Virulence genes and antimicrobial resistance of Pasteurella multocida isolated from poultry and swine

Pasteurella multocida causes atrophic rhinitis in swine and fowl cholera in birds, and is a secondary agent in respiratory syndromes. Pathogenesis and virulence factors involved are still poorly understood. The aim of this study was to detect 22 virulence-associated genes by PCR, including capsular serogroups A, B and D genes and to evaluate the antimicrobial susceptibility of P. multocida strains from poultry and swine. ompH, oma87, plpB, psl, exbD-tonB, fur, hgbA, nanB, sodA, sodC, ptfA were detected in more than 90% of the strains of both hosts. 91% and 92% of avian and swine strains, respectively, were classified in serogroup A. toxA and hsf-1 showed a significant association to serogroup D; pmHAS and pfhA to serogroup A. Gentamicin and amoxicillin were the most effective drugs with susceptibility higher than 97%; however, 76.79% of poultry strains and 85% of swine strains were resistant to sulphonamides. Furthermore, 19.64% and 36.58% of avian and swine strains, respectively, were multi-resistant. Virulence genes studied were not specific to a host and may be the result of horizontal transmission throughout evolution. High multidrug resistance demonstrates the need for responsible use of antimicrobials in animals intended for human consumption, in addition to antimicrobial susceptibility testing to P. multocida. (AU)

Detection of virulence-associated genes of Pasteurella multocida isolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR / Pesquisa de genes associados à virulência em cepas de Pasteurella multocida isoladas em casos de cólera aviária através da técnica de multiplex-PCR

The current systems of breeding poultry, based on high population density, increase the risk of spreading pathogens, especially those causing respiratory diseases and those that have more than one host. Fowl Cholera (FC) is one such pathogen, and even though it represents one of several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that present with sudden death, the pathogenesis and virulence factors involved in FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate twelve genes related to virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. The protocols developed were capable of detecting all of the proposed genes. The ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB and nanB genes were present in 100% of the samples (25/25), the sodA and nanH genes were present in 96% (24/25), ptfA was present in 92% (23/25), and pfhA was present in 60% (15/25). Gene toxA was not identified in any of the samples studied (0/25). Five different genetic profiles were obtained, of which P1 (negative to toxA) was the most common. We concluded that the multiplex-PCR protocols could be useful tools for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and the fact that all samples belonged to the same subspecies of P. multocida, five genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.(AU)

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de patógenos, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuam mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) apresenta estas características e apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar doze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). O gene toxA não foi identificado em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). Foram obtidos cinco diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para o gene toxA) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados cinco perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras.(AU)

Caracterização fenotípica e molecular de cepas de Pasteurella multocida

Entre as bactérias que habitam a cavidade oral e nasal dos animais, os constituintes da família Pasteurellaceae estão entre os microrganismos comensais ou oportunistas mais prevalentes. Apesar do número de doenças associadas e da diversidade de hospedeiros acometidos, o conhecimento sobre a patogenia desta bactéria ainda é restrito. Além disto, a análise da virulência de Pasteurella multocida, que ocasiona casos agudos e crônicos de cólera aviária, não é comum. Tais estudos são ainda mais raros para cepas circulantes no Brasil. O objetivo deste trabalho foi a caracterização fenotípica e molecular de 96 cepas de P. multocida isoladas de aves e de suínos no país. As subespécies e os biovares foram determinados através de testes bioquímicos, e os sorogrupos foram classificados pelo emprego de testes fenotípicos não sorológicos. A susceptibilidade in vitro a nove antimicrobianos também foi avaliada. Para os estudos genotípicos, foi realizada a pesquisa de 22 genes de virulência por multiplex-PCR, incluindo-se aqueles determinantes dos sorogrupos, a comparação dos perfis genéticos e a diferenciação molecular através de PCR-RFLP a partir dos genes ompH e oma87. Por último, os testes fenotípicos e moleculares para classificação dos sorogrupos foram comparados, e a distribuição dos genes foi relacionada com índices de patogenicidade in vivo das cepas para a identificação de marcadores moleculares. Um total de 87,5% (84/96) das cepas foi classificado na subespécie multocida. O biovar 3 foi o mais comum entre as cepas aviárias e suínas, sendo identificado respectivamente em 35,7% (20/56) e 25% (10/40) dos casos. Entre as cepas aviárias, 90,7% (49/54) foram classificadas no sorogrupo A através do multiplex-PCR, e 3,7% (2/54) não foram classificados em um dos dois sorogrupos. Em contraste, somente 75,9% (41/54) das cepas aviárias foram identificadas no tipo capsular A através do teste fenotípico e 20,4% (11/54) não foram tipificadas. Resultados semelhantes foram observados entre os isolados suínos. As taxas de susceptibilidade das cepas aviárias foram superiores a 80% para os antimicrobianos testados, com exceção à enrofloxacina e ao sulfafurazol. Somente amoxicilina, ciprofloxacina e gentamicina inibiram o crescimento de mais de 80% das cepas suínas. 8,9% (5/56) dos isolados de origem aviária e 37,5% (15/40) das cepas suínas foram multirresistentes. A maioria dos genes (ompH, oma87, psl, plpB, exbD-tonB, fur, hgbA, nanH, nanB, sodA, sodC, pmHAS, ptfA) apresentou uma frequência superior a 90% e distribuição regular, independentemente da origem. As cepas foram agrupadas em 33 perfis, sendo o perfil 1 (toxA-; pfhA-; dcbF-; bcbD-; hsf-1-) o mais frequente, identificado em 16,7% (16/96) dos casos. O PCR-RFLP a partir do gene ompH permitiu a classificação das cepas aviárias em sete grupos moleculares, sendo predominante o grupo II, identificado em 42,9% (24/56) das situações. A detecção do gene pfhA indica a presença de cepas de alta patogenicidade em aves, e em segundo lugar, de cepas intermediárias. Este estudo proveu a caracterização fenotípica e molecular de cepas de P. multocida isoladas de aves e de suínos no Brasil e os seus resultados possibilitam a distinção futura dos isolados aviários quanto à patogenicidade.

The constituents of the Pasteurellaceae family are among the most prevalent commensal microorganisms or opportunistic pathogens that inhabit the oral and nasal cavity of the animals. The knowledge of the pathogenesis of this bacterium is still restricted, despite the number of related diseases and diversity of affected hosts. Similarly, analysis of the virulence of Pasteurella multocida, that causes acute and chronic cases of fowl cholera, is not common. Such studies are even rarer for the circulating strains in Brazil. The present work aimed to the phenotypic and molecular characterization of ninety-six P. multocida strains isolated from poultry and swine in the country. The subspecies and biovars were determined through biochemical scheme and the serogroups or capsular types were classified by employing non-serologic phenotypic tests. Furthermore, the susceptbility to nine antimicrobial agents was evaluated. For genotypic studies, the investigation of twenty-two virulence genes by multiplex-PCR, including those that are serogroups determinants, the comparing of the genetic profiles and the molecular differentiation by PCR-RFLP from ompH e oma87 were performed. Finally, the results of phenotypic and molecular tests for classification of serogroups were compared and the distribution of genes was related to in vivo pathogenic indices of strains for identification of molecular markers. 87.5% (84/96) of the strains were classified in multocida subspecies. The biovar 3 was more common among avian and swine strains, identified respectively in 35.7% (20/56) and 25% (10/40) of cases. Among avian strains, 90.7% (49/54) were classified in serogroup A by multiplex-PCR and 3.7% (2/54) were not classified in one of two serogroups. In contrast, only 75.9% (41/54) of avian strains were identified in the capsular type A through phenotypic test and 20.4% (11/54) were not typed. Similar results were observed among swine isolates. The susceptibility rates of avian strains were above 80% for the tested antimicrobials, except to enrofloxacin and sulfafurazol. Only amoxicillin, gentamicin and ciprofloxacin inhibited the growth of more than 80% of the swine strains. 8.9% (5/56) of avian isolates and 37.5% (15/40) of swine strains were multidrug-resistant. The majority of genes (ompH, oma87, psl, plpB, exbD-tonB, fur, hgbA, nanH, nanB, sodA, sodC, pmHAS, ptfA) had a frequency higher than 90% and regular distribution, regardless of source. The strains were grouped in 33 profiles and profile 1 (toxA-; pfhA-; dcbF-; bcbD-; hsf-1-) was most frequent, identified in 16.7% (16/96) of cases. The PCR-RFLP from ompH gene allowed the classification of avian strains in seven molecular groups. The predominant group II was identified in 42.9% (24/56) of cases. The detection of pfhA gene indicates the presence of highly pathogenic avian strains, and secondly, of intermediate strains. This study provided the phenotypic and molecular characterization of P. multocida isolated from poultry and swine in Brazil and its results enable future distinction of avian strains according the pathogenicity.

Pasteurelosi aviária 1. Pasteurella anatipestifer - descrição de um surto em aves / Pasteurelosi aviária 1. Pasteurella anatipestifer - descrição de um surto em aves

A Pasteurella anatipestífer outbreak is described in different domestic fowl species. High morbidity and mortality; nervous symptoms and diarrhoea; central nervous system congestion and fibrinous serosity was observed. Peripferical blood and tracheo-bronchic secretion smears showed Gram negative cocobacili with bipolar stain. Peripherical blood culture in chicken blood agar showed characteristical colonies from Gram negative cocobacili with bipolar stain. Motility and biochemical finding confirmed P. anatipestifer. In vitro test with amicacin, streptomicyn, penicilling, gentamicin, cloramphenicol, sulfazotrin, furaltadone, lincomycin, showed sensitive, while tetracycline, neomycin and sulfametroprim, resistance. The oxytetracycline in drinking water helped in the control of this outbreak. The clinical, anatomopathologic, epidemical finding, isolation and identification, differential diagnostic and therapeutics methods are discussed.

É descrito um surto de Pasteurella anatipestifer em diferentes espécies de aves domésticas. Foi observado: alta morbidade e mortalidade; sintomas nervosos e diarréia; congestão do sistema nervoso central e serosite fibrinosa. Esfregaços de sangue periférico e de secreção traqueo-bronquica mostraram cocobacilos Gram negativos com coloração bipolar. O cultivo de sangue periférico em agar sangue galinha mostrou colônias características de cocobacilos Gram negativos com coloração bipolar. Os testes de motilidade e bioquímicos confirmaram a etiologia por P. anatipestifer. Teste in vitro com amicacina, estreptomicina, penicilina B, geniamicina, cloranfenicol, sulfazotrim, furaltadone, lincomicina mostraram sensíveis, enquanto a tetraciclina, neomicina e sulfametroprim, resistência. A oxitetraciclina em água de bebida, auxiliou o controle deste surto. Os dados clínicos, anatomopatológicos, epidemiológicos, isolamento e identificação, diagnóstico diferencial e métodos terapêuticos são discutidos.

Pasteurelosi aviária 1. Pasteurella anatipestifer - descrição de um surto em aves / Pasteurelosi aviária 1. Pasteurella anatipestifer - descrição de um surto em aves

A Pasteurella anatipestífer outbreak is described in different domestic fowl species. High morbidity and mortality; nervous symptoms and diarrhoea; central nervous system congestion and fibrinous serosity was observed. Peripferical blood and tracheo-bronchic secretion smears showed Gram negative cocobacili with bipolar stain. Peripherical blood culture in chicken blood agar showed characteristical colonies from Gram negative cocobacili with bipolar stain. Motility and biochemical finding confirmed P. anatipestifer. In vitro test with amicacin, streptomicyn, penicilling, gentamicin, cloramphenicol, sulfazotrin, furaltadone, lincomycin, showed sensitive, while tetracycline, neomycin and sulfametroprim, resistance. The oxytetracycline in drinking water helped in the control of this outbreak. The clinical, anatomopathologic, epidemical finding, isolation and identification, differential diagnostic and therapeutics methods are discussed.  

É descrito um surto de Pasteurella anatipestifer em diferentes espécies de aves domésticas. Foi observado: alta morbidade e mortalidade; sintomas nervosos e diarréia; congestão do sistema nervoso central e serosite fibrinosa. Esfregaços de sangue periférico e de secreção traqueo-bronquica mostraram cocobacilos Gram negativos com coloração bipolar. O cultivo de sangue periférico em agar sangue galinha mostrou colônias características de cocobacilos Gram negativos com coloração bipolar. Os testes de motilidade e bioquímicos confirmaram a etiologia por P. anatipestifer. Teste in vitro com amicacina, estreptomicina, penicilina B, geniamicina, cloranfenicol, sulfazotrim, furaltadone, lincomicina mostraram sensíveis, enquanto a tetraciclina, neomicina e sulfametroprim, resistência. A oxitetraciclina em água de bebida, auxiliou o controle deste surto. Os dados clínicos, anatomopatológicos, epidemiológicos, isolamento e identificação, diagnóstico diferencial e métodos terapêuticos são discutidos.