Congelação de espermatozoides recuperados do epidídimo de cão (Canis familiares) / Spermatozoa freezing recovered from dog epididymis (Canis familiares)

O presente estudo tem como objetivo avaliar o espermatozoide recuperado do epidídimo congelado/descongelado em diferentes diluidores. O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal do Setor Palotina no período de julho de 2017 a julho de 2019. Um mínimo de 40 CTE (complexo testículo epidídimo) de cães foi obtido de animais orquiectomizados. A recuperação dos espermatozoides da cauda do epidídimo foi realizada pela técnica de flutuação e submetida ao teste de swin-up para remoção dos resíduos celulares e espermatozoides inviáveis. Após a avaliação da concentração e motilidade, os espermatozoides foram diluidos pelo método “One Step” em Tris gema e/ou citrato gema e logo envazados em palhetas de 0,25mL numa concentração de 25 x 106 de espermatozoides viáveis. Logo as mesmas permaneceram em estabilização por 2 horas a temperatura de 5°C. Após foram colocadas em vapor de nitrogênio por 15 minutos, e por fim, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação foi realizada em banho maria a 37°C por um minuto, e após avaliou-se a motilidade e vigor em microscopia de Contraste de Fase 100x. Para avaliação da viabilidade espermática, foi utilizada a coloração vital Azul de Tripan/Giemsa. Na análise do sêmen descongelado, o diluente Tris-gema foi estatisticamente superior ao Citratogema nas variáveis motilidade, vigor e morfologia de espermatozoides epididimarios de cão. O presente estudo, mostra que é possível recuperar e preservar espermatozoides provenientes do epidídimo de canídeos utilizando meio crioprotetor a base de tris-gema.(AU)

The present study aims to evaluate sperm recovered from frozen / thawed epididymis in different extenders. The experiment was carried out in Animal Reproduction Laboratory at the Veterinary Hospital at the Palotina Sector from July 2017 to July 2019. A minimum of 40 ETC (epididymis testis complex) from dogs was obtained from orchiectomized animals. Epididymis tail sperm retrieval was performed by flotation technique and then submitted to the swin-up test to remove the unfeasible sperm and cellular waste. After evaluation of concentration and motility, the sperm were diluted by the “One Step” method in Tris yolk and / or citrate yolk and then packed in previously identified 0.25mL straws at a concentration of 25 x 106 viable sperm. Soon they remained in stabilization for 2 hours at 5 ° C. After that they were placed in nitrogen vapor for 15 minutes, and finally, dipped in liquid nitrogen and stored in cryogenic cylinder. The thawing was performed in a 37 ° C water bath for one minute, and then motility and vigor were evaluated by x100 magnification Phase Contrast microscopy. For sperm viability evaluation, the Tripan Blue/Giemsa vital stain was used. In the analysis of thawed semen, Tris-yolk extender was statistically superior to Yolk Citrate in the motility, vigor and morphology of dog epididymis sperm variables. The present study shows that it is possible to recovery and preserve sperm from the canid epididymis using tris-yolk cryoprotectant extender.(AU)

Congelação de espermatozoides recuperados do epidídimo de cão (Canis familiares) / Spermatozoa freezing recovered from dog epididymis (Canis familiares)

O presente estudo tem como objetivo avaliar o espermatozoide recuperado do epidídimo congelado/descongelado em diferentes diluidores. O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal do Setor Palotina no período de julho de 2017 a julho de 2019. Um mínimo de 40 CTE (complexo testículo epidídimo) de cães foi obtido de animais orquiectomizados. A recuperação dos espermatozoides da cauda do epidídimo foi realizada pela técnica de flutuação e submetida ao teste de swin-up para remoção dos resíduos celulares e espermatozoides inviáveis. Após a avaliação da concentração e motilidade, os espermatozoides foram diluidos pelo método “One Step” em Tris gema e/ou citrato gema e logo envazados em palhetas de 0,25mL numa concentração de 25 x 106 de espermatozoides viáveis. Logo as mesmas permaneceram em estabilização por 2 horas a temperatura de 5°C. Após foram colocadas em vapor de nitrogênio por 15 minutos, e por fim, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação foi realizada em banho maria a 37°C por um minuto, e após avaliou-se a motilidade e vigor em microscopia de Contraste de Fase 100x. Para avaliação da viabilidade espermática, foi utilizada a coloração vital Azul de Tripan/Giemsa. Na análise do sêmen descongelado, o diluente Tris-gema foi estatisticamente superior ao Citratogema nas variáveis motilidade, vigor e morfologia de espermatozoides epididimarios de cão. O presente estudo, mostra que é possível recuperar e preservar espermatozoides provenientes do epidídimo de canídeos utilizando meio crioprotetor a base de tris-gema.

The present study aims to evaluate sperm recovered from frozen / thawed epididymis in different extenders. The experiment was carried out in Animal Reproduction Laboratory at the Veterinary Hospital at the Palotina Sector from July 2017 to July 2019. A minimum of 40 ETC (epididymis testis complex) from dogs was obtained from orchiectomized animals. Epididymis tail sperm retrieval was performed by flotation technique and then submitted to the swin-up test to remove the unfeasible sperm and cellular waste. After evaluation of concentration and motility, the sperm were diluted by the “One Step” method in Tris yolk and / or citrate yolk and then packed in previously identified 0.25mL straws at a concentration of 25 x 106 viable sperm. Soon they remained in stabilization for 2 hours at 5 ° C. After that they were placed in nitrogen vapor for 15 minutes, and finally, dipped in liquid nitrogen and stored in cryogenic cylinder. The thawing was performed in a 37 ° C water bath for one minute, and then motility and vigor were evaluated by x100 magnification Phase Contrast microscopy. For sperm viability evaluation, the Tripan Blue/Giemsa vital stain was used. In the analysis of thawed semen, Tris-yolk extender was statistically superior to Yolk Citrate in the motility, vigor and morphology of dog epididymis sperm variables. The present study shows that it is possible to recovery and preserve sperm from the canid epididymis using tris-yolk cryoprotectant extender.

Óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino / Fish oil associated to ascorbic acid in diluter for cryopreservation goat semen

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão de óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino. Dois machos da raça Boer foram submetidos à coleta de sêmen pelo método de vagina artificial, sendo os ejaculados avaliados quanto aos aspectos físicos e morfológicos. Após avaliação, formou-se um pool, seguido do fracionamento em cinco grupos: G1 - diluidor citrato-gema e G2, G3, G4 e G5 - diluidor citrato-gema acrescido de 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0% de óleo de peixe e 0,05% de ácido ascórbico, respectivamente. Após descongelamento, foram realizadas avaliações físicas do sêmen e os testes complementares de termorresistência lento (TTR), hiposmótico (HO), integridade acrossomal e compactação da cromatina espermática. Houve comportamento linear crescente (P<0,05) para motilidade pós-descongelamento. Não houve diferença (P>0,05) para vigor pós-descongelamento (2,00±0,24). No TTR não houve diferença (P>0,05) para motilidade e vigor espermáticos entre os tempos cinco e 180min, com médias inicial e final de 62,17±12,13 e 14,29±10,55 para motilidade e de 2,00±0,52 e 0,49±0,44 para vigor. Não houve diferença (P>0,05) para o HO, com porcentagem média de espermatozoides reativos de 23,5±5,96%. Houve comportamento linear crescente para acrossoma íntegro e decrescente para acrossoma irregular (P<0,05). Não houve diferença (P>0,05) na compactação da cromatina, com 97,06±1,17% de cromatina íntegra. A inclusão até 4% de óleo de peixe acrescido de ácido ascórbico no diluidor melhorou motilidade e integridade de acrossoma após a criopreservação.(AU)

The study aimed to evaluate the effect of fish oil inclusion associated with ascorbic acid in the thinner for goat semen cryopreservation. Two male Boers underwent semen collection through the artificial vagina method, ejaculates being then assessed for physical and morphological aspects. After evaluation, a pool was formed, followed by the split into five groups: G1 - yolk-citrate extender and G2, G3, G4 and G5 - yolk-citrate extender plus 1.0; 2.0; 3.0 and 4.0% fish oil and 0.05% ascorbic acid, respectively. After thawing, physical evaluations of semen were assessed and additional testing slow heat resistance (TTR), hiposmotic (HO), acrosome integrity and compression of sperm chromatin. There was linear increase (P<0.05) post-thaw motility. No difference was obtained for post-thaw vigor and there was no influence of the association of fish oil and ascorbic acid in TTR. Plasma membrane integrity, by hyposmotic test (HO), presented a mean of reactive spermatozoa of 23.5±5.96% (P>0.05). There was linear increase for intact acrosome and decreasing acrosome irregular (P<0.05). In the analysis of the chromatin compaction, approximately 3% of damages (P>0.05) were observed. The inclusion of 4% fish oil plus ascorbic acid in diluter improved motility and acrosome integrity after cryopreservation.(AU)

Óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino / Fish oil associated to ascorbic acid in diluter for cryopreservation goat semen

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão de óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino. Dois machos da raça Boer foram submetidos à coleta de sêmen pelo método de vagina artificial, sendo os ejaculados avaliados quanto aos aspectos físicos e morfológicos. Após avaliação, formou-se um pool, seguido do fracionamento em cinco grupos: G1 - diluidor citrato-gema e G2, G3, G4 e G5 - diluidor citrato-gema acrescido de 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0% de óleo de peixe e 0,05% de ácido ascórbico, respectivamente. Após descongelamento, foram realizadas avaliações físicas do sêmen e os testes complementares de termorresistência lento (TTR), hiposmótico (HO), integridade acrossomal e compactação da cromatina espermática. Houve comportamento linear crescente (P<0,05) para motilidade pós-descongelamento. Não houve diferença (P>0,05) para vigor pós-descongelamento (2,00±0,24). No TTR não houve diferença (P>0,05) para motilidade e vigor espermáticos entre os tempos cinco e 180min, com médias inicial e final de 62,17±12,13 e 14,29±10,55 para motilidade e de 2,00±0,52 e 0,49±0,44 para vigor. Não houve diferença (P>0,05) para o HO, com porcentagem média de espermatozoides reativos de 23,5±5,96%. Houve comportamento linear crescente para acrossoma íntegro e decrescente para acrossoma irregular (P<0,05). Não houve diferença (P>0,05) na compactação da cromatina, com 97,06±1,17% de cromatina íntegra. A inclusão até 4% de óleo de peixe acrescido de ácido ascórbico no diluidor melhorou motilidade e integridade de acrossoma após a criopreservação.(AU)

The study aimed to evaluate the effect of fish oil inclusion associated with ascorbic acid in the thinner for goat semen cryopreservation. Two male Boers underwent semen collection through the artificial vagina method, ejaculates being then assessed for physical and morphological aspects. After evaluation, a pool was formed, followed by the split into five groups: G1 - yolk-citrate extender and G2, G3, G4 and G5 - yolk-citrate extender plus 1.0; 2.0; 3.0 and 4.0% fish oil and 0.05% ascorbic acid, respectively. After thawing, physical evaluations of semen were assessed and additional testing slow heat resistance (TTR), hiposmotic (HO), acrosome integrity and compression of sperm chromatin. There was linear increase (P<0.05) post-thaw motility. No difference was obtained for post-thaw vigor and there was no influence of the association of fish oil and ascorbic acid in TTR. Plasma membrane integrity, by hyposmotic test (HO), presented a mean of reactive spermatozoa of 23.5±5.96% (P>0.05). There was linear increase for intact acrosome and decreasing acrosome irregular (P<0.05). In the analysis of the chromatin compaction, approximately 3% of damages (P>0.05) were observed. The inclusion of 4% fish oil plus ascorbic acid in diluter improved motility and acrosome integrity after cryopreservation.(AU)

VIABILIDADE SEMINAL E STATUS DA CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA DE SÊMEN OVINO REFRIGERADO EM DIFERENTES DILUENTES, DILUIÇÕES E CONDIÇÕES DE AEROBIOSE

O objetivo deste estudo foi de determinar o status de capacitação espermática (CA) e de reação acrossomal (RA) durante o processamento e refrigeração do sêmen ovino sob diferentes diluentes, fatores de diluição e condições de aerobiose em função do tempo. Foram coletados ejaculados de dois carneiros adultos por vagina artificial a intervalos de 48-72 h. Após avaliações macro- e microscópicas, o sêmen foi segregado em grupos sob três diluentes (Tris-gema, citrato-gema ou leite desnatado), dois fatores de diluição (1 x 109 ou 100 x 106 células/mL) e duas condições de aerobiose (aeróbico ou semi-anaeróbico). O sêmen foi mantido refrigerado por 72 h, com avaliações a cada 24 h desde o equilíbrio a 5oC (T0). Alíquotas dos ejaculados frescos e de cada sub-grupo refrigerado de acordo com o diluente, a diluição e a aerobiose, foram coletadas nos tempos T0 e T72 para a determinação do status do acrossomo por coloração com clortetraciclina (CTC), e da integridade de membrana com azul de tripano e Giemsa. As maiores e menores quedas de motilidade e vigor espermáticos (M/V) em função do tempo foram observadas com a utilização de citrato-gema e Tris-gema, respectivamente. A proporção de espermatozoides com capacitação e/ou reação acrossomal aumentou após a diluição e armazenamento do sêmen ovino a 5oC, havendo correlação negativa com a viabilidade e M/V em função do tempo. Os fatores de variação sobre a M/V foram o diluente e o tempo de refrigeração, enquanto o status do acrossomo e a sobrevivência espermática esteve mais associada à condição de aerobiose e fator de diluição, com o diluente apresentando menor impacto no status do acrossomo em função do tempo.

The aim of this study was to determine the status of sperm capacitation (CA) and acrosome reaction (AR) during processing and refrigeration of ovine semen under different extenders, dilution factors and aerobiosis conditions as a function of time. Ejaculates were collected from two adult rams by artificial vagina at 48-72 h intervals. After macro- and microscopic evaluations, semen was segregated into groups under three extenders (Tris-egg yolk, citrate-egg yolk or skimmed milk), two dilution factors (1 x 109 or 100 x 106 cells/mL) and two aerobiosis conditions (aerobic or semi-anaerobic). Diluted semen was kept refrigerated for 72 h, with evaluations every 24 h from the equilibrium at 5oC (T0). Aliquots of fresh ejaculates and of each refrigerated diluted subgroup according to extender, dilution and aerobiosis were collected at times T0 and T72 for determination of acrosome status by staining with chlortetracycline (CTC), and membrane integrity with trypan blue and Giemsa. The largest and smallest falls in sperm motility and sperm vigor (M/V) as a function of time were observed with the use of citrate-yolk and Tris-yolk extenders, respectively. The proportion of capacitated and/or acrosome reacted sperm cells gradually increased over time after dilution and storage at 5oC, with a negative correlation observed with viability and M/V as a function of time. Variation factors on M/V were extender and refrigeration time, while acrosome status and sperm survival were more associated with aerobiosis condition and dilution factor, with the extender having less impact on the acrosome status as a function of time.

Adição do látex de mangabeira (Hancornia speciosa) ao diluidor citrato-glicose-gema na motilidade do sêmen ovino resfriado por 24h: estudos preliminares / Addition of mangabeira latex (Hancornia speciosa) to citrate-glucose-egg yolk extender on motility of ram semen cooled for 24 hours: preliminary studies

This study aimed to evaluate the effect of different concentrations of mangabeira latex (Hancorniaspeciosa) added to ram semen extender on motility of cooled semen stored for 24 hours. The latex was added tocitrate-glucose-yolk extender in concentrations of 0% (control), 2%, 4% and 6% (v:v) and diluted with SantaInês ram semen and cooled to 4°C for 24h. The semen was evaluated for sperm motility and vigor. No statisticaldifferences were found for fresh semen and the treatments with the addition of latex. These results indicate thatno improvement in ram semen quality cooled and stored for 24 by the addition of mangabeira latex.(AU)

Adição do látex de mangabeira (Hancornia speciosa) ao diluidor citrato-glicose-gema na motilidade do sêmen ovino resfriado por 24h: estudos preliminares / Addition of mangabeira latex (Hancornia speciosa) to citrate-glucose-egg yolk extender on motility of ram semen cooled for 24 hours: preliminary studies

This study aimed to evaluate the effect of different concentrations of mangabeira latex (Hancorniaspeciosa) added to ram semen extender on motility of cooled semen stored for 24 hours. The latex was added tocitrate-glucose-yolk extender in concentrations of 0% (control), 2%, 4% and 6% (v:v) and diluted with SantaInês ram semen and cooled to 4°C for 24h. The semen was evaluated for sperm motility and vigor. No statisticaldifferences were found for fresh semen and the treatments with the addition of latex. These results indicate thatno improvement in ram semen quality cooled and stored for 24 by the addition of mangabeira latex.

Teste de ligação do espermatozoide à membrana perivitelina da gema de ovo após a a adição de Ringer Lactato, Citrato de Sódio 2,92% e solução TRIS no sêmen caprino congelado / Sperm-perivitelline membrane egg binding assay after addition of Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS Solution in thawed goat semen

Com o presente estudo se verificou através do Teste de Ligação dos Espermatozoides à Membrana Perivitelina da Gema de Ovo a capacidade fecundante dessas células após o descongelamento e adição das soluções Ringer com Lactato, Citrato de Sódio 2,92% e TRIS. O sêmen dos animais foi coletado e realizado os procedimentos padrões de análise e criopreservação seminal. Após o descongelamento foi adicionado os diluentes Ringer com Lactato, Citrato de Sódio 2,92 % e Solução TRIS, os quais continham substâncias protetoras aos espermatozoides. Logo após, foram realizados os Testes de Ligação do Espermatozoide à Membrana Perivitelina da Gema de Ovo e Morfológico. Os parâmetros seminais do sêmen fresco ficaram de acordo com preconizado pela legislação vigente (CBRA,1998). A capacidade de ligação dos espermatozoides à membrana perivitelina da gema do ovo foi semelhante entre os tratamentos (P>0,05), mas foi observada correlação positiva entre a motilidade espermática e a capacidade de ligação (P<0,05). A diluição do sêmen criopreservado com soluções isoosmóticas após o descongelamento pode ser útil na manutenção da qualidade espermática e no aumento do volume existente a fim de otimizar a realização de testes e biotecnologias reprodutivas in vitro.

The present study was verified by testing for binding of sperm to the perivitelline membrane of the egg yolk fertilizing capacity of these cells after thawing and addition of Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS Solution. The semen of animals was collected and performed the standard procedures of analysis and cryopreservation seminal. After thawing was added the solutions Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS, which contained protective substances to sperm and performed the tests in vitro Sperm-Perivitelline Membrane egg Binding and Morphology. The seminal parameters of fresh semen were recommended according to current legislation. The binding capacity of the sperm membrane perivitelline egg yolk was similar between treatments(P>0,05), but there was a positive correlation between sperm motility and binding capacity (P<0,05). Thus, the dilution of semen cryopreserved with solutions isoosmóticas after thawing can be useful in maintaining the quality of sperm and increase existing volume to optimize the testing and reproductive biotechnologies in vitro.

Teste de ligação do espermatozoide à membrana perivitelina da gema de ovo após a a adição de Ringer Lactato, Citrato de Sódio 2,92% e solução TRIS no sêmen caprino congelado / Sperm-perivitelline membrane egg binding assay after addition of Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS Solution in thawed goat semen

Com o presente estudo se verificou através do Teste de Ligação dos Espermatozoides à Membrana Perivitelina da Gema de Ovo a capacidade fecundante dessas células após o descongelamento e adição das soluções Ringer com Lactato, Citrato de Sódio 2,92% e TRIS. O sêmen dos animais foi coletado e realizado os procedimentos padrões de análise e criopreservação seminal. Após o descongelamento foi adicionado os diluentes Ringer com Lactato, Citrato de Sódio 2,92 % e Solução TRIS, os quais continham substâncias protetoras aos espermatozoides. Logo após, foram realizados os Testes de Ligação do Espermatozoide à Membrana Perivitelina da Gema de Ovo e Morfológico. Os parâmetros seminais do sêmen fresco ficaram de acordo com preconizado pela legislação vigente (CBRA,1998). A capacidade de ligação dos espermatozoides à membrana perivitelina da gema do ovo foi semelhante entre os tratamentos (P>0,05), mas foi observada correlação positiva entre a motilidade espermática e a capacidade de ligação (P<0,05). A diluição do sêmen criopreservado com soluções isoosmóticas após o descongelamento pode ser útil na manutenção da qualidade espermática e no aumento do volume existente a fim de otimizar a realização de testes e biotecnologias reprodutivas in vitro.(AU)

The present study was verified by testing for binding of sperm to the perivitelline membrane of the egg yolk fertilizing capacity of these cells after thawing and addition of Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS Solution. The semen of animals was collected and performed the standard procedures of analysis and cryopreservation seminal. After thawing was added the solutions Ringer Lactate, Sodium Citrate 2.92% and TRIS, which contained protective substances to sperm and performed the tests in vitro Sperm-Perivitelline Membrane egg Binding and Morphology. The seminal parameters of fresh semen were recommended according to current legislation. The binding capacity of the sperm membrane perivitelline egg yolk was similar between treatments(P>0,05), but there was a positive correlation between sperm motility and binding capacity (P<0,05). Thus, the dilution of semen cryopreserved with solutions isoosmóticas after thawing can be useful in maintaining the quality of sperm and increase existing volume to optimize the testing and reproductive biotechnologies in vitro.(AU)

Comparação entre técnicas de recuperação de espermatozóides epididimários em cães

A coleta de espermatozoides diretamente do epidídimo, tem sido amplamente explorada em animais domésticos como uma alternativa para obtenção de gametas em situações especiais. Esse trabalho teve o objetivo de comparar qualitativa e quantitativamente duas técnicas de recuperação de espermatozoides da cauda de epidídimos de cães, utilizando-se dois diluidores de sêmen. Para o estudo quantitativo, foram utilizados epidídimos de 33 cães submetidos a orquiectomia eletiva. Imediatamente após orquiectomia, os epidídimos foram dissecados e a cauda individualizada, em uma delas testou-se a técnica de Fluxo Retrógrado (FR), injetando-se 1 ml do diluente pelo ducto deferente, no sentido da cauda do epidídimo. No outro epidídimo testou-se a técnica de Fatiamento e Flutuação (FF), que consiste na fragmentação da cauda do epidídimo e parte do ducto deferente, deixando os fragmentos em repouso, imersos em meio diluente, por 10 minutos, recuperando o sobrenadante em seguida. Todas as amostras foram avaliadas quanto a vigor, motilidade e número de espermatozoides recuperados. Em 16 destes epidídimos foi comparada a utilização de diferentes diluentes de sêmen, em oito animais foi testado o diluente Tris citrato com adição de gema de ovo a 20% (Nutricell®), nos outros oito cães foi testado o diluente Caniplus Enhance (Minitube®), utilizando-se as duas técnicas descritas. As médias do número total de espermatozoides, para os dois métodos foram: 258.872.697 de espermatozoides utilizando-se FF e 413.686.363 utilizando-se FR. O número total de espermatozoides recuperados com o uso do fluxo retrógrado pela cauda do epidídimo foi superior (p<0,05) ao número total obtido utilizando-se FF. Indicando que, para se obter um maior aproveitamento quantitativo da amostra, a técnica de fluxo retrógrado é a melhor opção. Foi observada maior motilidade espermática em espermatozoides recuperados por fluxo retrógrado, em comparação ao fatiamento e flutuação (médias de FR e FF, respectivamente 78,75 % ± 0,16 e 53,75 % ± 0,21 com Enhance® e 76,25 % ± 0,092 e 66,25% ± 0,12 com Tris citrato). O diluente Enhance® apresentou melhores resultados na avaliação da morfologia espermática com relação aos defeitos de cauda e cabeça, resultado pode ser atribuído a diferentes osmolaridades dos diluentes. A técnica de fluxo retrógrado tem se mostrado superior ao fatiamento e flutuação, quantitativa e qualitativamente, em cães. Palavras-chave: concentração espermática, fluxo retrógrado, flutuação, diluentes de sêmen, biotecnologia da reprodução.

The collection of spermatozoa by direct puncture of the epididymis is a technique broadly used on domestic animals as an alternative to obtain gametes in special situations. The current studies were undertaken to compare the number of canine spermatozoa obtained with two different techniques: the retrograde flushing (RF) and the float-up (FL) methods. We used the epididymis of 33 dogs previously submitted to elective orchiectomy. The vas deferens and the cauda epididymis were dissected and randomly submitted to one of the mentioned recovery techniques. In one of them, we used the retrograde flushing method (RF) by injecting 1 mL of the diluent through the vas deferens to the cauda. In the other epididymis, we used the float-up method (FL), consisting on the fragmentation of the cauda and part of the vas deferens, leaving the fragments immersed in dilution medium for 10 minutes. We used the epididymis of 16 animals previously submitted to elective orchiectomy. In eight of them, we applied the Tris-citrate diluent supplemented with 20% egg yolk (Nutricell®). The other eight samples were tested using the CaniPlus Enhance diluent (Minitube®). The samples were analysed regarding their vigor, motility, number of retrieved spermatozoa and morphology. The average spermatozoa count was: 258.872.697, when using FL, and 413.686.363, when using RF. The total number of spermatozoa recovered by the retrograde flushing method was higher (p<0,05) than the one obtained by the float-up method. The current studies showed that the motility was higher among the spermatozoa recovered by retrograde flushing (average number being 78,75 % ± 0,16 with CaniPlus and 76,25 % ± 0,092 with Tris-citrate, against 53,75 % ± 0,21 and 66,25% ± 0,12 when using the float-up method). The CaniPlus Enhance diluent reached better results in the morphological analysis regarding to the cauda and caput defects. The use of the RF in canine samples revealed itself as a better method than the FL, both qualitatively and quantitatively. The CaniPlus Enhance diluent presented better results than the egg-yolk Tris-citrate, when it comes to preserve de ideal morphology of the spermatozoa collected from canine epididymis.