potential for extensive cultivation and forage quality, Grama-tio-pedro appears as a candidate for genetic improvement within the Plicatula group through plant breeding. We used a colchicine-induced sexual autotetraploid genotype of P. plicatulum Michx. to obtain interspecific hybrids using the apomictic species, P. oteroi, as pollen donor. The very similar meiotic chromosome behavior observed in both parents, with main quadrivalent and bivalent associations, suggested that P. oteroi is a natural autotetraploid. The hybrids showed less irregular meiotic behavior with fewer quadrivalents and more bivalents than either parent. Fertility among interspecific hybrids varied from complete sterility in some of them to seed productions in others that were approximately twice as much as for either parent. The great variability of seed set performance may well be a drastic genetic consequence of joining two homologous chromosome sets of P. plicatulum together with two homologous sets of P. oteroi that, in turn, have some homeology between them. Most hybrids reproduce by sexual means, thus, they could be used as female parents in backcrosses and in crosses with other species of the Plicatula group for interspecific gene transferring in breeding programs.

Avaliação morfológica e nuclear de oócitos bovinos imaturos, obtidos de ovários com e sem a presença de corpo lúteo / Morphological evaluation and nuclear oocytes immature, obtained from ovarian with and without the body presence luteum

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotecnologia que possibilita principalmente o rápido aumento no número de descendentes com mérito genético superior. Atualmente o Brasil é líder mundial na PIVE e grande parte desse sucesso deve-se às inúmeras pesquisas realizadas nessa área. A seleção de oócitos de boa qualidade para essa técnica é determinante para obtenção de embriões de qualidade e satisfatórios índices de prenhez. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar oócitos, obtidos de ovários com e sem a presença de corpo lúteo (CL), de acordo com a classificação morfológica e nuclear, afim de identificar a possível influência do CL na viabilidade dos oócitos. Foram coletados ovários de abatedouro e separados em dois grupos, com e sem CL. Os folículos foram aspirados, e os oócitos obtidos foram selecionados, classificados e em seguida corados com Hoechst 33342 e avaliados sob microscópio de epifluorescência, para avaliação nuclear. Realizou-se análise descritiva de cada tratamento com relação a classificação morfológica e nuclear. Os resultados obtidos foram analisados através de testes não-paramétricos, sendo o efeito do corpo lúteo verificado por meio do teste Qui-quadrado (2) (R core Team, 2013). Concluiu-se que a presença de CL não influencia na qualidade de oócitos imaturos, do ponto de vista quantitativo, morfológico e nuclear.

The in vitro embryo production (IVP) is a biotechnology that primarily enables the rapid increase in the number of offspring with superior genetic merit . Currently, Brazil is the world leader in IVP and much of this success is due to the extensive research carried out in that area. The selection of good quality oocytes for this technique is critical to obtaining quality embryos and satisfactory pregnancy rates. Thus, this study aimed to assess oocytes obtained from ovaries with and without the presence of corpus luteum (CL), according to the morphological and nuclear classification, in order to identify the possible influence of CL on the viability of oocytes. They were collected from slaughterhouse ovaries and separated into two groups, with and without CL. Follicles were aspirated and the oocytes were selected, ranked, and then stained with Hoechst 33342 and evaluated by epifluorescence microscope for nuclear evaluation. A descriptive analysis of each treatment with respect to morphological and nuclear classification. The results were analyzed using non-parametric tests, with the effect of the corpus luteum verified using the chisquare test (χ2) (R Core Team, 2013). It was concluded that the presence of CL does not influence the quality of immature oocytes, from the quantitative and morphological nuclear standpoint.

Interspecific hybrids between Paspalum plicatulum and P. oteroi: a key tool for forage breeding

Grama-tio-pedro (Paspalum oteroi Swallen) is a rare stoloniferous grass of the Plicatula group of Paspalum, well adapted to continuous grazing in areas subject to seasonal flooding in the Pantanal region, in central western Brazil. The species is a facultative apomictic (asexual reproduction by seed) tetraploid, sporadically cultivated on Pantanal farms, propagated either by cuttings or seed. Due to its potential for extensive cultivation and forage quality, Grama-tio-pedro appears as a candidate for genetic improvement within the Plicatula group through plant breeding. We used a colchicine-induced sexual autotetraploid genotype of P. plicatulum Michx. to obtain interspecific hybrids using the apomictic species, P. oteroi, as pollen donor. The very similar meiotic chromosome behavior observed in both parents, with main quadrivalent and bivalent associations, suggested that P. oteroi is a natural autotetraploid. The hybrids showed less irregular meiotic behavior with fewer quadrivalents and more bivalents than either parent. Fertility among interspecific hybrids varied from complete sterility in some of them to seed productions in others that were approximately twice as much as for either parent. The great variability of seed set performance may well be a drastic genetic consequence of joining two homologous chromosome sets of P. plicatulum together with two homologous sets of P. oteroi that, in turn, have some homeology between them. Most hybrids reproduce by sexual means, thus, they could be used as female parents in backcrosses and in crosses with other species of the Plicatula group for interspecific gene transferring in breeding programs.(AU)

Avaliação morfológica e nuclear de oócitos bovinos imaturos, obtidos de ovários com e sem a presença de corpo lúteo / Morphological evaluation and nuclear oocytes immature, obtained from ovarian with and without the body presence luteum

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotecnologia que possibilita principalmente o rápido aumento no número de descendentes com mérito genético superior. Atualmente o Brasil é líder mundial na PIVE e grande parte desse sucesso deve-se às inúmeras pesquisas realizadas nessa área. A seleção de oócitos de boa qualidade para essa técnica é determinante para obtenção de embriões de qualidade e satisfatórios índices de prenhez. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar oócitos, obtidos de ovários com e sem a presença de corpo lúteo (CL), de acordo com a classificação morfológica e nuclear, afim de identificar a possível influência do CL na viabilidade dos oócitos. Foram coletados ovários de abatedouro e separados em dois grupos, com e sem CL. Os folículos foram aspirados, e os oócitos obtidos foram selecionados, classificados e em seguida corados com Hoechst 33342 e avaliados sob microscópio de epifluorescência, para avaliação nuclear. Realizou-se análise descritiva de cada tratamento com relação a classificação morfológica e nuclear. Os resultados obtidos foram analisados através de testes não-paramétricos, sendo o efeito do corpo lúteo verificado por meio do teste Qui-quadrado (2) (R core Team, 2013). Concluiu-se que a presença de CL não influencia na qualidade de oócitos imaturos, do ponto de vista quantitativo, morfológico e nuclear.(AU)

The in vitro embryo production (IVP) is a biotechnology that primarily enables the rapid increase in the number of offspring with superior genetic merit . Currently, Brazil is the world leader in IVP and much of this success is due to the extensive research carried out in that area. The selection of good quality oocytes for this technique is critical to obtaining quality embryos and satisfactory pregnancy rates. Thus, this study aimed to assess oocytes obtained from ovaries with and without the presence of corpus luteum (CL), according to the morphological and nuclear classification, in order to identify the possible influence of CL on the viability of oocytes. They were collected from slaughterhouse ovaries and separated into two groups, with and without CL. Follicles were aspirated and the oocytes were selected, ranked, and then stained with Hoechst 33342 and evaluated by epifluorescence microscope for nuclear evaluation. A descriptive analysis of each treatment with respect to morphological and nuclear classification. The results were analyzed using non-parametric tests, with the effect of the corpus luteum verified using the chisquare test (χ2) (R Core Team, 2013). It was concluded that the presence of CL does not influence the quality of immature oocytes, from the quantitative and morphological nuclear standpoint.(AU)

Meiotic behavior and pollen viability in Jatropha curcas L / Comportamento meiótico e viabilidade polínica na espécie Jatropha curcas L

The Jatropha curcas, known as physic nut, belonging to the Euphorbiaceae family, figure today as one of the greatest potential of oilseeds for biodiesel production in Brazil. The present study aimed to evaluate meiosis and pollen viability in J. curcas accesses from UFRRJ germplasm collection. To do that, flower buds were collected from 20 plants, these were fixed in acetic acid 3:1 solution and alcohol 70%. The staining of the cells was done by acetic carmine 2% solution and Alexanders triple solution, for the analysis of meiotic and pollen viability, respectively. All observations were carried out under an optical microscope. It was observed that the species has 2n = 2x = 22 chromosomes. It was observed many irregularities during the meiotic division as the presence of sticky chromosomes and irregular meiotic products, such as monads, dyads, triads and polyads, and the occurrence of cytomixis and micronucleus, these latter two anomalies had a higher frequency among the accessions. The meiotic index was estimated in 84.21% and the average pollen viability in 89.85%. The lowest pollen viability was 78% (UFRRJ885), while the maximum observed was 96% (UFRRJ861). Based on the results obtained, although Jatropha curcas presents certain anomalies during meiosis, the accessions analyzed here showed satisfactory pollen viability.(AU)

A espécie Jatropha curcas, conhecida como pinhão-manso, pertencente à família Euphorbiaceae, figura atualmente como uma das oleaginosas de maior potencial para a produção de biodiesel no Brasil. O presente estudo teve como objetivo avaliar a meiose e a viabilidade polínica em acessos de J. curcas que compõem a coleção de germoplasma da UFRRJ. Para tal, foram coletados botões florais de 20 plantas, a seguir estes foram fixados em solução de ácido acético 3:1 e álcool 70%. A coloração das células foi feita através dos corantes carmim acético 2% e da solução tripla de Alexander, para as análises meióticas e de viabilidade polínica, respectivamente. Todas as observações foram realizadas em microscópio óptico. Foi observado que a espécie possui 2n = 2x = 22 cromossomos. Foram observadas várias irregularidades durante a divisão meiótica, como a presença de cromossomos pegajosos, produtos meióticos irregulares, como mônades, díades, tríades e políades, além da ocorrência de citomixia e micronúcleos, sendo que estas duas últimas anomalias tiveram maior frequência entre os acessos avaliados. O índice meiótico foi estimado em 84,21% e a média da viabilidade polínica em 89,85%. A menor viabilidade polínica foi de 78% (UFRRJ885), enquanto que a máxima observada foi de 96% (UFRRJ861). Com base nos resultados obtidos, apesar de Jatropha curcas apresentar certas anomalias durante a meiose, os acessos aqui analisados mostraram viabilidade polínica satisfatória.(AU)

Large-scale chromatin structure and function changes during oogenesis: theinterplay between oocyte and companioncumulus cell

The process of chromatin configuration remodeling within the mammalian oocyte nucleus or germinal vesicle (GV), which occurs towards the end of its differentiation phase before meiotic resumption, has received much attention and has been studied in several mammals. This review is aimed to highlight the relationship between changes in chromatin configurations and to both functional and structural modifications occurring in the oocyte nuclear compartment. During the extensive phase of meiotic arrest at the diplotene stage, the chromatin enclosed within the GV is subjected to several levels of regulation. Morphologically, the chromosomes lose their individuality and form a loose chromatin mass. Then the decondensed chromatin undergoes profound rearrangements during the final stages of oocyte growth in tight association with the acquisition of meiotic and developmental competence. Functionally, the discrete stages of chromatin condensation are characterized by different level of transcriptional activity, DNA methylation and covalent histone modifications. Interestingly, the program of chromatin rearrangement is not completely intrinsic to the oocyte, but follicular cells exert their regulatory actions through gap junction mediated communications and intracellular messenger dependent mechanism(s). With this in mind and since oocyte growth mostly relies on the bidirectional crosstalk with the follicular cells, experimental manipulation of large-scale chromatin configuration is discussed. Besides providing tools to determine the key cellular pathways involved in genome-wide chromatin modifications , the present findings will aid to the refinement of physiological culture systems that can have important implications in treating human infertility as well as managing breeding schemes in animal husband .

Large-scale chromatin structure and function changes during oogenesis: theinterplay between oocyte and companioncumulus cell

The process of chromatin configuration remodeling within the mammalian oocyte nucleus or germinal vesicle (GV), which occurs towards the end of its differentiation phase before meiotic resumption, has received much attention and has been studied in several mammals. This review is aimed to highlight the relationship between changes in chromatin configurations and to both functional and structural modifications occurring in the oocyte nuclear compartment. During the extensive phase of meiotic arrest at the diplotene stage, the chromatin enclosed within the GV is subjected to several levels of regulation. Morphologically, the chromosomes lose their individuality and form a loose chromatin mass. Then the decondensed chromatin undergoes profound rearrangements during the final stages of oocyte growth in tight association with the acquisition of meiotic and developmental competence. Functionally, the discrete stages of chromatin condensation are characterized by different level of transcriptional activity, DNA methylation and covalent histone modifications. Interestingly, the program of chromatin rearrangement is not completely intrinsic to the oocyte, but follicular cells exert their regulatory actions through gap junction mediated communications and intracellular messenger dependent mechanism(s). With this in mind and since oocyte growth mostly relies on the bidirectional crosstalk with the follicular cells, experimental manipulation of large-scale chromatin configuration is discussed. Besides providing tools to determine the key cellular pathways involved in genome-wide chromatin modifications , the present findings will aid to the refinement of physiological culture systems that can have important implications in treating human infertility as well as managing breeding schemes in animal husband .(AU)

Efeito das células do cumulus e cisteamina durante o cultivo de maturação in vitro de oócitos bovinos sobre a maturação nuclear e aquisição da competência para desenvolvimento embrionário / Effects of cumulus cells and cysteamine during bovine oocyte in vitro maturation on meiosis progression and acquisition of developmental competence

Complexos cumulus-oócito (COC), oócitos desnudos (DO) e DO cocultivados com células do cumulus em suspensão (DO+CC) foram maturados in vitro (MIV) na presença ou ausência de cisteamina (50mM). Observou-se efeito benéfico da cisteamina durante o cultivo de MIV, pois a maturação nuclear no grupo COC cisteamina foi maior do que a do COC controle (P<0,05). No grupo sem a adição de cisteamina, foi observado que a ausência de CC durante o cultivo de MIV prejudicou a maturação nuclear em DO, em relação ao COC (P<0,05), todavia a cisteamina restaurou a capacidade de progressão da meiose em DO, tornando-os semelhantes aos COC (P>0,05). O acoplamento entre oócitos e CC durante MIV demonstrou ser essencial para aquisição da competência do oócito para suportar o desenvolvimento embrionário inicial, pois COC apresentaram maior porcentagem de blastocistos e eclosão quando comparados a DO e DO+CC (P<0,05). A inclusão de cisteamina no cultivo de MIV não restaurou a aquisição da competência em DO e DO+CC, que permaneceram semelhantes aos do grupo-controle (P>0,05). Conclui-se que a cisteamina no meio de MIV melhora as taxas de maturação nuclear em COC e restaura a capacidade de progressão da meiose em DO. Todavia, na concentração utilizada neste estudo, não promove efeito benéfico no desenvolvimento embrionário.(AU)

Cumulus-oocyte complexes (COC), denuded oocytes (DO) and DO co-cultured with cumulus cells in suspension (DO+CC) were in vitro matured (IVM) in the presence or absence of cysteamine (50mM). A beneficial effect of cysteamine was observed during IVM, because the nuclear maturation in the COC cysteamine group was higher than in COC control (P<0.05). In the control group, the absence of CC during IVM impaired nuclear maturation in DO when compared to COC (P<0.05), but cysteamine restored the ability of meiosis progression in DO, making them similar to COC (P>0.05). The coupling between oocytes and CC during IVM proved to be essential for the acquisition of oocyte competence to support early embryonic development, as COC had higher percentages of blastocyst and hatching when compared to DO and DO+DC (P<0.05). However, the inclusion of cysteamine in the IVM culture did not restore the acquisition of competence in DO and DO+DC, which remained similar to the control group (P>0.05). It is concluded that cysteamine in the IVM culture improves the nuclear maturation in COC and restores the progression ability of meiosis in DO. However, in the concentration used in this study, cysteamine does not promote a beneficial effect on embryo development.(AU)

Comportamento meiótico durante a microsporogênese em espécies da família meliaceae / Comportamiento meiótica durante la microsporogénesis en especies de la familia meliaceae / Meiotic behavior during microsporogenesis of some species of meliaceae family

A família Meliaceae inclui espécies de grande interesse agronômico, ecológico, econômico e ornamental de alto potencial madeireiro no mundo. No Brasil ocorrem cerca de seis gêneros e 100 espécies. Considerando a falta de estudos citológicos para esse grupo, este trabalho descreve o comportamento meiótico durante a microsporogênese de seis espécies (Trichilia pallida, Trichilia elegans, Trichilia catigua, Cedrela fissilis, Cabralea canjerana, Guarea guidonea) da família Meliaceae, representando quatro dos seis gêneros que estão presentes no Brasil. Inflorescências foram coletadas e fixadas em etanol/ácido acético (3:1 v/v) por 24 horas, transferidos para álcool a 70%, e acondicionadas sob refrigeração. As lâminas foram preparadas pela técnica de esmagamento, coradas com carmim acético a 1%. A análise citogenética revelou poucas irregularidades meióticas, sendo estas relacionadas a segregação dos cromossomos, fusos irregulares e conexão citoplasmática. Como consequência da segregação irregular dos cromossomos na meiose I e II e da organização irregular dos fusos na meiose II, o padrão de citocinese também foi irregular originando tétrades com micrócitos e tríades, resultando em micrósporos desbalanceados e de núcleo restituído (2n).(AU)

The Meliaceae family includes the most important species with great agronomic, ecological, economic and ornamental value and high timber potential in the world. In Brazil, approximately six genera and 100 species are found. Considering the lack of cytological studies for its genera, the present study describes the meiotic behavior during microsporogenesis of six species of the Meliaceae family, representing four of the six genera that are present in Brazil; these species are: Trichilia pallida, Trichilia elegans, Trichilia catigua, Cedrela fissilis, Cabralea canjerana, Guarea guidonea. Inflorescences were collected and fixed in ethanol/acetic acid (3:1 v/v) for 24 hours, transferred to alcohol at 70%, and stored under refrigeration. The slides were prepared by squashing, and stained with acetic carmine 1% and observed under optical microscopy. Cytogenetic analysis revealed few meiotic irregularities, which are related to segregation of chromosome spindles and irregular cytoplasmic connection. As a result of irregular segregation of chromosomes during meiosis I and II and the irregular organization of the spindles in meiosis II, the pattern of cytokinesis was also irregular resulting in microcytic tetrads and triads, unbalanced microspores and restored nuclei (2n).(AU)

La familia Meliaceae incluye especies de gran interés agronómico, ecológico, económico y ornamental de alto potencial maderero en el mundo. En Brasil ocurren cerca de seis géneros y 100 especies. Considerando la falta de estudios citológicos para ese grupo, este trabajo describe el comportamiento meiótica durante la microsporogénesis de seis especies (Trichilia pallida, Trichilia elegans, Trichilia catigua, Cedrela fissilis, Cabralea canjerana, Guarea guidonea) de la familia Meliaceae, representando cuatro de los seis géneros que están presentes en Brasil. Inflorescencias fueran colectadas y fijadas en etanol/ácido acético (3:1 v/v) por 24 horas, transferidos para alcohol a 70%, y acondicionadas bajo refrigeración. Las láminas fueron preparadas por la técnica de aplastamiento, coloradas con carmín acético a 1%. El análisis citogenética reveló pocas irregularidades meióticas, siendo éstas relacionadas a la segregación de los cromosomas, fusos irregulares y conexión citoplasmática. Como consecuencia de segregación irregular de cromosomas en la meiosis I y II y de la organización irregular de los fusos en la meiosis II, el estándar de citocinesis también fue irregular originando tétradas con micrófitos y tríades, resultando en micros poros desbalanceados y de núcleo restituido (2n).(AU)

The resumption of meiosis mediated by angiotensin II is dependent on progesterone, oxytocin and prostaglandin

Background: Oocytes are arrested in the first meiotic prophase during follicular development until near ovulation. In vitro, oocytes resume meiosis spontaneously, germinal vesicle breakdown (GVBD) occurs and oocytes progress to the MII stage when they are removed from their follicles and cultured under suitable conditions. On the other hand, meiotic maturation of bovine oocytes occurs within the follicle, raising the question regarding possible involvement of positive signal(s) to induce meiotic resumption in vivo. Meiotic resumption is dependent on the preovulatory surge of LH, but the bovine cumulus­oocyte complexes (COCs) do not have LH receptors, so the signal must occur through theca and mural granulosa cells. The LH surge stimulated the ovarian renin-angiotensin system (RAS), including an increase in the renin activity and angiotensin II (AngII) concentration in bovine follicular fluid. Also, the interactions among LH, AngII increased follicular production of prostaglandins (PGs) and modulated steroidogenesis in the bovine preovulatory follicle. AngII has also been associated with follicular growth and ovulation in cows. Furthermore, AngII stimulated the resumption of meiosis in co-culture systems of cumulus enclosed bovine oocytes and follicular cells. Review: The presence of prorenin, renin, angiotensinogen, angiotensin-converting enzyme, angiotensin II (Ang II) and Ang II receptors in the ovary is suggestive of a functional ovarian RAS. In the last few years, our research group has focused on studying the contribution of RAS in antral follicle development, ovulation and oocyte maturation. A new concept of mechanism and factors involved in oocyte meiotic resumption has been established using cattle as a model. Transvaginal ultrasound has been used for intrafollicular injection to investigate factors that play a part in the resumption of meiosis. With this in vivo and an in vitro model, culturing oocytes in the presence of theca and granulosa cells, we have demonstrated that AngII via the AT2 receptor subtype plays a pivotal role in the antral follicle development, early mechanism of ovulation and oocyte meiotic resumption in cattle. When bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) are cultured with follicular hemisections, oocyte maturation is inhibited; however, follicular cells or conditioned medium were unable to inhibit nuclear maturation in the presence of AngII. In vivo, intrafollicular injection of saralasin (a competitive AngII antagonist) completely inhibited the oocyte meiotic resumption in follicles (larger than 12 mm) challenged with an GnRH agonist. Moreover, oocytes co-cultured with follicular hemisections progressed nuclear maturation when prostaglandin E2 (PGE2), PGF2a, progesterone, oxitocin or AngII was present in the coculture system and indomethacin inhibited AngII-induced meiotic resumption. Conclusion: our results provide strong evidence that AngII mediates the oocyte meiotic resumption induced by an LH surge in cattle and that this event is dependent on progesterone, oxytocin and prostaglandin.

Epigenética e neo-oogênese: novos conceitos em foliculogênese / Epigenetic and neo-oogenesis: new concepts on folliculogenesis

Novas teorias têm sido propostas sobre a origem e o crescimento dos gametas femininos, desafiando conceitos de mais de 150 anos. A possibilidade de formação contínua de folículos e ovócitos apresenta-se como hipótese extremamente interessante, mas requer ainda novos trabalhos, seja para comprovar sua existência ou refutá-la definitivamente. O estudo da epigenética surge como grande possibilidade para uma melhor compreensão dessas teorias. As variações epigenéticas são dinâmicas, transmitidas entre gerações e guardam relação com o ambiente. O estoque finito de oócitos, a renovação contínua, ou a coexistência de ambos são discutidos neste artigo.(AU)

New theories have been proposed for the origin and growth of female gametes, challenging concepts of more than 150 years. The possibility of continue formation of follicles and oocytes appears to be very interesting hypothesis, but it still need further works, either to definitely prove or refute its existence. The study of epigenetic comes as a remarkable possibility for a better understanding of these theories. The epigenetic changes are dynamic, passed down between generations and are related with environment. The finite stock of oocytes, the continuous renewal, or co-existence of both are discussed in this paper.(AU)

Epigenética e neo-oogênese: novos conceitos em foliculogênese / Epigenetic and neo-oogenesis: new concepts on folliculogenesis

Novas teorias têm sido propostas sobre a origem e o crescimento dos gametas femininos, desafiando conceitos de mais de 150 anos. A possibilidade de formação contínua de folículos e ovócitos apresenta-se como hipótese extremamente interessante, mas requer ainda novos trabalhos, seja para comprovar sua existência ou refutá-la definitivamente. O estudo da epigenética surge como grande possibilidade para uma melhor compreensão dessas teorias. As variações epigenéticas são dinâmicas, transmitidas entre gerações e guardam relação com o ambiente. O estoque finito de oócitos, a renovação contínua, ou a coexistência de ambos são discutidos neste artigo.

New theories have been proposed for the origin and growth of female gametes, challenging concepts of more than 150 years. The possibility of continue formation of follicles and oocytes appears to be very interesting hypothesis, but it still need further works, either to definitely prove or refute its existence. The study of epigenetic comes as a remarkable possibility for a better understanding of these theories. The epigenetic changes are dynamic, passed down between generations and are related with environment. The finite stock of oocytes, the continuous renewal, or co-existence of both are discussed in this paper.

Utilização do hormônio luteinizante (lh), fator de crescimento epidermal (egf) e ativina-a no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados / Activin-A promotes the development of goat isolated secondary folliclesin vitro

[...] No experimento 1, foi verificado que a adição de LH a partir do dia 6 de cultivo aumentou as taxas de oócitos ? 110 µm, bem como a taxa de retomada da meiose (P<0,05). Por outro lado, quando o LH foi adicionado no início do cultivo foram obtidos apenas oócitos em estádio de vesícula germinativa. No experimento 2, no dia 6 de cultivo de cultivo, a adição de 50 ng/mL de EGF aumentou as taxas de formação do antro, em comparação com o controle cultivado, e após 18 dias resultou em maiores taxas de retomada da meiose quando comparado aos demais tratamentos (P<0,05). Na presença de EGF, a taxa de crescimento folicular diária foi superior em comparação ao controle cultivado (P<0,05). Após 18 dias, os níveis de RNAm para o FSH-R e aromatase P450 foram superiores ao controle não cultivado (P<0,05). No experimento 3 no dia 6 de cultivo, a taxa de formação de antro foi superior na presença de ativina-A quando comparado ao controle cultivado (P<0,05). A adição de 50 ng/mL de ativina-A aumentou a taxa de crescimento folicular do D12 para o D18, resultando em maiores taxas de retomada da meiose (P<0,05). No D6, a ativina-A (50 ng/ml) aumentou os níveis de RNAm para seu receptor (ActR-IA) quando comparado ao controle cultivado (P<0,05). Após 18 dias, a adição de 50 ng/ml de ativina-A aumentou significativamente seus próprios níveis de RNAm comparado ao controle não cultivado. Além disso, este tratamento reduziu os níveis de RNAm para aromatase P450 quando comparado ao controle cultivado (P <0,05). Em conclusão, o momento de adição de LH no meio de cultivo afetou o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados. Os efeitos do EGF e os níveis de mRNA para o EGF, EGF-R, FSH-R aromatase P450 variaram de acordo com a fase de desenvolvimento folicular. A adição de ativina-A, de forma dependente, ao meio de cultivo promoveu o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos após o cultivo.

[...] In experiment 1, was verified that the addition of LH from D6 onward of culture significantly increased the rates of oocytes ≥ 110 μm and the resumption of meiosis rate. On the other hand, when the LH was added since the beginning of culture, only oocytes at the germinal vesicle stage were obtained. In experiment 2, after 6 days of culture, the addition of 50 ng/ml EGF increased the rates of antrum formation compared to the cultured control, and after 18 days this treatment produced oocytes with higher rates of meiosis resumption compared to the other treatments (P<0.05). In the presence of EGF, the follicular growth rate was higher compared to the cultured control (P<0.05). After 18 days, the mRNA levels for FSH-R and P 450 aromatase were higher than the non-cultured control (P<0.05). In experiment 3, after 6 days of culture, the rate of antrum formation was higher in the presence of activin-A compared to the cultured control (P<0.05). The addition of 50 ng/ml activin-A increased the follicular growth rate from D12 to D18, resulting in higher rates of meiosis resumption (P<0.05). On D6, the activin-A (50 ng/ml) increased the mRNA levels for its own receptor (ActR-IA) compared to the cultured control (P<0.05). After 18 days, the addition of 50 ng/ml activin-A also significantly increased its own mRNA levels compared to the non-cultured control. Furthermore, this treatment reduced the mRNA levels for P 450 aromatase compared to the cultured control (P<0.05). In conclusion, the moment of LH addition to the culture medium affects the development of cultured goat preantral follicles. The effects of EGF and mRNA levels for EGF, EGF-R, FSH-R and P 450 aromatase varied according to the follicular developmental stage. The addition of activin-A to the culture medium promoted the development of goat preantral follicles after culture.