Impact of nitrogen and phosphorus fertilizers on Cry1Ac protein contents in transgenic cotton / Impacto de fertilizantes de nitrogênio e fósforo nos conteúdos de proteína Cry1Ac em algodão transgênico

Abstract Application of different fertilizers to check the efficiency of expression of Bt (Bacillus thuringiensis) gene in one of the leading commercialized crops (cotton) against Lepidopteran species is of great concern. The expression of Cry protein level can be controlled by the improvement of nutrients levels. Therefore, the myth of response of Cry toxin to different combinations of NP fertilizers was explored in three Bt cotton cultivars. Combinations include three levels of nitrogen and three levels of phosphorus fertilizers. Immunostrips and Cry gene(s) specific primer based PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis were used for the presence of Bt gene that unveiled the presence of Cry1Ac gene only. Further, the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit was used to quantify the expression of Cry1Ac protein. Under various NP fertilizers rates, the level of toxin protein exhibited highly significant differences. The highest toxin level mean was found to be 2.3740 and 2.1732 µg/g under the treatment of N150P75 kg ha-1 combination while the lowest toxin level mean was found to be 0.9158 and 0.7641 µg/g at the N50P25 kg ha-1 level at 80 and 120 DAS (Days After Sowing), respectively. It was concluded from the research that the usage of NP fertilizers has a positive relation with the expression of Cry1Ac toxin in Bt cotton. We recommend using the N150P50 kg ha-1 level as the most economical and practicable fertilizer instead of the standard dose N100P50 kg ha-1 to get the desired level of Cry1Ac level for long lasting plant resistance (<1.5). The revised dose of fertilizer may help farmers to avoid the cross-resistance development in contradiction of insect pests.

Resumo A aplicação de diferentes fertilizantes para verificar a eficiência da expressão do gene Bt (Bacillus thuringiensis) em uma das principais culturas comercializadas (algodão) contra espécies de lepidópteros é uma grande preocupação. A expressão do nível de proteína Cry pode ser controlada pela melhoria dos níveis de nutrientes. Portanto, o mito da resposta da toxina Cry a diferentes combinações de fertilizantes NP foi explorado em três cultivares de algodão Bt. As combinações incluem três níveis de nitrogênio e três níveis de fertilizantes de fósforo. A análise de PCR (reação em cadeia da polimerase) específica para o gene (s) Immunostrips e Cry (s) foi usada para a presença do gene Bt que revelou a presença do gene Cry1Ac apenas. Além disso, o kit ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) foi usado para quantificar a expressão da proteína Cry1Ac. Sob várias taxas de fertilizantes NP, o nível de proteína de toxina exibiu diferenças altamente significativas. A média do nível mais alto de toxina foi de 2,3740 e 2,1732 µg / g sob o tratamento da combinação N150P75 kg ha-1, enquanto a média do nível mais baixo de toxina foi de 0,9158 e 0,7641 µg / g no nível de N50P25 kg ha-1 em 80 e 120 DAS (dias após a semeadura), respectivamente. Concluiu-se com a pesquisa que o uso de fertilizantes NP tem relação positiva com a expressão da toxina Cry1Ac no algodão Bt. Recomendamos o uso do nível de N150P50 kg ha-1 como o fertilizante mais econômico e praticável em vez da dose padrão N100P50 kg ha-1 para obter o nível desejado de nível de Cry1Ac para resistência de planta de longa duração (<1,5). A dose revisada de fertilizante pode ajudar os agricultores a evitar o desenvolvimento de resistência cruzada em contradição com as pragas de insetos.

Spodoptera frugiperda (Noctuidae) fed on transgenic maize can transfer Bt proteins to Podisus nigrispinus (Pentatomidae)

An important concern with the use of genetically modified (GM) plants expressing Bacillus thuringiensis (Bt) insecticidal toxins is the deleterious effect on non-target organisms. The predatory stink bug Podisus nigrispinus (Dallas) (Hemiptera: Pentatomidae) is used in biological control programs and may be exposed to Bt toxins. This study evaluated the indirect effects of different Cry proteins on P. nigrispinus with the prey Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), fed on simple or pyramided Bt maize genotypes. The experiment was carried out in a completely randomized design with three treatments: i) Isohybrid (not Bt), ii) Herculex® (transgenic maize encoding Cry1F protein) and iii) PowerCore® (pyramidal transgenic maize encoding the Cry1F, Cry1A.105, and Cry2Ab2 proteins), which were used to feed S. frugiperda for 48 h. The caterpillars were used as prey by P. nigrispinus females. We evaluated the presence of Cry proteins, consumed prey biomass (predation), oviposition period, number of postures, number of eggs, number of eggs per posture, number of nymphs, egg viability, embryonic period, female longevity and development, and survival rates of immature. The results show that different Cry proteins move through the food chain of P. nigrispinus and provide evidence that the ingestion of three different proteins does not lead to unexpected synergistic effects. However, Cry toxins promoted histopathological changes in midgut cells of P. nigrispinus.

Behavior and development of Tetranychus ludeni Zacher, 1913 (Acari: Tetranychidae) and physiological stress in genetically modified cotton expressing Cry1F and Cry1Ac proteins / Comportamento e desenvolvimento de Tetranychus ludeni Zacher, 1913 (Acari: Tetranychidae) e estresse fisiológico em algodoeiro geneticamente modificado expressando as proteínas Cry1F e Cry1Ac

Genetically modified plants are one of the tactics used in integrated pest management - IPM. There is great concern about the impact of these plants on non-target organisms. On the other hand, there is little information in the literature on the effects of transgenics (Bacillus thuringiensis) Bt on populations of phytophagous mites, and the physiological responses that this attack promotes on plants. The objective of this work was to evaluate the biology of the T. ludeni mite in Bt cotton, expressing the Cry1F and Cry1Ac proteins. To evaluate the behavior of food and oviposition preference of the T. ludeni with Bt cotton and isohybrid. Verify if the physiological stress caused by T. ludeni's attack is differentiated in Bt cotton. The mites were reared in Bt cotton and isohybrid, in a total of 40 replicates in the completely randomized design and the biological cycle was evaluated. The food preference and oviposition analysis were done with 10 replicates, with choice. The physiological stress was evaluated through chlorophyll fluorescence, under greenhouse conditions. The data of the T. ludeni biology were analyzed by Student's t-test, for food and oviposition preference the chi-square test was performed. Regression models were fitted for the fluorescence parameters. The model identity test was used to evaluate the differences between Bt and isohybrid treatments. Cry1F and Cry1Ac proteins have not affected the biology of T. ludeni. The photosynthetic parameters in Bt cotton plants were less influenced by T. ludeni infestation.

O uso de plantas geneticamente modificadas é uma das táticas utilizadas no manejo integrado de pragas - MIP. Observa-se grande preocupação com o impacto dessas plantas sobre organismos não alvos. Por outro lado, existe pouca informação na literatura sobre efeitos dos transgênicos (Bacillus thuringiensis) Bt em populações de ácaros fitófagos, e as respostas fisiológicas que esse ataque promove nas plantas. Objetivou-se com esse trabalho avaliar a biologia do ácaro T. ludeni em algodoeiro Bt, expressando as proteínas Cry1F e Cry1Ac. Avaliar se há comportamento de preferência alimentar e postura de T. ludeni em relação ao algodoeiro Bt e seu iso-híbrido. E verificar se o estresse fisiológico causado pelo ataque de T. ludeni é diferenciado em algodoeiro Bt. Os ácaros foram criados em algodoeiro Bt e iso-híbrido, em um total de 40 repetições no delineamento inteiramente casualizado, onde foi avaliado o ciclo biológico. A análise de preferência alimentar e de posturas foi feita com 10 repetições, com escolha. O estresse fisiológico foi avaliando através da fluorescência da clorofila, em casa de vegetação. Os dados da biologia de T. ludeni foram analisados pelo teste t Student, para preferência alimentar e postura foi realizado o teste qui-quadrado. Para os parâmetros da fluorescência, foram ajustados modelos de regressão. Para testar as diferenças entre Bt e iso-híbrido foi utilizado o teste de identidade de modelos. As proteínas Cry1F e Cry1Ac não afetaram a biologia de T. ludeni. Os parâmetros fotossintéticos em plantas de algodoeiro Bt foram menos influenciados pela infestação de T. ludeni.

Seleção e caracterização molecular de Bacillus thuringiensis Berliner com atividade tóxica para Trichoplusia ni Huebner (Lepidoptera: Noctuidae) / Selection and molecular characterization of Bacillus thuringiensis Berliner with toxic activity against Trichoplusia ni Huebner (Lepidoptera: Noctuidae)

Trichoplusia ni é uma praga polífaga importante em plantios de crucíferas, soja e algodão. O presente estudo objetivou selecionar e caracterizar por método molecular isolados de Bacillus thuringiensis (Bt) com potencial para atuar com agentes de controle biológico de T. ni. Para os bioensaios de patogenicidade, uma alíquota com 3 x 108 esporos/mL de suspensão de Bt de cada isolado foi aplicada na superfície do disco de dieta artificial, previamente distribuída em placas de acrílico com 50 lagartas, distribuídas em 5 repetições. Nos bioensaios para a obtenção da CL50, apenas os isolados com 100% de mortalidade foram pré-selecionados, sendo testadas as seguintes concentrações: 102, 5 x 102, 103, 2 x 103, 4 x 103, 6 x 103, 8 x 103 esporos/mL, sendo os tratamentos compostos por 120 lagartas, distribuídas em 3 repetições. Foi feita caracterização molecular para detectar os genes cry1, cry2 e Vip para os isolados que obtiveram mortalidade acima de 95%. Os isolados HD-1 (Padrão), Bt-1043N-V, Bt-1034F, Bt-1009K, Bt-1000, Bt-969A causaram 100% de mortalidade nos testes de patogenicidade e CL50 de 1,17 x 103, 1,45 x 103, 1,46 x 103, 1,01 x 103, 9,43 x 102, 1,22 x 103, respectivamente. Não foram encontrados genes cry1, cry2 e Vip nos isolados testados, podendo outras toxinas Cry estar causando a mortalidade de T. ni, visto que os isolados testados são específicos para a ordem Lepidoptera. Estes isolados mostraram potencial para o controle de T. ni, sendo virulentos a este inseto, com potencial para serem utilizados em programa de manejo desta praga.

Trichoplusia ni is a polyphagous pest that is becoming a major pest in plantations of cruciferous crops, soybeans and cotton. This study was aimed to select and molecularly characterize efficient isolates of Bacillus thuringiensis (Bt) for the control of T. ni. For the bioassays of pathogenicity, an aliquot with a 3 x 108 spores/mL suspension of Bt of each isolate was applied on the surface of the artificial diet disk, previously distributed on acrylic plates with 50 larvae, distributed in 5 repetitions. In bioassays to obtain the LC50, only isolates with 100% mortality were preselected, and tests were carried out at the concentrations 102, 5 x 102, 103, 2 x 103, 4 x 103, 6 x 103, and 8 x 103 spores/mL, and the treatments consisting of 120 larvae, distributed in 3 repetitions. A molecular characterization was performed to detect the genes cry1, cry2 and Vip for the isolates which obtained mortality over 95%. Isolates HD-1 (Standard), Bt-1043N-V, Bt-1034F, Bt-1009K, Bt-1000 and Bt-969A caused 100% mortality in the test for pathogenicity and presented an LC50 of 1.17 x 103, 1.45 x 103, 1, 46 x 103, 1.01 x 103, 9.43 x 102, 1.22 x 103, respectively. Genes cry1, cry2 and Vip were not found in the isolates tested, and other Cry toxins may have been causing the mortality of T. ni, since the isolates tested are specific for the Lepidoptera order. These isolates showed potential for the control of T. ni, being aggressive to this insect, with a potential to be used in a pest management program for this species.