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1.
Arq. bras. med. vet. zootec. (Online) ; 73(2): 311-319, Mar.-Apr. 2021. tab
Artigo em Inglês | LILACS, VETINDEX | ID: biblio-1248952

Resumo

The objective of this study was to evaluate the rate of conception, metabolic, and structural conditions of cryopreserved bovine sperm cells, plus extender with IGF-1 and glutathione (GSH). 12 ejaculations of Nelore bulls were used, submitted to treatments: control, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) and gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). After cryopreservation and thawing the semen passed the fast thermo resistance test (TTR), plasma membrane and acrosomal integrity (PIAI), mitochondrial membrane potential (AP), oxidative stress, and conception rate. Tukey test was used for the statistical analysis of the parametric variables and the Friedman test for nonparametric. The gestation percentage was compared by the Chi-square test. There was no statistical difference (P<0.05) between treatments for the TTRr variable. Otherwise in the oxidative stress evaluated with the CellROX probe was noted that the IGF-1 showed the highest number of reactive cells (P<0.05). The PIAI, AP and gestation rate showed no difference among treatments (P>0.05), with an average of conceptions of 36.58%. It is concluded that IGF-1, gSH and their association did not cause changes in sperm motility, mitochondrial potential, plasma and acrosomal membrane integrity. IGF-1 increased oxidative stress, however, there was no difference in the gestation rate among the treatments.(AU)


Objetivou-se avaliar a taxa de concepção, as condições metabólicas e estrutural das células espermáticas bovinas criopreservadas, acrescidas de diluidores com fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 1(IGF-1) e glutationa (GSH). Foram utilizados 12 ejaculados de touros da raça Nelore, submetidos aos tratamentos: controle, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) e gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). Após a criopreservação e descongelação, o sêmen passou pelos testes de termorresistência rápida (TTRr), integridade de membrana plasmática e acrossomal (PIAI), alto potencial mitocondrial (AP), estresse oxidativo e taxa de concepção. Utilizou-se o teste de Tukey para as análises estatísticas das variáveis paramétricas e o teste de Friedman para as não paramétricas, com significância de 5%. A percentagem de gestação foi comparada pelo teste do qui-quadrado. Não hove diferença estatística (P<0,05) entre os tratamentos para a variável TTRr. Já no estresse oxidativo avaliado com a sonda CellROX, observou-se que o IGF-1 apresentou maior quantidade de células reativas (P<0,05), 36,38± 24,10. A PIAI, o AP e a taxa de gestação não apresentaram diferença entre tratamentos (P>0,05), com média de concepções de 36,58%. Conclui-se que o IGF-1, a gSH e a sua associação não causaram mudanças na motilidade espermática, no potencial mitocondrial, na integridade da membrana plasmática e acrossomal. O IGF-1 aumentou o estresse oxidativo, porém sem diferença na taxa de gestação entre os tratamentos.(AU)


Assuntos
Animais , Masculino , Bovinos , Preservação do Sêmen/métodos , Preservação do Sêmen/veterinária , Fator de Crescimento Insulin-Like I , Criopreservação/veterinária , Glutationa , Antioxidantes/uso terapêutico
2.
Anim. Reprod. (Online) ; 14(2): 437-441, Apr.-June.2017. graf, tab, ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1461268

Resumo

Considering the importance of ROS influence on sperm functionality and some limitations in sperm oxidative stress assessment methods, a field to studies of new techniques are still open. In this sense, the aim of this study is to validate the ROS detection technique through the CellRox Deep Red Reagent®probe in stallion sperm. Four stallions were used and the analyses were conducted on four replicates of semen samples from each of stallion (n = 16). The results of the polynomial regression presented a quadratic effect, high determination coefficient value (R2 = 0.88) and high significant P value (P < 0.0001). The CellRox Deep Red® fluorescent probe is able to detect reactive oxygen species in equine sperm, indicating accurately the occurrence of oxidative stress in stallion semen.


Assuntos
Masculino , Animais , Cavalos/embriologia , Corantes Fluorescentes/administração & dosagem , Corantes Fluorescentes/química , Espermatozoides/anormalidades
3.
Anim. Reprod. ; 14(2): 437-441, 17e.2017e.2017. graf, tab, ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-15959

Resumo

Considering the importance of ROS influence on sperm functionality and some limitations in sperm oxidative stress assessment methods, a field to studies of new techniques are still open. In this sense, the aim of this study is to validate the ROS detection technique through the CellRox Deep Red Reagent®probe in stallion sperm. Four stallions were used and the analyses were conducted on four replicates of semen samples from each of stallion (n = 16). The results of the polynomial regression presented a quadratic effect, high determination coefficient value (R2 = 0.88) and high significant P value (P < 0.0001). The CellRox Deep Red® fluorescent probe is able to detect reactive oxygen species in equine sperm, indicating accurately the occurrence of oxidative stress in stallion semen.(AU)


Assuntos
Animais , Masculino , Cavalos/embriologia , Corantes Fluorescentes/administração & dosagem , Corantes Fluorescentes/química , Espermatozoides/anormalidades
4.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-219663

Resumo

A fertilidade é a característica mais importante a ser considerada no manejo reprodutivo de bovinos. A este respeito, o efeito individual do touro é conhecido por ser de extrema importância, uma vez que um touro pode fertilizar um grande número de fêmeas. Tal efeito pode ser ainda mais acentuado com o uso de sêmen criopreservado que permite que o material genético de touros superiores seja conservado e transmitido ao rebanho. No entanto, lotes subférteis podem levar a perdas significativas. Isto pode ocorrer pois alguns touros apresentam características espermáticas dentro dos valores preconizados para a análise rotineira, mas com baixo índice de fertilidade. Um fator importante que pode prejudicar a fertilidade é o estresse oxidativo. Visando evitar esse efeito, uma terapia antioxidante pode ser uma alternativa. No entanto, escolher o antioxidante certo é a chave para o sucesso da terapia. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a susceptibilidade de espermatozóides de touros com diferentes taxas de fertilidade a diferentes desafios oxidativos com o objetivo de detectar os mais deletérios. Para tanto, 20 palhetas de sêmen de touros altamente férteis (n = 10) e pouco férteis (n = 10) foram descongelados e submetidos a desafios oxidativos induzidos (ânion superóxido [O¯], peróxido de hidrogênio [HO], radical hidroxila [(OH¯] e o subproduto tóxico da peroxidação lipídica (malondialdeído [MDA]). A fertilidade foi determinada usando um índice baseado em 170.000 inseminações artificiais realizadas em 543 fazendas. As amostras foram avaliadas quanto ao subproduto da peroxidação lipídica (substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico), cinética espermática (CASA), atividade mitocondrial (3'3 diamenobenzidina), estado oxidativo (CellROX verde e 2'-7 'diclorofluoresceína diacetato) , potencial mitocondrial (JC-1), integridade do DNA (SCSA), integridade das membranas plasmática (eosina-nigrosina) e acrossomal (Fast green/ rosa bengala). A análise estatística foi realizada utilizando o sistema SAS para Windows. Independentemente da fertilidade, a indução de hidroxila reduziu a atividade mitocondrial, enquanto a incubação com peróxido aumentou a atividade mitocondrial. No entanto, o grupo do peróxido foi altamente deletério para a cinética dos espermatozoides tanto em touros de alta quanto baixa fertilidade. O grupo de baixa fertilidade apresentou aumento da peroxidação nas amostras incubadas com peróxido de hidrogênio, enquanto o grupo de alta fertilidade foi mais suscetível ao radical hidroxila. Em conclusão, HO e OH¯ parecem ser as EROs mais deletérias para os espermatozoides bovinos, sendo que o grupo de baixa fertilidade é altamente afetado pelo peróxido de hidrogênio.


Fertility is the most important trait to consider in cattle reproductive management. In this regard, individual effect of bull is known to be of utmost importance as a bull can fertilize large numbers of females. Such effect can be even more pronounced when using cryopreserved semen, which allows the genetic material of superior bulls to be conserved and transmitted to the herd; However, sub fertile batches may lead to significant losses. This may occur due to bulls with seminal characteristics within the recommended values in the routine analysis but with lower fertility values. An important factor that may lead to impaired fertility is oxidative stress. Aiming to avoid this effect, an antioxidant therapy may be an alternative. However, choosing the right antioxidant is key to a successful therapy. Therefore, the aim of this study was to evaluate the susceptibility of bull spermatozoa with different fertility rates to different oxidative challenges aiming to detect the most deleterious. Toward this aim, 20 semen batches of highly fertile (n=10) and low fertile bulls (n=10)were thawed and submitted to induced oxidative challenges (superoxide anion [OH¯], hydrogen peroxide [HO], hydroxyl radical [OH¯] and the toxic by-product of lipid peroxidation (malondialdehyde [MDA])). Fertility was determined using an index based on 170,000 timed artificial inseminations in 543 farms. Samples were assessed for the quantification of the by-product of lipid peroxidation (thiobarbituric acid reative substances), sperm kinetics (CASA), mitochondrial activity (33 diamenobenzidine), oxidative status (CellROX green and 2'-7' dichlorofluorescein diacetate), mitochondrial potential (JC-1), DNA integrity (SCSA), and plasma membrane (eosin-nigrosin) and acrosome integrity (fast green/rose bengal). Statistical analysis was performed using the SAS system for windows. Regardless of fertility, hydroxyl induction reduced mitochondrial activity, whereas peroxide incubation increased mitochondrial activity. However, the peroxide group was highly deleterious to sperm kinetics. The low fertility group presented increased peroxidation in samples incubated with hydrogen peroxide whereas the high fertility group was more susceptive to hydroxyl. In conclusion, HO e OH¯ appears to be the most deleterious ROS to bovine sperm with the oxidative status of the low fertility group highly affected by the hydrogen peroxide.

5.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-217877

Resumo

A hipótese do presente estudo é de que o uso de gordura de palma e gordura de soja, protegidos com sais de cálcio e fornecidos via dieta afetam a histologia testicular e melhoram a qualidade do sêmen fresco e congelado de touros Nelores jovens, e pode interferir diretamente no perfil lipídico das células espermáticas e na fertilidade das doses de sêmen crio preservadas a ponto de melhorar a produção in vitro de embriões. No primeiro capítulo o objetivo foi avaliar a qualidade do sêmen fresco e a histologia testicular de 48 touros jovens da raça Nelore distribuídos aleatoriamente em quatro grupos consumindo os seguintes suplementos: Controle (CO, suplemento proteico-energético sem adição de gordura protegida); gordura de palma (OP, suplemento controle + adição de 285 g de gordura de palma protegida); gordura de soja (OS, suplemento controle + 285g de gordura de soja protegida) ou associação (OP+OS, suplemento controle + 145 g de gordura de soja protegida + 145 g de palma protegida). O período de suplementação durou 84 dias sendo então realizada a coleta e as avaliações do sêmen e a histologia dos testículos. As variáveis testiculares analisadas foram: circunferência escrotal (CE), consistência do testículo esquerdo (CONSTE), volume testicular do lado esquerdo (VOLTE), consistência do testículo direito (CONSTD) e volume testicular do testículo direito (VOLTD). Foram avaliados também os parâmetros seminais do sêmen fresco: Turbilhonamento (TURB), Motilidade (MOT), Vigor (VIG), Concentração (CONC) e o Volume seminal (VOL). Além disso, avaliou-se a Atividade Citoquímica mitocondrial (DAB) e a integridade funcional da membrana plasmática (HIPO). Com o auxílio da análise histológica avaliou-se o número de túbulos seminíferos (NTF), a densidade de superfície tubular (DST) e as características morfológicas das células germinativas: Célula (área (ARC), perímetro (PTC), circularidade (CIR), diâmetro mínimo (DMiC) e diâmetro máximo (DMaC) e Núcleo (área (ARN), perímetro, circularidade (PTN), diâmetro mínimo (DMiN), diâmetro máximo (DMaN), e relação núcleo/célula (NC). No segundo capítulo o objetivo foi avaliar o sêmen pós descongelamento na produção in vitro de embriões, associando com possíveis mudanças no perfil lipídico dos espermatozóides, após os 84 dias de suplementação foi realizada a criopreservação seminal dos ejaculados dos touros experimentais. No sêmen pós descongelamento as variáveis de movimentação foram avaliadas com técnica assistida por computador (CASA). Analisou-se também a atividade mitocondrial (DAB) e o estresse oxidativo induzido (TBARS induzido). Com o uso de sondas fluorescentes e análise em citometro de fluxo avaliou-se: a integridade de membrana plasmática e acrossomal (FITC-PI), o potencial de membrana mitocondrial sonda (JC-1), a quantidade de radicais livres intracelular (CellROX) e a desnaturação do DNA espermático através estabilidade da cromatina (LA). Foi realizada também a análise do perfil lipidico (LIP) dos espermatozóides sendo também testado na produção in vitro de embriões (PIVE). Os dados foram analisados utilizando o programa estatístico SAS (versão 9.3). Primeiro, verificou-se a normalidade e homogeneidade das variáveis e, quando necessário, foram aplicadas mudanças. Os dados foram primeiramente analisados através da ANOVA (análise de variância). Quando encontrada diferença para as variáveis paramêtricas utilizou-se o teste de médias Tukey e para as variáveis não paramétricas utilizou-se do teste Wilcoxon. Na análise de lipidômica utilizou-se de contrastes ortagonais (FC de 1.5, sem usar FDR- taxa de descoberta falsa). Utilizou-se 5% como nível de significância para todas as avaliações. Nas análises do sêmen fresco os animais dos grupos que receberam a suplementação contendo gordura de palma e gordura de soja protegidos, separados ou em associação apresentaram maior circunferência escrotal em comparação aos animais do grupo CO, porém os animais que consumiram dieta contendo oléo de Palma apresentaram maior volume do testículo direito (P= 0,0109) e tendência para menor volume do testículo esquerdo (P=0,0541), além disso apresentaram menor quantidade de túbulos seminíferos e números de células espermatogênica, menor densidade testicular. Por outro lado, apresentaram células com maior diâmetro máximo e maior relação núcleo-célula. Já a diferença estatística encontrada para a variável DAB -3, onde o grupo OP também apresentou diferença em relação aos outros grupos experimentais (P=0,0290) e é reflexo do maior número de espermatozoides DAB 1 nos animais que consumiram gordura de Palma. Já no sêmen pós-descongelamento a suplementação com a associação de gordura de palma e gordura de soja diminuiu a quantidade de espermatozoides com atividade mitocondrial reduzida (DAB 3) e melhorou a porcentagem da movimentação dos espermatozoides de touros Nelores jovens. Observou-se também a diminuição de 79 lipídeos (membrana e armazenamento) em todos os grupos que receberam suplementação com gordura protegida comparando os dias 0 e 86 do período experimental. Ademais, o grupo suplementado com gordura de Palma (OP) teve maior porcentagem de blastocistos (P= 0,0018) na produção in vitro de embriões. Dessa forma, conclui-se que a utilização de 285g de gordura de palma (protegido com sais de cálcio) pode ser uma alternativa de suplementação para melhorar os índices reprodutivos de touros jovens da raça Nelore.


The hypothesis of the present study was that testicular histology, fresh and post-thawed semen quality, sperm cells lipid profile and in vitro embryo production of young Nellore bulls could be affected after dietary supplementation with palm and soy oils protected with calcium salts. A review was carried out in order to answer the main questions of dietary supplementation with protected fat. In addition, two scientific papers were written aiming a better understanding of the results regarding dietary supplementation with protected fat in bulls. In the first chapter, the objective was to evaluate fresh semen quality and testicular histology of forty-eight young Nellore breeders. Therefore, the animals were randomly divided in four groups which were fed with the following supplements: Control (CO, corn and distillery grains supplement without the addition of protected fat); Palm oil (OP, control supplement + 285 g of protected palm fat); Soy oil (OS, control supplement + 285g of protected soy fat) or combination (OP + OS, control supplement + 145 g of protected soy fat + 145 g of protected palm). The supplementation lasted 84 days, and at the end this period semen collection and evaluation, as well as testicular sampling for histological analysis were performed. Scrotal circumference (SC), testicular consistency of the left testis (LTCONS), testicular volume on the left side (LTV), testicular consistency of the right testicle (RTCONS) and testicular volume of the right testicle (RTV) were assessed. Additionally, fresh semen swirling (SWIR), motility (MOT), vigor (VIG), concentration (CONC), seminal volume (VOL), mitochondrial cytochemical activity (DAB) and functional integrity of the plasma membrane (HIPO) were also evaluated. Histological analysis was performed by determining the number of seminiferous tubules (NTF), tubular surface density (DST) and germ cells morphological characteristics. Thus, for the latter: cell area (CAR), perimeter (CPT), circularity (CCIR), minimum diameter (CMiD) and maximum diameter (CMaD); and nucleus area (NAR), perimeter (NPT), circularity (NCIR), minimum diameter (NMiD), maximum diameter (NMaD), and nucleus/cell ratio (NC) were determined. The second chapter aimed to evaluate the sperm fertility of post-thawed semen on in vitro embryo production, and to determine if there was any correlation between this variable and changes in the sperm lipid profile. Therefore, post-thawed sperm movement characteristics were assessed by computer assisted sperm analysis (CASA). Sperm mitochondrial cytochemical activity and induced oxidative stress (induced TBARS) were also analyzed. Flow cytometry with the aid of fluorescent probes determined integrity of the plasma and acrosomal membranes (FITC-PI), mitochondrial membrane potential (JC-1), the amount of intracellular reactive oxygen species (CellROX) and DNA sperm denaturation through chromatin stability (LA). Sperm lipid profile (LIP) was performed and sperm was tested for fertility by in vitro embryo production (IVP). Normality and homogeneity of the variables were verified and, when necessary, changes were applied. Data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and compared by the Tukey mean test and Wilcoxon test for parametric and non-parametric variables, respectivelly. Orthogonal contrasts were applied (FC 1.5, without using FDR- false discovery rate) for lipidomic analysis. Level of significance was set at 5%, using SAS statistical program (version 9.3). Fresh semen evaluations showed lower percentage of sperm with less than half of the active mitochondria - DAB 3 (P = 0.0267) in animals supplemented with palm and soy oils (OP + OS). In addition, this finding affected directly the percentage of sperm with total (MOT) and progressive (PROG) motilities. Additionally, animals receiving palm and/or soy oils supplements showed greater scrotal circumference compared to the ones that were not supplemented. Nevertheless, animals fed with an enriched palm oil diet presented a greater right testicle volume (P = 0.0109) and a tendency of a smaller left testicle volume (P = 0.0541). The statistical difference found for the variable DAB 3 on OP group compared to the others experimental groups (P = 0.0290) is a reflection of an increased percentage of DAB 1 sperm in animals that consumed palm oil. In the post-thaw semen, supplementation with palm and/or soybean oils decreased the amount of sperm with reduced mitochondrial activity (DAB 3) and improved the percentage of motile sperm in young Nellore bulls. Sperm lipid profile evaluation showed a decrease of 79 lipids (membrane and storage) in all groups supplemented with protected fat comparing days 0 86 of the experimental period. As for the sperm fertility tested by IVP, palm oil supplementation led to a higher percentage of blastocysts (P = 0.0018). In conclusion, the use of 285g of palm oil (protected with calcium salts) in the animal feed could be used as a supplement alternative to improve reproductive rates of young Nellore bulls.

6.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-207869

Resumo

A vitrificação representa uma importante ferramenta em programas de melhoramento genético dos rebanhos, pois permite a criopreservação de gametas e embriões com menor percentual de crioinjúrias. Entretanto, lesões causadas nas organelas durante a criopreservação comprometem a taxa de sobrevivência dos embriões após o reaquecimento. Neste contexto, este estudo objetivou avaliar duas estratégias de suplementação com L-carnitina (modulador de atividade mitocondrial) na vitrificação de embriões ovinos da raça Santa Inês produzidos in vivo. Mórulas e blastocistos entre os dias 6 e 7 de desenvolvimento obtidos de ovelhas foram classificados quanto qualidade e estádio de desenvolvimento e uniformemente distribuídos entre os grupos experimentais. No ensaio 1 foram formados os grupos C1 (vitrificação sem suplementação) e LC1 (vitrificação suplementada com 3,72 mM L-carnitina). No ensaio 2, foram formados C2 (reaquecimento sem suplementação) e LC2 (reaquecimento suplementado com 3,72 mM L-carnitina). Após reaquecimento, os embriões foram cultivados in vitro para avaliação de sobrevivência às 24, 48 e 72h pós-reaquecimento. No ensaio 1, às 24h de CIV foram retirados 15 embriões reexpandidos (8 de C1 e 7 de LC1) e congelados em -80°C para extração de RNA e análise de expressão de genes relacionados ao metabolismo mitocondrial e estresse oxidativo através de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) e 22 embriões (9 de C1 e 13 de LC1) foram destinados para análise do número de células totais e de níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) através das colorações de Hoechst 33342 e CellROX® Green, respectivamente; às 72h de CIV, os embriões reexpandidos foram fixados para posterior análise de índice apoptótico por imunofluorescência com caspase-3. No ensaio 2 foram realizadas as mesmas avaliações de sobrevivência, sendo retirados 18 embriões (6 de C2 e 12 de LC2) do cultivo às 24h para congelação e análise de expressão dos mesmos genes avaliados no ensaio 1. Não foi observada diferença (p> 0,05) nas taxas de sobrevivência entre C1 e LC1 e entre C2 e LC2, tampouco nos níveis de ROS, número total de células, número de células apoptóticas e índice apoptótico entre C1 e LC1. Não houve diferença (p> 0,05) na expressão de CPT1 e CPT2 (carnitine palmytoil transferase 1 e 2) entre embriões frescos (CF), C1 e LC1 e entre CF e C2 e LC2, porém no ensaio 1 a abundância relativa de CrAT (carnitinte acetyl-O-transferase) foi sub-regulada (p<0,05) em LC1 (vs CF), e a abundância relativa de RNAm PRDX1 (peroxiredoxin 1) foi sub-regulada (p< 0,05) em C1 vs CF. No ensaio 2, a abundância relativa de CrAT e PRDX1 foram sobre-reguladas (p< 0,05) em C2 vs CF, e a de CrAT foi sub-regulada (p< 0,05) em LC2 vs CF. Conclui-se que na dosagem de 3,72 mM, a LC empregada durante a vitrificação ou reaquecimento, apesar de não ser observada diferença nas taxas de sobrevivência e na qualidade de embriões ovinos da raça Santa Inês produzidos in vivo, estimulam a resposta antioxidante celular e beneficia as vias de homeostase energética celular em nível molecular.


Vitrification represents an important tool in genetic improvement programs of the herds since it allows the cryopreservation of gametes and embryos with a lower percentage of cryoinjuries. However, damage caused in the organelles during cryopreservation compromise embryo survival rate after warming. In this context, the present study aimed to evaluate two strategies of supplementation with L-carnitine (modulator of mitochondrial activity) in vitrification medium used for in vivo-produced Santa Inês sheep embryos. Morulae and blastocysts between days 6 and 7 of development obtained from ewes were classified by quality and developmental stage and distributed among the experimental groups. In essay 1 the groups C1 (vitrification without supplementation) and LC1 (vitrification plus 3.72 mM L-carnitine) were set-up. In essay 2, were set-up C2 (warming without supplementation) and LC2 (warming plus 3.72 mM L-carnitine). After warming, embryos were in vitro cultured for survival evaluation at 24, 48 and 72h post-warming. In essay 1, 15 reexpanded embryos (8 from C1 and 7 from LC1) were frozen at -80°C at 24h IVC for RNA extraction and expression of genes correlated to mitochondrial metabolism and oxidative stress through Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR); 22 embryos (9 from C1 and 13 from LC1) were analysed for total cell number and reactive oxygen species (ROS) levels through Hoechst 33342 and CellROX® Green staining techniques, respectively; at 72h IVC, remaining reexpanded embryos were fixed for posterior analysis of apoptotic index by caspase-3 immunofluorescence staining. In essay 2 the same survival evaluations were performed. Eighteen embryos (6 from C2 and 12 from LC2) were withdrawn at 24h IVC for freezing and gene expression analysis of the same genes evaluated in essay 1. No difference was observed (p> 0.05) in survival rates between C1 and LC1 and between C2 and LC2, nor in ROS levels, total cell number, apoptotic cell number and apoptotic index between C1 and LC1. There was no difference (p> 0.05) in the expression of CPT1 and CPT2 (carnitine palmytoil transferase 1 and 2) between fresh embryos (CF), C1 and LC1 and between CF and C2 and LC2, but in essay 1 the relative abundance of CrAT (carnitine-O-acetyltransferase) was downregulated (p< 0.05) in LC1 (vs. CF), and the relative abundance of PRDX1 (peroxiredoxin 1) mRNA was downregulated (p< 0.05) in C1 vs CF. In essay 2, the relative abundance of CrAT and PRDX1 were upregulated (p< 0.05) in C2 vs CF, and CrAT was downregulated (p< 0.05) in LC2 vs CF. In conclusion, 3.72 mM LC during vitrification or warming, , it stimulate the cell antioxidant response and benefits cellular energy and homeostasis pathways at a molecular level, although no differences in survival rates and quality of in vivo produced Santa Inês sheep embryos are observed

7.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206519

Resumo

A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik® comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p 0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração.


Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik® ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

8.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203393

Resumo

As espécies reativas de oxigênio podem ser responsáveis por causar danos às membranas dos espermatozoides, fragmentação de DNA, entre outros fatores, influenciando assim na fertilidade principalmente no processo de criopreservação do sêmen. A melatonina (MEL) é um potente antioxidante anfifílico (hidro e lipossolúvel), o que a torna capaz de penetrar qualquer compartimento celular. O ácido ferúlico (AF) é um composto fenólico que exibe uma ampla gama de efeitos terapêuticos contra diversas doenças devido à sua potente ação antioxidante. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos antioxidantes AF e MEL na criopreservação do sêmen equino. Foram utilizados 5 ejaculados de 4 garanhões. Dentre os tratamentos aplicados, foram utilizadas duas concentrações de cada antioxidante (AF 0,5mM, AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM) além do controle (diluidor de congelação convencional BotuCrio®), totalizando 5 tratamentos. As variáveis analisadas foram cinética espermática através do sistema CASA (programa SCA - Sperm Class Analyser), morfologia, integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, com o uso das sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox Deep Red® nunca anteriormente utilizada em espermatozoides equinos. Comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3) e as diferenças entre eles foram localizadas através do teste de Duncan. A probabilidade de P0,05 foi considerada como diferença significativa. Os resultados para características da motilidade tiveram diferença significativa em alguns aspectos, porém nenhum tratamento foi superior ao controle. A avaliação da morfologia espermática apresentou uma diminuição nos defeitos maiores nas amostras tratadas com AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM. No que diz respeito às integridades de membrana, o tratamento MEL 1µM apresentou porcentagens significativamente melhores nas células inteiramente íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial). As células em estresse oxidativo não se diferenciaram entre os tratamentos. Previamente a este trabalho, foi realizado outro experimento para a validação da sonda fluorescente CellRox Deep Red® em espermatozoides de equinos. Foram utilizados 4 ejaculados de 4 garanhões aos quais eram submetidos aos tratamentos T0 (fração do ejaculado não submetida à indução do estresse oxidativo), T50 (50% da amostra não induzida e 50% induzida ao estresse oxidativo) e T100 (amostra induzida ao estresse oxidativo). Os dados de porcentagem de células positivas (com estresse oxidativo) foram submetidos à análise de regressão polinomial pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3). O valor do coeficiente de determinação (R2) foi igual a 0,88 e a probabilidade de P0,05 foi considerada significativa. Diante dos dois trabalhos citados acima e baseados nas análises realizadas, pode-se concluir que o tratamento MEL 1µM melhora a integridade de membranas espermáticas no processo de criopreservação do sêmen equino e que a sonda fluorescente CellRox Deep Red® é eficiente na detecção de espécies reativas de oxigênio no espermatozoide de garanhões.


Reactive oxygen species can be responsible for causing damage to the membranes of sperm, DNA fragmentation, among other factors influencing fertility especially in cryopreservation. Melatonin (MEL) is a potent antioxidant amphiphilic (hydro and fat soluble), which makes it able to penetrate any cell compartment. The ferulic acid (FA) is a phenolic compound that exhibits a wide range of therapeutic effects against various diseases due to their potent antioxidant effect. This study aimed to evaluate the effect of antioxidants AF and MEL in cryopreservation of equine semen. Five ejaculates from four stallions were used. Among the treatments, we used two concentrations of each antioxidant (AF 0.5mM, AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M) beyond the control (conventional freezing extender BotuCrio®), totaling five treatments. The parameters analyzed were sperm kinetics with the CASA system (SCA program - Sperm Class Analyzer), morphology, plasma and acrossomal membrane integrity mitochondrial membrane potential, using fluorescent probes PI, Hoechst 33342, FITC-PSA and JC- 1 over production of reactive oxygen species (ROS) by the sperm with the fluorescent probe CellRox Deep Red® never previously used in equine spermatozoa. Comparisons between treatments were performed by generalized linear model (PROC GLM) of SAS (version 9.3) and the differences between them were located with the Duncan test. The probability of P0.05 was considered significant. The results for the motility characteristics were significant differences in some aspects, but no treatment was superior to the control. The evaluation of sperm morphology showed a decrease in major defects in the samples treated with AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M. Regarding to membrane integrity, treatment MEL 1M showed significantly better in percentages of intact cells (intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential). Cells with oxidative stress not differ between treatments. Previously to this study, we performed another experiment to validate the fluorescent probe CellRox Deep Red® in equine sperm. Was used ejaculates of 4 stallion which were subjected to the treatments T0 (fraction of the ejaculate not subjected to induction of oxidative stress), T50 (50% sample uninduced and 50% induced to oxidative stress) and T100 (sample induced to oxidative stress). The data of percentage of positive cells (with oxidative stress) were submitted to polynomial regression analysis based on generalized linear model (GLM PROC) of SAS (version 9.3). The value of the coefficient of determination (R2) was 0.88 and a probability of P0.05 was considered significant. Considering the two studies cited above, and based on the analyzes, it is possible to conclude that the treatment MEL 1M improves sperm membrane integrity in the equine sperm cryopreservation process and the fluorescent probe CellRox Deep Red® is efficient in the detection of reactive oxygen species in stallions sperm.

9.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203421

Resumo

Objetivou-se com esse estudo avaliar a taxa de concepção, as condições metabólicas e estrutural das células espermáticas bovinas após a congelação, utilizando meios diluidores acrescidos de IGF-1 e glutationa. Foram utilizados 6 touros da raça Nelore, aptos a reprodução animal segundo o CBRA. Dois ejaculados de cada touro foram coletados e submetidos a quatro tratamentos: TI Controle; TII Glutationa (2mM/mL); TIII - IGF-I (100ng/mL); e TIV Glutationa (1mM/mL) + IGF-I (50ng/mL). Foi realizada análise subjetiva da motilidade e vigor espermático logo após a coleta do sêmen e após o congelamento foram realizadas análises morfológicas e funcionais como Teste de Termoresistência Rápida (TTRr), integridade de membrana plasmática e acrossomal (PIAI) por meio de sondas fluorescentes, estresse oxidativo e a taxa de concepção de novilhas da raça nelore. As variáveis paramétricas foram avaliadas pela ANOVA, comparando-se através do teste de Tukey e as não paramétricas pelo teste de Friedman, com significância de 5%. No TTRr os tratamentos não apresentaram efeito dentro do tempo (P> 0,05) 0, 10, 20 e 30 min. Porém, quando avaliado no tempo 0 e 30 min a glutationa manteve a motilidade dentro do tempo analisado (P < 0,05) de 40,8 ± 10,65 e 18,33±18,50, respectivamente. A avaliação das sondas fluorescentes e os efeitos dos tratamentos sobre as integridades da membrana plasmática e/ou acrossomal, também não apresentaram efeitos dos tratamentos (P> 0,05), onde se obteve resultados de PIAI para os tratamentos TI, TII, TIII e TIV de 13,58%, 14,66%, 14,87% e 14,29%, respectivamente. Quando avaliado o estresse oxidativo com a sonda CellROX, Deep Red, se observou que o IGF-1 apresentou maior quantidade de células espermáticas com estresse (P<0,05), TI (14,54 ± 10,08a212 ), TII (17,21 ± 19,21a), TIII (36,38 ± 24,10b) e TIV (24,04 ± 20,26a213 ). A taxa de gestação não apresentou diferença entre tratamentos (P>0,05), tendo uma média de 36,58% por ciclo estral. Conclui-se que o IGF-1 e associação não apresentaram alteração na motilidade e integridade das membranas, porém aumentou o número de células com estresse oxidativo. Já a glutationa, apesar de não ter causado alteração na integridade das membranas, permitiu a manutenção da motilidade dentro do tempo analisado.


The objective of this study was to evaluate the conception rate, metabolic and structural conditions of bovine sperm cells after freezing, using means with IGF-1 and glutathione. Six bulls were used Nellore, of breeding animals according to the CBRA. Two ejaculates from each bull were collected and submitted to four treatments: TI - Control; TII -Glutationa (2 mM / mL); TIII - IGF-I (100ng / mL) and TIV -Glutationa (1mM / mL) + IGF-I (50ng / mL). Was performed subjective motility analysis and sperm vigor immediately after collection of the semen and after freezing were carried out morphological and functional analysis as the heat resistance Test (TTRr), plasma membrane integrity and acrosome (PIAI) by means of fluorescent probes, stress oxidative and conception rate of Nellore breed heifers. The parametric variables were evaluated by ANOVA, comparing by Tukey test and the nonparametric by Friedman test, with significance level of 5%. In TTRr treatments had no effect in time (P> 0.05) 0, 10, 20 and 30 min. However, when assessed at time 0 and 30 min glutathione motility 245 kept within the examined time (P <0.05) 40.8 ± 10.65 and 18.33 ± 18.50, respectively. The evaluation of fluorescent probes and the effects of treatments on the integrity of the plasma membrane and / or acrosome, showed no effects of the treatments (P> 0.05),where we got results PIAI for treatments, TI, TII, TIII and TIV of 13.58%, 14.66%, 14.87% and 14.29%, respectively. When measured with oxidative stress CellROX Deep Red probe, was observed that IGF-1 showed more of the sperm with stress (P <0.05), TI (14.54 ± 10,08a), TII (19,21± 17 21a), TIII (36.38 ± 24,10b) and TIV (24.04 ± 20,26a251 ). The pregnancy rate was not different between treatments (P> 0.05), with an average of 36.58% per estrous cycle. We conclude that IGF-1 and association did not have changes in motility and membrane integrity, but increased the number of cells with oxidative stress. Already glutathione, although it has not caused changes in membrane integrity, motility possible to maintain within the examined time.

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