EFEITO DA CONTRIBUIÇÃO MATERNA EM BOVINOS DE DIFERENTES RAÇAS NA CINÉTICA DO DESENVOLVIMENTO E METABOLISMO EMBRIONÁRIO IN VITRO

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da contribuição materna das raças bovinas leiteiras, Holandesa (Bos taurus) e Gir (Bos indicus), sobre o desempenho reprodutivo de doadoras mestiças e puras na ovum pick up (OPU)/ produção in vitro de embriões (PIVE), cinética do desenvolvimento e metabolismo embrionário in vitro, tendo sido realizado ao longo de três capítulos experimentais. No primeiro, doadoras mestiças Holandês-Gir com maior/menor grau de sangue Holandês (HG: 71,9 a 87,5% Holandês, n=9; GH: 40,6 a 46,9% Holandês, n=7; respectivamente) foram submetidas à OPU e comparadas quanto ao desempenho reprodutivo (quantidade e qualidade dos oócitos recuperados). As doadoras apresentaram desempenho semelhante (P>0,05), sugerindo que a variação individual teve maior influencia sobre o desempenho reprodutivo de doadoras mestiças na OPU. No entanto, ainda que a variação individual seja um elemento reconhecido na PIVE, a diferença na composição racial entre os grupos foi considerada moderada. Assim, foi desenvolvido o segundo capítulo experimental, em que doadoras Holandesas (H: n=8) e Gir (G> n=8) puras foram submetidas à OPU e comparadas quanto ao desempenho reprodutivo, tendo as doadoras Gir retornado uma maior taxa de oócitos viáveis (P<0,05). Os oócitos (H e G) foram ativados partenogeneticamente para avaliação da contribuição materna sobre a cinética de desenvolvimento de embriões 48, 96, 144 e 168 horas pós-ativação (hpa) (dias 2, 4, 6 e 7, respectivamente). Os grupos H e G apresentaram clivagem e produção de blastocistos semelhantes (P>0,05). Contudo, o grupo Gir exibiu quase três vezes mais embriões em estágio de 8/16 células 96 hpa (p<0,05) (G 53,6% vs H 17,9%). Foi possível concluir que a raça Gir teve desempenho superior na OPU e contribuiu para uma cinética de desenvolvimento inicial mais rápida. Com base nos achados do segundo capitulo e considerando a relação entre a cinética e o metabolismo embrionário, foi desenvolvido o terceiro capítulo, que comparou embriões bovinos com diferentes cinéticas durante o desenvolvimento inicial quanto à atividade metabólica e quantificação de dano ao DNA. Embriões produzidos in vitro foram fixados 48 (dia2 - D2) e 96 (dia4 - D4) horas pós-fertilização (hpf) e separados de acordo com a cinética (D2: 2cel e 3-7cell; D4: 5-7cel e 8-16cell). A atividade metabólica foi avaliada pela autofluorescência (AF) das coenzimas de NAD(P)H e FAD e status redox (FAD/NAD(P)H), utilizando duas metodologias: AF de dois canais espectrais e hiperespectral (40 canais). A quantificação do dano ao DNA foi realizada por reação de Imunoflurescência para a histona H2AX fosforilada (H2AX). No D4, os embriões com perfil de desenvolvimento mais rápido exibiram maior intensidade de NAD(P)H (P<0,05), que reduziu o status redox (P<0,05), na análise da AF de dois canais; e menor intensidade de FAD (P<0,05) na análise hiperespectral, consistente com o status redox reduzido perfil metabólico que preconiza a conservação de energia e defesa contra o estresse oxidativo. Com base nos achados do presente estudo, e considerando as diferenças marcantes entre oócitos e embriões das subespécies Bos taurus e Bos indicus, é possível que a raça Gir apresente um sistema de geração e conservação de energia mais eficiente, contribuindo para um perfil de desenvolvimento embrionário inicial mais rápido.

The present study aimed to assess the maternal contribution of dairy cattle breeds, Holstein (Bos taurus) and Gir (Bos indicus) on reproductive performance of crossbred and purebred donors at ovum pick up (OPU) / embryo in vitro production (IVP), embryo kinetics and metabolism, having been carried out over three experiments. In the first, Holstein-Gir crossbred with higher/lower Holstein composition (HG: 71.9 to 87.5% Holstein, n = 9; GH: 40.6 to 46.9% Holstein, n = 7 respectively) were submitted to OPU and compared for reproductive performance (quantity and quality of oocytes recovered). Donors presented similar performance (P> 0.05), suggesting that individual variation had a greater influence on crossbred donors performance at OPU. However, although individual variation is a recognized element in IVP, the difference in breed composition between groups was moderate. Thus, a second experiment was developed, in which purebred Holstein (H: n = 8) and Gir (G: n = 8) were submitted to OPU and compared regarding reproductive performance, in which Gir donors returned a higher rate of viable oocytes (P <0.05). Oocytes (H and G) were parthenogenetically activated to evaluate the maternal contribution on embryo kinetics 48, 96, 144 and 168 hours post-activation (hpa) (days 2, 4, 6 and 7, respectively). Groups showed similar cleavage and blastocysts production (P> 0.05). However, Gir group exhibited almost three times more embryos at 8/16 cell stage 96 hpa (p <0.05) (G 53.6% vs H 17.9%). It was possible to conclude that the Gir had superior performance at OPU and contributed to a faster kinetics during early development. Based on this finding and knowing that kinetics and embryo metabolism are related, a third experiment was carried out, comparing embryos with different kinetics during early development considering metabolic activity and quantification of DNA damage. Bovine IVP embryos were fixed 48 (dia2 - D2) and 96 (dia4 - D4) hours post - fertilization (hpf) and separated according to kinetics (D2: 2cel and 3-7cell; D4: 5-7cel and 8 -16cell). The metabolic activity was evaluated by autofluorescence (AF) of NAD(P)H and FAD coenzymes and redox status (FAD/NAD(P)H) using two methodologies: two-channel spectral and hyperspectral AF (40 channels). Quantification of DNA damage was performed by immunofluorescence reaction for phosphorylated histone H2AX (H2AX). In D4, fastdeveloping embryos showed a higher intensity of NAD(P)H (P<0.05), which reduced redox status (P<0.05) at the two-channel AF analysis; and lower intensity of FAD (P<0.05) at the hyperspectral analysis, consistent with reduced redox status a metabolic profile that prioritizes energy conservation and defense against oxidative stress. Based on these findings and considering the differences between oocytes and embryos of Bos taurus and Bos indicus subspecies, it is possible to suggest that Gir embryos are more efficient in generate and conserve energy, which seems to contribute to an faster development.

Genotype and expression of the enhanced gree fluorescent protein in LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc rats / Genótipo e expressão da proteína fluorescente verde melhorada em ratos da linhagem LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc

The Green fluorescent protein (GFP) was first described after being extracted from Aequorea victoria in 1987; Since then, GFP and its derivatives have been widely used in several experiments as cell and protein marker. In the present study it was verified the genotype of the offspring from crosses between heterozygote Lewis LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc rats and analyzed the expression of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) in different cell types and genotypes. The genotype of the offspring was assessed by PCR and analysis of EGFP expression in different cells and genotypes, including mesenchymal stem cells (MSC) derived from adipose tissue and calvarial osteoblast cells. Expression of EGFP was verified by flow cytometry, fluorescence microscopy, and immunostaining. Through these methods, it was identified the genotypes of the offspring and determined the levels of expression of EGFP in two cell types. A difference in expression between the (EGFP +/+) and (EGFP +/-) genotypes was also observed in addition to the presence of autofluorescence. Further studies on the natural fluorescence of cells with the (EGFP +/-) genotype and that induced by presence of the EGFP are necessary.(AU)

A proteína fluorescente verde (GFP) foi descrita pela primeira vez após ter sido extraída de Aequorea victoria em 1987. Desde então, a GFP e seus derivados têm sido amplamente utilizados em várias experiências como marcador celular e de proteínas. O objetivo do presente estudo foi o de verificar o genótipo dos descendentes de cruzamentos entre ratos Lewis LEW-Tg (EGFP) F455.5/Rrrc heterozigotos e de analisar a expressão da proteína fluorescente verde melhorada (EGFP) em diferentes tipos celulares e genótipos. O genótipo da descendência foi avaliado por PCR e pela análise da expressão da EGFP em diferentes células e genótipos, incluindo-se as células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas de tecido adiposo e de osteoblastos de calvária. A expressão da EGFP foi verificada por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e imunocoloração. Foram, identificados os genótipos da descendência e determinados os níveis de expressão de EGFP em dois tipos de células. Foi também constatada uma diferença de expressão entre os genótipos (EGFP +/+) e (EGFP +/-) além da presença de autofluorescência. Mais estudos são necessários para esclarecer a fluorescência natural de células com o genótipo (EGFP +/-) e aquela induzida pela presença da EGFP.(AU)

Estudo da interação da alga Prototheca zopfii com neutrófilos recuperados de leite bovino e ação do sistema AIA/HRP sobre este patógeno / Study of the interaction of the algae Prototheca zopfii with neutrophils recovered from bovine milk and action of the IAA/HRP on this pathogen

Estudos têm mostrado a incidência de mastite bovina associada à alga Prototheca zopfii. O objetivo deste trabalho foi estudar a interação da P. zopfii com neutrófilos recuperados de leite bovino e avaliar o efeito do sistema ácido indol-3-acético/peroxidase de raiz forte (AIA/HRP) sobre a viabilidade deste microrganismo em experimentos in vitro. A P. zopfii foi recuperada de vacas com mastite clínica e, no laboratório, foram realizadas a caracterização molecular, morfológica e crescimento exponencial do microrganismo. Em seguida, neutrófilos recuperados de leite bovino foram incubados na ausência e na presença de P. zopfii opsonizada e foram avaliadas a produção de peróxido de hidrogênio, enzimas antioxidantes dos neutrófilos e microrganismo, e a capacidade fagocitária. Em outro estudo, a P. zopfii foi incubada com o sistema AIA/HRP e foram avaliadas a viabilidade por unidades formadoras de colônias (UFC), atividade de enzimas antioxidantes, integridade de membrana por exclusão com azul de Trypan e integridade do DNA. Os resultados foram analisados pela análise de variância com significância de 5% usando o teste Tukey. Foram observados diversos tamanhos celulares da P. zopfii, presença de autofluorescência, crescimento exponencial ao longo do tempo de incubação em que não foi possível determinar o início da fase de morte. Ainda, foram encontrados os genótipos 1, 2 e 3 nos isolados em estudo. A produção de peróxido de hidrogênio pelos neutrófilos na presença da alga foi estimulada 5 vezes em relação ao controle, estimulou a atividade das enzimas catalase (CAT) em 21% e glutationa redutase (GR) em 27% e não houve diferença significativa quanto à atividade de CAT, GR e superóxido dismutase (SOD) produzido pela P. zopfii. Também foi verificado que a P. zopfii não foi englobada pelo neutrófilo. O sistema AIA/HRP inibiu o crescimento do microrganismo em 45, 82 e 88% nos tempos de 4, 6 e 9 horas de incubação; a atividade da SOD, CAT, Glutationa Peroxidase (GPx) e GR aumentou respectivamente em 90, 120, 150% e 3,4 vezes; houve redução da viabilidade da P. zopfii em 10, 15, 20, 25 e 32% após os tempos de 4, 6, 8, 10 e 12 horas de incubação; e não afetou a integridade do DNA após 6 horas de incubação. Conclui-se que a P. zopfii é altamente resistente frente aos neutrófilos e demonstrou ser susceptível quanto ao efeito microbicida do sistema AIA/HRP

Studies have shown the incidence of bovine mastitis associated with the algae Prototheca zopfii. The objective of this work was to study the interaction of P. zopfii with neutrophils recovered from bovine milk and to evaluate the effect of system indole-3-acetic acid/horseradish peroxidase (IAA/HRP) on the viability of this microorganism in vitro experiment. P. zopfii was recovered from cows with clinical mastitis and both the molecular and morphological characterization were performed besides the evaluation of exponential growth of the microorganism in the laboratory. Next, neutrophils recovered from bovine milk were incubated in the absence and presence of opsonized P. zopfii and were evaluated the production of hydrogen peroxide, antioxidant enzymes on neutrophils and microorganism, and phagocytic capacity. In another study, P. zopfii was incubated with the system IAA/HRP and the viability assessed by colony forming units (CFU), antioxidant enzymes activity, membrane integrity by exclusion with Trypan blue and DNA integrity. The results were analyzed by analysis of variance with a 5% significance using the Tukey test. Results from P. zopfii characterization showed various cellular sizes, presence of autofluorescence, exponential microorganism growth throughout the incubation time and was not possible to determine the beginning of the death. Moreover it was found genotypes 1, 2 and 3 in the isolates in study. The production of hydrogen peroxide by neutrophils in the presence of algae was stimulated 5 times compared to the control, increase the activity of catalase (CAT) in 21% and glutathione reductase (GR) in 27% was seen in neutrophils; and there was no significant difference in CAT, GR and superoxide dismutase (SOD) activity produced by P. zopfii. P. zopfii was not engulfment by neutrophils. The system IAA/HRP inhibited the growth of the microorganism in 45, 82 and 88% in the times of 4, 6 and 9 hours of incubation, the activity of SOD, CAT, glutathione peroxidase (GPx) and GR increased respectively by 90, 120, 150%, and 3.4 times, decreased the viability of P. zopfii 10, 15, 20, 25 and 32% after the times of 4, 6, 8, 10 and 12 hours of incubation, and did not affect the integrity of DNA after 6 hours of incubation. As a conclusion, P. zopfii is highly resistant to the neutrophils and demonstrated to be susceptible to the effect microbicidal of system IAA/HRP