Resumo

The genus Streptomyces is associated with the ability to produce and excrete a variety of bioactive compounds, such as antibiotic, antifungal and antiviral. Biological active polyketide and peptide compounds with applications in medicine, agriculture and biochemical research are synthesized by PKS-I and NRPS genes. The evaluation of the presence of these genes associated with the biosynthesis of secondary metabolites in different phytopathogenic Streptomyces strains were performed using degenerated primers. The positive signal was observed in 58/63 Streptomyces strains for NRPS gene, 43/63 for PKS-I, and for PKS-II all the 63 strains showed positive signal of amplification. These strains also were tested with double layer agar-well technique against bacterial with clinical importance, and it was possible to observe the Streptomyces spp. strains were able to inhibit the growth of 14, 20, 13 and 3 isolates Gram-positive and Gram-negative bacteria, Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Escherichia coli (ATCC 11775) respectively. The Streptomyces sp. strains IBSBF 2019 and IBSBF 2397 showed antibacterial activity against all four bacteria-target tested.(AU)

O gênero Streptomyces apresenta alta capacidade de produzir e excretar uma grande variedade de compostos biologicamente ativos, como antibióticos, antifúngicos e antivirais. Compostos biologicamente ativos de policetídeos e peptídeos com aplicações na medicina, agricultura e pesquisas bioquímicas são sintetizados pelos genes PKS-I e NRPS. A avaliação da presença desses genes associados à biossíntese de metabólitos secundários em diferentes linhagens de Streptomyces fitopatogênicas foi realizada através do uso de primers degenerados. O sinal positivo foi observado em 58/63 linhagens de Streptomyces para o gene NRPS, 43/63 para o gene PKS-I e, para o gene PKS-II, todas as 63 linhagens apesentaram o sinal positivo de amplificação. Essas linhagens também foram testadas através da técnica de dupla camada contra bactérias de importância clínica e foi possível observar que as linhagens de Streptomyces spp. foram capazes de inibir o crescimento de 14, 20, 13 e 3 isolados de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 11775), respectivamente. As linhagens de Streptomyces sp. ISBSF 2019 e 2397 apresentaram atividade antibacteriana contra todas as bactérias-alvo testadas.(AU)

Resumo

O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma neoplasia maligna oriunda dos queratinócitos altamente prevalente em equinos, afetando frequentemente o pênis e prepúcio. Sua contrapartida benigna, o papiloma, também é comum na região genital, e pode ser induzida pela infecção por papilomavírus (PVs). Embora se saiba que os papilomas genitais de equinos podem ter uma origem viral, a etiologia dos CCEs genitais não está completamente elucidada. Recentemente foi detectada a presença de um novo PV, o papilomavírus Equus caballus tipo 2 (EcPV-2), em meio a CCEs genitais de equinos machos. Acredita-se, a partir disso, que possa existir uma associação entre a infecção por EcPV-2 e a gênese de alguns papilomas e CCEs genitais em equinos. Desde a sua descoberta em 2010, o EcPV-2 já foi descrito em diferentes países da América do Norte e Europa, no entanto, sem relatos no Brasil. Com base nisso, o objetivo desse trabalho é investigar a presença de EcPV-2 em meio a CCEs e papilomas genitais de equinos machos brasileiros. Foram investigados 40 CCEs e papilomas acometendo pênis e/ou prepúcio recebidos na rotina de biópsias e necropsias do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) e na rotina de biópsias do setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Dados relacionados à raça e à idade foram retirados dos laudos histopatológicos. Os blocos de parafina foram recuperados para confecção de lâminas de Hematoxilina e Eosina, imuno-histoquímica (IHQ) para PV (40/40) e reação de polimerase em cadeia (PCR) utilizando um par de primers específico para PV (40/40) e um par de primers específico para EcPV-2 (40/40). Casos positivos foram sequenciados. Dos casos incluídos, 34 eram CCEs invasivos, três eram carcinomas in situ (CIS) e três eram papilomas. A mediana de idade foi de 13,2 anos, e dos equinos com status reprodutivo informado, três eram garanhões e dois eram castrados. A raça Crioula foi a mais representada (16/40). Todos os tumores apresentaram graus variáveis de inflamação linfoplasmocítica, sendo que dois CCEs apresentaram invasão vascular linfática e dois apresentaram invasão sanguínea. Em meio aos carcinomas, ou na mucosa adjacente, também se observaram ceratinócitos tumefeitos, degenerados, com citoplasma fracamente basofílico, ocasionalmente contendo um vacúolo claro, e um núcleo grande. Inclusões estavam ausentes em todos os casos. Na IHQ utilizando anticorpo anti-BPV-1, quatro casos (dois CCEs, um CIS e um papiloma) tiveram imunomarcação positiva, observada no núcleo de ceratinócitos neoplásicos (CIS e papiloma) ou no epitélio adjacente ao tumor (CCEs). A análise molecular revelou sete casos positivos para PV e cinco desses positivos para EcPV-2. Três casos positivos para EcPV-2 e dois casos negativos para EcPV-2 e positivos para PV foram sequenciados, sendo todos compatíveis com EcPV-2. A partir desses resultados, podemos confirmar a presença de EcPV-2 em equinos brasileiros. Espera-se que esse estudo venha a estimular novas pesquisas relacionadas a esse novo vírus, contribuindo, por fim, para o melhor conhecimento das formas de transmissão do vírus, e para o desenvolvimento de medidas preventivas eficazes.

Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant neoplasm arising from keratinocytes. It is highly prevalent in horses, often affecting the penis and prepuce. Its benign counterpart, the papilloma, is also common in the genital region, and can be induced by infection with papillomaviruses (PVs). Although it is known that equine genital papillomas may have a viral origin, the etiology of genital SCCs is not fully understood. The presence of a new PV, Equus caballus papillomavirus type 2 (EcPV-2), was recently detected among genital SCCs in male horses. Based on this, it is believed that there may be an association between EcPV-2 infection and the genesis of some equine genital papillomas and SCCs. Since its discovery in 2010, EcPV-2 has been described in different countries in North America and Europe, however, with no reports in Brazil. The objective of this research is to investigate the presence of EcPV-2 within genital papillomas and SCCs of male Brazilian horses. We investigated 40 SCCs and papillomas involving the penis and/or prepuce, diagnosed in the biopsy or necropsy routine of the Laboratório de Patologia Veterinária (LPV), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), and in the biopsy routine of the Setor de Patologia Veterinária (SPV), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Data related to breed and age were taken from the histopathological reports. The paraffin blocks were recovered for the preparation of Hematoxylin and Eosin slides, immunohistochemistry (IHC) for PV (40/40) and polymerase chain reaction (PCR) using a pair of primers specific for PV (23/40) and another pair specific for EcPV-2 (40/40). Positive cases were sequenced. Of the included cases, 34 were invasive SCCs, three were carcinomas in situ (CIS), and three were papillomas. The median age was 13.2 years, and of the horses with informed reproductive status, three were stallions and two were geldings. The breed Crioula was the most represented (16/40). All tumors showed varying degrees of lymphoplasmacytic inflammation, with two SCC's showing lymphatic vascular invasion and two showing blood invasion. Within the carcinomas, or in the tumor-adjacent mucosa, swollen, degenerated keratinocytes with a weakly basophilic cytoplasm, occasionally containing a clear vacuole and a large nucleus, were ocasionally observed. Viral inclusions were absent in all cases. In the IHC using anti-BPV-1 antibody, four cases (two SCCs, one CIS and one papilloma) had positive immunostaining, observed in the nucleus of neoplastic keratinocytes (CIS and papilloma) or in the epithelium adjacent to the tumor (SCCs). PCR revealed seven positive cases for PV and five of these positive for EcPV-2. Three EcPV2-positive cases and two PVpositive and EcPV2-negative were sequenced, and compatible with EcPV-2. With this study, we can confirm the presence of EcPV-2 in Brazilian horses. We hope this study stimulates further research related to this new virus, ultimately contributing to a better understanding of transmission routes, and to the development of effective preventive measures

Resumo

A sexagem de embriões equinos através do fluido da blastocele (FB), é uma biotecnologia recente, e associada ao transporte de embriões têm boas perspectivas no campo. Objetivos:(1) testar a técnica de sexagem por PCR do FB de embriões pré-implantacionais produzidos in vivo coletado a partir do colapso embrionário com agulha hipodérmica; (2) avaliar a capacidade de re-expansão embrionária após acondicionamento destes embriões produzidos in vivo colapsados; (3) avaliar a qualidade e tamanho de embriões produzidos in vivo, colapsados e íntegros, após simulação de transporte sob acondicionamentos em temperatura ambiente (25ºC) e refrigeração à 5ºC por 24 horas. As condições experimentais visaram mimetizar condições aplicáveis à rotina de campo. Métodos: I -Foram coletados 42 embriões e distribuídos aleatoriamente entre quatro grupos experimentais: CTA (n=11 embriões colapsados acondicionados em temperatura ambiente), CTR (n=11 embriões colapsados acondicionados sob refrigeração), NCTA (n=10 embriões não colapsados acondicionados em temperatura ambiente) e NCTR (n=10 embriões não colapsados acondicionados sob refrigeração), e todos armazenados por um período de 24 horas. II -As amostras de FB (n=19) foram coletadas após o colapso dos embriões com agulha hipodérmica 26G, dos grupos CTA e CTR, e foram submetidas as duas PCR sequenciadas com os primers específicos TSPY e AMEL para a identificação dos sexos. III - Apenas três embriões (n=1 CTA, n=1 CTR, e n=1 imediatamente após o colapso) foram submetidos a microscopia por fluorescência com marcador DAPI e microscopia de interferência de contraste (DIC) para uma análise descritiva da lesão. Resultados: (I)Todos os embriões submetidos ao colapso sofreram redução no tamanho após as 24h, mas os acondicionados em temperatura ambiente (25ºC) apresentaram uma melhor qualidade morfológica após as 24h. Dos embriões íntegros, apenas o grupo NCTA obtiveram uma taxa de crescimento positiva (+25,95%) e mantiveram sua qualidade de grau 1 excelente em M24, enquanto que os refrigerados a 5ºC apresentou uma queda na classificação com 20% de embriões degenerados após as 24h. (II) A técnica de sexagem por FB mostrou-se eficiente com o diagnóstico de 57,90% de machos, através da amplificação de bandas especificas para TSPY com as duas PCR sequenciadas. (III) A lesão embrionária causada pelo colapso manual com a agulha hipodérmica 26G foi visualizada por microscopia de fluorescência. É possível realizar a sexagem embriões equinos através de amostras do FB por PCR. Conclusões: Os embriões colapsados com a agulha hipodérmica 26G são capazes de se recuperar parcialmente das lesões, principalmente quando acondicionados em meio de manutenção em temperatura ambiente por até 24h. A temperatura ambiente (25ºC) demonstrou ser a melhor temperatura de acondicionamento para o transporte de embriões equinos íntegros e colapsados por até 24h, dentro das condições apresentadas, por atuar diretamente otimizando a qualidade morfológica durante as 24hrs. Estudos complementares são necessários para comprovar a viabilidade das células embrionárias pós-colapso como teste in vitro, e a aplicabilidade de inovulação desses embriões para obtenção de suas possíveis taxas de prenhez e perdas embrionárias como teste in vivo.

The sexing of equine embryos through the blastocoel fluid (BF) is a recent biotechnology, and associated with embryo transport has good prospects in the field. Objectives:(1) to test the technique of PCR sexing the FB of pre-implantation embryos produced in vivo collected from embryonic collapse with a hypodermic needle; (2) to evaluate the capacity of embryonic re-expansion after packaging these collapsed in vivo produced embryos; (3) to evaluate the quality and size of embryos produced in vivo, collapsed and intact, after simulation of transport under packaging at room temperature (25ºC) and refrigeration at 5ºC for 24 hours. The experimental conditions aimed to mimic conditions applicable to the field routine. Methods: I - Forty-two embryos were collected and randomly distributed among four experimental groups: CTA (n=11 collapsed embryos conditioned at room temperature), CTR (n=11 collapsed embryos conditioned under refrigeration), NCTA (n=10 non-collapsed embryos conditioned at room temperature) and NCTR (n=10 non-collapsed embryos stored under refrigeration), and all stored for a period of 24 hours. II - The FB samples (n=19) were collected after the embryos collapsed with a 26G hypodermic needle, from the CTA and CTR groups, and were submitted to two PCR sequenced with the specific primers TSPY and AMEL to identify the sexes. III - Only three embryos (n=1 CTA, n=1 CTR, and n=1 immediately after collapse) were submitted to fluorescence microscopy with DAPI marker and contrast interference microscopy (DIC) for a descriptive analysis of the lesion. Results: (I) All embryos submitted to collapse suffered a reduction in size after 24h, but those conditioned at room temperature (25ºC) showed a better morphological quality after 24h. Of the intact embryos, only the NCTA group achieved a positive growth rate (+25.95%) and maintained their excellent grade 1 quality in M24, while those refrigerated at 5ºC showed a decrease in classification with 20% of embryos degenerated after at 24h. (II) The FB sexing technique proved to be efficient with the diagnosis of 57.90% of males, through the amplification of specific bands for TSPY with the two sequenced PCRs. (III) The embryonic lesion caused by manual collapse with the 26G hypodermic needle was visualized by fluorescence microscopy. It is possible to sex equine embryos using FB samples by PCR. Conclusions: Embryos collapsed with the 26G hypodermic needle are able to partially recover from the lesions, especially when placed in a maintenance medium at room temperature for up to 24 hours. Room temperature (25ºC) proved to be the best packaging temperature for the transport of intact and collapsed equine embryos for up to 24 hours, under the conditions presented, by acting directly optimizing the morphological quality during the 24 hours. Complementary studies are needed to prove the viability of post-collapse embryonic cells as an in vitro test, and the applicability of inovulation of these embryos to obtain their possible pregnancy and embryo loss rates as an in vivo test.

Resumo

Os objetivos desta dissertação foram estudar a epidemiologia e a distribuição das lesões do sarcoide equino recebidos no Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD/UFPel) em um período de 20 anos, bem como determinar os principais tipos de sarcoide e, por meio da técnica de PCR, identificar o tipo de papilomavirus bovino (BPV) envolvido nas lesões dos equinos da região. Os casos de sarcoide equino recebidos no período de 2000 a 2020 foram resgatados por meio da revisão dos protocolos de necropsia do LRD/UFPel. Os blocos parafinados de cada um dos casos foram cortados em secções de 3-5µm de espessura, corados pela técnica de hematoxilina e eosina (HE) e posteriormente reavaliados em microscópio ótico. As características macroscópicas descritas nos protocolos associadas à histopatologia permitiram determinar o tipo de sarcoide em cada caso. As amostras encaminhadas ao LRD/UFPel no ano de 2021 foram divididas sendo uma parte fixada em formalina 10% tamponada para histopatologia e imunohistoquímica (IHQ) e outra parte encaminhada congelada ao Laboratório de Virologia e Imunologia da Universidade Federal de Pelotas (LabVir/UFPel), para identificar a presença de BPVs através da técnica molecular de PCR. No período estudado foram diagnosticados 258 casos de sarcoide representando 41,95% dos casos de lesões de pele em equinos. Destes, 75,96% ocorreram em equinos da raça Crioula. Equinos com idade entre dois e cinco anos (42,64%) foram os mais afetados. Em 46,8% dos casos os sarcoides eram do tipo fibroblástico. Dos 258 casos 61% eram únicos e em 32% dos casos as lesões eram múltiplas. A IHQ foi negativa para proteína S-100 e positiva para vimentina. O presente trabalho demonstrou que na Região Sul do Rio Grande do Sul sarcoide equino é a mais importante neoplasia cutânea dos equinos. Observou-se que a doença ocorre principalmente em animais da raça Crioula, que é a mais numerosa na região e que equinos de 24 meses a cinco anos então entre os mais frequentemente afetados. As lesões únicas são as mais numerosas e ocorrem nos membros. Foi possível sugerir que as lesões de sarcoide menores que 7,5 cm tem mais possibilidade de não recidivar após a excisão completa. O tipo mais frequentemente diagnosticado é o fibroblástico. O genoma dos BPVs não foi detectado pela PCR nas amostras analisadas. Estes resultados demonstram que as técnicas convencionais de diagnóstico podem estar subestimando a diversidade genética desta família viral. No presente estudo, foram utilizados os primers degenerados FAP59/64, (amplamente utilizados na literatura científica), porém com limitações inerentes devido a diversidade genética dos BPVs.

The goal of this dissertation was study the epidemiology and distribution of equine sarcoid lesions received at the Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD/UFPel) in a period of 20 years. The main types of sarcoid were also determined and, by the PCR technique, the type of bovine papillomavirus (BPV) involved in the lesions of horses in the region were identified. The equine sarcoid cases received in the period from 2000 to 2020 were rescued by reviewing the LRD/UFPel necropsy protocols. The paraffin blocks of each case were cut into 3-5µm thick sections, stained using the hematoxylin and eosin (HE) technique. The macroscopic characteristics described in the protocols associated with histopathology allowed the determination of the type of sarcoid in each case. The samples sent to the LRD/UFPel in 2021 were divided, with a part fixed in 10% buffered formalin for histopathology and immunohistochemistry (IHC) and another part sent frozen to the Laboratório de Virologia e imunologia da universidade Federal de Pelotas (LabVir/UFPel), to identify the presence of BPVs through the molecular technique of PCR. In the period studied, 258 cases of sarcoid were diagnosed, representing 41.95% of cases of skin lesions in horses. Of these, 75.96% occurred in Crioulo horses. Horses aged between two and five years (42.64%) were the most affected. In 46.8% of the cases, the sarcoids were of the fibroblastic type. Of the 258 cases, 61% were single and in 32% of the cases the lesions were multiple. The IHC was negative for protein S-100 and positive for vimentin. The present paper showed that in the southern region of Rio Grande do Sul, equine sarcoid is the most important equine skin neoplasm. It was observed that the disease occurs mainly in animals of the Crioulo breed, which is the most numerous in the region and that horses aged 24 months to five years are among the most frequently affected. Single lesions are the most numerous and occur on the limbs. It was possible to suggest that sarcoid lesions smaller than 7.5 cm are more likely to not recur after complete excision. The most frequently diagnosed type is fibroblastic. The BPV genome was not detected by PCR in the analyzed samples.These results demonstrate that conventional diagnostic techniques may be underestimating the genetic diversity of this viral family. In the present study, the degenerate primers FAP59/64 (widely used in the scientific literature) were used, but with inherent limitations due to the genetic diversity of BPV.

Resumo

A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3 do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirus de RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT-qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is characterized by viral acute progressive encephalitis. The RABV belongs to Lyssavirus genus, that includes seventeen others virus. Due to the high lethality, almost 100%, diagnosis techniques for rabies must be accurate and reliable for the accomplishment of diseases control. The gold standard for rabies diagnostic is the direct fluorescent antibody test (dFAT), due to its high sensibility and specificity. Although, sample conservation, low viral title, poor quality inputs, and skilled technicians may hamper results accurate. The RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay is a combination of degenerated and multiple primers with Locked Nucleic Acid (LNA) probe that can be used as secondary test for dFAT, due to its ease manipulation and capacity for detecting the different virus species within the Lyssavirus genus, and due its high sensitivity and specificity. This assay detects and amplifies the leader region 3 and the initial portion of nucleoprotein gene that is considered the most conserved gene within the Lyssavirus. This study aims the LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay standardization and implementation for detecting the different RABV genetic lineages and antigenic variants described in Brazil. Therefore, 324 positive samples compatible with different RABV genetic lineages or antigenic variants were collected and tested in RT-qPCR, using LN34 Pan-Lyssavirus assay. The two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, showed positivity of 87,3%, and 41 samples obtained false negative result. Those false negative samples in the two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay were tested in the one step LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, and 100% of those samples confirmed the true positive result. Based in these results, is possible to infer that the two steps RT-qPCR assay may hamper the detection of different RABV genetic lineages and antigenic variants, probably due to mismatches between sense primer and the target region during the revere transcription technique. On the other hand, the one step RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay were able to detect and amplify those false negative samples in two steps RT-qPCR, showing to be a highly sensitivity test, and showing potential to be used as confirmatory test to dFAT for rabies diagnosis.

Resumo

Papilomavírus (PV) são vírus oncogênicos que acometem diversas espécies de mamíferos, incluindo o homem. São capazes de induzir tumores benignos (papilomas ou verrugas) e malignos (condilomas) em epitélio cutâneo e mucoso. O genoma viral é constituído por até 10 fases abertas de leitura (ORFs), sendo que a ORF L1, sequência de nucleotídeos mais conservada entre os PVs, é utilizada para a identificação de novos tipos virais. Este estudo teve como objetivo identificar os tipos de papilomavírus bovino (BPV) presentes em cinco amostras de papilomas provenientes de um rebanho bovino leiteiro da região do norte pioneiro do estado do Paraná e determinar a sua classificação taxonômica por meio de comparação dessas sequências com as sequências de nucleotídeos de outros PVs previamente identificados e depositados em base pública de dados (GenBank). O par de primers degenerados FAP54/59 foi utilizado em reação de PCR para a triagem das amostras de papilomas. Os fragmentos de 480 pb obtidos das cinco amostras analisadas, permitiram a identificação de cinco diferentes tipos de BPV no mesmo rebanho, sendo estes BPV10, BPV6 e dois subtipos mais similares a BPV11 e BPV3. A quinta amostra, denominada BPV/BRUEL8, foi identificada no terceiro animal analisado, a partir de uma amostra de papiloma cutâneo. A análise da sequência gerada com o emprego do primeiro par de primers indicou que a cepa BPV/BR-UEL8 apresentava apenas 77% de identidade com o isolado 7Z (KT315748). Adicionalmente, foram empregados primers específicos do gene L1 de BPV6 para a obtenção da sequência completa do gene L1 do provável novo tipo. O produto da PCR foi submetido à clonagem e sequenciamento. A análise filogenética envolvendo a sequência completa da ORF L1 com 1.521 pb possibilitou identificar que a cepa BPV/BR-UEL8 pertence ao gênero Xipapillomavirus com maior identidade (apenas 75,1% identidade de nt) com BPV15. Este resultado possibilitou caracterizar a cepa BPV/BR-UEL8 como um provável novo tipo viral. Nos últimos anos, estudos que avaliaram características moleculares de BPV revelaram grande diversidade de tipos virais envolvidos em infecções singulares e, principalmente, em infecções mistas. A identificação de novos tipos virais pode auxiliar na compreensão da patogenia da doença e na avaliação de novos tratamentos, assim como no desenvolvimento de vacinas eficazes contra a papilomatose bovina

Papillomaviruses (PV) are oncogenic viruses that affect various mammalian species, including man. They can induce benign tumors (papillomas or warts) and malignant tumors (condylomas) in cutaneous and mucosal epithelium. The viral genome consists of up to 10 open reading frames (ORFs), and the L1 ORF, the most conserved nucleotide sequence among the PVs, is used to identify new viral types. The aim of this study was to identify the bovine papillomavirus (BPV) types present in five samples of papillomas from a dairy cattle herd at pioneer northern region of the state of Paraná and to determine their taxonomic classification by comparing these sequences with the sequences of nucleotides from other PVs previously identified and deposited in a public database (GenBank). The degenerate primer pair FAP54/59 was used in PCR reaction for the screening of papillomavirus samples. The 480 bp fragments obtained from the five analyzed samples allowed the identification of five different types of BPV in the same herd, being these BPV10, BPV6 and two subtypes more similar to BPV11 and BPV3. The fifth sample, named BPV/BR-UEL8, was identified in the third animal analyzed from a cutaneous papilloma sample. Analysis of the sequence generated using the first pair of primers indicated that the BPV/BR-UEL8 strain showed only 77% identity with the 7Z isolate (KT315748). In addition, specific primers of BPV6 L1 gene were used to obtain the complete L1 gene sequence of the putative new type. The PCR product was subjected to cloning and sequencing. The phylogenetic analysis involving the complete sequence of the L1 ORF with 1.521 bp allowed to identify that the BPV / BR-UEL8 strain belongs to the genus Xipapillomavirus with identity (only 75.1% identity of nt) with BPV15. This result made it possible to characterize the BPV/BR-UEL8 strain as a putative new viral type. In recent years, studies that have evaluated molecular characteristics of BPV revealed a wide variety of viral types involved in unique infections and, especially, mixed infections. The identification of new viral types can help to understand the pathogenesis of the disease and the evaluation of new treatments, as well as in the development of effective vaccines against bovine papillomatosis.

Resumo

Os papilomavírus (PV) são vírus epiteliotrópicos e constituem um grande grupo geneticamente diverso da família Papillomaviridae que infecta diferentes espécies de mamíferos, répteis e aves. Estes vírus caracterizam-se por sua propriedade oncogênica, sendo responsáveis pela indução de tumores benignos e malignos nos epitélios cutâneo e mucoso de suas espécies hospedeiras. Nos bovinos, a papilomatose causa importantes prejuízos econômicos à pecuária de corte e leiteira, dentre as quais destacam-se as infecções secundárias, a dificuldade de amamentação do bezerro, a depreciação do couro e o descarte precoce de animais e, ainda, no caso de rebanhos de aptidão leiteira, a papilomatose mamária ocasiona dificuldade de ordenha, retenção de leite e predispõe à mastite. Independente do nível de tecnificação da exploração na pecuária, estes agentes podem ser encontrados em quase todos os países. No entanto, poucos tipos de papilomavírus bovinos (BPV) foram caracterizados até o presente momento. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo de caracterização genética e patológica das infecções causadas pelo BPV na região norte do Brasil. No Capítulo 1, buscou-se avaliar a diversidade dos BPVs em lesões cutâneas de bovinos na região Amazônica brasileira utilizando o par de primers degenerados FAP (FAP59 e FAP64). Foram encontrados os BPVs tipo 1, 2, 11, e 13 além de quatro prováveis novos tipos virais que apresentaram baixa identidade com os BPVs 7, 8, 11 e 12. No Capítulo 2, o genoma de um novo tipo de papilomavírus bovino pertencente ao gênero Xipapillomavirus, espécie Xipapillomavirus 1, foi caracterizado aplicando a técnica de amplificação por círculo rolante seguida de sequenciamento de alta eficiência utilizando a plataforma Illumina. Este novo tipo apresentou maior similaridade com o BPV3 (79% de identidade a nível genômico) e preenche os requisitos para ser considerado um novo tipo de BPV. Histopatologicamente, a lesão causada por esse novo BPV foi caracterizada como papiloma exofítico, apresentando células bem diferenciadas, marcada acantose e paraqueratose. No Capítulo 3, foi realizado o sequenciamento de um genoma completo de BPV5 utilizando o mesmo protocolo do Capítulo 2. Este foi o primeiro genoma de BPV5 da América do Sul completamente sequenciado e caracterizado. Assim, os resultados obtidos nesta tese contribuem para o melhor conhecimento da variabilidade genética do BPV e mostra a importância da utilização de ferramentas moleculares na sua caracterização, principalmente em regiões carentes de estudos e que podem abrigar tipos desconhecidos.

Papillomaviruses (PV) are epitheliotropic viruses that constitute a large genetically diverse group of the Papillomaviridae family which can infect different species of mammals, reptiles and birds. These viruses are characterized by their oncogenic properties and are responsible for the induction of benign and malignant tumors in cutaneous and mucosal epithelia. In cattle, papillomatosis causes significant economic losses to beef and dairy cattle characterized by secondary infections, calf breastfeeding difficulties, leather depreciation, early animal discarding, mammary papillomatosis, retention of milk and predisposes to mastitis. Regardless of the level of technification of livestock farming, these agents can be found in almost all countries. However, few types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized to date. Thereby, this work had as objective to carry out a study of genetic and pathological characterization of the infections caused by the BPV from Northern Brazil. In Chapter 1, we evaluated the genetic diversity of BPVs in bovine cutaneous lesions from Brazilian Amazon using the degenerate FAP pairs of primers (FAP59 and FAP64). BPV1, 2, 11, and 13 were found in addition to four probable new viral types that had low identity with BPVs 7, 8, 11 and 12. In Chapter 2, the whole genome of a new BPV type belonging to genus Xipapillomavirus, species Xipapillomavirus 1, was characterized applying the technique of rolling circle amplification followed by high-throughput sequencing using the Illumina platform. This new type showed greater similarity with BPV3 (79% identity at the genomic level) and fulfills the requirements to be considered a new BPV type. Histopathology was characterized by exophytic papilloma, presenting well differentiated cells, marked acanthosis and parakeratosis. In Chapter 3, a complete BPV5 genome was sequenced using the same protocol used in Chapter 2. This was the first fully sequenced and characterized BPV5 genome from South America. Thus, the results obtained in this thesis contribute to a better knowledge of the genetic variability of BPV and shows the importance of the use of molecular tools in their characterization, especially in regions that are lacking in studies and which may harbor unknown types.

Resumo

The vegetative propagation of grapevine facilitates multiple viral infections, with different symptoms which vary according to combinations of cultivar or host species with viral species. The aims of this research were to detect and identify the viral species infecting two grapevine species/cultivars: one symptomatic and one symptomless. DsRNA from both samples was assayed by RT-PCR using 17 pairs of specific primers for detection of the Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) and Grapevine leafroll-associated virus 1-4 (GLRaV-1 to -4), besides three degenerate primer pairs. For each primer pair at least one amplicon was cloned and sequenced. Symtomatic and symptomless plants were multiple infected by RSPaV, GLRaV-2 and/or GLRaV-3. The nucleotide sequences of seven isolates of RSPaV, three of GLRaV-2 and two of GLRaV-3 showed identities higher than 90% with the homologous viral species and allowed to identify possible viral strains in infected samples. These results highlight the necessity of viral diagnosis based on specific assays to determine grapevine sanitary status.

A propagação vegetativa da videira favorece infecções virais múltiplas, com expressão diferencial de sintomas em função da combinação da cultivar ou espécie da hospedeira com a espécie viral. Os objetivos deste trabalho foram detectar e identificar as espécies virais presentes em duas espécies/cultivares de videira: uma sintomática e outra assintomática. DsRNA de ambas as amostras foi submetido à RT-PCR com 17 pares de oligonucleotídeos específicos para a detecção de Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 1 a 4 (GLRaV-1 a -4), além de três pares de oligonucleotídeos degenerados. Pelo menos um fragmento amplificado, por par de oligonucleotídeos, foi clonado e sequenciado. Plantas sintomáticas e assintomáticas mostraram infecções múltiplas por RSPaV, GLRaV-2 e/ou GLRaV-3. As sequências de nucleotídeos obtidas para sete isolados de RSPaV, três de GLRaV-2 e dois de GLRaV-3 apresentaram identidades superiores a 90% com espécies homólogas e permitiram a definição das possíveis estirpes presentes nas amostras infectadas. Esses resultados evidenciam a necessidade da diagnose viral baseada em testes específicos para determinar a condição sanitária da videira.

Resumo

De acordo com a OMS, Doenças tropicais negligenciadas (DTNs), sendo exemplos a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo a cada ano, no entanto, são pouco estudadas, apesar de seu grande impacto sobre a saúde. Além disso, incluem espécies de importância veterinária que causam um grande dano para a indústria pecuária. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como marcadores para genotipagem de protozoários parasitas, de modo a obter uma caracterização interespecífica. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas. Neste estudo, nós genotipamos 16 espécies de protozoários patogênicos, utilizando uma abordagem que envolve métodos de biologia molecular de PCR e sequenciamento e bioinformática utilizando filogenia molecular. Genes ortólogos universais foram identificados e utilizados como marcadores para genotipagem de protozoários. Além disso, parasitas com importância para a saúde pública como T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. vivax foram utilizados neste trabalho. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Os marcadores utilizados no presente estudo foram obtidas a partir de sequências de DNA de sete genes ortólogos: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seriltRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Nossos resultados com os testes de com as diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma, Leishmania e Plasmodium mostraram uma sensibilidade de até 10 pg/L de DNA. A reação de PCR singleplex que padronizamos foi eficiente para todos os marcadores, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, em que utilizamos em conjunto os iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multi-locus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania e Trypanosoma. As análises filogenéticas nos permitiram ver que todos os marcadores. Embora tivéssemos observado algumas divergências na topologia da árvore para DRG1 em Kinetoplastea, o mesmo pode ser considerado um bom marcador, inclusive podendo ser usado na separação de duas espécies do gênero Plasmodium com o par 28. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem sucedida, e podemos destacar após observar todos os resultados juntos que o melhor marcador em termos de eficiência, sensibilidade e fidelidade com os dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises.

According to WHO, Neglected Tropical Diseases (NTDs), examples being the Chagas disease, African trypanosomiasis, among others, affect about 1 billion people worldwide each year, nevertheless, are little studied despite its large impact on health. In addition, include veterinary importance that cause great harm to the livestock industry. Common orthologous genes conserved in protozoa can be used as markers for genotyping parasitic Protozoa, in order to obtain an inter-specific characterization. With advances in molecular genetics, techniques such as genotyping is being increasingly used. In this study, we genotypes 16 spicies of pathogenic protozoa, using an approach involving molecular biology methods PCR and sequencing and bioinformatics using molecular phylogeny. Universal orthologous genes common to the Protozoa were identified and used as general markers for genotyping protozoans species. In addition, parasites with importance to public health as T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum and P. vivax were used in this work. To this purpose 39 degenerate primer pairs were designed and used with the genomic DNA of species of two groups protozoa Apicomplexa phylum and Kinetoplastea class, then the PCR reactions were performed to standardize the reactions for multiplex PCR. To this purpose 39 degenerate primer pairs were designed and used with the genomic DNA of species of two groups protozoa Apicomplexa phylum and kinetoplastids class, then the PCR reactions were performed to standardize the reactions for multiplex PCR. The markers used in this study were obtained from DNA sequences of the seven orthologous genes: methionyl-tRNA synthetase, leucyl-tRNA synthetase, seryltRNA synthetase, U5 snRNP spliceosome, GTP-binding protein, mismatch repair ATPase and triosephosphate isomerase. Our test results with serial dilutions of Trypanosoma, Plasmodium and Leishmania DNA showed sensitivity up to 10 pg/uL of DNA. The PCR reaction singleplex that standardized was efficient for all markers, which resulted in the design of multiplex PCR reaction, where the best result was the reaction number 5, where use together primers of the GTP-binding protein, U5 snRNP subunit spliceosome and Leucyl-tRNA synthetase genes, which when integrated allowed genotyping trypanosomatid multi-locus of Leishmania genus and Trypanosoma. As phylogenetic analysis allowed us to see all the markers. Although we observed some differences in the tree topology for DRG1 in kinetoplastids, it can be considered a good marker, including being able to be used in the separation of two species of the genus Plasmodium with pair 28. The methodology used for genotyping of these parasite species It was successful, and we can highlight after observing all the results together that the top scorer in efficiency, sensitivity and fidelity to the data in the literature, was Leucyl-tRNA synthetase, which showed satisfactory results in all analyzes.

Resumo

A infecção pelo papilomavírus bovino (BPV) causa lesões hiperplásicas no epitélio cutâneo dos animais. De acordo com a localização e as características morfológicas das lesões, os seis tipos de BPV são classificados em dois sub-grupos. O objetivo desse trabalho foi identificar os tipos de BPV presentes em lesões cutâneas em bovinos de rebanhos do Estado do Paraná. Os primers degenerados FAP59 e FAP64 foram utilizados para a amplificação de um fragmento com 478 pb do gene L1 do BPV bovino em nove amostras de papilomas cutâneos obtidos de seis animais provenientes de quatro rebanhos bovinos do Estado. Em todas as amostras foi possível a amplificação de um produto com a massa molecular esperada. Por meio da análise filogenética das seqüências dos amplicons foi possível identificar o BPV-2 em três amostras, o BPV-1 em uma e o BPV-6 em cinco amostras de papilomas. O BPV-6 foi encontrado tanto em papilomas localizados no teto quanto em outras partes do corpo. Em um dos animais, do qual foram colhidas mais de uma amostra, foi detectada infecção concomitante do BPV-1 com o BPV-2. As cinco amostras positivas para o BPV-6 apresentaram 100 por cento de identidade de nucleotídeos com a amostra padrão disponível no GenBank. No entanto, foram identificadas diferenças entre as amostras do BPV-2 e BPV-1 e aquelas depositadas neste banco de dados. Esse estudo demonstrou a diversidade de tipos do BPV circulantes em rebanhos do Estado do Paraná.

Bovine papillomavirus (BPV) infection causes hyperplastic lesions in the cutaneous epithelium of cattle. Six types of BPV were classified in two sub-groups, being correlated to the anatomical regions of the infection and morphologic characteristics of the lesions. The present study was carried out to identify the types of BPV present in skin warts of cattle from the state of Paraná, Brazil. The generic primers FAP59 and FAP64 were used for amplification of a 478 bp fragment of BPV L1 gene in nine cutaneous papilloma samples obtained from six animals in four herds. In all papillomas examined, a product with the expected molecular size was amplified. Phylogenetic analysis of the PCR products identified BPV-2 in three samples, BPV-1 in one, and BPV-6 in five papillomas. BPV-6 was detected in cutaneous papillomas of the teat and in other body parts as well. In one animal, from which more than one sample was collected, a concomitant infection by BPV-1 and BPV-2 was identified. The five positive BPV-6 samples showed a nucleotide identity of 100 percent with the sequence of the reference strain available in GenBank. However, differences among BPV-2 and BPV-1 Brazilian samples and the respective reference sequences deposited in GenBank were observed. Molecular comparison of the two BPV-2 strains identified showed the involvement of two viral variants. This study revealed the diversity of BPV types circulating in the state of Paraná.

Resumo

As PKSs tipo II são complexos enzimáticos envolvidos na produção de policetídeos. Estes são metabólitos secundários que possuem papel-chave no desencadeamento das respostas bioquímicas que levam à diversificação fisiológica frente a fatores adversos, fazem parte da composição de pigmentos de esporos microbianos, além de comporem a estrutura química de importantes antibióticos explorados pela indústria farmacêutica. Foi feita a prospecção de novos ?clusters? gênicos para PKSs tipo II em uma biblioteca metagenômica de 9.320 clones, através de amplificação por PCR com ?primers? degenerados para uma região gênica conservada. Dentre três clones encontrados, um foi sequenciado pela estratégia de shotgun, resultando em um consensus de 22.988 pares de bases. Foi feita a predição funcional de ORFs por homologia obtida com a ferramenta Blast (NCBI) e também a identificação de domínios enzimáticos pelo PRODOM e PFAM. Dentre os resultados da predição por homologia de domínios enzimáticos foi possível identificar ORFs homologas à: reguladores gênicos (LacI e LuxR); carboidrases (Lacases, ?-glucosidases, Quitinases/Celulases); transferases (O-metil-transferases, Acíl-transferases); pks mínima; ciclases, aromatases, hidroxilases, mono-oxigenases e transportadores ABC. Alguns ?clusters? enzimáticos podem ainda atuar em degradação de celulose e lignina. As enzimas candidatas ao core biossíntético do ?cluster? (pks mínima) foram submetidas à modelagem de estrutura tridimensional in silico. Os modelos 3D foram avaliados quanto a acurácia, utilizando as ferramentas: Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage e Swiss-Model. Uma vez validados, as KSA e CLF foram submetidas a simulações de ?docking? enzimático

The type II PKSs are enzyme complexes involved in the production of polyketides. These are secondary metabolites that have key role in triggering the biochemical responses that lead to physiological diversification against adverse factors are part of the pigment composition of microbial spores, and compose the chemical structure of most antibiotics exploited by the pharmaceutical industry. Some clusters could act in enzymatic degradation of cellulose and lignin. It was made a prospection for new clusters gene for type II PKSs in a metagenomic library of 9320 clones by PCR amplification with degenerate primers for a conserved gene region. Among three clones found, one was sequenced by subcloning and shotgun strategy, resulting in a consensus of 22,988 base pairs. It was made the prediction of functional homology ORFs by Blast (NCBI) and also identifying areas for enzymatic Prodom and PFAM. Among them were found homologous to: ABC transporters; minimal PKS, cyclasea; Aromatasea; Hydroxylases; Mono-oxygenases; O-methyl-transferases; Multicopper oxidase/laccase, ?-glucosidase, chitinase/ Cellulases; Peptidases; Acyl-transferases, in addition of gene regulators similar to LacI and LuxR. The biosynthetic enzymes candidates for the core of the cluster (minimal pks) underwent three-dimensional structure modeling in silico. The 3D models were evaluated for accurate, using the tools of 'Assessing "Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage and Swiss-Model. Once validated, the KSA and CLF were subjected to simulated docking enzyme between them

Resumo

O objetivo deste trabalho foi analisar amostras de soro e de células sangüíneas de caprinos para detecçäo de anticorpos e DNA proviral do vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV), respectivamente. Utilizou-se a técnica de imunodifusäo em ágar (AGID) e a reaçäo em cadeia da polimerase (PCR) com "primers" degenerados. Foram analisadas amostras de diferentes procedências: 39 de Mato Grosso do Sul (MS), 19 de Säo Paulo (SP) e 22 do Ceará (CE), dessas últimas, 12 oriundas de animais importados do Canadá. Os resultados de AGID e PCR foram discordantes, pois o primeiro permitiu a detecçäo de 25 animais soropositivos, enquanto a PCR detectou DNA proviral de CAEV em 16 amostras. Pela PCR foi possível identificar animais infectados cujos testes sorológicos foram negativos pela AGID: oito amostras do MS e um do CE. Säo discutidos diferentes aspectos que poderiam estar envolvidos na discordância dos resultados