Adding a dimension to cell fate

Cell fate specification, gene expression and spatial restriction are process finely tuned by epigenetic regulatory mechanisms. At the same time, mechanical forces have been shown to be crucial to drive cell plasticity and boost differentiation. Indeed, several studies have demonstrated that transitions along different specification states are strongly influenced by 3D rearrangement and mechanical properties of the surrounding microenvironment, that can modulate both cell potency and differentiation, through the activation of specific mechanosensing-related pathways. An overview of small molecule ability to modulate cell plasticity and define cell fate is here presented and results, showing the possibility to erase the epigenetic signature of adult dermal fibroblasts and convert them into insulin-producing cells (EpiCC) are described. The beneficial effects exerted on such processes, when cells are homed on an adequate substrate, that shows “in vivo” tissue-like stiffness are also discussed and the contribution of the Hippo signalling mechanotransduction pathway as one of the mechanisms involved is examined. In addition, results obtained using a genetically modified fibroblast cell line, expressing the enhanced green fluorescent protein (eGFP) under the control of the porcine insulin gene (INS) promoter (INS-eGFP transgenic pigs), are reported. This model offers the advantage to monitor the progression of cell conversion in real time mode. All these observations have a main role in order to allow a swift scale-up culture procedure, essential for cell therapy and tissue engineering applied to human regenerative medicine, and fundamental to ensure an efficient translation process from the results obtained at the laboratory bench to the patient bedside. Moreover, the creation of reliable in vitro model represents a key point to ensure the development of more physiological models that, in turn, may reduce the number of animals used, implementing non-invasive investigations and animal welfare and protection.

Adding a dimension to cell fate

Cell fate specification, gene expression and spatial restriction are process finely tuned by epigenetic regulatory mechanisms. At the same time, mechanical forces have been shown to be crucial to drive cell plasticity and boost differentiation. Indeed, several studies have demonstrated that transitions along different specification states are strongly influenced by 3D rearrangement and mechanical properties of the surrounding microenvironment, that can modulate both cell potency and differentiation, through the activation of specific mechanosensing-related pathways. An overview of small molecule ability to modulate cell plasticity and define cell fate is here presented and results, showing the possibility to erase the epigenetic signature of adult dermal fibroblasts and convert them into insulin-producing cells (EpiCC) are described. The beneficial effects exerted on such processes, when cells are homed on an adequate substrate, that shows “in vivo” tissue-like stiffness are also discussed and the contribution of the Hippo signalling mechanotransduction pathway as one of the mechanisms involved is examined. In addition, results obtained using a genetically modified fibroblast cell line, expressing the enhanced green fluorescent protein (eGFP) under the control of the porcine insulin gene (INS) promoter (INS-eGFP transgenic pigs), are reported. This model offers the advantage to monitor the progression of cell conversion in real time mode. All these observations have a main role in order to allow a swift scale-up culture procedure, essential for cell therapy and tissue engineering applied to human regenerative medicine, and fundamental to ensure an efficient translation process from the results obtained at the laboratory bench to the patient bedside. Moreover, the creation of reliable in vitro model represents a key point to ensure the development of more physiological models that, in turn, may reduce the number of animals used, implementing non-invasive investigations and animal welfare and protection.(AU)

"Recelularização de biomateriais derivados de vasossanguineos da superficie alantocoriônica da placenta bovina"

SCom o aumento de doenças vasculares e necessidade de substituição de vasos sanguíneos danificados são crescentes os avanços na bioengenharia de vasos sanguíneos. Embora vasos autólogos sejam a principal opção de uso, muitas vezes podem estar com acesso limitado. Enxertos sintéticos seriam uma alternativa para a substituição. Entretanto, para enxertos de diâmetro menor que 6 mm, a taxa de insucesso a longo prazo é alta, devido a trombo, infecção ou estenose. Atualmente buscam-se alternativas na bioengenharia de tecidos, e dentre os biomateriais de origem animal, temos os derivados de tecidos descelularizados, resultando em arcabouços de matriz extracelular. Assim, biomateriais derivados de órgãos com abundante rede vascular mantida após a descelularização seriam fontes favoráveis para produção de biomateriais vascularizados e/ou enxertos vasculares. Diante disto, a placenta bovina além de possuir abundante sistema vascular, que se assemelha a vasos humanos de pequeno e médio diâmetro. Ela ainda pode ser coletada sem prejuízo ao doador e manter a estrutura e composição da matriz extracelular (MEC) mesmo após a descelularização. Para a recelularização desse biomaterial, células progenitoras endoteliais são necessárias para reconstituição do endotélio, portanto a eleição de uma linhagem progenitora endotelial com superexpressão do fator de crescimento endotelial vascular teria uma maior utilidade para tal finalidade. O presente estudo tem como objetivo geral promover a recelularização em biomateriais derivados de vasos sanguíneos da superfície alantocoriônica da placenta bovina com uso de células progenitoras endoteliais do saco vitelino canino (linhagem SV) e células progenitoras endoteliais do saco vitelino canino transduzidas com VEGF e com superexpressão de eGFP (linhagem SV- VEGF). Para tanto, a placenta bovina foi descelularizada por perfusão com solução SDS, em concentrações crescentes (0,01 a 1 %), e seus vasos sanguíneos derivados da superfície alantocoriônica foram isolados e seccionados para validação da descelularização. O procedimento foi validado por quantificação de gDNA genômico, histologia básica, imunohistoquímica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Outros fragmentos foram esterilizados sob ponto crítico LEICA EM CPD 300 (-5°C a 40°C), e submetidos à recelularização em cultivo celular estático em placa de 24 poços, com 2,5 x104 células por poço para ambas as linhagens (SV- VEGF e SV) durante 7 dias. Por último a recelularização foi validada por meio marcação nuclear por DAPI em microscopia confocal, imunohistoquímica, histologia básica e microscopia eletrônica de varredura MEV. Os resultados iniciais demonstraram preservação da matriz extracelular após a descelularização e adesão celular inicialmente aos três dias de cultivo para ambas as linhagens de células originárias de fonte xenogênica ao modelo bovino.

With the increase in vascular diseases and the need to replace damaged blood vessels, advances in blood vessel bioengineering are intensive. Although autologous vessels are the main use option, they can often have limited access. Synthetic grafts would be an alternative option for replacement. However, for grafts with a diameter of less than 6 mm, in the long run, the failure rate is high due to thrombus, infection or stenosis. Thus, alternatives are sought in tissue bioengineering. Among the biomaterials of animal origin, we currently have those derived from decellularized tissues, resulting in extracellular matrix frameworks. Thus, biomaterials derived from organs with an abundant vascular network maintained after decellularization would be favorable sources for the production of vascularized biomaterials and / or vascular grafts. In view of this, the bovine placenta, in addition to having an abundant vascular system, resembles human vessels of small and medium diameter. It can still be collected without prejudice to the donor and maintain the structure and composition of the extracellular matrix (MEC) even after decellularization. To recelularize this biomaterial, endothelial progenitor cells are necessary for endothelial reconstitution, therefore the choice of an endothelial progenitor line with overexpression of the vascular endothelial growth factor would be more useful for this purpose. The present study has the general objective of promoting recelularization using endothelial progenitor cells of the canine yolk sac (strain SV) and endothelial progenitor cells of the canine yolk sac transduced with VEGF and with overexpression of eGFP (strain SV-VEGF) in biomaterials derived from blood vessels of the allantoic chorionic surface of the bovine placenta. For this purpose, the bovine placenta was decellularized by perfusion with SDS, in increasing concentrations (0.01 to 1 %), and its blood vessels derived from the allantoic chorionic surface were isolated and sectioned for validation of decellularization. We validated this procedure by quantifying the remaining gDNA; absence of nuclei and composition of MEC by basic histology, immunohistochemistry, and its structure by scanning electron microscopy (SEM). Other fragments were sterilized at a critical point LEICA EM CPD 300 (-5°C to 40°C) and submitted to recellularization in static cell culture in a 24-well plate, with 2.5,104 cells per well for both strains (SV-VEGF and SV) for 7 days. Finally, recelularization was validated by visualizing cell adhesion by DAPI using confocal microscopy, immunohistochemistry, basic histology, and SEM scanning electron microscopy. The initial results demonstrated preservation of the extracellular matrix after decellularization and cell adhesion initially at three days of culture for both cell lines originating from a xenogenic source to the bovine model.

Genotype and expression of the enhanced gree fluorescent protein in LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc rats / Genótipo e expressão da proteína fluorescente verde melhorada em ratos da linhagem LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc

The Green fluorescent protein (GFP) was first described after being extracted from Aequorea victoria in 1987; Since then, GFP and its derivatives have been widely used in several experiments as cell and protein marker. In the present study it was verified the genotype of the offspring from crosses between heterozygote Lewis LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc rats and analyzed the expression of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) in different cell types and genotypes. The genotype of the offspring was assessed by PCR and analysis of EGFP expression in different cells and genotypes, including mesenchymal stem cells (MSC) derived from adipose tissue and calvarial osteoblast cells. Expression of EGFP was verified by flow cytometry, fluorescence microscopy, and immunostaining. Through these methods, it was identified the genotypes of the offspring and determined the levels of expression of EGFP in two cell types. A difference in expression between the (EGFP +/+) and (EGFP +/-) genotypes was also observed in addition to the presence of autofluorescence. Further studies on the natural fluorescence of cells with the (EGFP +/-) genotype and that induced by presence of the EGFP are necessary.(AU)

A proteína fluorescente verde (GFP) foi descrita pela primeira vez após ter sido extraída de Aequorea victoria em 1987. Desde então, a GFP e seus derivados têm sido amplamente utilizados em várias experiências como marcador celular e de proteínas. O objetivo do presente estudo foi o de verificar o genótipo dos descendentes de cruzamentos entre ratos Lewis LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc heterozigotos e de analisar a expressão da proteína fluorescente verde melhorada (EGFP) em diferentes tipos celulares e genótipos. O genótipo da descendência foi avaliado por PCR e pela análise da expressão da EGFP em diferentes células e genótipos, incluindo-se as células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas de tecido adiposo e de osteoblastos de calvária. A expressão da EGFP foi verificada por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e imunocoloração. Foram, identificados os genótipos da descendência e determinados os níveis de expressão de EGFP em dois tipos de células. Foi também constatada uma diferença de expressão entre os genótipos (EGFP +/+) e (EGFP +/-) além da presença de autofluorescência. Mais estudos são necessários para esclarecer a fluorescência natural de células com o genótipo (EGFP +/-) e aquela induzida pela presença da EGFP.(AU)

Recent advances in micromanipulation and transgenesis in domestic mammals

Background: Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) involves mechanical transfer of a single sperm cell into ooplasm. A new application has been recently found for ICSI, the production of transgenic animals. Since the birth of ''Dolly'', the first adult somatic cloned mammal, viable offspring has been produced by nuclear transfer in many species including cattle. The present review briefly summarizes our experience with ICSI and somatic cell nuclear transfer mainly to produce transgenic embryos, as well as for the generation of new micromanipulation technique. Review: We have evaluated different factors that affect SCNT and transgenesis including the chemical activator, the transfection event and the effect of recloning. Also, we included a brief description of the ICSI technique, which we used in five different species, examining its potential to produce transgenic embryos. Finally different strategies to produce transgenic animals were analyzed: ICSI- mediated gen transfer (ICSI-MGT), Injection of cumulus cell and ooplasmic vesicle incubated for 5 min with the transgene or injection of the plasmid alone. All of them were very efficient in exogenous DNA expression at embryo stages but resulted in mosaic embryos. We demonstrated that "ICSI-MGT" assisted by chemical activation is the only treatment of sperm mediated gen transfer capable to generated transgenic embryos in ovine. Besides, after ICSI-MGT, it is possible to obtain enhanced green fluorescent protein (EGFP)-expressing embryos in five diferent species: ovine, porcine, feline, bovine and equine. Our studies also established for the first time that short term transgene co-incubation with somatic cells can produce transgene-expressing mammalian SCNT embryos, and also that parthenogenic, eDNA- expressing embryos can be obtained by injection of vesicles or eDNA alone. Moreover, eDNA- -expressing embryos can be also obtained by cytoplasmic injection of vesicles in IVF zygotes, simplifying the traditional IVF pronuclear injection technique. We tried a further simplification of the technique in bovine oocytes and zygotes, by intracytoplasmically injecting them with eDNA-liposomes complexes. Approximately 70% of the cleaved embryos and 50% of the blastocysts expressed EGFP, when egfp­liposome was injected 16 h post-fertilization. Different approaches were assayed to reverse the mosaicism including a novel technique of gamete cloning. Our first approach consisted of the production of transgenic IVF embryos by vesicle microinjection to generate transgenic blastomeres to be used as donor cells for cloning. A high efficiency in mosaicism reversal and multiplication of transgenic embryos was attaineded. Other technique assayed was the separation of transgenic blastomeres followed by the aggregation of two-cell fused embryos or by the asynchronous younger blastomere successfully multiplied transgenic embryos, and theoretically reduces mosaicism rates in future offspring [15]. This technology can also be used to multiply embryos from animals with high genetic value. We demonstrated that a sperm and oocyte can be efficiently cloned. Green haploid androgenic blastomeres produced with the injection of a single sperm by egfp ICSI-MGT could be used to fertilized oocytes resulting in several homogeneous expressing embryos. This approach shows great potential because it allows for determination of the sex of the sperm nucleus prior to fertilization. It is also possible to clone previously transfected oocytes followed by the reconstruction of biparental bovine embryos to generate homogeneous transgene-expressing embryos. This review summarizes recent experiments in micromanipulation and gene transfer in domestic animals. The objective is not to exhaustedly describe the research done in this field but to present the promising methods recently developed or evaluated in our lab. Conclusion: Significant advancements have been made in the course of the recent years in micromanipulation and transgenesis techniques. In our lab we have been evaluating ICSI and Nuclear transfer mainly to produce transgenic embryos. We used also transgensis to apply or developed new micromanipulation technique in domestic animals linke sperm and oocyte cloning.

Biologia do glioblastoma multiforme da dinâmica de ativação microglial ao papel do canal de potássio Kv 10.1

O glioblastoma multiforme é o tumor cerebral mais agressivo. Já a micróglia representa 30% da massa tumoral e desempenha um importante papel na tumorigênese. Este trabalho buscou estudar o padrão de infiltração e alteração morfológica da micróglia no tecido tumoral formado por células da linhagem GL261mCherry implantadas ortotopicamente. Além disto, buscou-se examinar o papel do canal de potássio Kv 10.1, correlacionado ao crescimento tumoral, primeiro na interação da micróglia com as células tumorais e, segundo, frente à lesão celular causada pelo fármaco de escolha ao tratamento do glioma, a temozolomida. Camundongos CX3CR1-EGFP receberam injeções intracorticais de células de glioblastoma multiforme capazes de expressar a proteína fluorescente mCherry. Microscopia de epifluorescência e confocal foram empregadas nas análises morfométricas, ao passo que a microscopia do tipo 2-photon (2P-LSM) foi usada para visualizar as células tumorais e microgliais no cérebro de animais vivos. Os resultados deste estudo revelaram uma microgliose intensa em áreas cerebrais logo após a implantação do tumor, isto é, aos 30 minutos. Nos primeiros três dias, a micróglia tende a formar aglomerados de células em torno dos tumores. Para, em seguida, infiltrar no centro tumoral, onde permanece durante todos os pontos de tempo estudados, de 6 a 18 dias. Com o aumento da massa tumoral, as células tumorais perdem progressivamente a sua forma original, assumindo uma morfologia heterogênea e difusa; o tamanho do corpo celular (perímetro) passou de 10 µm, três dias após o implante, para 52 µm aos 18 dias. Em contato com o glioma, a micróglia também muda sua morfologia. A forma tornou-se amebóide, com corpos celulares alargados. O corpo celular (área) cresceu de 366±0.0 µm2, na micróglia em vigilância, para 1310±146.0 µm2 e ramificações curtas, ou mesmo ausência de ramificações no fenótipo ativado. Aos 12 dias após o implante, foi notada a presença de células multinucleadas de glioma, os policariócitos, em contato íntimo com a micróglia ativada. Sobre o canal Kv-10.1, este foi expresso em células cultivadas de glioma, de micróglia (linhagem BV-2) e também em tecido tumoral de camundongos implantados com o tumor. A supressão deste canal, em células de glioma, potencializou a injúria por TMZ em 29%, conforme ensaio de MTT. Em conclusão, a micróglia apresentou um padrão espaço-temporal de infiltração no glioma, o que favorece influências recíprocas e pró-tumorigênicas. Já o canal Kv-10.1, pode tanto representar uma via de comunicação entre estes tipos celulares, quanto ser um potencial alvo para a terapêutica do glioma, já que foi capaz de potencializar os efeitos da temozolomida na morte celular de linhagens de glioma.

Glioblastoma multiforme is the most aggressive brain tumor. Microglia represents 30% of the tumor mass, and plays a role in tumorigenesis. This work studied the pattern of microglial growth into brain tumor tissue formed by orthotopically implanted glioma cells of the established GL261 cell line. In addition, we examined the expression of the Kv 10.1 potassium channel that frequently correlates with tumor growth. CX3CR1-EGFP mice received intracortical injections of GL261 tumor cells with stable expression of the red fluorescent protein mCherry. Epifluorescence - and confocal laser-scanning microscopy were employed in the analysis of tissue sections, whereas two-photon laser-scanning microscopy (2P-LSM) was used to visualize tumor cells and microglia in the brain of living animals. Our results revealed an intense microgliosis in brain areas already shortly after tumor implantation, i.e. at 30 minutes. In the first three days, microglia formed clusters of cells around tumors mass. Then cells infiltrated the tumor area, where they remained during all the time points studied, from 6 to 18 days. As tumor increased in size, GL261 cells progressively lost their original shape, assuming a heterogeneous and diffuse morphology. Soma size increased from 10 to 52 µm. In contact with the glioma, microglia also changed its morphology. Cell bodies enlarged from 366±0.0 µm2, in quiescent microglia, to 1310±146.0 µm2. The shape became amoeboid, with enlarged cell bodies and short processes (or even absence of them). Remarkably, we found microglial processes that closely surrounded glioma cells. Microglia also grew around multinucleated polycariocytes, found in tumors at 12 days. The Kv 10.1 channel was expressed in cultured GL261 cells, microglia cell line (BV-2) and also in mouse tumors. Suppression of Kv10.1 caused a 29% decrease in the viability of glioma cells injured by TMZ. In conclusion, microglia presented a temporal and spatial pattern of infiltration in glioma tumors, which favors reciprocal and protumorigenic influences. Kv 10.1 expressed by glioma cells in close contact with microglia may represent a communication pathway between microglia and cancer cells and, could be a potential target for antiglioma gene therapy, since it potentiated the effects of temozolomide in glioma cell lines.

Transplante alogênico de células-tronco mesenquimais induz alteração do perfil de citocinas pró e antiflamatórias e de fatores neurotróficos no tratamento da lesão espinal

O objetivo deste estudo foi comparar dois protocolos de tratamento da lesão espinal aguda com células-tronco mesenquimais criopreservadas, extraídas do tecido adiposo (CTM-AD) de ratos Lewis eGFP. Avaliou-se a expressão de marcadores de superfície, capacidade de diferenciação e viabilidade celular pré e pós criopreservação de CTM-ADsubmetidas à três meios de criopreservação com concentrações distintas de soro fetal bovino (SFB). Os resultados demonstraram que as CTM-AD não perdem sua multipotência, não modificam a expressão fenotípica e apresentam alta viabilidade celular por até 90 dias de criopreservação. Avaliou-se também os efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores do tratamento único (grupo GI) e duplo (grupo GII) com CTM-AD alogênicas criopreservadas por via intravenosa após lesão espinal Os grupos tratados (GI e GII) foram avaliados conjuntamente com o grupo sham (GS) e controle negativo (GC) atravéz da escala de função motora (BBB), expressão dos transcriptos gênicos de interleucina-10 (IL-10), interleucina-1 beta (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator de transformação do crescimento (TGF-), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neutrófico derivado da glia (GDNF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Adicionalmente realizou-se quantificação por imunohistoquímica do infiltrado inflamatório (anti-CD68), integridade neuronal (anti-NeuN), e ativação de astrócitos (anti-GFAP). Quando comparado ao grupo GC, os grupos tratados com CTM apresentaram maiores escores nas avaliações funcionais a partir de 72h após lesão, sendo a média dos maiores escores alcançada pelo grupo GII; menor expressão de CD68 e GFAP juntamente com a redução da degeneração da substância branca e maior expressão de NeuN. O tratamento com as células também resultou em aumento da expressão de IL-10, GDNF, VEGF e redução da expressão de TNF- e TGF-. Adicionalmente o grupo GII apresentou redução da expressão de IL-1 e aumento da expressão de BDNF. Conclui-se que o tratamento alogênico com duas aplicações de CTM-AD criopreservadas promove melhor recuperação da atividade motora, reduz o infiltrado inflamatório, ativa células da micróglia/macrógafos com fenótipo antinflamatório, aumenta a quantidade de neurônios íntegros, reduz a degeneração da substância branca e a ativação de astrócitos na medula espinal e aumenta a secreção do fator neurotrófico BDNF.

This thesis aimed to compare two treatment protocols with cryopreserved allogenic adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) after spinal cord injury. Experiment 1 evaluated pre-freeze and pos-freeze populations of AD-MSCs response to freezing at 30, 60 and 90 days following cryopreservation. Plasticity, cell surface phenotype and cell viability were evaluated at different times after thawing technique. Results showed that MSC do not lose their multipotency, do not alter phenotypic profile and have a high cell viability for up to 90 days of cryopreservation. Experiment 2 evaluated the immunomodulatory and neuroprotective effects of cryopreserved allogenic adipose-derived MSCs after spinal cord injury (SCI). Treatment effects were comparatively evaluated by quantitation of gene expression of interleukin-10 (IL-10), interleukin-1 beta (IL-1), tumor necrosis factor (TNF-), transforming growth factor (TGF -), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial derived neurotrophic factor (GDNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Immunohistochemical analyzes were used to quantify inflammatory infiltrate (anti-CD68), neural integrity (anti-NeuN), and astrocytes activation (anti-GFAP). Frozen adipose-derived MSCs were transplanted after three hours (GI) and three hours and seven days after SCI (GII). The results were compared with animals without SCI (GS) and SCI without treatment (GC). MSCs treated groups had higher scores in functional assessments from 72h after injury, being the average of the highest scores achieved by the GII; lower expression of CD68 and GFAP along with reducing of degeneration of the white matter and increased expression of NeuN. The treatment with the cells also resulted in increased IL-10 expression, GDNF, VEGF and reduced of TNF- and TGF- expression. Additionally the GII decreased IL-1 expression and increased BDNF expression. The results suggest that early intravenous injection of AD-MSCs after acute SCI promotes better recovery of function, prevent futher damage through enhancement of anti-inflammatory mechanisms, reduces the inflammatory infiltrate, active anti-inflammatory phenotype of microglia, increase neuron viability, reduces the degeneration of the white matter and astrocyte activation in SCI. In addition, treatment with double applications of AD-MSCs was superior to the single administration of these cells, resulting in improved motor response and secretion of BDNF.

Caracterização do gene vasa em Rhamdia quelen para aplicações biotecnológicas

O gene vasa codifica uma proteína que pertence a uma família de proteínas denominada DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, constituída de RNA helicases ATP-dependente. Extremamente conservada entre os organismos, sua função está associada com o metabolismo do RNA. Na maioria das espécies investigadas, a expressão do vasa restringe-se a linhagem germinativa. Estudos realizados utilizando metodologias distintas (knockdown, knockout, mutação) para conhecer o papel do vasa, demonstraram que o vasa tem fundamental importância no desenvolvimento da linhagem germinativa dos invertebrados e vertebrados. Em nosso estudo, caracterizamos o cDNA do vasa de forma inédita em uma espécie nativa, R. quelen (Heptapteridae, Siluriformes). Análises comparativas da proteína foram realizadas, mostrando que a proteína é altamente conservada ao longo da evolução. Além disso, a expressão do Rqvasa (Rhamdia quelen vasa) por RT-PCR (transcrição reversa reação em cadeia da polimerase) e qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real) em diferentes tecidos mostra que o mesmo é expresso somente nas gônadas. Os sítios de expressão do Rqvasa localizam-se exclusivamente nas células da linhagem germinativa. Análises por RT-PCR e por qRT-PCR durante o desenvolvimento embrionário de R. quelen demonstram que o Rqvasa é herdado maternalmente e sua expressão diminui gradativamente ao longo do desenvolvimento embrionário e larval. Através da hibridização in situ nos embriões e larvas, foi possível visualizar o processo migratório das células germinativas primordiais (CGPs). Desta forma, este trabalho caracteriza de forma inédita, o cDNA do Rqvasa, descrevendo sua expressão durante o desenvolvimento assim como o processo migratório das CGPs. Os resultados obtidos neste estudo servirão de base para utilizar o gene vasa em diferentes abordagens biotecnológicas, como por exemplo, esterilidade, transgenia (vasa::egfp, como exemplo), transplante utilizando células germinativas, dentre outras.

The vasa gene encodes a protein that belongs to protein family called DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, which is constituted of ATP-dependent RNA helicases. This protein is extremely conserved among the organisms, and its role is associated with RNA metabolism. In the majority of the investigated species, vasa expression is restricted to the germline cells. Different methods (such as knockdown, knockout and mutation) to address vasa's role have demonstrated that vasa is crucial for germ cell development. In this study, we have characterized the full cDNA of vasa from a native species, R. quelen (Heptapteridae Siluriformes). Comparative analysis using the protein sequence has demonstrated that Vasa is highly conserved along the evolution. Moreover, we have evaluated through RT-PCR and qRT-PCR Rqvasa expression in different tissues, showing that vasa transcripts are exclusively expressed in the R. quelen gonads, specifically in the germinal cells RT-PCR and qRT-PCR analysis during embryonic and larval development have shown that Rqvasa is maternally inherited and its expression decreased during development. in situ hybridization techniques performed in whole embryos and larvae allowed to study the primordial germ cells (PGCs) migratory process towards the gonadal ridge. This work has characterized for the first time the full length cDNA of vasa, describing its expression patterns during R. quelen embryonic development as well as the PGCs migratory process in this species. Our results will contribute for the basic reproductive biology of this native species, and will support studies using vasa in different biotechnological studies, such as sterility, transgenesis (vasa::egfp, for example) germ cell transplantation and others.

Transfecção de DNA de BoHV-5 com fosfato de cálcio em diferentes tipos de cultivos celulares / Transfection of BoHV-5 DNA with calcium phosphate in different types of cell culture

As condições para uma transfecção eficaz pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi testado o tipo de cultivo celular mais apropriado para transfecção de DNA de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) por esta técnica. Primeiramente foi avaliada a capacidade de multiplicação do BoHV-5 em três diferentes tipos de células. Para isto, a concentração viral foi calculada pelo método de dose infectante para cultivo celular / 50% (TCID50/mL). O BoHV-5 foi titulado em células de linhagem de rim de macaco verde Africano (VERO), células de linhagem de rim de suíno (PKsC3), células primárias de testículos de terneiro (TT) e células de linhagem de rim de bovino (MDBK). Em células VERO e PKsC3 a concentração viral máxima obtida foi 103,3 TCID50/mL, enquanto que em células MDBK o título foi de 106,8 TCID50/mL, similar ao encontrado para as células TT. Para avaliar a eficácia da transfecção nessas células, foi utilizado DNA plasmideal expressando um gene repórter (EGFP). Os resultados mostraram um valor de 4,5% de células fluorescentes para células TT, de 2,9% para PKsC3, de 0,5% para VERO e de 0,05% para MDBK. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 μg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo, com duas placas virais por poço. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 μg e 1 μg de DNA purificado de BoHV-5, produzindo duas e quatro placas, respectivamente. Nas condições experimentais testadas neste estudo os resultados indicam que as células TT poderiam ser boas candidatas para serem utilizadas para a transfecção de DNA de BoHV-5.

The conditions for an efficacious transfection by calcium phosphate method can vary substantially. In this study the most appropriate cell type for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) DNA using this technique was tested. It was first evaluated the capacity of BoHV-5 multiplication in three different cell types. For this purpose virus concentration was calculated by tissue culture infectious dose 50% assay (TCID50/mL). BoHV-5 was titrated in kidney cells from African green monkey (VERO), cell clone of pig kidney (PKsC3), primary cell culture of calf testis (TT) and bovine kidney cells (MDBK). In Vero and PK15 cells maximum virus concentration reached 103,3 TCID50/mL, whereas in MDBK cells the titre was 106,8 TCID50/mL, similar to that of TT cells. In order to evaluate the transfection efficacy in these cells, plasmid DNA expressing a reporter gene (EGFP) was used. Results showed 4.5% fluorescent cells for TT, 2.9% for PKsC3, 0.5% for VERO and 0.05% for MDBK cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5 mg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two plaques per well. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were then transfected with 0.5 mg and 1.0 mg of purified BoHV-5 DNA producing two and four plaques, respectively. Under experimental conditions tested in this study the results indicate that TT cells could be good candidates to be used for transfection of BoHV-5 DNA.

Efeitos imunomodulatório e neuroprotetor da aplicação de células tronco mesenquimais alogênicas criopreservadas em ratos com trauma experimental de medula espinhal.

Objetivou-se avaliar os efeitos imunomodulatório e neuroprotetor da aplicação de células tronco mesenquimais (CTM) alógenas e criopreservadas no trauma experimental de medula espinhal em ratos. Foram utilizados dez Rattus norvegicus (Lewis, eGFP) para isolamento e criopreservação das CTM. Para estudo do trauma de medula espinhal, foram utilizados 120 Rattus norvegicus (Wistar) distribuídos em três grupos experimentais: Controle negativo (CN) - animais submetidos à laminectomia (n=20), Controle positivo (CP) - animais submetidos ao trauma de medula espinhal sem tratamento (n=50) e grupo CTM - animais submetidos ao trauma e tratado com CTM (n=50). As avaliações foram realizadas às 24, 48, 72 horas e aos oito e 21 dias após a cirurgia. Avaliou-se função motora dos animais pelo teste BBB. Foram realizadas análises histopatológicas e imunoistoquímica para quantificação do infiltrado inflamatório (anti-CD68), da integridade neuronal (anti-NeuN) e da ativação de astrócitos (anti-GFAP). Foi realizada quantificação dos transcritos gênicos para IL-10, TNF-, IL-1, TGF-, BDNF, GDNF e VEGF por RT-PCR em tempo real. Quando comparado ao grupo CP, o grupo CTM apresentou maiores escores nas avaliações de função motora 72 horas, 8 e 21 dias após trauma, bem como menor expressão de CD68 no tempo de avaliação 8 dias e de GFAP aos 21 dias. Adicionalmente, houve menor degeneração da substância branca e maior expressão de NeuN no grupo CTM aos 21 dias. A expressão de Il-10 foi maior no grupo CTM 24 horas após trauma, de GDNF 48 horas e 8 dias e de VEGF 21 dias após trauma. Observou-se, no grupo CTM, menor expressão de TNF- aos 8 e 21 dias e de TGF- 24 horas e 21 dias após trauma. Não houveram diferenças na expressão de IL-1 e BDNF entre os grupos CTM e CP (P<0,05). A administração de CTM reduziu o infiltrado inflamatório, ativou células da micróglia/macrófagos com fenótipo anti-inflamatório, aumentou a quantidade de neurônios íntegros, diminuiu a degeneração da substância branca e a ativação de astrócitos após trauma de medula espinhal. Adicionalmente, as CTM aumentaram expressão de IL-10, de GDNF e de VEGF, e reduziram as de TNF e TGF-. Concluiu-se que as CTM criopreservadas promovem efeito imunomodulatório e neuroprotetor em ratos com trauma de medula espinhal, por meio do aumento na expressão de IL-10, GDNF e VEGF, e redução na de TNF e TGF-.

The aim of the present study was to evaluate immunomodulatory and neuroprotective effects of cryopreserved allogenic mesenchymal stem cells (MSCs) aplication on rat experimental spinal cord injury. Therefore, ten Rattus norvegicus were used (Lewis, EGFP) for CTM isolation and cryopreservation. For the spinal cord injury study 120 Rattus norvegicus (Wistar) were distributed on three groups: negative control (NC) - animals submitted to laminectomy (n = 20), positive control (CP) - animals submitted to spinal cord injury without treatment (n = 50) and MSC group - animals submitted to spinal cord injury and with MSC treatment (n = 50). The evaluations were made at 24, 48, 72 hours and at eight and 21 days after surgery. Motor function was assessed by BBB locomotor rating scale. Histopathological and immunohistochemical analyzes were performed for measurement of inflammatory infiltration (anti-CD68) of neuronal integrity (anti-NeuN) and astrocyte activation (anti-GFAP). IL-10, TNF-, IL-1, TGF-, BDNF, GDNF and VEGF gene transcripts measurement were performed by real time RT-PCR. When compared to the CP group, the MSC group showed higher motor function scores at 72 hours, 8 and 21 days after spinal cord injury, lesser CD68 expression at eight days and GFAP at 21 days after spinal cord injury. Furthermore, there was lesser white matter degeneration and higher NeuN expression in MSC group at 21 days. IL-10 expression was higher in the MSC group 24 hours after injury, GDNF 48 hours and 8 days and VEGF 21 days after injury. However it was observed in the MSC group, lower TNF- expression at 8 and 21 days, and TGF- 24 hours and 21 days after injury. There were no differences in IL-1 and BDNF expression between MSC and CP groups (P <0.05). The MSC administration reduced the inflammatory infiltrate, activated microglia cells/ macrophages with anti-inflammatory phenotype, increased the amount of intact neurons, decreased degeneration of the white matter and astrocytes activation after spinal cord injury. Additionally, the MSC increased IL-10 expression, GDNF and VEGF, and the reduced TNF and TGF-. We conclude that MSC cryopreserved promote immunomodulatory and neuroprotective effect in rats with spinal cord injury, by increasing the expression of IL-10, VEGF, and GDNF, and a reduction in TNF and TGF-.

Transfecção de DNA de BoHV-5 com fosfato de cálcio em diferentes tipos de cultivos celulares / Transfection of BoHV-5 DNA with calcium phosphate in different types of cell culture

As condições para uma transfecção eficaz pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi testado o tipo de cultivo celular mais apropriado para transfecção de DNA de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) por esta técnica. Primeiramente foi avaliada a capacidade de multiplicação do BoHV-5 em três diferentes tipos de células. Para isto, a concentração viral foi calculada pelo método de dose infectante para cultivo celular / 50% (TCID50/mL). O BoHV-5 foi titulado em células de linhagem de rim de macaco verde Africano (VERO), células de linhagem de rim de suíno (PKsC3), células primárias de testículos de terneiro (TT) e células de linhagem de rim de bovino (MDBK). Em células VERO e PKsC3 a concentração viral máxima obtida foi 103,3 TCID50/mL, enquanto que em células MDBK o título foi de 106,8 TCID50/mL, similar ao encontrado para as células TT. Para avaliar a eficácia da transfecção nessas células, foi utilizado DNA plasmideal expressando um gene repórter (EGFP). Os resultados mostraram um valor de 4,5% de células fluorescentes para células TT, de 2,9% para PKsC3, de 0,5% para VERO e de 0,05% para MDBK. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 μg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo, com duas placas virais por poço. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 μg e 1 μg de DNA purificado de BoHV-5, produzindo duas e quatro placas, respectivamente. Nas condições experimentais testadas neste estudo os resultados indicam que as células TT poderiam ser boas candidatas para serem utilizadas para a transfecção de DNA de BoHV-5.(AU)

The conditions for an efficacious transfection by calcium phosphate method can vary substantially. In this study the most appropriate cell type for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) DNA using this technique was tested. It was first evaluated the capacity of BoHV-5 multiplication in three different cell types. For this purpose virus concentration was calculated by tissue culture infectious dose 50% assay (TCID50/mL). BoHV-5 was titrated in kidney cells from African green monkey (VERO), cell clone of pig kidney (PKsC3), primary cell culture of calf testis (TT) and bovine kidney cells (MDBK). In Vero and PK15 cells maximum virus concentration reached 103,3 TCID50/mL, whereas in MDBK cells the titre was 106,8 TCID50/mL, similar to that of TT cells. In order to evaluate the transfection efficacy in these cells, plasmid DNA expressing a reporter gene (EGFP) was used. Results showed 4.5% fluorescent cells for TT, 2.9% for PKsC3, 0.5% for VERO and 0.05% for MDBK cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5 mg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two plaques per well. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were then transfected with 0.5 mg and 1.0 mg of purified BoHV-5 DNA producing two and four plaques, respectively. Under experimental conditions tested in this study the results indicate that TT cells could be good candidates to be used for transfection of BoHV-5 DNA.(AU)

Expression of GFP in transgenic tilapia under the control of the medaka B-actin promoter: establishment of a model system for germ cell transplantation

The Nile tilapia (Oreochromis niloticus) stands out as one of the most important fresh water edible fish, possessing remarkable characteristics that make it desirable for both commercial culture and as a laboratory model. For the utilization of tilapia in germ cell transplantation experiments, appropriate cell markers are required to evaluate the colonization behavior of donor-derived germ cells in recipient gonads. Here we report the production of a medaka β-actin/EGFP transgenic tilapia strain expressing the green fluorescent protein (GFP) reporter gene in several tissues including germ cells in testis and ovary. Fluorescent observations in F2 generation transgenic individuals showed GFP positive cells along the body axis in pre-hatched embryos, while in hatching embryos the GFP gene was strongly expressed in the area surrounding the gills, operculum and in the cephalic region. In early larvae, fluorescent cells were scattered throughout the body, forming aggregations around the dorsal-cephalic and mouth areas. At 38 days post-fertilization, juvenile fish expressed the GFP homogeneously in the whole body. GFP fluorescence was also observed in caudal fins, muscle, and in several internal organs (gills, heart, testes, and ovaries) in 140 and 240 day F2 and F3 individuals. Immunohistochemistry using a monoclonal anti-GFP antibody in juvenile and adult gonads showed that both mitotic and meiotic germ cells were labeled with GFP. The utilization of this transgenic line in a germ cell transplantation system could offer a fast and reliable screening of donor-derived transgenic offspring, as well as accurate tracing of donor-derived cell colonization in the recipient gonad by means of immunohistochemistry using GFP antibodies. In the future, germ cell transplantation using Nile tilapia also could help to preserve the genetic resources of threatened cichlids, through cryopreservation and interspecies transplantation of germ cells from endangered cichlids into O. niloticus recipients.(AU)

Expression of GFP in transgenic tilapia under the control of the medaka B-actin promoter: establishment of a model system for germ cell transplantation

The Nile tilapia (Oreochromis niloticus) stands out as one of the most important fresh water edible fish, possessing remarkable characteristics that make it desirable for both commercial culture and as a laboratory model. For the utilization of tilapia in germ cell transplantation experiments, appropriate cell markers are required to evaluate the colonization behavior of donor-derived germ cells in recipient gonads. Here we report the production of a medaka β-actin/EGFP transgenic tilapia strain expressing the green fluorescent protein (GFP) reporter gene in several tissues including germ cells in testis and ovary. Fluorescent observations in F2 generation transgenic individuals showed GFP positive cells along the body axis in pre-hatched embryos, while in hatching embryos the GFP gene was strongly expressed in the area surrounding the gills, operculum and in the cephalic region. In early larvae, fluorescent cells were scattered throughout the body, forming aggregations around the dorsal-cephalic and mouth areas. At 38 days post-fertilization, juvenile fish expressed the GFP homogeneously in the whole body. GFP fluorescence was also observed in caudal fins, muscle, and in several internal organs (gills, heart, testes, and ovaries) in 140 and 240 day F2 and F3 individuals. Immunohistochemistry using a monoclonal anti-GFP antibody in juvenile and adult gonads showed that both mitotic and meiotic germ cells were labeled with GFP. The utilization of this transgenic line in a germ cell transplantation system could offer a fast and reliable screening of donor-derived transgenic offspring, as well as accurate tracing of donor-derived cell colonization in the recipient gonad by means of immunohistochemistry using GFP antibodies. In the future, germ cell transplantation using Nile tilapia also could help to preserve the genetic resources of threatened cichlids, through cryopreservation and interspecies transplantation of germ cells from endangered cichlids into O. niloticus recipients.

Efeito de inibidores de endonucleases na transferência gênica mediada por espermatozoides em camundongos / Effect of endonucleases inhibitor in mice sperm mediated gene transfer

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%.

The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10µM, 25µM and 50µM) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%.

Efeito de inibidores de endonucleases na transferência gênica mediada por espermatozoides em camundongos / Effect of endonucleases inhibitor in mice sperm mediated gene transfer

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. (AU)

The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10µM, 25µM and 50µM) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%. (AU)

Terapia celular sob aquapuntura em modelos murinos para distrofia muscular de Duchenne / Cellular therapy under aquapuncture in murine models for Duchenne

O camundongo mdx é um modelo animal muito utilizado para estudar a distrofia muscular degenerativa de Duchenne (DMD) e apesar de o modelo apresentar uma degeneração mais branda, inúmeras pesquisas com este animal são realizadas devido à alta reprodutibilidade de fenótipos, obtenção comercial de várias linhagens e baixo custo de manutenção. [...] Nesta pesquisa foram avaliados 22 camundongos mdx, machos, 4 a 6 semanas de idade. As células-tronco utilizadas para a aplicação foram de polpa dentária humana carregando a proteína verde fluorescente (EGFP) e a quantidade aplicada em cada acuponto foi de 1x104 células. Os acupontos selecionados foram B47 (Hunmen), B49 (Yishe) e B52 (Zhishi). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (A) células-tronco em acupontos falsos, (B) solução fisiológica em acupontos verdadeiros, (C) células-tronco em acupontos verdadeiros e (D) controle, sem nenhum tratamento. No total três injeções foram realizados em um período de 56 dias de estudo. As avaliações do tratamento foram feitas através das análises da força de tração dos músculos, da creatinofosfoquinase sérica (CPK), histológica através da estruturação das miofibrilas e morfometria do colágeno e imuno-histoquímica pela expressão da proteína distrofina. [...]Conclui-se que os tratamentos com terapia celular nos acupontos verdadeiros, acupontos falsos e solução fisiológica nos acupontos podem melhorar a doença degenerativa muscular no mdx pelo aumento da expressão da proteína distrofina

Muscular dystrophy in mdx mouse is an animal model used to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans. Although this model presents a milder degeneration, there are several studies with this animal due to the high reproducibility of phenotypes, obtaining various lines available and low maintenance cost. [...]In this study 22 mdx mice, males, 4-6 weeks of age were evaluated. Stem cells were used for the application of human dental pulp carrying the green fluorescent protein (EGFP) and the quantity applied to each acupoint was 1x104 cells. The acupoints selected were B47 (Hunmen), B49 (Yishe) and B52 (Zhishi). The animals were randomly assigned to four treatments groups: (A) stem cells in false acupoints, (B) saline in true acupoints, (C) stem cells in true acupoints and (D) control without any treatment. In total, three injections were performed over a period of 56 days of study. Evaluations of treatment were made by analyzing the tensile strength of muscles, measuring the serum creatine phosphokinase (CPK), structuring of myofibrils by histology and morphometry of collagen immunohistochemistry and by the amount of dystrophin protein.[...] We conclude that treatment with stem cell therapy on true and false acupoints and with saline solution on acupoints can improve muscular degenerative disease in mdx by increased expression of dystrophin protein

Terapia celular sob aquapuntura em modelos murinos para distrofia muscular de Duchenne / Cellular therapy under aquapuncture in murine models for Duchenne

O camundongo mdx é um modelo animal muito utilizado para estudar a distrofia muscular degenerativa de Duchenne (DMD) e apesar de o modelo apresentar uma degeneração mais branda, inúmeras pesquisas com este animal são realizadas devido à alta reprodutibilidade de fenótipos, obtenção comercial de várias linhagens e baixo custo de manutenção. [...] Nesta pesquisa foram avaliados 22 camundongos mdx, machos, 4 a 6 semanas de idade. As células-tronco utilizadas para a aplicação foram de polpa dentária humana carregando a proteína verde fluorescente (EGFP) e a quantidade aplicada em cada acuponto foi de 1x104 células. Os acupontos selecionados foram B47 (Hunmen), B49 (Yishe) e B52 (Zhishi). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (A) células-tronco em acupontos falsos, (B) solução fisiológica em acupontos verdadeiros, (C) células-tronco em acupontos verdadeiros e (D) controle, sem nenhum tratamento. No total três injeções foram realizados em um período de 56 dias de estudo. As avaliações do tratamento foram feitas através das análises da força de tração dos músculos, da creatinofosfoquinase sérica (CPK), histológica através da estruturação das miofibrilas e morfometria do colágeno e imuno-histoquímica pela expressão da proteína distrofina. [...]Conclui-se que os tratamentos com terapia celular nos acupontos verdadeiros, acupontos falsos e solução fisiológica nos acupontos podem melhorar a doença degenerativa muscular no mdx pelo aumento da expressão da proteína distrofina (AU)

Muscular dystrophy in mdx mouse is an animal model used to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans. Although this model presents a milder degeneration, there are several studies with this animal due to the high reproducibility of phenotypes, obtaining various lines available and low maintenance cost. [...]In this study 22 mdx mice, males, 4-6 weeks of age were evaluated. Stem cells were used for the application of human dental pulp carrying the green fluorescent protein (EGFP) and the quantity applied to each acupoint was 1x104 cells. The acupoints selected were B47 (Hunmen), B49 (Yishe) and B52 (Zhishi). The animals were randomly assigned to four treatments groups: (A) stem cells in false acupoints, (B) saline in true acupoints, (C) stem cells in true acupoints and (D) control without any treatment. In total, three injections were performed over a period of 56 days of study. Evaluations of treatment were made by analyzing the tensile strength of muscles, measuring the serum creatine phosphokinase (CPK), structuring of myofibrils by histology and morphometry of collagen immunohistochemistry and by the amount of dystrophin protein.[...] We conclude that treatment with stem cell therapy on true and false acupoints and with saline solution on acupoints can improve muscular degenerative disease in mdx by increased expression of dystrophin protein (AU)

Implante de células-tronco de polpa dentária humana associadas à biomateriais para o reparo de lesões em joelhos de ovinos / Implantation of stem cells from human dental pulp associated with biomaterials in joint damage in sheep

A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD) cultivadas ou não em associação com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in vitro e in vivo, após o implante na articulação femorotibiopatelar de ovinos. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo a viabilidade celular semelhante em ambos os períodos, porém com uma maior dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e histologia. Ainda para a realização das análises histológicas, foram realizadas técnicas para padronizar os métodos de descalcificação e inclusão do tecido ósseo-articular, prévio aos cortes. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que as CTPD humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas

Cell therapy with stem cells (CT) has emerged in recent years as a hope for the treatment of diseases without effective treatment, such as osteoarthritis (OA) in knee. In this work we use stem cells from immature human dental pulp (hSCIDP) in association or not with biomaterials for the treatment of osteoarticular lesions in sheep´s kneef. The human hSCIDP were transduced with the reporter gene EGFP, thus making easier monitoring these in vitro and in vivo after implantation in sheep´s femorotibiopatelar joint. The capacity of adhesion and accommodation of dental pulp cells in the biomaterial in vitro was observed 24 h and one month after its application, resulting in similar cell viability in both periods, but with a greater cell dispersion in the longer, period, according to analysis performed by scanning electron microscopy and histology. Moreover, some histological techiniques were performed to standardize the methods for inclusion and decalcification of bone tissue joints. Radiographic, ultrasonographic and arthroscopic analyses were made to monitor the progress of treatment. The results revealed that the human hSCIDP adhere well to the biomaterial and have an excellent apparent reconstitution of damaged tissue. With this work, we conclude that the therapy protocol used is a good model for studying OA and useful for future clinical applications

Avaliação do promotor OCT-4 de equinos em uma abordagem transgênica em células-tronco embrionárias de murinos

O fator de transcrição Oct-4 é bem conservado entre as espécies e é conhecido por ser expresso em embriões e células-tronco embrionárias (CTE), sendo um importante marcador da pluripotência. Recentemente, foi relatado que a combinação de Oct-4 com três outros fatores de transcrição Klf-4, c-Myc e Sox2 foram capazes de reprogramar células somáticas a um estado indiferenciado pluripotente, chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (?células iPS?), as quais apresentam várias das mesmas propriedades das CTE incluindo a pluripotência, auto-renovação e proliferação. O objetivo desse estudo foi avaliar a funcionalidade do promotor Oct-4 de eqüino em CTE de murinos. Três vetores plasmidiais expressando GFP (?green fluorescent protein?) sob o controle do promotor Oct-4 de equinos, camundongo e quatro vetores lentivirais, também contendo o gene reporter GFP e os promotores Oct-4 de equinos, camundongo e humanos, pLZ2-ecOCT-EGFP (meq) (sequência equivalente de camundongos), pLZ2-ecOCT-EGFP (heq) (sequência equivalente de humanos), pLZ2-mOCT-EGFP e pLZ2-hOCT-EGFP, respectivamente, foram construídos. Todos os vetores também contêm um sítio de resistência à blasticidina que permite a seleção das células estáveis e das células transduzidas. Essas construções plasmidiais foram verificadas se funcionavam eficientemente, bem como o efeito do promotor Oct-4 em transfectar transientes e estáveis CTE. As construções com promotor Oct-4 de camundongo, humano e eqüino (sequência análoga à de camundongo) produziram somente 6% de células GFP positivas com intensidade de fluorescência (IF) >1000 pela análise em citômetro de fluxo, enquanto que o plasmídeo contendo o promotor Oct-4 de eqüino (sequência equivalente à de humanos) produziu menos células GFP positivas (>3%) com IF >1000, quando...

The pluripotency transcription factor Oct-4 is well conserved among species and is known to be expressed in embryos and embryonic stem (ES) cells; it is being an important pluripotency marker. It was recently demonstrated that the combination of Oct-4 with three other factors Klf-4, c-myc and Sox2 were able to reprogram somatic cells to a pluripotent and undifferentiated state. These cells known as induced pluripotent stem (iPS) cells share several properties with ES cells including self-renewal, proliferation and pluripotency. The aim of this study was to assess the functionality of the horse Oct-4 promoter in mouse ES cells. Three plasmids vectors expressing GFP (green fluorescent protein) under the control of the horse, mouse and four lentivirus vectors also containing reporter gene GFP and horse, mouse and human promoters, pLZ2-ecOCT-EGFP (mouse sequence equivalent), pLZ2-ecOCT-EGFP (human sequence equivalent), pLZ2-mOCT-EGFP and pLZ2-hOCT-EGFP, respectively, were built. All these vectors also contain a blasticidin resistance cassette to allow selection of transfected stable cells and transduced cells. Afterwards, to assess the functionality of the Oct-4 promoter all plasmids were tranfected the into transient and stable mouse ES cells. Constructs with mouse, human and horse (mouse analog sequence) Oct-4 promoter produced only 6% GFP positive cells with fluorescence intensity (FI)>1000 by 20 FACs assay, while plasmid horse (human analog sequence) Oct-4 promoter produced less GFP positive cells (>3%) with FI>1000, when compared with the positive control and among groups. However, GFP expression was not present in stable cells, whereas there were Blasticidin-resistant colonies-forming from 6 days post-transfection. To optimize the system in mouse ES cells, pLZ2-mOCT-EGFP and pLZ2-hOCT-EGFP lentivectors, were tested as controls. It was used HIV-1-derived...

Hibridização in situ em espermatozóides bovinos tratados com DNA exógeno: estudo experimental / In situ hybridization in bovine sperm treated with exogenous DNA: an experimental study

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática

Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells