Imunofenotipagem dos linfócitos positivos para indoleamina 2, 3 dioxigenase (IDO) em cultura de células de placenta bovina / Phenotyping of the indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) positive lymphocytes in bovine placental cell culture

A gestação é um estado fisiológico que exige adaptações imunológicas para que transcorra normalmente. Nesse período a mãe e o feto apresentam uma relação imunológica, ou seja, a interface materno fetal. A enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO) desempenha um papel importante na tolerância materno fetal, por ser responsável pela metabolização do triptofano, impedindo por diversas vias a proliferação principalmente de linfócitos TCD8. Diversos tipos celulares estão presentes na interface materno fetal e vários deles podem expressar a IDO. Os leucócitos com perfil Th1 produzem uma citocina conhecida: o interferon γ que estimula a expressão da IDO em vários tipos celulares. Os linfócitos são divididos em subpopulações de acordo com sua função e fenótipo. Seus tipos incluem linfócitos T, linfócitos B e as células natural killer (NK). Hormônios também atuam nesse processo a progesterona que exerce função determinante sobre a resposta imunológica materna podendo alterar o prognóstico gestacional e o estrógeno essencial para a tolerância materno fetal e manutenção da prenhez. Dessa maneira este trabalho tem por objetivo principal identificar os linfócitos presentes na placenta bovina em cultivo que expressam IDO (linfócitos T, linfócitos B e células NK), frente a estimulação por progesterona, estrógeno e interferon γ nas diversas fases gestacionais utilizando a citometria de fluxo. Segundo os resultados no período de 67,5 a 77, 5 dias com a adição de interferon γ a expressão da enzima IDO aumentou discretamente nos linfócitos TCD3, TCD4, e diferente dos linfócitos T CD8 apresentaram uma elevada expressão da enzima (4,48 ± 2,12 - 8,65± 4,91). No período de 92,5 a 172, 5 dias os linfócitos TCD4, TCD8 e TCD25 apresentaram uma diminuição da IDO. No período final de 195 a 222,5 dias, os linfócitos TCD3, TCD4 e os BCD25 aumentaram a expressão da IDO quando submetidos ao interferon γ, no entanto, os linfócitos T CD8 e as células NK não apresentaram alterações [...](AU)

Pregnancy is a physiological state that requires immune adaptation in order to be successfully carried on. During this period, mother and fetus establish an immune tolerance status at the maternal fetal interface. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) plays an important role in maternal-fetal tolerance by metabolizing tryptophan, impairs by several pathways, mainly T CD8 cells proliferation. Several cell types are present in the maternal fetal interface and several of them can express IDO. Leucocytes with Th1 produce a cytokine known as interferon γ that stimulates the expression of IDO in several cell types. Lymphocytes are divided into sub-populations according to their function and phenotype: T lymphocytes, B lymphocytes and natural killer cells (NK). Hormones also involved in this process where progesterone exerts decisive role on maternal immune response that may change gestational outcome and estrogen is essential for fetal maternal tolerance and maintenance of pregnancy. Therefore, the main objective of this study was to identify lymphocytes in the bovine placental cell culture that are sensitive to progesterone, estrogen and interferon γ, IDO expression in various gestational stages using flow cytometry. According to the results in the gestational period from 67.5 to 77.5 days with the addition of interferon γ expression IDO was slightly increased in TCD3 lymphocytes, CD4, and differently from the other T cells CD8 displayed an higher expression of the enzyme (4.48±2.12 to 8.65±4.91). In the period from 92.5 to 172. 5 days the CD4 lymphocytes, CD8 and TCD25 showed a significant decrease of IDO expression (p<0.05). At the final stages between 195 and 222, 5 days TCD3 lymphocytes, CD4 and BCD25 increased expression when subjected to interferon γ supplementation; however, CD8 T cells and NK cells showed no significant changes [...](AU)

Influence of covering reused broiler litter with plastic canvas on litter characteristics and bacteriology and the subsequent immunity and microbiology of broilers

In broiler production, the litter is reused for consecutives flocks, and it is treated during down time between flocks to reduce its microbial load. Although covering the litter with a plastic canvas is a common litter treatment in the field, there is little scientific information available on its efficacy. The aim of this study was to evaluate the effects of covering broiler litter with a plastic canvas for eight days on litter microbiological, physical, and chemical parameters, and on the intestinal microbiota and immunity of broilers. In the first trial, reused litter from a previous flock was distributed into three treatments, with six replicates each: L1 (negative control, litter free from Salmonella Enteritidis (SE) and Eimeria maxima (EM) and not covered), L2 (positive control, litter with SE and EM, and not covered), and L3 (litter with SE and EM, and covered with plastic canvas for eight days). Litter total bacteria, Enterobacteria, Lactobacillus, SE, and EM counts, and litter pH, temperature, moisture, and ammonia emission were determined on days 1 and 8. In the second trial, broilers were housed on those litters according to the treatments described above, and their intestinal microbiota, gut CD4+ and CD8+ lymphocytes and macrophages, and liver and intestinal pro-inflammatory interleukin (IFN-, IL-1 e IL-18) levels were evaluated on days 14 and 28. A significant reduction of litter bacterial populations was observed in the litter covered with plastic canvas. A significantly higher mRNA IFN- gene expression (12.5-fold) was observed in the jejunum and liver of broilers reared on the litter with Enterobacteria counts. No EM reduction was observed in the covered litter. Covering reused broiler litter with plastic canvas reduces initial litter bacterial load as a result of the interaction between physical and chemical parameters.

Influence of covering reused broiler litter with plastic canvas on litter characteristics and bacteriology and the subsequent immunity and microbiology of broilers

In broiler production, the litter is reused for consecutives flocks, and it is treated during down time between flocks to reduce its microbial load. Although covering the litter with a plastic canvas is a common litter treatment in the field, there is little scientific information available on its efficacy. The aim of this study was to evaluate the effects of covering broiler litter with a plastic canvas for eight days on litter microbiological, physical, and chemical parameters, and on the intestinal microbiota and immunity of broilers. In the first trial, reused litter from a previous flock was distributed into three treatments, with six replicates each: L1 (negative control, litter free from Salmonella Enteritidis (SE) and Eimeria maxima (EM) and not covered), L2 (positive control, litter with SE and EM, and not covered), and L3 (litter with SE and EM, and covered with plastic canvas for eight days). Litter total bacteria, Enterobacteria, Lactobacillus, SE, and EM counts, and litter pH, temperature, moisture, and ammonia emission were determined on days 1 and 8. In the second trial, broilers were housed on those litters according to the treatments described above, and their intestinal microbiota, gut CD4+ and CD8+ lymphocytes and macrophages, and liver and intestinal pro-inflammatory interleukin (IFN-, IL-1 e IL-18) levels were evaluated on days 14 and 28. A significant reduction of litter bacterial populations was observed in the litter covered with plastic canvas. A significantly higher mRNA IFN- gene expression (12.5-fold) was observed in the jejunum and liver of broilers reared on the litter with Enterobacteria counts. No EM reduction was observed in the covered litter. Covering reused broiler litter with plastic canvas reduces initial litter bacterial load as a result of the interaction between physical and chemical parameters.(AU)

Imunidade celular em caninos neonatos - do nascimento ao 45° dia de idade / Cellular immunity in canine newborns - from birth to the 45th day of life

O objetivo do presente trabalho foi acompanhar o desenvolvimento imunológico dos neonatos caninos, a fim de avaliar a imunidade celular pela análise dos leucócitos e linfócitos totais e das subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) pela técnica de citometria de fluxo. Foram utilizados 30 cães neonatos de ambos os sexos, sem raça definida, aos três, 10, 17, 24, 31, 38 e 45 dias de idade. A contagem de leucócitos totais aos 45 dias (11.639±3.574) foi significativamente maior que no terceiro dia de idade (8.740±1.812) (P<0,05); não houve diferença entre a contagem total de linfócitos aos 45 dias em relação ao terceiro dia de idade. Quanto às subpopulações de LT CD4+ e LT CD8+, os percentuais de LT CD4+, aos três dias de idade (24,9±16,8 por cento), foram inferiores quando comparados à média entre o 10°, o 24° e o 31°dia (35,5 por cento), e os de CD8+, ao terceiro dia, menores em relação às médias do 10° e do 31° dia de idade. Pode-se concluir que as subpopulações de LT CD4+ e CD8+ sofrem oscilações durante o desenvolvimento pós-natal, sendo estas crescentes em relação aos níveis obtidos aos três dias de idade. A relação CD4+:CD8+ mostrou superioridade para o primeiro tipo celular, sendo que a maior relação entre CD4+ e CD8+ ocorreu no terceiro dia de idade. Com base nos resultados obtidos neste estudo, notaram-se as diferenças semanais nas populações linfocitárias, o que demonstra a dinâmica dessas células durante o período neonatal.(AU)

The aim of this study was to evaluate the immune development of newborn canines, evaluating the cellular immunity by analysis of leukocyte and lymphocyte totals and sub-population of T lymphocytes (CD4+ and CD8+) by the flow cytometry technique. Thirty neonatal mongrel dogs of both sexes were used, at 3, 10, 17, 24, 31, 38 and 45 days of age. The total leukocyte count to 45 days (11639±3574/µL) was significantly greater than on the third day of age (8740±1812) (p<0.05); There were no differences between the total count of lymphocytes at 45 days in relation to the third day of age. As for the subpopulations of CD4+ and CD8+, CD4+ cell percentages, at three days of age (24.9±16.8) they were inferior when compared to the average between the 10th, 24th and 31st day (35.5), and CD8+ cells, on the third day, were lower compared with averages from the 10th and 31st day of age. It can be concluded that the subpopulations of CD4+ and CD8+ cells undergo oscillations during development, with growing postnatal levels obtained at three days old. The CD4:CD8 ratio showed superiority to the first cell type, and the largest relationship between CD4+ and CD8+ occurred on the third day of age. Based on the results obtained in this study, the differences noted in lymphocyte populations weekly showed the dynamics of these cells during the neonatal period.(AU)

CÉLULAS T REGULADORAS NO LINFOMA CUTÂNEO CANINO

O linfoma pode ser caracterizado pela proliferação clonal de linfócitos malignos nos órgãos linfóides, podendo, porém, atingir diversos tecidos entre os quais a pele, denominado linfoma cutâneo. No cão, o linfoma cutâneo pode apresentar-se clinicamente por lesões localizadas ou generalizadas, podendo evoluir para lesões em placas e nódulos, muitas vezes edemaciados, ulcerados e hemorrágicos. Segundo avaliação histopatológica, podem ser classificados em epiteliotrópico ou não epiteliotrópico, com linhagem imunofenotípica T ou B, sendo o T mais comum. Células T reguladoras são linfócitos com capacidade imunossupressora, com papel importante na manutenção de processos fisiológicos, impedindo respostas de autoimunidade. Além disto, estudos demonstraram a influência das mesmas na supressão de respostas anti-tumorais, permitindo o escape das células neoplásicas dos mecanismos de defesa. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a presença das células T reguladoras em 12 cães com linfoma cutâneo T e 12 animais saudáveis, no sangue periférico e pele, através das técnicas de citometria de fluxo, avaliando porcentagens de Tregs, células T CD4+ e CD8+, e imuno-histoquímica, com a expressão tecidual de Foxp3. Observou-se maior número de Tregs no sangue periférico de cães com linfoma cutâneo (10,84±1,18) em relação aos animais saudáveis (5,67±0,89), sem diferença quanto às porcentagens de células CD4+ (48,26±4,54; 51,01±4,92, respectivamente) e CD8+ (30,32±4,82; 31,78±5,65, respectivamente). Não houve diferença nos valores celulares entre os animais com linfoma epiteliotrópico e não epiteliotrópico. Quanto à expressão tecidual de Foxp3 não foram observadas células imunomarcadas nos fragmentos cutâneos saudáveis, apenas nos linfomas cutâneos, com média de 8% (±5) de células positivas, demonstrando a presença de Tregs no tecido neoplásico, sem diferença entre os tipos histopatológicos. Não foi observada associação entre o número de Tregs e relação Treg/CD8, com a sobrevida dos pacientes. Não houve correlação entre os valores teciduais e sanguíneos das células T regulatoras nos animais com linfoma cutâneo. Desta forma, pode-se concluir que há estímulo para diferenciação e/ou proliferação de Tregs no ambiente tumoral de cães com linfoma cutâneo e aumento das mesmas na circulação, porém, não foi possível estabelecer exato valor prognóstico destas células

Lymphoma can be characterized by clonal proliferation of malignant lymphocytes in the lymphoid organs, but may reach several tissues including the skin, called cutaneous lymphoma. In dogs, the cutaneous lymphoma may present clinically as localized or generalized lesions, wich may progress to plaque and nodules, often swollen, ulcerated and bleeding. Histologically, they can be classified as epitheliotropic or non-epitheliotropic, with immunophenotypic line T or B. Regulatory T cells are lymphocytes with immunosuppressive capacity, with a significant role in the maintenance of physiological processes, preventing autoimmunity responses. Furthermore, studies have demonstrated their influence in the suppression of anti-tumor responses, allowing the escape of neoplastic cells from the defense mechanisms. Thus, the present study aimed to evaluate the presence of regulatory T cells in 12 dogs with cutaneous T cell lymphoma and 12 healthy animals in peripheral blood and skin, through flow cytometry techniques, assessing blood concentration of Tregs, CD4+ and CD8+, and immunohistochemical, through tissue expression of Foxp3. A higher number of Tregs in the peripheral blood of dogs with cutaneous lymphoma (10,84±1,18) was observed in relation to the healthy animals (5,67±0,89), with no difference in the percentages of CD4 + (48,26±4,54; 51,01±4,92, respectively) and CD8 + (30,32±4,82; 31,78±5,65, respectively) cells. There was no difference in cellular values between the animals with epitheliotropic and non-epitheliotropic lymphoma. Regarding the tissue expression of Foxp3, we did not observe marked cells in healthy cutaneous fragments, only in cutaneous lymphomas (8%+5), demonstrating the presence of Tregs in the neoplastic tissue, with no difference between histopathological types. No association was observed between the number of Tregs and the Treg/CD8 ratio, with the patients' survival. There was no correlation between tissue and blood values of regulatory T cells in animals with cutaneous lymphoma. In this way, it can be concluded that there is stimulus for differentiation and / or proliferation of Tregs in the tumor environment of dogs with cutaneous lymphoma, leading to their accumulation in the neoplastic tissue and consequently increase in circulation, but it was not possible to establish an exact value prognosis

"Função da galectina-1 na resistência do hospedeiro contra a infecção experimental por Neospora caninum"

Neospora caninum (Nc) é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório, causador da neosporose, uma doença clínica indicada como uma das principais causas de aborto, morte neonatal e infertilidade em bovinos, representando um importante problema de saúde veterinária com grande impacto econômico no mundo todo. Galectina-1 (gal-1), uma proteína ligante de -galactosídeos, exibe diversas atividades biológicas em muitas doenças inflamatórias, mas nada foi descrito até o momento sobre a gal-1 na infecção por Nc. Este trabalho foi desenvolvido para avaliar o efeito da gal-1 (tanto endógena quanto exógena) na infecção experimental murina por N. caninum e o efeito da gal-1 exógena sobre a invasão celular de N. caninum em ensaios in vitro. Primeiramente, foram realizados ensaios para investigar a capacidade de ligação da gal-1 com taquizoítas de Nc e seu papel na invasão in vitro por Nc em diferentes modelos celulares. Nesses ensaios, gal-1 mostrou ligar-se aos taquizoítas de Nc via CRD (domínio de reconhecimento de carboidrato) de maneira dose-dependente. Tanto células VERO, quanto macrófagos e esplenócitos mostraram ser modelos eficazes para o estudo in vitro do processo de invasão e proliferação de Nc, porém, gal-1 não interfere no processo de invasão. Para os ensaios in vivo, camundongos C57BL/6 machos selvagens (WTgal-1+/+) e geneticamente deficientes de gal-1 (KOgal-1-/-) foram infectados com taquizoítas de Nc1-lacZ, por via intraperitoneal, e tratados com gal-1 exógena por 7 dias. Aos 5, 8 e 15 dias pós-infecção, foram avaliados diversos parâmetros imunológicos, como carga parasitária peritoneal e produção de óxido nítrico por células da cavidade peritoneal, perfil celular do peritônio e baço, produção de citocinas por células T, quantificação de anticorpos específicos anti-Nc e quantificação de citocinas nos sobrenadantes de cultura de células esplênicas. A ausência de galectina-1 endógena levou ao aumento da produção de óxido nítrico (NO), da população de macrófagos F4/80+ peritoneais e da secreção de IL-6. Porém, essa deficiência de gal-1 levou à redução da população de linfócitos T (CD4+ e CD8+) produtores de IFN- , diminuição da ativação de linfócitos B e da secreção de IFN- e IL-10. Com relação aos camundongos WTgal-1+/+, foi destacada a contribuição da gal-1 exógena para estimular a produção de NO, promover o aumento do número de células F4/80+, induzir a secreção de IFN- , IL-10, IL-4 e IL-6, além de aumentar a produção de IgG e IgM. Em animais KOgal-1-/-, em contrapartida, foi observado um efeito imunorregulatório dessa galectina exógena sobre a resposta à infecção, caracterizado pelo aumento da carga parasitária peritoneal e diminuição da população de macrófagos (F4/80+) produção de NO na cavidade peritoneal. Além disso, e em conformidade com o perfil regulatório da resposta, foi possível observar a diminuição da população de linfócitos TCD8+ produtores de IFN- e aumento das células T (CD4+ e CD8+) produtoras de IL-10 nos animais infectados e tratados, que corroborou com a secreção destas citocinas por células esplênicas. Com base nestes resultados, sugerimos que a gal-1 endógena medeia perfis imunológicos da resposta do hospedeiro, inibindo mecanismos efetores da resposta inata e estimulando a resposta adaptativa contra o parasita N. caninum e que a suplementação com gal-1 exógena gera uma imunorregulação na reposta do hospedeiro contra o parasita N. caninum. Nosso trabalho é pioneiro no estudo da interação da gal-1 na infecção com Nc e, embora seja um investigação inicial dos mecanismos imunológicos envolvidos nesse processo, sugere uma ação da gal-1 na modulação da resposta imunológica contra N. caninum.

Neospora caninum (Nc) is an apicomplexa protozoan, an obligate intracellular parasite that causes neosporosis, a clinical disease indicated as one of the main causes of abortion, neonatal death and infertility in cattle, representing an important veterinary health problem with great economic impact worldwide. Galectin-1 (gal-1), a -galactosidase binding protein, exhibits several biological activities in many inflammatory diseases. This work was aimed to evaluating the effect of gal-1 (both endogenous and exogenous) on N. caninum infection and the effect of exogenous gal-1 on the in vitro cellular invasion of N. caninum. Firstly, assays were developed to investigate the binding capacity of gal-1 with Nc tachyzoites and the role of this lectin in in vitro invasion process by Nc. Different cell models were used and VERO cells, macrophages and splenocytes proved to be effective models for the study of the Nc invasion and proliferation process. However, although galectin-1 has the ability to bind to Nc via CRD in a dose-dependent manner, this lectin does not interfere with the invasion process. For the in vivo assays, wild-type (WTgal-1+/+) and genetically deficient gal-1 mice (KOgal-1-/-) were intraperitoneally infected with Nc1-lacZ tachyzoites and treated with gal-1 for 7 days. At 5, 8 and 15 days post infection, various immunological parameters were evaluated, such as peritoneal parasite load and nitric oxide production by peritoneal cells, peritoneal and spleen cell profile, cytokine production by T cells, quantification of specific anti-Nc and quantification of cytokines in splenic cell culture supernatants. The absence of endogenous galectin-1 led to increased nitric oxide, peritoneal F4/80+ macrophage population and IL-6 secretion. However, gal-1 deficiency decreased the population of T cells (CD4+ and CD8+) producing IFN-, the B lymphocyte activation and the secretion of IFN- and IL-10. With respect to WTgal-1+/+ mice, we can highlight a contribution of exogenous gal-1 to stimulating NO production, promoting the increase of F4/80+ cells, inducing the secretion of IFN-, IL-10, IL-4 and IL-6, in addition to increasing the production of IgG and IgM. In contrast, an immunoregulatory effect of this galectin in response to infection was observed in the KOgal-1-/- animals. It was observed an increased peritoneal parasite burden, decreased macrophage (F4/80+) population and NO production by these cells in the peritoneal cavity. In addition, in agreement with the regulatory profile of the response, it was observed a decrease of the CD8+ T cells population producing IFN- and increased T cells (CD4+ and CD8+) producing IL-10, which corroborated with the secretion of these cytokines by the splenic cells. Based on these results, we suggest that endogenous gal-1 mediates immunological profiles of host response by inhibiting innate effector mechanisms and stimulating an adaptive response against N. caninum. Furthermore, exogenous gal-1 immunoregulate the host immune response against the parasite. Our work is a pioneer in studying the interaction of gal-1 in Nc infection and, although it is an initial investigation of the immunological mechanisms, our data suggests role of gal-1 in the modulation of the immune response against N. caninum.

Estudo das expressões de marcadores imunoistoquímicos do sistema imune em felinos com linfoma gastrointestinal

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que tem em comum a origem em células linforreticulares, sendo a forma anatômica gastrointestinal a mais prevalente na espécie felina. A maioria dos animais responde inicialmente ao tratamento, contudo, sabe-se que o desequilíbrio no sistema imune, de modo geral, pode facilitar a ocorrência e a disseminação das neoplasias. Para equilibrar a atividade do sistema imune, as células com função regulatória (Tregs) são fundamentais e por isso, alvo de diversas pesquisas isoladamente ou associadas a outros marcadores, como a IL-17A e o CD8, já que tanto as Tregs quanto os linfócitos Th17 originam-se de uma mesma célula T progenitora. Assim, alterações na relação Treg/Th17 podem levar à supressão na produção de linfócitos T CD8, invertendo a relação Tregs/CD8. Também há indícios de que as Tregs alterem a função efetora de células T contra neoplasias em seres humanos e em cães. Foram objetivos deste estudo avaliar as características do linfoma gastrointestinal em felinos, a proliferação celular por meio do índice mitótico e do marcador Ki-67, a expressão imunoistoquímica de CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 e IL-17A e correlacionar a expressão desses marcadores com o tipo celular, imunofenótipo, resposta ao tratamento e sobrevida global. Para análise estatística foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Qui-quadrado de Pearson, de correlação de Spearman e a curva Kaplan-Meyer. Dos 47 gatos, 85% apresentaram a forma linfocítica de células T, com mediana de sobrevida de 24 meses; 15% apresentaram a forma linfoblástica de células B ou T, com mediana de sobrevida de 5 meses. A expressão de Ki-67 foi mais evidente naqueles pacientes com linfoma linfoblástico de células B ou T se comparado ao linfocítico de células T, com mediana de 40,5% e 8,2%, respectivamente e p=0,002. Na análise dos marcadores do sistema imune, não foi observada marcação de IL-2R. Não houve diferença significante na expressão de IL-17 e FOXP3 entre os tipos celulares e imunofenótipo, bem como não houve correlação entre FOXP3 e IL-17 e entre FOXP3 e CD8. Considerando somente os casos de linfoma linfocítico de células T, na análise do padrão de remissão parcial (n=12) versus completa (n=27), constatou-se diferença significante quanto à sobrevida (p<0,0001) e CD8 (p=0,015). Na análise de sobrevida, o tratamento com L-asparaginase, clorambucil e prednisolona, os níveis de albumina sérica iguais ou maiores que 2,5g/dL e o ganho de peso no início do tratamento foram preditores de maior tempo de sobrevida. Pode-se concluir que o linfoma linfocítico de células T foi o mais prevalente na espécie felina, envolvendo principalmente o intestino delgado e com um tempo mediano de sobrevivência de 24 meses; a expressão de ki-67 foi melhor marcador para determinar a proliferação celular se comparada ao índice mitótico; a expressão de FOXP3 foi baixa e não se relacionou à resposta terapêutica e ao tempo de sobrevida. Na análise específica dos casos de linfoma linfocítico de células T, não houve correlação entre FOXP3/IL-17 e FOXP3/CD8, enquanto que a baixa expressão de CD8 correlacionou-se a maior sobrevida naqueles pacientes em remissão completa.

Lymphomas belong to a group of neoplasia that have in common the origin in lymphoreticular cells, and gastrointestinal is the most prevalent anatomical form in feline species. Most animals initially respond to treatment, however, it is known that the imbalance in the immune system generally may facilitate the occurrence and spread of tumors. To balance the activity of immune system, cells with regulatory function (Treg) are essential and therefore the target of many researches, alone or in combination with other markers such as IL-17A and CD8, as well Tregs as Th17 lymphocytes originate from a same progenitor T-cell. Thus, the relation between Treg / Th17 is important since changes in this relation can lead to suppressed production of CD8+ T lymphocytes, inverting the relation Treg/CD8. There is also evidence that Tregs alter the effector function of T cells against tumors in human beings and dogs. The objectives of this study was to evaluate the characteristics of gastrointestinal (GI) lymphoma in cats, cell proliferation by mitotic index and Ki-67 marker, immunohistochemical expression of CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 and IL-17A and correlate the expression of these markers on the cell-type, immunophenotype, response to treatment and overall survival. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Pearsons Chi-squared test, Spearman correlation and Kaplan-Meier curve. Of the 47 cats, 85% showed lymphocytic T cells, with a median survival of 24 months; and 15% had lymphoblastic B or T cells, with a median survival of 5 months. Ki-67 expression was most evident in patients with lymphoblastic B- or T-cell lymphoma compared to lymphocytic T cell lymphoma, with a median of 40.5% and 8.2%, respectively and p = 0.002. In the analysis of immune system markers, immunostaing was not observed IL-2R. There was no significant difference in IL-17A and FOXP3 expression between cell-type and immunophenotypes, as well as no correlation between FOXP3 and IL-17A and between FOXP3 and CD8. Considering only the cases of lymphocytic T-cell lymphoma, there was a significant difference in survival time (p <0.0001) and CD8 expression (p = 0.015) considering partial (n = 12) versus complete remission (n = 27). In survival analysis, treatment A (L-asparaginase, chlorambucil and prednisolone), as well as serum albumin levels equal or higher than 2.5g/dL and weight gain after 30 days of treatment were predictive of increased survival time. As conclusion, lymphocytic T-cell lymphoma was more prevalent in feline species, mainly involving the small intestine and with a median survival of 24 months. Ki-67 expression was better marker to determine cell proliferation than mitotic index. FOXP3 expression was low and did not correlate to therapeutic response and survival time in GI lymphoma. In the specific analysis of lymphocytic T-cell lymphoma, there was no correlation between FOXP3/IL-17A and FOXP3/CD8, while low CD8 expression was correlated with increased survival in patients in complete remission.

Human T-Lymphotropic virus (HTLV) type I in vivo integration in oral keratinocytes

Although the infection of HTLV-1 to cell components of the mouth have been previously reported, there was not until this report, a detailed study to show the characteristics of such infection. From 14 Tropical Spastic Paraparesis/ HTLV-1-Associated Myelopathy (HAM/TSP) patients and 11 asymptomatic carrier individuals (AC) coming from HTLV-1 endemic areas of southwest Pacific of Colombia, infected oral mucosa cells were primary cultured during five days. These cell cultures were immunophenotyped by dual color fluorescence cell assortment using different lymphocyte CD markers and also were immunohistochemically processed using a polyclonal anti-keratin antibody. Five days old primary cultures were characterized as oral keratinocytes, whose phenotype was CD3- /CD4-/CD8-/CD19-/CD14-/CD45-/A575-keratin+. From DNA extracted of primary cultures LTR, pol, env and tax HTLV-1 proviral DNA regions were differentially amplified by PCR showing proviral integration. Using poly A+ RNA obtained of these primary cultures, we amplify by RT-PCR cDNA of tax and pol in 57.14% (8/14) HAM/TSP patients and 27.28% (3/11) AC. Tax and pol poly A+ RNA were expressed only in those sIgA positive subjects. Our results showed that proviral integration and viral gene expression in oral keratinocytes are associated with a HTLV-1 specific local mucosal immune response only in those HTLV-1 infected individuals with detectable levels of sIgA in their oral fluids. Altogether the results gave strong evidence that oral mucosa infection would be parte of the systemic spreading of HTLV-1 infection.

Fenotipagem das células Indoleamina 2,3 dioxigenase - IDO positivas em cultura de células de placenta bovina

A gestação é um estado fisiológico que exige adaptações imunológicas para que transcorra normalmente. Nesse período a mãe e o feto apresentam uma relação imunológica, ou seja, a interface materno-fetal. A enzima indoleamina-2,3 dioxigenase (IDO) desempenha um papel importante na tolerância materno fetal, por ser responsável pela metabolização do triptofano, impedindo por diversas vias a proliferação principalmente de linfócitos TCD8. Diversos tipos celulares estão presentes na interface materno fetal e vários deles podem expressar a IDO. Os leucócitos com perfil Th1 produzem uma citocina conhecida: o interferon que estimula a expressão da IDO em vários tipos celulares. Os linfócitos são divididos em subpopulações de acordo com sua função e fenótipo. Seus tipos incluem linfócitos T, Linfócitos B e as Células Natural Killer (uNK). Hormônios também atuam nesse processo a progesterona que exerce função determinante sobre a resposta imunológica materna podendo alterar o prognóstico gestacional e o estrógeno essencial para a tolerância materno fetal e manutenção da prenhez. Dessa maneira este trabalho tem por objetivo principal identificar os linfócitos presentes na placenta bovina em cultivo que expressam IDO (linfócitos T, linfócitos B e células NK), frente a estimulação por progesterona, estrógeno e interferon nas diversas fases gestacionais utilizando a citometria de fluxo. Segundo os resultados no período de 67,5 a 77, 5 dias com a adição de interferon a expressão da enzima IDO aumentou discretamente nos linfócitos TCD3, TCD4, e diferentemente dos linfócitos T CD8 apresentaram uma elevada expressão da enzima (4,48 ± 2,12 8,65± 4,91). No período de 92,5 a 172, 5 dias os linfócitos TCD4, TCD8 e TCD25 apresentaram uma diminuição significativa da IDO. No período final da gestação entre 195 a 222, 5 dias, os linfócitos TCD3, TCD4 e os BCD25 aumentaram a expressão da IDO quando submetidos ao interferon , no entanto, os linfócitos T CD8 e as células NK não apresentaram alterações significativas. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que todos os tipos celulares foram capazes de expressar a IDO mediante a suplementação com interferon , sendo que o linfócito T CD8 apresentou uma diferença bastante significativa quanto ao aumento da IDO, já o estrógeno elevou a expressão da IDO somente nos linfócitos B (CD25) e a progesterona diminuiu a expressão da enzima nos linfócitos T (CD3 e CD4) e nas células NK.

Pregnancy is a physiological state that requires immune adaptations in order to be successfully carried on. During this period the mother and the fetus establish an immuno tolerance status at the maternal fetal interface. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) plays an important role in maternal-fetal tolerance by metabolizing tryptophan, impairs by several pathways, mainly T CD8 cells proliferation. Several cell types present in the maternal fetal interface and several of them can express IDO. Leukocytes with Th1 produce a cytokine known: interferon that stimulates the expression of IDO in several cell types. Lymphocytes are divided into sub-populations according to their function and phenotype: T lymphocytes, B lymphocytes and natural killer cells (uNK). Hormones also involved in this process where progesterone exerts decisive role on maternal immune response that may change gestational outcomes and estrogen is essential for fetal maternal tolerance and maintenance of pregnancy. Therefore this work main objective was to identify lymphocytes present in the bovine placental cells culture that were sensitive to progesterone, estrogen and interferon stimulation regarding their IDO expression in various gestational stages using flow cytometry. According to the results in the gestation period from 67,5 to 77,5 days, with the addition of interferon . IDO expression was slightly increased in TCD3 lymphocytes, CD4, and differently from the other T cells CD8 displayed a higher expression of the enzyme (4.48 ± 2.12 to 8.65 ± 4.91). In the period from 92.5 to 172, 5 days CD4 lymphocytes, CD8 and TCD25 showed a significant decrease of IDO expression (p<0,05). At the final gestacional stages between 195-222 5 days, TCD3 lymphocytes, CD4 and BCD25 increased expression when subjected to interferon supplementation, however, CD8 T cells and NK cells showed no significant changes. Based on the results presented we can conclude that all cell types were able to express IDO by supplementation with interferon , and that T CD8 lymphocyte showed a highly significant increasing of IDO expression, whereas estrogen increased the expression of IDO only in B lymphocytes (CD25) and progesterone decreased the enzyme expression in T lymphocytes (CD3 and CD4) and in NK cells.

ADITIVO ANTI-MICOTOXINAS ADICIONADO À RAÇÃO MULTICONTAMINADA POR AFLATOXINA, FUMONISINA E ZEARALENONA PARA LEITÕES

Um experimento foi conduzido para avaliar a eficácia de um aditivo anti-micotoxinas para prevenir os efeitos tóxicos simultâneos de aflatoxinas, fumonisinas e zearalenona sobre o desempenho, incidência de diarreia, área de vulva, parâmetros séricos imunológicos e bioquímicos e peso relativo dos órgãos de leitões. Durante 21 dias de experimentação, quarenta e oito leitões recém-desmamados (24 machos castrados e 24 fêmeas), com peso vivo médio inicial de 6,88 ± 0,89 kg foram distribuídos em um delineamento em blocos casualizados completos, com três tratamentos e 8 repetições cada. A unidade experimental foi composta por dois leitões (macho/macho ou fêmea/fêmea). Os tratamentos fornecidos ad libitum foram: T1 - dieta basal (controle negativo sem adição de milho contaminado por micotoxinas); T2 - dieta basal multicontaminada por 107,5 ppb de aflatoxina (82 ppb de AFB1 + 1,5 ppb de AFB2 + 24 ppb de AFG1), 3.794 ppb de fumonisina (2.577 ppb of FB1 + 1.417 ppb de FB2) e 88,5 ppb de zearalenona; e T3 - T2 com um aditivo anti-micotoxinas (0,25% de Elitox®). O peso vivo e o consumo de ração dos leitões foram registrados aos 7, 14 e 21 dias de experimentação. Para avaliar a incidência de diarreia, as amostras fecais foram registradas diariamente pelo mesmo observador, atribuindo os escores 0 para fezes normais, 1 para fezes pastosas, 2 para fezes pastosas/líquidas e 3 para fezes aquosas. Além disso, o comprimento e largura da vulva foram mensurados no dia 21 de experimentação para calcular a área de vulva. Amostras de sangue via punção da veia jugular foram coletadas dos leitões mais pesados de cada baia nos dias 7, 14 e 21 de experimentação, para quantificação dos leucócitos circulantes por citometria de fluxo e análise bioquímica sérica. No final do experimento, 36 animais (24 fêmeas e 12 machos) foram abatidos para registro do peso do fígado, rim, pulmão e trato reprodutor feminino. Os dados paramétricos foram submetidos à análise de variância, enquanto os dados de incidência de diarreia foram analisados por qui-quadrado, ambos considerando 5% de nível de significância. A exposição aos tratamentos não afetou (P>0,05) o desempenho zootécnico dos leitões. No entanto, exceto no período de 14 a 21 dias (T1>T2>T3), a incidência de diarreia foi maior no grupo T2 em relação a T1 e T3 (P<0,05). A área de vulva foi afetada (P<0,05) aos 21 dias de consumo da dieta multicontaminada por micotoxinas, sendo T2>T1=T3. O número de células T citotóxicas (CD4-/CD8+) foi maior (P<0,05) em T2 e T3 comparados ao controle T1, aos 14 dias de experimentação. A concentração sérica de ureia foi reduzida nos animais expostos a T2, comparado ao T3 (P<0,05), mas igual ao controle T1 no dia 7 de exposição. Além disso, a concentração de proteínas totais foi maior (P<0,05) em T2 comparado ao controle T1 e igual a T3, no dia 21 de experimentação. O peso relativo do fígado, rim, pulmão e trato reprodutor feminino não foi influenciado (P>0,05) pelos tratamentos. O aditivo anti-micotoxinas Elitox® demonstrou efeito protetor reduzindo a incidência de diarréia e os efeitos estrogênicos em suínos recém-desmamados expostos à dietas multicontaminadas por aflatoxina, fumonisina e zearalenona.

An experiment was carried out to evaluate the protective efficacy of an anti-mycotoxins additive against the toxic combined effect of aflatoxin, fumonisin, and zearalenone on growth performance, diarrhea incidence, vulva size, concentration of circulating immune cells, serum biochemistry, and organs weights in piglets. Along 21 days of experimental period, a total of forty eight weanling piglets (24 castrated males and 24 females) with initial body weight average of 6.88 ± 0.89 kg were distributed in a randomized complete block design with three treatments with eight pens and two animals per treatment (male/male or female/female). The treatments provided ad libitum were T1 - basal diet (negative control without mycotoxins); T2 - multi-contaminated basal diet with 107.5 ppb of total aflatoxin (82 ppb of AFB1 + 1.5 ppb of AFB2 + 24 ppb of AFG1), 3,794 ppb of total fumonisin (2,577 ppb of FB1 + 1,417 ppb of FB2), and 88.5 ppb of zearalenone; and T3 - T2 plus an anti-mycotoxin additive (0.25% of Elitox®). Individual piglet's body weight and feed consumption for each pen were recorded weekly (7, 14, and 21 d) for growth performance evaluation. For analysis the diarrhea incidence, the animals were observed daily by the same observer for visual assessment of the stool consistency, being attributed the score 0 to normal feces, 1 to pasty feces, 2 to pasty/liquid feces, and 3 to watery stools. Moreover, vulva length and width were measured at 21 day to calculate the vulva area. Blood samples were collected from the heaviest piglets of each pen via vena duct to serum biochemical analysis and to quantify the circulating leucocytes by flow cytometry, at 7, 14, and 21 days of experiment. At the end of the experiment, 36 animals (24 female and 12 male piglets) were slaughtered to evaluate the relative weights of liver, kidney, lung, and whole female genital organ. The parametric data were analyzed by ANOVA and diarrhea frequency data were analyzed by chi-square, both considering 5% of level of significance. In general, there were no effects (P>0.05) of the treatments on piglet's growth performance. Higher diarrhea incidence was observed (P<0.05) in T2 group (T2>T1=T3) along all the experiment, except from 14 to 21d (T1>T2>T3). The contaminated diet (T2) showed (P<0.05) the larger vulva area (T2>T1=T3) on day 21. The number of cytotoxic T cell (CD4-/CD8+) was increased (P<0.05) likely due the multi-contaminated treatment (T2=T3>T1), on day 14 of experimental period. The urea serum concentration was decreased (P<0.05) in T2 group compared to T3, however both treatments were equal T1 on day 7 of exposition. Moreover, the total protein concentration was increased (P<0.05) in animals exposed to T2 compared to T1 on day 21. The relative weight of liver, kidney, lung, and whole female genital organs were not affected (P>0.05) by the treatments. Therefore, Elitox® is efficient to reduce diarrhea and estrogenic effects in piglets exposed to multi-contaminated diet with aflatoxin, fumonisin, and zearalenone.

Pressão intra-ocular, condições endoteliais e prostaglandina E2 no humor aquoso de cães com catarata senil madura ou hipermatura

Estudaram-se a pressão intraocular, a densidade e a hexagonalidade de células endoteliais, níveis de Prostaglandina E2 e sua correlação com catarata senil madura (n=8) ou hipermatura (n=8). Adicionalmente, foram utilizados valores de Prostaglandina E2 do humor aquoso de cães oftalmologicamente saudáveis (n=7). Para avaliação da pressão intraocular empregou-se tonometria digital de aplanação. A avaliação da densidade e da hexagonalidade das células endoteliais foi realizada por meio de microscopia especular de não contato. Sob anestesia geral, 0,2mL de humor aquoso foram colhidos por meio de paracentese da câmara anterior. As amostras de aquoso foram congeladas e armazenadas à -80 oC para mensuração da concentração de PGE2, por imunoensaio enzimático competitivo. Os valores foram comparados estatisticamente, empregando-se análise de variância de via única, e o teste de múltiplas comparações de Bonferroni. Teste t não pareado foi utilizado para se avaliar os dados obtidos por microscopia especular. Possíveis correlações entre os resultados foram comparadas aplicando-se o teste de Person. Adotou-se nível de significância de p<0,05. Em ambos os grupos observou-se diminuição significativa da pressão intraocular (PIO), entretanto não houve diferença entre eles (p = 0,90). As médias dos valores de densidade celular (CD) e de hexagonalidade (HEX) foram 2253,363 cell/mm² e 59,03% para GSM e 2058,325 cell/mm² e 63,75% para GSH, respectivamente. Entretanto não houve diferença significativa entre ambos, tanto para CD (p=0,201), quanto para HEX (p=0,61). Observou-se incremento nos valores de PGE2 nos grupos com catarata em relação aos cães oftalmologicamente saudáveis (p<0,001), entretanto, não houve diferença significativa entre os grupos com catarata...

Intraocular pressure, endothelial cell density and hexagonality, and aqueous humor prostaglandin E2 (PGE2) were studied and correlated in dogs with mature (n=8) and hypermature (n=8) senil cataratcs. In addition, aqueous humor PGE2 values of ophthalmic healthy dogs (n=7) were used. Non contact specular microscopy was used to evaluate density and hexagonality of endothelial cells. 0.2mL of aqueous humor was collected by means of anterior chamber paracentesis. Aqueous humor samples were frozen at -80 oC and concentration of PGE2 were quantified by means of competitive enzyme immunoassay. PGE2 values were statistically compared with one way analysis of variance and Bonferroni´s multi comparison test. Specular microscopy data were assessed by means of unparied T test. Person´s test was used in order to assess possible correlations among data. Significance was set at value of P < 0.05. Values of endothelial cell density and hexagonality did not change significantly between groups (P = 0.61). PGE2 values were significantly higher in dogs with cataract, when compared with ophthalmic healthy dogs (P < 0.001), however, this parameter did not change significantly between mature and hypermature groups (P > 0.05). Is it possible tosay that cataract patients in stages of maturity or hipermaturity develop uveitis...