AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS NO PLASMA SEMINAL DE TOURINHOS SENEPOL DA PUBERDADE À MATURIDADE SEXUAL

Na agropecuária brasileira o comercio de carne e destaque no setor econômico para aperfeiçoamento da cadeia produtiva o cruzamento industrial de animais de origem taurina e zebuíno vem como uma alternativa permitindo assim um ganho em heterose, refletindo na produtividade animal sem perder adaptabilidade ao clima tropical. A raça Senepol vem ganhando destaque nesse cenário, pois é um genótipo taurino de alto potencial genético para produção de carne e adaptado ao clima tropical, mais poucas informações têm sido relatadas sobre seus aspectos reprodutivos. Assim a raça Senepol por ser um genótipo promissor a ser utilizado no cruzamento com raças zebuínas buscando-se aumentar a eficiência produtiva e conhece mais sobre seu desenvolvimento reprodutivo. O objetivo do presente estudo foi avaliar a evolução dos parâmetros seminais com a expressão de proteínas no plasma seminal da puberdade até a maturidade sexual de tourinhos da raça Senepol criados no Triângulo Mineiro- MG. Amostra de sêmen utilizadas de 10 tourinhos PO (puros de origem) da raça Senepol com idade de 12,22 ±0,16 meses esses animais foram divididos em dois grupos (5 maduros sexualmente aos 16 meses e 5 imaturos sexualmente aos 16 meses ) foram coletadas em cinco idades, com intervalos regulares de 30±2 dias entre elas, no período de Outubro/2010 a Fevereiro/2011 e o plasma seminal foi centrifugado e submetido à eletroforese bidimensional (2-DE). Os géis foram corados com Coomassie Blue G-250, digitalizados e analisados pelo programa PDQuest 2-D Analysis Software para identificação dos spots Foram identificados 51 spots diferencialmente expressos sendo 10 spots entre os dois grupos de animais (Maduros e Imaturos sexualmente aos 16 meses de idade) sendo as proteínas BSP-30 kDa, spermadhesin-1, seminal plasma protein PDC-109 e albumina , 34 spots entre as idades medias avaliadas sendo as proteínas BSP-30 kDa, spermadhesin-1, seminal plasma protein PDC-109, platelet activating factor acetylhydrolase, spermadhesin Z13, cystatin M, glutathione peroxidase 3, matrilin 4, serpin B4, WAP four-disulfide core domain, serpin peptidase inhibitor, clade B like , immunoglobulin gamma 1, Immunoglobulin light e epididymisspecific. 7 spots foram diferentes significativamente entre os dois grupos e as idades medias avaliadas demostrando que expressão dessas proteínas ocorreu de forma diferente ao longo tempo sendo elas WAP four-disulfide core domain, Spermadhesin 1, BSP 30 KD, beta-2 microglobuline Acrosin inhibitor 1. A diferença na expressão dessas proteínas ao longo das idades podem caracterizar possíveis marcadores moleculares da maturidade sexual de touros da raça Senepol criado no Triangulo Mineiro-MG.

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Influence of Caffeine and Chondroitin Sulfate on Swine Sperm Capacitation and In Vitro Embryo Production

Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)

Influence of Caffeine and Chondroitin Sulfate on Swine Sperm Capacitation and In Vitro Embryo Production

Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)(AU)

Proteoma do plasma seminal de touros da raça Gir - Leiteiro (Bos taurus indicus) clinicamente normais e com hipoplasia testicular

A raça Gir Leiteiro é uma excelente opção para os rebanhos leiteiros no Brasil pelas características apresentadas por seus animais, como rusticidade, adaptabilidade e produção de leite expressiva. A hipoplasia testicular causa problemas reprodutivos nos touros podendo levar à subfertilidade ou, em casos mais graves, à infertilidade. No Brasil, a incidência dessa patologia varia de 5 a 15%. Devido à grande importância que animais da raça Gir Leiteiro têm na pecuária brasileira e aos impactos negativo, tanto em termos de fertilidade quanto economicamente, causados pela hipoplasia testicular, este trabalho objetivou traçar o perfil proteico diferencialmente expresso entre animais com esta patologia e clinicamente normais. Amostras de sêmen de 18 animais (9 hipoplásicos e 9 normais) foram coletadas e o plasma seminal foi centrifugado e submetido à eletroforese bidimensional (2-DE). Os géis foram corados com Coomassie Blue G-250, digitalizados e analisados pelo programa PDQuest 2-D Analysis Software para identificação dos spots. Foram identificados 33 spots diferencialmente expressos entre os dois grupos de animais, sendo 26 mais intensamente expressos em animais hipoplásicos. Os spots foram cortados dos géis e submetidos à espectrometria de massa sendo identificadas 38 proteínas e, dentre estas, o grupo de proteínas conhecidas como Binder of Sperm Proteins (BSP) e a platelet-activating fator acetylhydrolase (PAF AH) foram as mais presentes nos spots identificados nos animais hipoplásicos. Os animais também foram submetidos à avaliação clinico-andrológica e houve diferenças estatísticas quanto ao comprimento, largura e volume testicular, turbilhonamento e defeitos espermáticos (p<0,05).

The Gir - Dairy is an excellent option for dairy herds in Brazil because of the features presented by its animals, such as hardiness, adaptability and expressive milk production. Testicular hypoplasia causes reproductive problems in bulls and can lead to subfertility or, in more severe cases, infertility. In Brazil, the incidence of this disease varies from 5 to 15%. Due to the great importance that Gyr- Dairy animals have in the Brazilian cattle industry and because of the negative impact, not only in economically terms but also in fertility, caused by testicular hypoplasia, this study aimed to determine the differentially expressed protein profile between animals with this disease and clinically normal . Semen samples from 18 animals (9 hypoplastic and 9 normal) were collected and seminal plasma was centrifuged and subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE). Gels were stained with Coomassie Blue G-250, digitized and analyzed using PDQuest program 2-D Analysis Software to identify the "spots". Were identified 33 "spots" differentially expressed between the two groups of animals, 26 more intensely expressed in hypoplastic animals. The "spots" were cut from the gels and subjected to mass spectrometry and identified 38 proteins and, among these, the group of proteins known as Binder of Sperm Proteins (BSP) and platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF - AH) were more present in spots identified in hypoplastic animals. The animals also underwent clinical and soundness evaluation and were statistical differences in the length, width and testicular volume, turbulence and sperm defects (p <0.05).

Influência da estação do ano sobre as prote?nas do plasma seminal de touros limousin

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da estação do ano sobre as proteínas do plasma seminal em touros Limousin. Coletou-se amostras de sêmen de 12 animais com dois anos de idade por eletroejaculação, durante o inverno, com sete dias de intervalo, em um total de 55 amostras. No verão, nove desses touros foram reavaliados pelo exame andrológico. Amostras do sêmen foram centrifugadas a 1500 g/15 min e acondicionadas em tubos eppendorf?, estocadas a -20ºC até o processamento. As proteínas foram extraídas de 200 L de cada amostra em 2mL de tampão de extração composto por 0,625M Tris-HCl; pH 6,8, 2% SDS, 5% -mercaptoetanol e 20% de glicerol. As proteínas foram quantificadas e as eletroforeses realizadas; e os géis fixados e corados na mesma solução com 2% de Coomassie Blue R250. Nos touros A, C, D, E, H e I a ausência de proteínas de alto peso molecular (APM 55KDa, 66KDa e 80KDa) foi verificada no inverno e uma que se supõe ser de baixa fertilidade (BF 40 KDa) ausente no touro D, no verão. Os touros F, G e J mostraram presença de proteínas de APM (55KDa) no inverno. Nos touros H, I e J, proteínas APM (55KDa, 66KDa ou 80KDa) estiveram presentes com uma condição satisfatória de sêmen. O touro I mostrou presença de proteínas APM (66KDa e 80KDa) no verão. Sugere-se que as diferentes estações do ano podem influenciar a presença ou ausência de proteínas no plasma seminal.

INFLUÊNCIA DA ESTAÇÃO DO ANO SOBRE AS PROTE?NAS DO PLASMA SEMINAL DE TOUROS LIMOUSIN

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da estação do ano sobre as proteínas do plasma seminal em touros Limousin. Coletou-se amostras de sêmen de 12 animais com dois anos de idade por eletroejaculação, durante o inverno, com sete dias de intervalo, em um total de 55 amostras. No verão, nove desses touros foram reavaliados pelo exame andrológico. Amostras do sêmen foram centrifugadas a 1500 g/15 min e acondicionadas em tubos eppendorf?, estocadas a -20ºC até o processamento. As proteínas foram extraídas de 200 L de cada amostra em 2mL de tampão de extração composto por 0,625M Tris-HCl; pH 6,8, 2% SDS, 5% -mercaptoetanol e 20% de glicerol. As proteínas foram quantificadas e as eletroforeses realizadas; e os géis fixados e corados na mesma solução com 2% de Coomassie Blue R250. Nos touros A, C, D, E, H e I a ausência de proteínas de alto peso molecular (APM 55KDa, 66KDa e 80KDa) foi verificada no inverno e uma que se supõe ser de baixa fertilidade (BF 40 KDa) ausente no touro D, no verão. Os touros F, G e J mostraram presença de proteínas de APM (55KDa) no inverno. Nos touros H, I e J, proteínas APM (55KDa, 66KDa ou 80KDa) estiveram presentes com uma condição satisfatória de sêmen. O touro I mostrou presença de proteínas APM (66KDa e 80KDa) no verão. Sugere-se que as diferentes estações do ano podem influenciar a presença ou ausência de proteínas no plasma seminal.

Identification of proteases produced by entomopathogenic fungi Beauveria bassiana (Bals) Vuill. strain CG432 previously activated in coffee berry borer alive (Hypothenemus hampei) / Identificação de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (Bals) Vuill. Cepa CG432 previamente ativada em insetos vivos de broca do café ((Hypothenemus hampei))

Conidia of entomopathogenic fungi can penetrate the insect exoskeleton both by mechanic action of the germinative tube and by production of multiple proteases, chitinases, and lipases in response to the composition of the insect cuticle. Therefore the purpose of this work was to produce, to purify, and to characterize the structure of the proteases produced by the fungus Beauveria bassiana CG432, previously activated in adults of coffee berry borer (Hypothenemus hampei) grown under submerged culture conditions. A suspension containing 106 activated conidia/mL was inoculated to a culture medium at 28ºC and 150 rpm for 3 days. Protease extracts, were obtained by centrifugation at 8000g for 20 minutes, were fractionated and were concentrated by ultrafiltration using controlled porosity membranes of 100 kDa and 3 kDa, respectively. Gel filtration chromatography on Sephadex G-100 isolated one protein peak (peak II), which contained 56% of residues of the aminoacid aspartic acid, characterized by HPLC using an ODS-C18 reverse phase column. The peak protein showed specific activity 43 times superior when compared to the free-cell extract in bovine serum albumin, subtilisin-like protease activity, and a single protein band reveled by Brilliant Coomassie Blue on a gelatin zimogram PAGE electrophoresis, by native conditions. The homogeneity of peak II was confirmed by revelation of a sin

Conídios de fungos entomopatogênicos atravessam o exoesqueleto do inseto pela ação mecânica do tubo germinativo e produção de múltiplas isoformas de proteases, quitinases e lipases em resposta à composição da cutícula do inseto. Desta forma o objetivo deste trabalho foi extrair, purificar e caracterizar a estrutura de proteases produzidas em cultivo submerso por Beauveria bassiana CG432 previamente ativada em adultos vivos de broca-do-café (Hypothenemus hampei). Uma suspensão contendo 106 conídios ativados/mL foi inoculada em meio de cultura líquido a 28ºC, 150 rpm por 3 dias. O extrato de proteases (EP) foi obtido da centrifugação a 8000 g por 20 minutos, fracionado e concentrado por ultrafiltração em membrana de porosidade controlada 100 kDa e 3 kDa, respectivamente. A cromatografia de gel filtração em Sephadex G-100 separou um pico proteico (Pico II) que apresentou 56% de resíduos do aminoácido ácido aspártico quando analisado por HPLC em coluna de fase reversa ODS-C18; atividade específica 43 vezes superior ao EP sobre soro albumina bovina; atividade de protease tipo-subtilisina e uma única banda proteica revelada por nitrato de prata e Coomassie Brilhant Blue em zimograma sobre gelatina por eletroforese PAGE em condições nativas. A homogeneidade do Pico II foi confirmada pela revelação de uma única banda durante a determinação do pH isoelétrico igual a 4,5, porém a determi

Identification of proteases produced by entomopathogenic fungi Beauveria bassiana (Bals) Vuill. strain CG432 previously activated in coffee berry borer alive (Hypothenemus hampei) / Identificação de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (Bals) Vuill. Cepa CG432 previamente ativada em insetos vivos de broca do café ((Hypothenemus hampei))

Conidia of entomopathogenic fungi can penetrate the insect exoskeleton both by mechanic action of the germinative tube and by production of multiple proteases, chitinases, and lipases in response to the composition of the insect cuticle. Therefore the purpose of this work was to produce, to purify, and to characterize the structure of the proteases produced by the fungus Beauveria bassiana CG432, previously activated in adults of coffee berry borer (Hypothenemus hampei) grown under submerged culture conditions. A suspension containing 106 activated conidia/mL was inoculated to a culture medium at 28ºC and 150 rpm for 3 days. Protease extracts, were obtained by centrifugation at 8000g for 20 minutes, were fractionated and were concentrated by ultrafiltration using controlled porosity membranes of 100 kDa and 3 kDa, respectively. Gel filtration chromatography on Sephadex G-100 isolated one protein peak (peak II), which contained 56% of residues of the aminoacid aspartic acid, characterized by HPLC using an ODS-C18 reverse phase column. The peak protein showed specific activity 43 times superior when compared to the free-cell extract in bovine serum albumin, subtilisin-like protease activity, and a single protein band reveled by Brilliant Coomassie Blue on a gelatin zimogram PAGE electrophoresis, by native conditions. The homogeneity of peak II was confirmed by revelation of a sin

Conídios de fungos entomopatogênicos atravessam o exoesqueleto do inseto pela ação mecânica do tubo germinativo e produção de múltiplas isoformas de proteases, quitinases e lipases em resposta à composição da cutícula do inseto. Desta forma o objetivo deste trabalho foi extrair, purificar e caracterizar a estrutura de proteases produzidas em cultivo submerso por Beauveria bassiana CG432 previamente ativada em adultos vivos de broca-do-café (Hypothenemus hampei). Uma suspensão contendo 106 conídios ativados/mL foi inoculada em meio de cultura líquido a 28ºC, 150 rpm por 3 dias. O extrato de proteases (EP) foi obtido da centrifugação a 8000 g por 20 minutos, fracionado e concentrado por ultrafiltração em membrana de porosidade controlada 100 kDa e 3 kDa, respectivamente. A cromatografia de gel filtração em Sephadex G-100 separou um pico proteico (Pico II) que apresentou 56% de resíduos do aminoácido ácido aspártico quando analisado por HPLC em coluna de fase reversa ODS-C18; atividade específica 43 vezes superior ao EP sobre soro albumina bovina; atividade de protease tipo-subtilisina e uma única banda proteica revelada por nitrato de prata e Coomassie Brilhant Blue em zimograma sobre gelatina por eletroforese PAGE em condições nativas. A homogeneidade do Pico II foi confirmada pela revelação de uma única banda durante a determinação do pH isoelétrico igual a 4,5, porém a determi

Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça gir / SDS-PAGE seminal plasma proteins pattern and its correlation with gir breed semen freezability

Foram utilizados dez animais doadores de sêmen em nível de Central de Inseminação Artificial, da raça Gir, divididos em dois grupos, de acordo com o grau de congelabilidade do sêmen de cada animal. Os animais com sêmen de alta congelabilidade foram aqueles cuja porcentagem de ejaculados viáveis pós-descongelação foi superior a 80 por cento. O grupo de baixa congelabilidade tinha animais com porcentagem menor que 50 por cento de ejaculados viáveis pós-descongelação. Os critérios de avaliação da viabilidade do sêmen e seleção dos animais foram definidos pelo controle de qualidade do Departamento de Produção da Central de Inseminação Artificial. Foram feitas quatro coletas semanais consecutivas, sendo que obtiveram-se as amostras de plasma seminal por centrifugação a 1.500 g por 15 a 20 minutos a 4ºC, momentos após a coleta do sêmen em vagina artificial. O plasma seminal foi dialisado em membrana de celulose, em tampão Tris-Glicina pH-7,4 por 24 horas a 4ºC, em agitação lenta e constante. As amostras foram padronizadas em 1,0 mg/ml de proteína total, por diluição em tampão Tris-HCl 62mM pH-6,2 mais 20 por cento de glicerol e 4 por cento de SDS. Através de eletroforese do tipo SDS-PAGE, foram feitas as corridas em gel a 13 por cento. A corrida foi feita com a constante de 25 mA, por um período de 5 horas. A coloração do gel foi feita por Coomassie Brilliant Blue. Pelos resultados obtidos, verificou-se que existe uma banda no grupo de alta congelabilidade, cujo fragmento polipeptídico desta proteína tem Mr (mobilidade relativa) 20,3 e PM (peso molecular) aproximado de 61.800 Da. Esta banda nao foi detectada nas amostras do grupo de baixa congelabilidade, o que sugere ser um possível marcador bioquímico quanto ao potencial de criopreservação do sêmen de bovinos.(AU)