First record of cannibalism in the giant mottled eel Anguilla marmorata (Actinopterygii: Anguilliformes) as revealed by DNA barcoding

Although the giant mottled eel, Anguilla marmorata Quoy & Gaimard, 1824, is widely distributed in the Indo-Pacific region, few ecological studies have been conducted on the species. We investigated the stomach contents of A. marmorata visually and used the DNA-barcode region of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) to confirm the species' identification. The stomach content analysis revealed that teleosts and crustaceans are the major prey items of A. marmorata. Interestingly, the stomach content of one of the specimens, which was 1029 mm in total length (TL), contained an eel-like fish identified as A. marmorata measuring 510 mm in TL. This study is the first to record cannibalism in the diet of A. marmorata. Although the diet of anguillid eels is generally selective for a single prey species, larger eels are more likely to adopt a diverse feeding habit that includes cannibalism in the tropical river ecosystems.(AU)

Babesia vogeli in dogs from Rio Branco, South-west Amazonia, Brazil / Babesia vogeli em cães de Rio Branco, sudoeste da Amazônia, Brasil

This is the first report of Babesia vogeli molecular detection in dogs from the state of Acre, northern Brazil. This study aimed to perform the molecular detection of Babesia vogeli in dogs in the municipality of Rio Branco, Acre. Blood samples were collected from 47 dogs presenting with clinical signs comparable to hemoparasitosis. These were dogs which were attended in veterinary clinics from Rio Branco municipality, Acre. Physical examinations, packed cell volume (PCV) determination, platelet number estimation, hemoparasite investigation in the blood (collected from the pinna and peripheral blood), and polymerase chain reaction (PCR) for piroplasm based on the 18S rRNA gene, were performed. One dog (1/47, 2.1%; CI 95%: 0.1-11.3%) tested positive to Babesia vogeli in the polymerase chain reaction (PCR) assay for piroplasms and the resulting sequence showed 100% identity with Babesia vogeli isolates deposited in GenBank®. Co-infection with Ehrlichia spp. was also observed by direct examination (via blood smear). The clinical and hematological alterations observed in the positive animal were anorexia, dehydration, white mucous membranes, anemia and thrombocytopenia.(AU)

Este é o primeiro relato de detecção molecular de Babesia vogeli em cães do estado do Acre, norte do Brasil. Este estudo teve como objetivo realizar a detecção molecular de B. vogeli em amostras de sangue de 47 cães com sinais clínicos compatíveis com hemoparasitoses no município de Rio Branco, Acre. Tratavam-se de animais atendidos em clínicas veterinárias do município, sendo realizados exames físicos, determinação do volume globular (VG), estimativa do número de plaquetas, investigação de hemoparasitos no sangue (coletado da ponta da orelha e sangue periférico). Além disso, amostras de sangue foram submetidas a extração de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação de fragmentos do gene 18S rRNA de piroplasmas. Um cão (1/47, 2,1%; IC 95%: 0,1-11,3%) apresentou resultado positivo para B. vogeli na PCR para piroplasmas e a sequência resultante mostrou 100% de identidade com os isolados de B. vogeli depositados no GenBank®. Co-infecção com Ehrlichia spp. também foi observado por exame direto (esfregaço de sangue). As alterações clínicas e hematológicas observadas no animal positivo foram anorexia, desidratação, mucosas pálidas, anemia e trombocitopenia.(AU)

Molecular phylogenetic analysis of Cysticercus ovis from Egypt based on MT-CO1 gene sequences / Análise filogenética molecular de Cysticercus ovis do Egito com base nas sequências do gene MT-CO1

Cysticercus ovis or sheep measles is the larval stage of Taenia ovis, which is the intestinal tapeworm of dogs. It is found in the cardiac and skeletal muscles of sheep and can be the cause of partial or total condemnation of carcasses at abattoirs. The aim of the current work was to determine the prevalence of C. ovis among sheep in Upper Egypt and to present the molecular and phylogenetic analysis of this using the amplified Mitochondrial Cytochrome Oxidase subunit 1 (MT-CO1) gene. A total of 1885 sheep slaughtered at local abattoirs of 4 different governorates of Upper Egypt (Asuit, Sohag, Qena and Aswan) were carefully examined for C. ovis. The overall prevalence of infection was 2.02%. The highest rate of infection was observed in adult animals over 4 years of age (44.73%). There was no significant effect of animal sex on infection rates. The phylogenic analysis of C. ovis Egyptian isolates showed very close similarity to the New Zealand isolate (AB731675). This is the first report showing the genetic analysis of C. ovis in Egypt, which provides a very powerful tool for taxonomy and definitive diagnosis of C. ovis, which could be helpful for preventive and control programs.(AU)

Cysticercus ovis sheep measles é o estágio larval da Taenia ovis, encontrada nos músculos de carneiros, causado pela ingestão de ovos de Taenia ovis, parasita de cães. O objetivo do presente trabalho foi determinar a prevalência de C. ovis entre ovinos no Alto Egito e apresentar as análises moleculares e filogenéticas, utilizando o gene da subunidade mitocondrial citocromo-oxidase amplificada 1 (MT-CO1). Um total de 1885 ovinos abatidos em matadouros locais de 4 províncias diferentes do Alto Egito (Asuit, Sohag, Qena e Aswan) foram cuidadosamente examinados para C. ovis. A prevalência geral de infecção foi de 2,02%. A maior taxa de infecção foi observada em animais adultos com mais de 4 anos de idade (44,73%). Não houve efeito significativo do sexo nas taxas de infecção. A análise filogenética de isolados egípcios de C. ovis mostrou uma similaridade muito próxima ao isolado da Nova Zelândia (AB731675). Este é o primeiro relato mostrando a análise genética de C. ovis no Egito, fornecendo uma ferramenta para taxonomia e diagnóstico definitivo de C. ovis, podendo ser útil para programas preventivo e de controle.(AU)

QUANTITATIVE GENETICS AND GENOMIC TOOLS APPLIED TO AQUACULTURE BREEDING

A procura por animais mais uniformes frente as adversidades ambientais e a aplicação de ferramentas genômicas são exemplos de novas estratégias para tornar o melhoramento genético em espécies aquícolas mais eficiente. No intuito de avaliar a efetividade destas estratégias, os objetivos do presente trabalho foram: i) estimar os componentes genéticos da uniformidade de peso a despesca (PD) e investigar se o PD e sua uniformidade (PDu) podem afetar a sobrevivência (SOB) em camarões; ii) estimar o desequilíbrio de ligação (LD) em uma população de camarões cultivados usando um novo painel de 50k polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) e iii) avaliar a viabilidade da imputação ao nível de sequência em tilápia do Nilo e os impactos do tamanho e origem da população de referência na acurácia. Para i), foram utilizados 149.919 registros de PD e 164.023 de SOB de uma larvicultura de camarões mexicana. Os dados foram agrupados em três conjuntos de acordo com o tipo de produção: viveiros escavados com baixa densidade (S1), tanques de concreto com recirculação em alta densidade (S2) e juntando ambos conjuntos de dados (S1+S2). Um modelo linear generalizado hierárquico duplo foi aplicado para estimar os componentes de (co)variância de PD-PDu e um modelo bivariado linear misto foi utilizado para estimar os componentes referentes a PD-SOB. As correlações genéticas (rg) para estas características foram estimadas, além da correlação entre valores genéticos (VG) para PDu-SOB. Para ii), 96 camarões (40 machos e 56 fêmeas) reprodutores originários de uma larvicultura do Equador foram genotipados utilizando um novo painel de 50k SNPs. Posteriormente, o LD foi estimado usando três controles de qualidade distintos com diferentes filtros de frequência de alelo menor: 0,1 (CQ1); 0,05 (CQ2) e 0,01 (CQ3). Para iii), amostras de DNA de 326 tilápias provenientes de três populações de origens distintas (PA, PB e PC) foram extraídas e sequenciadas. Após o controle de qualidade dos dados de sequência foram obtidos 4,6 milhões de SNPs em comum para todas as populações. A imputação foi feita em quatro cenários distintos: dois tamanhos (10 ou 90% dos animais de cada população) e duas origens de referência (apenas duas populações diferentes ou todas as três populações). Os animais de validação tiveram seus genótipos ocultados mantendo somente 50k SNPs para a imputação a nível de sequência. Foi utilizado o software FImpute3 e a acurácia de imputação foi avaliada através da correlação entre o genótipo imputado e observado (r²). No estudo de uniformidade, uma proporção significativa de variância genética foi detectada na variância residual de PD, revelando que existe a possibilidade de selecionar para uniformidade desta característica em camarões (coeficiente de variação genética variando de 17 a 35%). As rg entre PD e SOB foram diferentes em sinal e magnitude com base no sistema de produção, sendo iguais a 0,36, -0,59 e -0,02 para S1, S2 e S1+S2, respectivamente. Os coeficientes de correlação entre o VG de PDu e SOB foram significativos apenas para S1 (-0,32), sugerindo que a seleção para famílias mais uniformes também pode aumentar as taxas de sobrevivência em um ambiente de menor densidade. Para os dados genômicos de camarões, foram obtidos 34.425, 39.091 e 42.789 SNPs após CQ1, CQ2 e CQ3, respectivamente, exibindo alto grau de polimorfismo e validando a aplicação deste painel de SNPs para esta população de camarões cultivados. O LD decaiu rapidamente nos primeiros 30 KB de distância de 0,2 para 0,07 e depois diminuiu para 0,02 para distancias mais longas (>80 KB). Esses resultados sugerem v incorporação recente de animais de diferentes populações ou linhagens neste grupo de reprodutores e que a seleção genômica e estudos de associação amplo do genoma são viáveis em camarões usando este painel de SNP como ferramenta. Para a imputação, no geral, o r² por animal mostrou resultados intermediários variando de 0,37 a 0,56 para PA e 0,43 a 0,58 para PB e Pc. Entretanto, os resultados mostraram que foi possível imputar de 50k a aproximadamente 680k com alta acurácia usando dados de sequência de tilápia. Foi observado um aumento de 31,5% para PA e 24,6% para PB e PC no r², quando 90% dos animais da mesma população foram usados como referência em comparação a 10%. Não houve diferenças significativas para r² entre os cenários que usaram 90% dos animais da mesma população e usaram animais das três populações como referência, mostrando que a estratégia de usar informações de outra população para aumentar a população de referência teve pouco efeito na acurácia de imputação.

The search for more uniform animals in the face of environmental adversities and the application of genomic tools are examples of new strategies to make genetic improvement in aquaculture species more efficient. In order to evaluate the effectivity of these strategies, the aims of the present study were: i) to estimate the genetic components of uniformity of harvest weight (HW) and investigate whether the HW and its uniformity (HWv) may affect the survival (SUR) in shrimp; ii) to estimate linkage disequilibrium (LD) in a population of farmed shrimp using a new 50k single-nucleotide polymorphisms (SNPs) panel and; iii) to assess the feasibility of genotype imputation to sequence level in Nile tilapia and the impacts of size and origin of population reference on accuracy of imputation. For i), 149,919 records of HW and 164,023 of SUR were obtained from a Mexican shrimp hatchery. The data were grouped into three sets according to the system of production: excavated ponds with low density (S1), concrete recirculation tanks with high density (S2) and joining both sets of data (S1+S2). A double hierarchical generalized linear model was applied to estimate the (co)variance components of HW-HWv and a bivariate mixed linear model was used to estimate the components referring to HW-SUR. The genetic correlations (rg) for these traits were estimated, in addition to the correlation between the estimated breeding values (EBV) for HWv-SUR. For ii), 96 broodstock shrimp (40 males and 56 females) from a commercial hatchery from Ecuador were genotyped using a new 50k SNPs panel. Then, the LD was estimated using three distinct quality controls with different minor allele frequency filters: 0.1 (QC1); 0.05 (QC2) and 0.01 (QC3). For iii), DNA samples from 326 tilapia from three populations (PA, PB and PC) were extracted and sequenced. After quality control of sequence data, 4.6 million of SNPs were obtained in common for all populations. The imputation was performed in four different scenarios: two sizes (10 or 90% of animals from each population) and two origins of population reference (only two different populations or all three populations). The validation animals had their genotypes masked keeping only 50k SNPs for imputation to the sequence level. The FImpute3 software was used and the imputation accuracy was evaluated through the correlation between the imputed and observed genotypes (r²). In the uniformity study, a significant proportion of genetic variance was detected in the residual variance of HW, revealing that there is possibility to select for uniformity of this trait in shrimp (genetic coefficient of variation ranging between 17 and 35%). The genetic correlations between HW and SUR were different in sign and magnitude based on the production system, being equal to 0.36, -0.59 and -0.02 for S1, S2 and S1+S2, respectively. The correlation coefficients between the EBV of HWv and SUR were significant only for S1 (-0.32), suggesting that selection for more uniform families may also increase survival rates in a lower density environment. For shrimp genomic data, 34,425, 39,091 and 42,789 SNPs were obtained after QC1, QC2 and QC3, respectively, showing high polymorphism and validating the application of this panel of SNPs to this farmed shrimp population. The LD declined rapidly in the first 30 KB of distance from 0.2 to 0.07 and then decreased to 0.02 for longer distances (>80 KB). These results suggest recent incorporation of animals from different populations or strains into this breeding population and that genomic selection and genome-wide association studies are feasible in shrimp using this SNP panel as tool. For the imputation using tilapia sequence data, in general, the r² per animal showed intermediate results ranging from 0.37 to 0.56 for PA and 0.43 to 0.58 for PB and PC. vii However, the results showed that it was possible to impute from 50k to approximately 680k with high accuracy. An increase in r² of 31.5% for PA and 24.6% for PB and PC was observed, when 90% of animals from the same population were used as reference. There were no significant differences for r² between the scenarios that used 90% of animals from the same population and used animals from the three populations as a reference, showing that the strategy of using information from another population to increase the reference population had minor effect on the accuracy of imputation.

A Proteína ARFGAP com dois domínios plaquistrinos 2 (ADAP2) no sistema imune inato de galinhas

Aves e mamíferos possuem algumas semelhanças em seu sistema imune inato, porém também apresentam diferenças pela sua divergência evolutiva. Alguns componentes da via do interferon (IFN) estão ausentes em células de galinha, como o gene RIG-I, IRF 3 e IRF 9. Outros componentes são únicos no sistema imune inato das galinhas, como o gene do receptor do tipo Toll 15 (TLR15). A via do IFN, que possui os genes estimulados por IFN (ISGs), possui um importante papel contra os vírus, estabelecendo o estado antiviral no hospedeiro. No entanto, os mecanismos moleculares dessa indução em aves são pouco compreendidos e podem ser evolutivamente distintos dos mamíferos. Em mamíferos, uma das proteínas responsivas ao vírus e reguladas por IFN é codificada pelo gene Arf-GAP com dois domínios plaquistrinos 2 (ADAP2, também conhecido como CENTA2 e Centaurina-). A caracterização molecular e biológica da proteína ADAP2 de galinha (chADAP2) foi realizada neste estudo. Análises de bioinformática foram realizadas para identificar características da sequência de aminoácidos desta proteína e compará-las com as sequências obtidas de mamíferos. A expressão do gene chADAP2 foi calculada após a infecção em células de galinha (DF-1) com o vírus da influenza aviária (AIV) de dois subtipos (H2N1 e H5N1) em diferentes tempos. A localização da proteína chADAP2 e sua interação com a proteína MAVS de galinha (chMAVS) e grânulos de estresse (G3BP1) em células de galinhas foi acessada pela microscopia confocal e pela coimunoprecipitação. A atividade antiviral foi avaliada após a transfecção de plasmídeos expressando as proteínas de chADAP2 em células infectadas com o subtipo H9N2 do AIV. Nossos resultados mostraram que as sequências de aminoácidos da proteína ADAP2 deram origem a dois clusters (mamíferos e aves) na análise filogenética. Após a infecção com os isolados AIV houve um aumento de expressão do gene chADAP2, entre o período de 0 a 48 horas em células aviárias. A co-localização entre as proteínas chADAP2, MAVS e grânulos de estresse (G3BP1) na região citoplasmática celular foi confirmada pela microscopia confocal. A interação entre chADAP2 e chMAVS foi também comprovada pela co-imunoprecipitação. Finalmente, a atividade antiviral foi confirmada pela diminuição de infecção de AIV em células transfectadas com o plasmídeo expressando a proteína chADAP2 em células de galinha. O presente estudo identificou que a proteína chADAP2 possui um papel semelhante ao descrito pela ADAP2 em células de mamíferos, apesar da distância genética das sequências de nucleotídeos e organização dos domínios proteicos entre eles. Nossos dados confirmam a interação entre os grânulos de estresse e as proteínas da resposta antiviral, com as proteínas chADAP2 e chMAVS envolvidas na cascata para expressão de IFN tipo I. Este é o primeiro relato sobre o papel chADAP2 em células aviárias. Este novo conhecimento sobre a resposta imune inata permitirá o desenvolvimento de ferramentas para o controle de infecções virais em aves.

Avian and mammals have some similarities in their innate immune system, but they also show differences due to their evolutionary divergence. A few components of the interferon (IFN) pathway are absent in chicken cells, such as the RIG-I gene, IRF 3, and IRF 9. Other components are unique in their innate immune system, like the tolllike receptor 15 (TLR15) gene. The IFN pathway, which has the IFN-stimulated genes (ISGs), plays a crucial role against viruses by establishing an antiviral state in the host. However, molecular mechanisms of this induction in avian are poorly understood and can be evolutionarily distinct from mammalian. In mammalian, one of the virusresponsive and IFN-regulated protein is encoded by Arf-GAP with dual PH Domain- Containing Protein 2 gene (ADAP2, also known as CENTA2 and Centaurin-). Molecular and biological characterization of chicken ADAP2 protein (chADAP2) was performed in this study. Bioinformatics analyses were performed to identify molecular features in the amino acid sequence and compare them to sequences obtained from mammals. chADAP2 gene expression was calculated after infection in chicken cells (DF-1) with avian influenza viruses (AIV) from two subtypes (H2N1 and H5N1) at different time points. The co-localization of chADAP2 protein with the chicken MAVS (chMAVS) and stress granules (G3BP1) in chicken cells was evaluated by confocal microscopy and co-immunoprecipitation. The antiviral activity was evaluated after the transfection of plasmids expressing chADAP2 protein in cells infected with AIV from H9N2 subtype. Our results showed that the ADAP2 amino acid sequences had two clusters (mammals and avian) by phylogenetic analysis. After infection with AIV isolates, an upregulation of the ADAP2 gene was detected from 0 to 48 hours in chicken cells. Confocal microscopy assays confirmed the co-localization of chADAP2, MAVS, and G3BP1 proteins in the cells' cytoplasmic region. The interaction between chADAP2 and chMAVS has been also proven by co-immunoprecipitation. Finally, the antiviral activity of the chADAP2 was confirmed by a decrease in AIV expression in cells transfected with the plasmid expressing the chADAP2 protein in chicken cells. The present study identified that chADAP2 has a similar role, as described in mammals' cells, despite their high genetic distances of nucleotide sequences and protein domains organization. Our results confirm the interaction among stress granules and antiviral response proteins, such as ADAP2 and chMAVS proteins involved in the cascade for IFN type I. This is the first report of the chADAP2 role in avian cells. This new knowledge about the innate immune response will allow the development of tools for controlling virus infections in birds.

ANÁLISE FILOGENÉTICA DE AMOSTRAS DE VÍRUS DA RAIVA DE HERBÍVOROS NO RIO GRANDE DO SUL (2012-2017) E VALIDAÇÃO DE UM TESTE DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA DIAGNÓSTICO

O vírus da raiva (Rabies lyssavirus, RABV) é o agente da raiva, uma doença zoonótica de distribuição mundial, caracterizada por sinais neurológicos graves, de curso geralmente fatal, que afeta mamíferos domésticos e selvagens. O RABV pertence à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. O genoma do RABV consiste de uma molécula de RNA de fita simples de sentido negativo, com aproximadamente 12 quilobases (kb) e contém 5 genes, entre eles o gene da nucleoproteína (N) que é altamente conservado e tem sido amplamente utilizado como alvo de estudos filogenéticos, assim como no desenvolvimento de testes de diagnóstico. No primeiro estudo que compõe esta Tese, descreve-se uma análise filogenética de 145 amostras de RABV oriundas de herbívoros no Rio Grande do Sul (RS), entre 2012 e 2017, baseada na análise da sequência parcial do gene da proteína N. Estas sequências exibiram uma alta identidade de nucleotídeos (nt) e similaridade de aminoácidos (aa) entre si, bem como com sequências de RABV identificadas em bovinos e de morcegos hematófagos. Os vírus segregaram em dois clusters distintos. O cluster 1 agrupou sequências de RABV abrangendo todo o período estudado, enquanto o cluster 2 agrupou um número menor de vírus detectados em 2013, 2014, 2015 e 2017. Em alguns casos, vírus obtidos de uma mesma região em um curto período de tempo agruparam em clusters ou sub-clusters distintos, indicando a co-circulação de vírus de diferentes linhagens. A separação em sub-clusters também foi observada em sequências virais obtidas de uma mesma região em diferentes momentos, indicando o envolvimento de mais de um vírus. O segundo estudo reporta o desenvolvimento e validação de um ensaio em tempo real, baseado em transcrição reversa seguida de reação da polimerase em cadeia (RT-PCR em tempo real; RT-qPCR) para o diagnóstico da raiva em bovinos. Os primers foram desenhados visando a região altamente conservada do gene da proteína N a partir de sequências de RABV de bovinos do RS obtidas do GenBank. O limite de detecção correspondeu a 12,99 cópias de DNA e a repetibilidade intra- e inter-ensaio foi adequada. Não foram detectadas amplificações inespecíficas com outros patógenos de síndromes neurológicas semelhantes à raiva em bovinos no RS, nem contaminação cruzada. Amostras de cérebro bovino de 21 casos suspeitos de raiva foram testadas com o novo ensaio e com o teste padrão-ouro de imunofluorescência direta (FA). A sensibilidade e a especificidade da RT-qPCR foram determinadas. A sensibilidade e a especificidade diagnóstica foram ambas 100%. Em resumo, os estudos apresentados na presente Tese revelaram uma alta conservação do gene da proteína N e a circulação de duas linhagens e sub-linhagens diferentes de RABV no RS, confirmando a adequação do gene N no estudo das relações genéticas entre amostras de RABV. Além disso, a RT-qPCR se apresentou sensível e específica nos critérios analítico e diagnóstico. Em função disso, o ensaio aqui proposto se mostrou útil para diagnóstico da raiva em bovinos, apresentando rapidez, sensibilidade e especificidade adequadas.

Rabies virus (Rabies lyssavirus, RABV) is the agent of rabies, a zoonotic disease distributed worldwide, characterized by severe neurological signs of course generally fatal in domestic and wild mammals. The RABV belongs to the order Mononegavirales, family Rhabdoviridae and genus Lyssavirus. The RABV genome consists of a single-stranded, negative-sense RNA molecule of approximately 12 kilobases (kb) containing 5 genes, including the highly conserved nucleoprotein (N) gene. The N gene has been widely used as a target in phylogenetic studies and for development of molecular tests for diagnosis. In a first study, we describe a phylogenetic analysis of 145 RABV recovered from herbivorous from Rio Grande do Sul state (RS) between 2012 and 2017, based on partial sequence analysis of the N gene. These sequences displayed a high sequence nucleotide (nt) identity and amino acid (aa) similarity to each other and with bovine and hematophagous bat RABV sequences. The viruses segregated into two distinct clusters. Cluster 1 comprised RABV sequences covering the whole studied period, whereas cluster 2 grouped a lower number of viruses from 2013, 2014, 2015 and 2017. In some cases, viruses obtained from the same region within a short period of time grouped to distinct clusters or sub-clusters, indicating the co-circulation of distinct virus lineages in these outbreaks. The segregation into sub-clusters was also observed for viral sequences obtained from the same region at different times, indicating the involvement of distinct viruses. The second study reports the development and validation of a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) for diagnostics of rabies in cattle. The primers were designed targeting the highly conserved N gene of RABV from samples obtained from cattle in RS, obtained from GenBank. The detection limit corresponded to 12.99 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate. Non-specific amplification with a range of other pathogens causing neurological syndromes similar to rabies in cattle in RS, as well as cross-contamination were not detected. Bovine brain samples from 21 suspected cases of rabies were tested with the new RABV RT-qPCR assay and with a gold-standard fluorescent antibody test (FAT) and the sensitivity and specificity of the RT-qPCR assay were determined. Both the sensitivity and specificity of the RT-qPCR were 100%. In summary, the studies presented in this Thesis revealed a high conservation of N protein gene and the circulation of two lineages and different sublineages of RABV in the RS, confirming the suitability of N gene to study the genetic relationships among RABV isolates. Furthermore, the RABV RT-qPCR assay provides is analytically and diagnostically sensitive and specific. Thus, this assay may be very useful for a rapid, sensitive and specific diagnosis of rabies in cattle.

Detecção e identificação genética de herpesvírus equídeo em equinos n aregião sul do Rio Grande do Sul, Brasil

Os herpesvírus de equídeos são endêmicos e reconhecidos em nível mundial pelos 9 prejuízos econômicos nos rebanhos acometidos. Dentre os principais herpesvírus que 10 afetam equinos, se destacam os alfaherpesvírus equídeo tipos 1 e 4 (EHV-1; EHV-4), 11 geralmente associados a enfermidade respiratória, reprodutiva ou neurológica e os 12 gamaherpesvírus equídeo tipos 2 e 5 (EHV-2; EHV-5), que apesar de associações com 13 enfermidade respiratória, o real impacto das infecções nos rebanhos ainda continua sob 14 investigação. Estudos sorológicos realizados no Brasil indicam uma ampla 15 disseminação do EHV-1/EHV-4 na população equina. Porém, estudos de 16 caracterização genética dos vírus circulantes envolvem, essencialmente, o EHV-1. Por 17 outro lado, com exceção de um trabalho recente, onde o EHV-2 e EHV-5 foram 18 identificados em animais assintomáticos na região sul do país, investigações 19 demonstrando a identificação e circulação dos outros tipos de herpesvírus de equinos 20 são escassas em nível nacional. Neste sentido, o presente estudo demonstra a 21 identificação e caracterização genética do EHV-1, EHV-2, EHV-4 e EHV-5 em amostras 22 clínicas de equinos distribuídos em 7 diferentes propriedades (A - F) da região sul do 23 Rio Grande do Sul. De um total de 179 amostras de sangue/leucócitos e 110 amostras 24 de swabs nasais (coletadas de 179 animais) testadas pela PCR, o EHV-1 foi detectado 25 em 11 amostras clínicas (leucócitos, n=8; swabs nasais, n=3) enquanto que o EHV-4 26 foi detectado em 13 amostras (leucócitos, n=4; swabs nasais, n=9). Adicionalmente, o 27 EHV-2 foi detectado em 6 amostras clínicas (leucócitos, n=1; swabs nasais, n=5) e o 28 EHV-5 foi detectado em 13 amostras de sangue. A presença de infecções mistas por 2 29 vírus foi observada em 6 animais enquanto que 2 animais apresentaram infecções por 30 3 tipos diferentes de herpesvirus. O sequenciamento dos amplicons revelou um 31 percentual de identidade de 97,8-100% com cepas padrão dos herpesvirus de equinos 32 depositados no GenBank. O EHV-1 e EHV-4 foram diagnosticados em 2 propriedades 33 com cenários distintos, seja como sugestivo de infecção ativa e excreção viral no 34 momento da coleta das amostras ou indicativos de infecções latentes em uma parcela 35 dos animais avaliados. O EHV-2 e EHV-5 foram detectados exclusivamente em uma 36 das propriedades estudadas. Os achados sugerem replicação ativa e excreção do EHV-37 2 enquanto que infecções latentes pelo EHV-5 possam ter sido estabelecidas após 38 contato e transmissão a partir de um equino, na mesma propriedade, com diagnóstico 39 de EMPF. Em resumo, este trabalho demonstra a detecção e identificação genética de 40 quatro tipos de herpesvírus de equinos em propriedades da região sul do RS e 41 representam uma contribuição para o diagnóstico e conhecimento da situação 42 epidemiológica destes agentes em nível regional e nacional.

Equid herpesvirus are widespread in the horse population and represent a major threat 9 to the horse industry worldwide. Both EHV-1 and EHV-4 produce well-documented 10 respiratory, reproductive and neurological disease in horses, whereas the real impact of 11 EHV-2 and EHV-5 is less clearly defined. In Brazil, serological investigations have 12 indicated the circulation of EHV-1/EHV-4 in the country. However, genetic 13 characterization of the circulating viruses are mainly focused on the EHV-1. Except for 14 the recent demonstration of EHV-2 and EHV-5 in asymptomatic horses, studies aimed 15 at identifying other equid herpesviruses are scarce. This study describes the detection 16 and genetic characterization of EHV-1, EHV-2, EHV-4 and EHV-5 in clinical samples 17 from horses located at seven farms (A to F) from southern Brazil. Virus-specific PCRs 18 were used to detect EHV-1, -2, -4 and -5. From the total of 179 buffy coat samples (BC) 19 and 110 nasal swabs (NS), collected from 179 animals, EHV-1 was detected in 11 20 clinical samples (BC, n=8 and NS, n=3) whereas EHV-4 was detected in 13 samples 21 (BC, n=4 and NS, n=9). In addition, EHV-2 was detected in 6 clinical samples (BC, n=1 22 and NS, n=5) whereas EHV-5 specific DNA was detected in 13 buffy coat samples. 23 Additionally, mixed infections by two or three viruses were recorded in 6 and 2 animals, 24 respectively. Nucleotide sequence identity among each other ranged from 97.8% to 25 100% when compared to reference strains deposited in GenBank. EHV-1 and EHV-4 26 were found in two farms and may represent distinct scenarios, either as indicative of 27 active infection and viral shedding during sample collection or suggestive of latent 28 infections in some horses. On the other side, EHV-2 and EHV-5 were exclusively 29 detected in a single farm. Results have suggested active viral replication and EHV-2 30 shedding from the infected animals. Latent infection by EHV-5 in the PCR positive 31 horses might have been established after a close contact in the same farm with a horse 32 diagnosed with EMPF post mortem. In summary, results from this investigation 33 demonstrate the detection and genetic identification of four types of equid herpesvirus 34 in horses from southern Brazil and, may represent a contribution to diagnosis and better 35 understanding of epidemiological situation of these viral agents in the region. 36 37 38Key words: , ,

Isolamento e caracterização de Fibroblastos Associados ao Câncer provenientes de Mastocitomas caninos e sua influência sobre a malignidade de células neoplásicas: uma abordagem molecular, patológica e in vitro

Os mastocitomas cutâneos (MCTs) são neoplasias comuns em cães e são considerados potencialmente malignos. Diversas pesquisas tentaram identificar biomarcadores para melhor predizer o comportamento biológico deste tumor. Além disso, estudos envolvendo o cultivo primário de MCTs caninos podem ser uma ferramenta valiosa para a análise das propriedades funcionais das células. O objetivo deste estudo foi identificar vias moleculares ligadas a características de malignidade histopatológicas, menor tempo de sobrevida e pior prognóstico associados ao MCT. Além disso, objetivamos investigar o comportamento de mastócitos in vitro obtidos a partir de MCTs de diferentes graus histopatológicos e determinar o tipo de interação com os fibroblastos estromais. Realizamos análises de expressão gênica em MCTs únicos obtidos de 15 cães e identificamos dois subtipos distintos de tumor alto risco e baixo risco - associados a diferenças nos graus histológicos, tempos de sobrevida, índices Ki67 e ocorrência de morte devido a doença. Análises comparativas de perfis de sequência de RNA revelaram 71 genes diferencialmente expressos entre MCTs de alto e baixo risco. Ademais, examinamos redes de co-expressão gênica para explorar as funções biológicas dos genes identificados. A construção da rede revelou 63 módulos gênicos, dos quais 4 foram significativamente associados ao grupo mais agressivo. Dois dos módulos gênicos positivamente correlacionados com MCTs de alto risco também foram associados à proliferação celular e à matriz extracelular. No topo do módulo de matriz extracelular, foram identificados genes com funções diretamente relacionadas àqueles de fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Análises imuno-histoquímicas também revelaram um maior número de CAFs em MCTs de alto risco. Os experimentos de cultivo foram feitos imediatamente após a ressecção cirúrgica e as células foram cultivadas em DMEM-F12 completo por 4 a 7 passagens. Os mastócitos foram evidenciados por coloração com Romanowsky e azul de toluidina com perda progressiva de seus grânulos em cultivo. A confirmação de fibroblastos como células aderentes foi feita por qRT-PCR para o gene da Proteína Específica de Fibroblastos 1 (FSP1). A caracterização dos fibroblastos cultivados como miofibroblastos foi realizada por imunofluorescência para -actina de músculo liso (SMA) e vimentina. A percentagem de células viáveis no sobrenadante foi determinada a cada passagem. Durante as 4-10 semanas de cultivo sem adição de fatores de crescimento ou citocinas, a população de mastócitos vivos diminuiu progressivamente e os fibroblastos e miofibroblastos continuam a crescer até a senescência. Amostras de MCTs de alto grau foram viáveis por períodos mais curtos (P =0.0442) e menor número de passagens (P <0.0001). Examinamos também os efeitos a curto prazo dos fibroblastos estromais na viabilidade dos mastócitos neoplásicos em diferentes condições de culturas. O contato célula-célula foi a melhor condição em que maior proporção de mastócitos neoplásicos permaneceu viável em comparação com todas as outras condições, isto é, utilizando-se de inserto e no cultivo de mastócitos isolados (P<0.05). Verificamos também que os mastócitos neoplásicos não ficam viáveis por mais de 4 dias na ausência de fibroblastos ou de seus fatores solúveis. Estes resultados indicam uma importante interação entre os mastócitos e os fibroblastos, que podem ocorrer no microambiente tumoral.

Mast cell tumours (MCTs) are common neoplasms in dogs and are considered potentially malignant. Several researches have attempted to identify biomarkers to better predict biological behavior for this tumor. In addition, studies with primary culture of canine MCTs coud be a valuable tool for the analysis of the cells functional properties. The objetive of this study was to identify molecular pathways connected to histopathological malignancies, shorter survival time and poor prognoses associated with MCTs. Moreover, we aimed to investigate the in vitro behavior of mast cells obtained from canine cutaneous MCTs of different histopathological grades and the type of interaction with the stromal fibroblasts. We performed genome-wide gene expression analyses on tissues obtained from 15 dogs with single MCTs, and identified two distinct tumour subtypes - high-risk and low-risk - associated with differences in histological grades, survival times, Ki67 indices, and occurrence of death due the disease. Comparative analyses of RNA sequence profiles revealed 71 genes that were differentially expressed between high and low-risk MCTs. In addition to these analyses, we examined gene co-expression networks to explore the biological functions of the identified genes. The network construction revealed 63 gene modules, 4 of which were significantly associated with the more aggressive tumour group. Two of the gene modules positively correlated with high-risk MCTs were also associated with cell proliferation and extracellular matrix-related terms. At the top of the extracellular matrix module category, genes with functions directly related to those of cancer-associated fibroblasts (CAFs) were identified. Immunohistochemical analyses also revealed a greater number of CAFs in high-risk MCTs. Culture experiments were made immediately after surgical resection and cells were cultured in complete DMEM-F12 for 4 to 7 passages. Mast cells was stained with Romanowsky and toluidine blue and showed progressive loss of their granules in culture. The presence of fibroblasts as adherent cells was confirmed by use of qRT-PCR for Fibroblast-specific Protein 1 (FSP1) gene. The characterization of cultured fibroblasts as myofibroblasts was performed by immunofluorescence for -smooth muscle-actin (SMA) and vimentin. The percentage of viable cells in the supernatant was determined in each passage. During 410 weeks of culture without any addition of growth factors or cytokines, living mast cell population decreased progressively and adherent fibroblasts and myofibroblasts continue to grow until senescence. High-grade MCTs samples were viable for shorter periods in culture (P=0.0442) and lower number of passages (P<0.0001). We also have examined the short-term effects of stroma fibroblasts on neoplastic mast cells in different cultures conditions. The cell-cell contact co-culture was the best condition in which canine neoplastic mast cells remained viable in highest proportion during the experiment compared to all other conditions, i.e. with the transwell condition and mast cells isolated cultures (P<0.05). We also found that isolated neoplastic mast cells are not viable for more than 4 days in the absence of fibroblasts or their soluble factors. These results indicate an important interaction between mast cells and fibroblasts, which may also occur in the tumor microenvirnomental setting.

Phylogenetic grouping and pathotypic comparison of urine and fecal Escherichia coli isolates from children with urinary tract infection

The aim of this study was to investigate the phylogenetic background and to assess hlyD (involved in the secretion of haemolysin A) and intll (encoding a class 1 integrase) in Escherichia coli isolates derived from urinary and fecal specimens. A total of 200 E. coli isolates was collected from patients presenting with urinary tract infection (UTI) during September 2009 to September 2010 and screened for hlyD and intll genes by polymerase chain reaction (PCR). Phylogenetic analysis showed that E. coli is composed of four main phylogenetic groups (A, B1, B2 and D) and that uropathogenic E. coli (UPEC) isolates mainly belong to groups B2 (54%) and D (34%) whereas group A (44%) and D (26%) are predominant among commensal E. coli isolates. In this study, hlyD was present in 26% of UPEC and 2% of commensal E. coli isolates. However, hemolytic activity was detected for 42% of UPEC and 6% of commensal E. coli isolates (p < 0.05). intll gene was more frequently expressed in UPEC (24%) in comparison with commensal E. coli isolates (12%). Resistance to aztreonam, co-trimoxazole and cefpodoxime were frequently found among UPEC isolates whereas commensal E. coli isolates were commonly resistant to co-trimoxazole, nalidixic acid and cefotaxime. Concluding, a considerable difference between UPEC and commensal E. coli isolates was observed regarding their phylogenetic groups, presence of class 1 integron and hlyD gene, hemolysin activity and resistance pattern. The detection of class 1 integrons and hlyD gene was higher among UPEC compared with commensal E. coli isolates. These findings may contribute for a better understanding of the factors involved in the pathogenesis of UPEC.

Sequenciamento, anotação e análise do genoma de Mycobacterium pinnipedii e genômica comparativa de espécies do Complexo Mycobacterium tuberculosis

O Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) causa tuberculose em humanos e animais e é composto de 12 espécies bacterianas com diferentes tropismos por hospedeiros e perfis de virulência. O MTBC se originou na África, e evoluiu clonalmente por meio de mutações pontuais e deleções genéticas de até 12Kb. Apesar das variações fenotípicas, sequências homólogas de genomas do MTBC são 99,95% idênticas e transferências horizontais de genes são consideradas ausentes. Estudos compreensivos de genômica comparativa incluindo todas as espécies de MTBC a fim de identificar os determinantes genéticos dessas diferenças fenotípicas não estão disponíveis. Paralelamente, a recente descoberta de uma estirpe relacionada a Mycobacterium pinnipedii infectando múmias peruanas pré-colombianas, isto é, antes da introdução europeia da tuberculose nas Américas, levantou dúvidas quanto ao papel do M. pinnipedii na evolução do MTBC e sobre a co-evolução desses patógenos com populações humanas. Desta forma, esta dissertação tem como objetivos: (i) sequenciar e anotar os genomas completos de estirpes de M. pinnipedii isoladas de um leão marinho no Brasil e compará-los com outras estirpes da mesma espécie depositadas em bancos de dados públicos; (ii) produzir uma avaliação de genômica comparativa de todos as espécies descritas do MTBC a fim de identificar genes relacionados à virulência e à adaptabilidade ao hospedeiro. No primeiro estudo, foi realizado o sequenciamento dos genomas completos de dois isolados de M. pinnipedii obtidos da carcaça de um leão marinho (Otaria flavescens) encontrada no Rio Grande do Sul. Análises comparativas das mutações encontradas nesses genomas indica que esse animal estava infectado por duas estirpes diferentes desta bactéria. Este achado constitui o primeiro relato de infecção mista por M. pinipedii nesta espécie hospedeira e sugere que o patógeno é altamente endêmico na população de origem deste animal. Em contraste com estirpes de M. tuberculosis, a genômica comparativa entre estirpes modernas e antigas de M. pinnipedii depositadas em bancos de dados públicos indica proteomas altamente conservados e a ocorrência de um decaimento gênico através de deleções e pseudogenização, em um processo ativo de redução do genoma que vem ocorrendo há, pelo menos, 1.000 anos. Por fim, duas linhagens filogenéticas, modernas de M. pinnipedii foram detectadas globalmente, circunscritas por geografia e, consequentemente, por espécies hospedeiras. No segundo estudo, o objetivo foi investigar a presença e conservação de epítopos de células T e fatores de virulência no genoma core, acessório e espécie específico de 205 estirpes do MTBC. A estrutura do pan-genoma do MTBC mostra que a maioria das proteínas (832.234/866.916, 96,00%) está no genoma core, que é composto por proteínas importantes para a sobrevivência bacteriana. A análise da arquitetura do genoma acessório de MTBC com a distribuição dos epítopos mostrou, pela primeira vez, um mecanismo de variação antigênica de epítopos de células T baseado na perda de genes. Adicionalmente, foi possível observar variações significativas na quantidade de genes relacionados aos fatores de virulência, principalmente em estirpes de M. pinnipedii e M. africanum, sugerindo que a perda gênica relacionada à virulência possui importante papel nos fenótipos bacterianos. Em conclusão, os resultados apresentados contribuem para o entendimento da interação patógeno-hospedeiro de M. pinnipedii e outros membros do MTBC, sugerindo marcadores genéticos importantes dessa interação, e elucidando efeitos de pressões seletivas na determinação dos fenótipos de adaptabilidade hospedeira e virulência do grupo clonal MTBC.

The Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC) causes tuberculosis in humans and animals and is composed of 12 bacterial species with different host tropisms and virulence profiles. MTBC originated in Africa and evolved clonally through point mutations and genetic deletions of up to 12Kb. Despite phenotypic variations, homologous sequences of MTBC genomes are 99.95% identical and horizontal gene transfers are considered absent. Comprehensive comparative genomics studies including all MTBC species to identify the genetic determinants of these phenotypic differences are not available. At the same time, the recent discovery of a strain related to Mycobacterium pinnipedii infecting pre-Columbian Peruvian mummies, i.e. prior to the European introduction of tuberculosis in the Americas, raised doubts about the role of M. pinnipedii in the evolution of MTBC and the co-evolution of these pathogens with human populations. Thus, the aims of this study were to: (i) sequence and annotate the complete genomes of M. pinnipedii strains isolated from a sea lion in Brazil and compare them with other strains of the same species deposited in public databases; (ii) produce a comparative genomic evaluation of all described MTBC species to identify genes related to virulence and host adaptability. In the first study we sequenced the complete genomes of two M. pinnipedii isolates obtained from the carcass of a sea lion (Otaria flavescens) found in Rio Grande do Sul. Comparative analysis of mutations found in these genomes indicates that this animal was infected with two different strains of this bacterium. This finding is the first report of mixed M. pinipedii infection in this host species and suggests that the pathogen is highly endemic in the source population of this animal. In contrast to M. tuberculosis strains, the comparative genomics of ancient and modern M. pinnipedii strains deposited in public databases indicate highly conserved proteomes and the occurrence of gene decay through deletions and pseudogenization in an active process of genome reduction occurring for at least 1,000 years. Finally, two modern phylogenetic strains of M. pinnipedii were detected globally, circumscribed by geography and, consequently, by host species. In the second study, the aim was to investigate the presence and conservation of T cell epitopes and virulence factors in the core, accessory and strain-specific genomes of 205 MTBC strains. The MTBC pan-genome structure shows that most proteins (832,234/866,916, 96.00%) are in the core genome, which is composed of proteins important for bacterial survival. Analysis of the MTBC accessory genome architecture with epitope distribution showed, for the first time, a mechanism of antigenic T cell epitope variation based on gene loss. Additionally, it was possible to observe significant variations in the number of genes related to virulence factors, mainly in M. pinnipedii and Mycobacterium africanum strains, suggesting that virulence-related gene loss plays an important role in determining bacterial phenotypes. In conclusion, the results presented contribute to the understanding of the pathogen-host interaction of M. pinnipedii and other MTBC members, suggesting important genetic markers of this interaction, and elucidating the effects of selective pressures in the determination of host adaptability and virulence phenotypes of the clonal group MTBC.

Phylogenetic analysis of rabies virus isolated from herbivores in Minas Gerais and São Paulo border (2000-2009), Brazil / Análise filogenética de isolados do vírus da raiva de herbívoros na fronteira de Minas Gerais e São Paulo (2000-2009), Brasil

Rabies transmitted by the hematophagous bat Desmodus rotundus represents a public health concern and a burden for the Brazilian livestock industry. Current evidence suggests that rabies occurrence is related to landscape characteristics, topography, hydrography, animal production systems and land use. However, a few studies have analyzed the possible connections among geographic factors and the molecular diversity of the rabies virus, furthering the understanding of the spatial and temporal dynamics of outbreaks. A study reported that the latest rabies epizootics in herbivores reported in the eastern region of São Paulo (close to the Minas Gerais border) occurred in two epidemic waves; the first was before 1998, and the other occurred after 1999. Using this evidence, the aim of the present study was to analyze cases of rabies in herbivores in the southern region of Minas Gerais (2000-2009) and their possible relationship with the aforementioned epidemics, considering the geographic characteristics of the region. Partial sequences of glycoprotein (539 nt) and nucleoprotein genes (414 nt) were obtained from 31 rabies virus isolates from herbivores. A phylogenetic tree was proposed for each genomic region using the Neighbor joining method, fixing the Kimura 2-parameter evolution model with a bootstrap level of 1,000 replications. Genetic sublineages were plotted on maps, considering rabies risk areas for herbivores in São Paulo, as well as topographic characteristics and hydrographic basins, to visualize any apparent distribution pattern influenced by those features. The phylogenetic trees had concordant topologies, suggesting a possible common origin for rabies outbreaks in herbivores along the SP/MG border, surrounding the less elevated portions of the Serra da Mantiqueira and along the hydrographic basins of Piracicaba/Jaguarí, Paranaíba do Sul, Grande, Pardo and Mogi-Guaçu rivers.The co-circulation of several viral lineages was observed in some municipalities, possibly due to an overlapping of rabies outbreaks. Inferred protein sequences of both genes showed synonymous mutations, except among residues 20 to 200, corresponding to the external domain of the glycoprotein. This information prompted cooperation among the animal health services of both states to reinforce rabies control in the border area.(AU)

A raiva transmitida por morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus representa uma preocupação de saúde pública e causa de importantes prejuízos para a pecuária brasileira. A evidência atual sugere que a ocorrência de raiva está relacionada às características da paisagem, topografia, hidrografia, sistemas de produção animal e usos da terra. Contudo, existem poucos estudos que analisem as possíveis conexões entre fatores geográficos e a diversidade molecular do vírus da raiva, permitindo a compreensão da dinâmica espacial e temporal dos focos de raiva. Um desses trabalhos estabeleceu que a última epizootia de raiva dos herbívoros registrada no leste do estado de São Paulo (na fronteira com Minas Gerais), aconteceu em duas ondas epidêmicas, sendo a primeira em 1998 e, em 1999, a segunda. Considerando esta evidência, o intuito do presente estudo foi analisar casos de raiva em herbívoros na região sudeste de Minas Gerais (2000-2009) e sua possível relação com a epidemia previamente mencionada, incluindo as características geográficas da região. Foram obtidas sequencias parciais dos genes da glicoproteína (539 nt) e da nucleoproteína (414 nt) a partir de 31 isolados de vírus da raiva procedentes de herbívoros. Foi proposta uma árvore filogenética para cada região genômica usando o método de Neighbor joining, fixando o modelo evolutivo Kimura 2 - parâmetros com um nível de bootstrap de 1000 replicações. As sublinhagens genéticas foram localizadas sobre mapas, considerando as áreas de risco para raiva dos herbívoros em São Paulo, assim como as características topográficas e bacias hidrográficas com o intuito de visualizar qualquer padrão aparente de distribuição segundo essas características. As duas árvores filogenéticas mostraram topologias concordantes, sugerindo uma possível origem comum para os surtos que aconteceram ao longo da fronteira SP/MG, ao redor das porções menos elevadas da Serra da Mantiqueira e acompanhando as bacias hidrográficas dos rios Piracicaba/Jaguarí, Paranaíba do Sul, Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Foi possível observar circulação de varias linhagens virais simultaneamente em alguns municípios, possivelmente por causa de sobreposição de surtos. As sequencias de proteína inferidas a partir dos dois genes mostraram mutações sinônimas, excetuando aquelas encontradas entre os resíduos 20 a 200, correspondentes ao domínio externo da glicoproteína. Esta informação salienta a importância da cooperação entre as autoridades sanitárias de ambos os estados para reforçar o programa de controle da doença nas áreas limítrofes.(AU)

Molecular and serological detection of tick-borne pathogens in dogs from an area endemic for Leishmania infantum in Mato Grosso do Sul, Brazil

Tick-borne pathogens affect a wide range of vertebrate hosts. To identify tick-borne pathogens among dogs from Campo Grande, MS, Brazil testing seropositive for Leishmania infantum (syn. L. chagasi), a serological and molecular study was conducted to detect Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia vogeli in 60 serum and spleen samples. A confirmatory diagnosis of L. infantum based on serological and molecular assays was also performed, as was sequence alignment and phylogenetic analysis to assess the identity of the parasite species infecting these animals. IgG antibodies to Ehrlichia spp., B. vogeli and L. infantum were found, respectively, in 39 (65%), 49 (81.6%) and 60 (100%) of the sampled dogs. Twenty-seven (45%), fifty-four (90%), fifty-three (88.3%), two (3.3%) and one (1.6%) dog were positive, respectively, for E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. and Anaplasma sp. in PCR assays. After sequencing, the amplicons showed 99% of identity with E. canis, B. vogeli, A. platys and Leishmania chagasi isolates. The findings of this study indicate that L. infantum-seropositive dogs from Campo Grande are exposed to multiple tick-borne pathogens, which should therefore be included in the differential diagnosis of dogs with clinical suspicion of leishmaniasis.

Patógenos transmitidos por carrapatos atingem uma variedade de hospedeiros vertebrados. Para identificar os agentes patogênicos transmitidos por carrapatos entre cães soropositivos para Leishmania infantum no município Campo Grande-MS, foi realizado um estudo sorológico e molecular para a detecção de Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Babesia vogeli em 60 amostras de soro e baço, respectivamente. Adicionalmente, foi realizado o diagnóstico confirmatório de L. infantum por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Também foi realizado o alinhamento e análise filogenética das sequências para indicar a identidade das espécies de parasitas que infectam esses animais. Anticorpos IgG anti-Ehrlichia spp., anti-B. vogeli e anti-L. infantum foram detectados em 39 (65%), 49 (81,6%) e 60 (100%) dos cães amostrados, respectivamente. Vinte e sete (45%), cinquenta e quatro (90%), cinquenta e três (88,3%), dois (3,3%) e um (1,6%) cães mostraram-se positivos na PCR para E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. e Anaplasma sp., respectivamente. Após o seqüenciamento, os amplicons mostraram 99% de similaridade com isolados de E. canis, B. vogeli e A. platys e Leishmania chagasi. Os resultados deste estudo indicaram que os cães soropositivos para L. infantum de Campo Grande, MS, são expostos a vários agentes transmitidos por carrapatos, e, portanto, devem ser incluídos no diagnóstico diferencial em cães com suspeita clínica de leishmaniose.

Análise das funções moonlighting de duas proteínas de Leptospira: Enolase e GAPDH

Mais de 25% das mortes em humanos são causadas por doenças infecciosas. Muitas dessas doenças são emergentes e de importância zoonótica. A leptospirose é considerada uma das mais importantes doenças zoonóticas emergentes. Sua distribuição global e seu potencial epidêmico constituem um problema de Saúde Pública. Estima-se que ocorram anualmente 1.03 milhão de casos e 58.900 mortes por leptospirose em todo o mundo, mas, em se tratando de uma doença negligenciada, a real prevalência da doença é subestimada. O Rattus norvegicus é o principal reservatório associado a epidemias urbanas. Leptospiras possuem a capacidade de aderir às células dos túbulos renais e interagem com muitos componentes da matriz extracelular do hospedeiro, o que facilita a invasão e colonização. Possuem também mecanismos de evasão ao sistema complemento do hospedeiro. A identificação destes mecanismos tem sido alvo de pesquisas desenvolvidas por vários grupos. Enolase e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) pertencem à categoria de proteínas conhecidas como proteínas moonlighting. Estas englobam um grupo de proteínas multifuncionais. Enolases são metaloenzimas citossólicas que catalisam a conversão de 2-D-fosfo-glicerato em fosfoenolpiruvato. Apesar de não possuírem sequência clássica de ancoragem à membrana, são encontradas na superfície de uma variedade de células eucarióticas e procarióticas, tendo a capacidade de interagir com plasminogênio. GAPDH é uma enzima da via glicolítica responsável pela conversão de gliceraldeído 3-fosfato em D glicerato 1,3-bifosfato. Estudos recentes mostram que a GAPDH tem múltiplas funções independentes do seu papel no metabolismo de energia. Neste trabalho demonstrou-se que GAPDH de Leptospira está localizada na superfície da bactéria, e que tanto GAPDH como enolase interagem com plasminogênio, o qual é convertido em sua forma ativa, a plasmina, na presença do ativador exógeno uPA. A capacidade da plasmina gerada sobre a enolase de clivar substratos fisiológicos foi testada. A cadeia do fibrinogênio foi totalmente degradada, e a molécula vitronectina parcialmente clivada em fragmentos de 61- 64 kDa. Ainda, mostrou-se que a enolase interage com os reguladores do complemento C4BP e FH. Ambos os reguladores permanecem funcionais, agindo como co-fatores de Fator I na degradação de C3b (FH) e C4b (C4BP). No que diz respeito à GAPDH, os dados claramente mostram que a plasmina ligada à GAPDH degrada as cadeias e do fibrinogênio, assim como a isoforma de 75 kDa da vitronectina, de forma tempo-dependente. Ainda, na presença de GAPDH, a plasmina degradou totalmente a cadeia de C5, mas não degradou C3b. Por fim, resultados obtidos por Far Western Blot revelam que GAPDH interage com C1q, molécula-chave da via clássica do sistema complemento, e também com fibronectina plasmática, podendo, portanto, contribuir para a adesão da bactéria durante a colonização do hospedeiro. Em suma, no presente estudo caracterizamos duas novas proteínas moonlighting de Leptospira: enolase e GAPDH. A caracterização funcional destas proteínas, assim como a identificação das moléculas-alvo do hospedeiro com as quais essas proteínas são capazes de interagir, podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de invasão, disseminação e evasão imune utilizados por leptospiras patogênicas.

More than 25% of human deaths are caused by infectious diseases, among which a large number are emerging and of zoonotic importance. Leptospirosis is considered one of the most important emerging zoonotic diseases. Its global distribution and its epidemic potential constitute a Public Health problem. It is estimated that approximately 1,03 million cases and 58,900 deaths from leptospirosis occur annually worldwide, but as a neglected disease, its actual prevalence is underestimated. Rattus norvegicus is the main reservoir associated with urban epidemics. Leptospires have the capacity to adhere to renal tubule cells which facilitates invasion and colonization. They also have mechanisms to evade the host's complement system. The identification of these mechanisms has been the object of research developed by several groups. Enolase and Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) belong to the category of proteins known as moonlighting proteins. These encompass a group of multifunctional proteins. Enolases are cytosolic metalloenzymes that catalyze the conversion of 2-D-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate. Although they do not have a classic membrane anchor sequence, they are found on the surface of a variety of eukaryotic and prokaryotic cells, and have the capacity to interact with plasminogen. GAPDH is an enzyme of the glycolytic pathway responsible for the conversion of glyceraldehyde 3-phosphate to D-glyceryl 1,3-bisphosphate. Recent studies show that GAPDH has multiple functions independent of its role in energy metabolism. In this work we demonstrated that Leptospira GAPDH is located on the surface of the bacterium, and that both GAPDH and enolase interact with plasminogen, which is converted into its active form, plasmin, in the presence of the exogenous activator uPA. The capacity of plasmin-bound enolase to cleave physiological substrates was tested. The -chain of fibrinogen was totally degraded, and vitronectin was partially cleaved into fragments of 61-64 kDa. Further, enolase interacts with the complement regulators C4BP and FH. Both regulators remain functional, acting as cofactors for Factor I on the degradation of C3b (FH) and C4b (C4BP). With regard to GAPDH, the date clearly show that plasmin bound to GAPDH degrades the and chains of fibrinogen as well as the 75-kDa isoform of vitronectin, in a time-dependent manner. Furthermore, in the presence of GAPDH, plasmin totally degraded C5 -chain, but did not degrade C3b. Finally, our Far Western Blot data reveal that GAPDH interacts with C1q, a key molecule of the classical pathway of the complement system, and also interacts with plasma fibronectin, and may therefore contribute to bacterial adhesion during host colonization. Briefly, in the present study we characterized two novel moonlighting proteins of Leptospira: enolase and GAPDH. The functional characterization of these proteins, as well as the identification of the host target molecules with which these proteins are capable of interacting, may contribute to the understanding of the mechanisms of invasion, dissemination and immune evasion used by pathogenic leptospires.

Etiology of vertebral osteomyelitis in broilers

As alterações locomotoras representam um desafio na produção avícola moderna em todo o mundo e podem ter origem não infecciosa e infecciosa. A osteomielite vertebral é uma doença bacteriana descrita em surtos em diversos países caracterizada por infecção da vértebra torácica móvel (T4) que resulta em compressão da medula espinhal, dificuldade de locomoção e morte das aves acometidas. O objetivo deste trabalho foi determinar a frequência da doença em frangos de corte do estado de Minas Gerais, além de conhecer e caracterizar molecularmente os agentes etiológicos envolvidos na doença. Para isso, foram analisados 608 frangos de corte com problemas locomotores que tiveram os sinais clínicos registrados e foram submetidos à necropsia. Amostras de corpo vertebral e articulações com alterações macroscópicas foram coletadas para isolamento bacteriano, histopatologia e análise molecular. Osteomielite vertebral foi encontrada em 5,1% (31/608) das aves, as quais apresentaram diferentes graus de dificuldade locomotora relacionados ao nível de compressão da medula espinal. As bactérias mais frequentemente isoladas das lesões foram: Enterococcus spp. (53,6%), E. faecalis (32,1%) e E. hirae (7,1%); Escherichia coli (42,8%) em co-infecção E. faecalis em dois casos; Staphylococcus aureus (14,3%) em dois casos em co-infecção com Enterococcus spp. ou E. hirae. Os isolados de E. coli apresentaram diferentes padrões genéticos por PFGE, independentemente do lote estudado e tipo de lesão (osteomielite vertebral ou artrite). Os isolados pertenciam a sete sequence types (STs) descritos anteriormente (ST117, ST101, ST131, ST371 e ST3107) ou descritos pela primeira vez neste estudo (ST5766 e ST5856). A maioria dos isolados pertenciam ao grupo filogenético D (66,7%) e diversos sorogrupos (O88, O25, O12 e O45), alguns de importância mundial. O perfil de susceptibilidade antimicrobiana também refletiu a diversidade dos isolados e revelou alta frequência de cepas multirresistentes (73%), principalmente às quinolonas e beta-lactâmicos. A análise do Multilocus sequence typing (MLST) revelou que os isolados de E. faecalis pertenciam a oito STs distintos. Desses, seis (ST49, ST100, ST116, ST202, ST249 e ST300) foram previamente descritos, enquanto ST708 e ST709 foram descritos pela primeira vez nesse estudo. E. faecalis ST49 foi o mais frequentemente isolado das lesões vertebrais. Os isolados da bactéria apresentaram maior percentual de resistência antimicrobiana aos aminoglicosídeos, principalmente à gentamicina (40.0%), e baixa resistência à vancomicina (10%). Os resultados desse estudo demonstram que, no Brasil, osteomielite vertebral em frangos de corte pode não ser causada por um único agente infeccioso e sugere diferenças geográficas relativas à frequência e etiologia da doença entre esta região do Brasil e outros países. Além disso, nossos resultados demonstraram a diversidade de STs de E. faecalis envolvidos na doença com alta frequência de isolados resistentes a aminoglicosídeos e baixa frequência de E. faecalis resistentes à vancomicina. Nossos resultados demonstram, ainda, que osteomielite vertebral e artrite podem estar associadas à E. coli altamente diversas, as quais são frequentemente resistentes a múltiplas drogas antimicrobianas. Alguns isolados de E. coli pertencem a STs descritos também em seres humanos, o que representa uma preocupação para a saúde pública e animal

Locomotor disorders represent a major challenge in modern poultry production worldwide and they may be related to non-infectious and infectious etiologies. Vertebral osteomyelitis is a bacterial disease described in outbreaks in many countries, characterized by infection of the mobile thoracic vertebra (T4), which results in the compression of the spine, reduced mobility and death of affected broilers. The objective of this study was to determine the frequency of vertebral osteomyelitis in broilers in the state of Minas Gerais, and to determine the bacterial etiologies involved in disease and their molecular characteristics. For this, we analyzed 608 broilers with locomotor disorders, which had their clinical signs recorded and then necropsied. Vertebral column samples and joints with gross changes were collected for bacterial isolation, molecular and histopathological analysis. Vertebral osteomyelitis was found in 5.1% (31/608) of the birds, which had different degrees of limited mobility, related to the level of spinal cord compression. The bacteria most frequently isolated from lesions were: Enterococcus spp. (53.6%), E. faecalis (32.1%) and E. hirae (7.1%); Escherichia coli (42.8%) in co-infection with E. faecalis in two cases; Staphylococcus aureus (14.3%) in co-infection with Enterococcus spp. or E. hirae in two cases. E. coli strains harbored different genetic pattern as assessed by PFGE, regardless of flock origin and lesion site (vertebral osteomyelitis or arthritis). The E. coli strains belonged to seven sequence types (STs) described previously (ST117, ST101, ST131, ST371 and ST3107) or newly described in this study (ST5766 and ST5856). Most strains belonged to ECOR phylogenetic group D (66.7%) and diverse serogroups (O88, O25, O12 and O45), some of worldwide importance. The antimicrobial susceptibility profile also showed the diversity of the strains and revealed a high proportion of multidrug-resistant strains (73%), mainly to quinolones and beta-lactams. Multilocus sequence typing (MLST) analysis of E. faecalis revealed that the strains belonged to eight different STs, being six (ST49, ST100, ST116, ST202, ST249, and ST300) previously described and ST708 and ST709 first identified in this study. ST49 was the most frequently isolated from vertebral osteomyelitis lesions. E. faecalis strains showed the highest resistance to aminoglycoside antibiotics, mainly to gentamicin (40.0%), and low resistance to vancomycin (10%). The results indicated that, in Brazil, vertebral osteomyelitis in broilers may not be caused by a single infectious agent and suggested geographical differences concerning the frequency and etiology of the disease, as comparing our region in Brazil with reports in other countries. Furthermore, our results showed the diversity of E. faecalis STs involved with this disease and high frequency of aminoglycoside resistance and low frequency of vancomycin-resistance. Also, vertebral osteomyelitis and arthritis could be associated with highly diverse E. coli, which were often multidrug-resistant. Some E. coli strains belonged to STs described also in humans, which may represent a concern to public and animal health.

DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA PRIMÁRIA E ANÁLISE DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE UMA LECTINA DA ALGA MARINHA VERMELHA Amansia multifida J.V. LAMOUROUX

Os oceanos guardam 50% da biodiversidade do planeta sendo o maior reservatório de compostos bioativos. As algas marinhas participam de um grupo diversificado de organismos que são fonte de uma gama de compostos bioativos com aplicação diversificada para benefício humano. Dentre esses compostos estão as lectinas, (glico) proteínas ubíquas com pelo menos um domínio não catalítico que se ligam específica e reversivelmente a carboidratos podendo aglutinar células e/ou glicoconjugados. Estudos com lectinas de algas, embora ainda recentes quando comparados a lectina de outros organismos, mostram que essas proteínas possuem uma ampla possibilidade de aplicação biotecnológica. A AIDS, o câncer, e também infecções causadas por bactérias resistentes a antibióticos são problemas de saúde pública que matam centenas de milhares de pessoas anualmente, e as lectinas de algas, têm atraído atenção especial com relação a estudos com atividades antivirais, contra células cancerígenas e antibióticas. Por outro lado, estudos investigando a atividade antioxidante de lectinas é pouco explorado havendo apenas um estudo com lectina de alga relatado até o momento. O objetivo desse trabalho foi determinar a estrutura primária da lectina de Amansia multifida (AML) através da combinação das técnicas de espectrometria de massas, Degradação de Edman e clonagem de cDNA, bem como avaliar o potencial biotecnológico da AML através de ensaios de atividade contra células de câncer colorretal, vírus HIV-I e HIV-II, atividade antioxidante e formação de biofilmes bacterianos. A estrutura primária da AML, associada às suas características físico-químcas, comprovou que ela é mais uma integrante da família OAAH que possui quatro domínios repetidos na sua sequência de aminoácidos além de um sítio de ligação a carboidrato conservado e com alta identidade com os das lectinas da família OAAH. A AML foi capaz de reduzir a viabilidade celular de células de câncer colorretal e de reduzir o número de células viáveis de S. aureus e E.coli. Apresentou atividade contra vírus HIV em concentrações 0,77 µM para HIV-1 e 2,08 µM para HIV-2 com células de linfócitos T, e EC50 foi de 1,55 µM para -1 em células SUPT1 co-cultivadas com HUT78. Este trabalho também é o primeiro relato de atividade antioxidante de uma lectina de alga marinha vermelha.

Fifty percent of the biodiversity of the world are in the oceans. The seaweeds are a diverse group of organisms that are the source of bioactive compounds with diverse application for human benefit. Among these compounds are lectins, ubiquitous proteins or glycoproteins with at least one non-catalytic domain binding reversibly to a specific mono- or oligosaccharides. Studies with algae lectin, although still recent when compared to lectins from other organisms, show that these proteins have a wide possibility of biotechnological applications. AIDS, cancer as well infections caused by antibiotic-resistant bacteria are public health problems that kill hundreds of thousands of people each year, lectins from algae have been shown proteins with highly potent activity because of their specificity to carbohydrates high mannose. Because of that, algae lectins have attracted particular attention with regard to studies of antiviral activities, against cancer cells and antibiotic. Furthermore, studies researching antioxidant activity of lectins are underexplored with only one reported with this property. The aim of this study was to determine the primary structure of the Amansia multifida lectin (AML) by combining mass spectrometry, Edman degradation and molecular biology, evaluate its antioxidant activity, biotechnological potential of AML against cancer cells, HIV-I and HIV- II and against growth of bacterial biofilms. The sequence when compared to databases (NCBI) showed homology to lectins belonging to the family OAAH. The results have shown that AML is a protein of OAAH family with four repeated domains in its aminoacid sequence as well as a conserved carbohydrate binding site with high identity with the lectins of OAAH family. AML is the first lectin from red marine alga with antioxidant activity, capable to reduce cell viability of colon cancer cells, it also reduces the number of viable cells of S. aureus and E. coli, and exhibit activity at micromolar concentrations against HIV-I and HIV-II virus.

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS INFLUENZA ISOLADOS EM SUÍNOS NO RIO GRANDE DO SUL

O vírus influenza A (IAV) é um agente zoonótico de grande relevância tanto para saúde humana como animal. A influenza suína teve seu primeiro reconhecimento clínico em 1918, em suínos do Meio Oeste dos EUA, coincidindo com a pandemia de influenza em humanos. Desde então, o IAV permanece como um importante patógeno para a indústria suinícola em todo o mundo. A grande variabilidade genética destes vírus é causada por dois principais mecanismos genéticos: mutações pontuais e recombinações genéticas. A influenza é endêmica em muitos países e a emergências de recombinantes tem desafiado o controle e o diagnóstico desta enfermidade. No Brasil, a infecção pelo IAV em suínos (swIAV) não está bem caracterizada; poucos relatos evidenciam a prevalência deste agente antes do ano de 2009, especialmente no Estado do Rio Grande do Sul, que alberga um dos maiores rebanhos de suínos do Brasil. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo investigar ocorrência de swIAV em alguns rebanhos suínos comerciais do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 2013-2014, e determinar os tipos e subtipos de vírus circulantesnaquelas propriedades. O primeiro capítulo deste estudo reporta os aspectos clínicos,patológicos e virológicos da ocorrência de influenza suína e co-infecções identificadas em seis propriedades suinícolas selecionadas na região do Vale do Taquari. Neste estudo foram analisados suabes nasais coletados de 66 animais e 6 amostras de tecido pulmonar de suínos com sinais de infecção respiratória. A detecção viral foi feita através de uma PCR de triagem e confirmada através do isolamento viral em célulasMDCK. A identificação dos subtipos virais foi feita através de uma PCR em Tempo Real (rRT-PCR) para o subtipo A(H1N1)pdm09 ou através de uma PCR multiplex(RT-PCR) para outros subtipos de swIAV. A detecção de agentes bacterianos foi realizada apenas nas amostras de tecido pulmonar, através da pesquisa de genomas bacterianos por PCR. O subtipo A(H1N1)pdm09 foi identificado em 4/6 granjas e o subtipo H1N2 em 2/6 granjas. Além disso, agentes envolvidos no complexo respiratório dos suínos foram identificados em todas as granjas; Pasteurella multocida foi identificada em 5/6 granjas e Mycoplasma hyopneumoniae em 3/6 granjas. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) e PCV2 (1/6) também foram detectados. O segundo capítulo deste estudo teve como objetivo o sequenciamento do genoma completo de um novo recombinante H1N2 de origem humana, detectado em suínos. O genoma completo foi gerado através de uma RT-PCR. Os produtos forampurificados e submetidos ao sequenciamento utilizando a plataforma MiSeq(illumina). A análise filogenética revelou que as sequencias dos genes HAe NA correspondem a genes de IAV de origem humana, enquanto que as sequencias dos genes que codificam as proteínas internas do vírus (PB1, PB2, PA, NP, M e NS) correspondem a genes de amostras do vírus A(H1N1)pdm09. O terceiro capítulo reporta o sequenciamento completo dos genomas de 8 amostras de vírus influenza identificados nas populações de suínos amostradas. Foram identificados dois subtipos virais de origem humana (H1N2 e H3N2), além do vírus A(H1N1)pdm09. Os subtipos de origem humana possuem os genes HAe NA similares a vírus sazonais de humanos e os genes internos são estreitamente relacionados com o vírus A(H1N1)pdm09.

Influenza A virus (IAV) is a zoonotic agent of great relevance to human and animal health. Swine influenza was first recognized clinically in pigs in the Midwestern U.S., in 1918, coinciding with the human influenza pandemic.Since that time swine influenza has remained of importance to the swine industry throughout the world. The great genetic variability of influenza viruses is caused by two main genetic mechanisms: point mutations (antigenic drift) and gene reassortment (antigenic shift). Influenza is endemic in pigs in many countries and the emergence of new viruses has been challenging its control and diagnostics. Influenza virus (swIAV) infection in Brazilian swine population is not well characterized, and little evidence existed of swIAV circulation before 2009, especially in Rio Grande do Sul State, which hosts one of the largest swine populations in Brazil. Thus, this study aimed to investigate the occurrence of IAV in commercial swine herds in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, between 2013-2014 and to know the types and subtypes of swine influenza viruses that are circulating in these herd. The first chapter of this study reports the clinical, pathological and virological aspects of the occurrence of swine influenza and related co-infections in six pig properties of the Taquari Valley region. In this study were analyzed nasal swabs collected from 66 animals and six lung tissue samples from pigs showing clinical signs of respiratory disease. IAV detection was performed by PCR screening and confirmed by virus isolation in MDCK cells and hemagglutination (HA). Influenza A subtyping was performed by real-time reverse transcription PCR (rRT-PCR) to detect the 2009 H1N1pandemic A(H1N1)pdm09; other swIAV subtypes were identifieded by multiplex RT-PCR. Bacterial infections were identified through detection of bacterial genomes by PCR, only in lung samples. Influenza A was detected by screening PCR in 46/66 swab samples and from 5/6 lungs. Virus was recovered from pigs of the six herds. Subtype A(H1N1)pdm09 was detected in 4/6 herds and H1N2 in the other 2/6 herds. In lung tissues, further agents involved in porcine respiratory disease complex were detected in all cases; Pasteurella multocida was identified in 5/6 samples and Mycoplasma hyopneumoniae in 3/6. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) and PCV2 (1/6) were also detected. The aim ofthe second chapter was to sequence the whole-genome of a novel human-like H1N2 swine influenza virus. Whole-genome sequences were generated by RT-PCR. Amplicons were purified followed by sequencing in the MiSeq sequencing platform (Illumina). Phylogenetic analyses revealed that the HA and NA genes clustered with influenza viruses of human lineage, whereas the internal genes (PB1, PB2, PA, NP, M andNS) clustered with the A(H1N1)pdm09. The third chapter reports the geneticsequencing of the full genomes of eight swine influenza viruses circulating in the sampled pig population. Two swine human-like subtypes (H1N2 and H3N2) and the A(H1N1)pdm09 virus were identified. The human-like subtypes have the HA and NA genes similar to the human seasonal strains and the internal genes are closely related to the virus A(H1N1)pdm09.

Toxoplasma gondii: humoral and cellular immune response of BALB/c mice immunized via intranasal route with rTgROP2

TgROP2 is an intracellular protein associated with rhoptries of Toxoplama gondii and an antigen component of a candidate vaccine for toxoplasmosis. The purpose of the present study was to evaluate the efficacy of rTgROP2 to stimulate humoral and cellular immune responses in BALB/c mice via intranasal injection. TgROP2 partial coding sequence was (196-561) amplified by PCR from genomic T. gondii RH strain DNA and cloned into the pTrcHis expression vector. Escherichia coli Rosetta 2 cells transformed with pTrcHis-TgROP2 showed high levels (~1 mg.mL-1) of recombinant protein after 4 hours of IPTG induction. Recombinant TgROP2 exhibited an apparent Mr equal to 54 kDa. In order to test immunogenicity of the recombinant protein, 10 BALB/c mice received 10 µg of rROP2 protein + 10 µg of Quil-A via intranasal injection. Doses were administered at days 0, 21, and 42. Three animals were euthanized and used to evaluate cell-ular immune response on day 62. Five (50%) and two (20%) out of ten animals produced IgG (DO mean = 0.307; cut-off = 0.240) and IgA (DO mean = 0.133, cut-off = 0.101), respectively, by ELISA on day 62. The proliferation of splenocytes revealed high stimulation index (SI) when co-cultured with 5, 10 and 15 µg.mL-1 of rTgROP2. These results indicate that intranasal immunization with recombinant protein ROP2 plus Quil-A can elicit both cellular and humoral immune responses in BALB/c mice.

TgROP2 é uma proteína localizada nas roptrias do Toxoplasma gondii, sendo um antígeno candidato a componente de uma vacina contra a toxoplasmose. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia da TgROP2 recombinante em estimular a resposta imune celular e humoral de camundongos BALB/c após estímulo intranasal. A sequência da TgROP2 foi amplificada pela PCR a partir da cepa RH e clonada em vetor de expressão pTrc-His. Após a transformação em Escherichia coli- Rosetta 2, a pTrcHis-TgROP2 exibiu alto nível de expressão após 4 horas de indução com IPTG. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 54 kDa. Para avaliar a imunogenicidade dessa proteína recombinante, 10 camundongos receberam, pela via intranasal, 10 µg da rROP2 associado a 10 µg de Quil-A. Três doses foram realizadas nos dias 0, 21 e 42. No dia 62 do experimento, três animais foram eutanasiados para avaliar as respostas imune celular e humoral. Cinco (50%) e dois (20%) dos 10 animais apresentaram níveis de IgG (DO média = 0,307; ponto de corte = 0,240) e IgA (DO média = 0,133; ponto de corte = 0,101) acima do ponto de corte no ELISA no dia 62. A proliferação de esplenócitos revelou altos Índices de Estimulação (SI), quando as células foram cultivadas com 5, 10 e 15 µg.mL-1 de rTgROP2. Os resultados obtidos indicam que a via nasal pode estimular tanto a resposta imune celular como a humoral.

Toxoplasma gondii: humoral and cellular immune response of BALB/c mice immunized via intranasal route with rTgROP2 / Toxoplasma gondii: avaliação da resposta imune humoral e celular de camundongos BALB/c imunizados pela via nasal com rTgROP2

TgROP2 is an intracellular protein associated with rhoptries of Toxoplama gondii and an antigen component of a candidate vaccine for toxoplasmosis. he purpose of the present study was to evaluate the eficacy of rTgROP2 to stimulate humoral and cellular immune responses in BALB/c mice via intranasal injection. TgROP2 partial coding sequence was (196-561) amplified by PCR from genomic T. gondii RH strain DNA and cloned into the pTrcHis expression vector. Escherichia coli Rosetta 2 cells transformed with pTrcHis-TgROP2 showed high levels (1 mg.mL potentiation -1) of recombinant protein after 4 hours of IPTG induction. Recombinant TgROP2 exhibited an apparent Mr equal to 54 kDa. In order to test immunogenicity of the recombinant protein, 10 BALB/c mice received 10 µg of rROP2 protein + 10 µg of Quil-A via intranasal injection. Doses were administered at days 0, 21, and 42. Three animals were euthanized and used to evaluate cellular immune response on day 62. Five (50%) and two (20%) out of ten animals produced IgG (DO mean = 0.307; cut-of = 0.240) and IgA (DO mean = 0.133, cut-of = 0.101), respectively, by ELISA on day 62. he proliferation of splenocytes revealed high stimulation index (SI) when co-cultured with 5, 10 and 15 µg.mL potentiation -1 of rTgROP2. These results indicate that intranasal immunization with recombinant protein ROP2 plus Quil-A can elicit both cellular and humoral immune responses in BALB/c mice. (AU)

TgROP2 é uma proteína localizada nas roptrias do Toxoplasma gondii, sendo um antígeno candidato a componente de uma vacina contra a toxoplasmose. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia da TgROP2 recombinante em estimular a resposta imune celular e humoral de camundongos BALB/c após estímulo intranasal. A sequência da TgROP2 foi amplificada pela PCR a partir da cepa RH e clonada em vetor de expressão pTrc-His. Após a transformação em Escherichia coli- Rosetta 2, a pTrcHis-TgROP2 exibiu alto nível de expressão após 4 horas de indução com IPTG. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 54 kDa. Para avaliar a imunogenicidade dessa proteína recombinante, 10 camundongos receberam, pela via intranasal, 10 µg da rROP2 associado a 10 µg de Quil-A. Três doses foram realizadas nos dias 0, 21 e 42. No dia 62 do experimento, três animais foram eutanasiados para avaliar as respostas imune celular e humoral. Cinco (50%) e dois (20%) dos 10 animais apresentaram níveis de IgG (DO média = 0,307; ponto de corte = 0,240) e IgA (DO média = 0,133; ponto de corte = 0,101) acima do ponto de corte no ELISA no dia 62. A proliferação de esplenócitos revelou altos Índices de Estimulação (SI), quando as células foram cultivadas com 5, 10 e 15 µg.mL elevado a -1 de rTgROP2. Os resultados obtidos indicam que a via nasal pode estimular tanto a resposta imune celular como a humoral. (AU)

Marker assisted identification of tospovirus resistant tomato genotypes in segregating progenies

The SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 'Sw-421' molecular marker is located at 1.0 cM from the Sw-5 allele, originated from Lycopersicon peruvianum (L.), which confers resistance to the tomato spotted wilt virus (TSWV). However, it had not been tested yet in advanced tomato populations. The goal of this study was to distinguish resistant homozygotes (Sw-5/Sw-5) and heterozygotes (Sw-5/Sw-5+) from susceptible (Sw-5+/Sw-5+) plants in crossing populations with the Stevens cultivar and advanced backcrossing populations by using 'Sw421' SCAR marker. The amplification of 940 bp and 900 bp bands characterized the resistant homozygotes and susceptible controls, respectively. A two band pattern (900 bp and 940 bp) was observed in heterozygote genotypes (Sw-5/Sw-5+), which confirmed the co-dominant inheritance mechanism of the marker. Fifty seven plants from the isogenic progenies were characterized based on bands pattern: 18 plants (31.6%) were identified as resistant homozygotes, 8 plants (14.0%) as resistant heterozygotes and 31 plants (54.4%) were characterized as susceptible. The SCAR 'Sw-421' marker is an important tool for selection and pyramid resistance alleles, mainly when other resistance sources to the TSWV are available, such as the Rey de los Tempranos source.

O marcador molecular SCAR 'Sw-421' é localizado a 1,0 cM do alelo Sw-5, proveniente de Lycopersicon peruvianum (L.), que confere resistência ao vira-çabeça em tomateiro. Contudo, o mesmo ainda não havia sido testado em populações avançadas de tomateiro. O objetivo do trabalho foi distinguir plantas resistentes homozigotas (Sw-5/Sw-5), resistentes heterozigotas (Sw-5/Sw-5+) e suscetíveis (Sw-5+/Sw-5+) pelo marcador SCAR 'Sw-421'. As amplificações de bandas de 940 pb e 900 pb caracterizaram os genótipos resistentes homozigotos e suscetíveis, respectivamente. Duas bandas (900 pb e 940 pb) foram observadas nos genótipos heterozigotos, confirmando a herança codominante do marcador. De 57 plantas das progênies isogênicas avaliadas 18 (31,6%) plantas foram caracterizadas como resistentes, 8 (14,0%) como heterozigotas e 31 (54,4%) plantas suscetíveis. O marcador molecular SCAR 'Sw-421' constitui importante ferramenta para seleção e piramidação de alelos de resistência, especialmente quando se utilizam outras fontes de resistência ao vira-cabeça, como por exemplo, a fonte Rey de los Tempranos.

Marker assisted identification of tospovirus resistant tomato genotypes in segregating progenies

The SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 'Sw-421' molecular marker is located at 1.0 cM from the Sw-5 allele, originated from Lycopersicon peruvianum (L.), which confers resistance to the tomato spotted wilt virus (TSWV). However, it had not been tested yet in advanced tomato populations. The goal of this study was to distinguish resistant homozygotes (Sw-5/Sw-5) and heterozygotes (Sw-5/Sw-5+) from susceptible (Sw-5+/Sw-5+) plants in crossing populations with the Stevens cultivar and advanced backcrossing populations by using 'Sw421' SCAR marker. The amplification of 940 bp and 900 bp bands characterized the resistant homozygotes and susceptible controls, respectively. A two band pattern (900 bp and 940 bp) was observed in heterozygote genotypes (Sw-5/Sw-5+), which confirmed the co-dominant inheritance mechanism of the marker. Fifty seven plants from the isogenic progenies were characterized based on bands pattern: 18 plants (31.6%) were identified as resistant homozygotes, 8 plants (14.0%) as resistant heterozygotes and 31 plants (54.4%) were characterized as susceptible. The SCAR 'Sw-421' marker is an important tool for selection and pyramid resistance alleles, mainly when other resistance sources to the TSWV are available, such as the Rey de los Tempranos source.

O marcador molecular SCAR 'Sw-421' é localizado a 1,0 cM do alelo Sw-5, proveniente de Lycopersicon peruvianum (L.), que confere resistência ao vira-çabeça em tomateiro. Contudo, o mesmo ainda não havia sido testado em populações avançadas de tomateiro. O objetivo do trabalho foi distinguir plantas resistentes homozigotas (Sw-5/Sw-5), resistentes heterozigotas (Sw-5/Sw-5+) e suscetíveis (Sw-5+/Sw-5+) pelo marcador SCAR 'Sw-421'. As amplificações de bandas de 940 pb e 900 pb caracterizaram os genótipos resistentes homozigotos e suscetíveis, respectivamente. Duas bandas (900 pb e 940 pb) foram observadas nos genótipos heterozigotos, confirmando a herança codominante do marcador. De 57 plantas das progênies isogênicas avaliadas 18 (31,6%) plantas foram caracterizadas como resistentes, 8 (14,0%) como heterozigotas e 31 (54,4%) plantas suscetíveis. O marcador molecular SCAR 'Sw-421' constitui importante ferramenta para seleção e piramidação de alelos de resistência, especialmente quando se utilizam outras fontes de resistência ao vira-cabeça, como por exemplo, a fonte Rey de los Tempranos.