Uso de placa aquecedora visando a incubação do espermatozoide ovino após criopreservação / Use of heating plate aiming at the ovine sperm incubation after cryopreservation

Objetivou-se avaliar a utilização da placa aquecedora, em substituição ao banho-maria, no teste de termorresistência (TTR) de espermatozoides de carneiros após a criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de três carneiros adultos (n=30), por meio de vagina artificial para ovinos. Em seguida, foram diluídos em TrisGema de ovo, a uma concentração final de 200 x106 sptz/mL, e submetidos á curva de resfriamento, para posterior criopreservação em palhetas em nitrogênio líquido. Após descongelação, as amostras foram analisadas quanto à integridade de membrana, de acrossoma e atividade mitocondrial. O sêmen então foi dividido em dois tubos e submetido ao TTR, um em banho-maria e outro em placa aquecedora, e, ainda, avaliado a cada 30 minutos, do tempo zero (pós-descongelação) até 90 minutos de incubação, a 37 °C, quanto à motilidade espermática e à motilidade progressiva. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Após o processo de congelação/descongelação, os espermatozoides apresentaram baixo percentual de integridade de membrana e elevado percentual de atividade mitocondrial e integridade do acrossoma. Não foi observada diferença na motilidade espermática nem na motilidade progressiva ao longo do TTR, quando comparados os espermatozoides que foram incubados em banho-maria aos incubados em placa aquecedora durante o período de 90 minutos. A placa aquecedora pode ser utilizada como meio de incubação dos espermatozoides de carneiros em substituição ao banho-maria.

The objective was to evaluate the use of the hot plate to replace the water bath in the thermo resistance test of ovine sperm after cryopreservation. Ten ejaculates were also collected from three adult sheep (n=30), by means of artificial sheep vagina. The collected samples were diluted in Tris-Egg Yolk, at a final concentration of 200 x106 sptz/mL and subjected to a cooling curve for subsequent cryopreservation in liquid nitrogen straws. Immediately after thawing, the samples were analyzed for membrane and acrosome integrity, and mitochondrial activity. The semen was then divided into two tubes and submitted to TTR, one in a water bath and the other in a hot plate, and evaluated every 30 minutes, from time zero (post-thaw) until 90 minutes of incubation at 37 °C, for sperm motility and progressive motility. The variables were subjected to analysis of variance and the means were compared using the Tukey test at 5% probability. After the freeze/thawing process, sperm showed a low percentage of membrane integrity, high percentage of mitochondrial activity, in addition to maintaining the integrity of acrossome. No difference was observed in sperm motility nor progressive motility, along the TTR, when comparing the sperm that were incubated in a water bath in relation to those incubated in a hot plate during the period of 90 minutes. The heating plate can be used as a means of incubating sheep sperm in replacement of the water bath.

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.(AU)

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.(AU)

Uso de sêmen refrigerado bovino: quebrando paradigmas / Colled bovine semen: breaking paradigms

A utilização do sêmen refrigerado (SR) cresce a cada dia, no entanto mais estudos são necessários para validar e viabilizar o uso em massa desta biotécnica, garantindo aumento dos índices de prenhez, quando utilizamos sêmen refrigerado comparado com o sêmen congelado de um mesmo touro. A membrana plasmática é a parte da estrutura do espermatozoide mais susceptível a modificações durante o processo de criopreservação, as quais são causadas por alterações de temperatura induzidas sobre as células (curva de resfriamento e congelamento, além do processo de pós-descongelamento), ou seja, em última análise, ocorre a diminuição da viabilidade das células, principalmente, porque a membrana espermática é submetida a rearranjos estruturais envolvendo lípideos e proteínas. Assim, quanto menor for o processamento, mais células viáveis estarão disponíveis no momento da fecundação e, consequentemente, aumentará a prenhez. Na tentativa de diminuir as perdas celulares, o uso do sêmen refrigerado ressurge com a possibilidade de aumentar a prenhez nos protocolos de IATF.(AU)

The use of cooled semen (CS) has been increase every day, however more researches are needed to validate and spread this biotech, improves pregnancy rates higher than when compared to the frozen semen of same bull. Plasma membrane is the part of the sperm structure most susceptible to modifications during the cryopreservation process caused by changes in temperature that the cell undergoes (cooling and freezing curve besides the process of post-thawing), that is, in the last analysis, there is a decrease in cell viability, mainly because the sperm membrane is submitted to structural rearrangements involving lipids and proteins. Thus, the smaller the processing, the more viable cells will be available at the time of fertilization and consequently, the pregnancy will increase. In an attempt to decrease cell losses, the use of cooled semen resurfaces with the possibility of increasing pregnancy in the IATF protocols.(AU)

Uso de sêmen refrigerado bovino: quebrando paradigmas / Colled bovine semen: breaking paradigms

A utilização do sêmen refrigerado (SR) cresce a cada dia, no entanto mais estudos são necessários para validar e viabilizar o uso em massa desta biotécnica, garantindo aumento dos índices de prenhez, quando utilizamos sêmen refrigerado comparado com o sêmen congelado de um mesmo touro. A membrana plasmática é a parte da estrutura do espermatozoide mais susceptível a modificações durante o processo de criopreservação, as quais são causadas por alterações de temperatura induzidas sobre as células (curva de resfriamento e congelamento, além do processo de pós-descongelamento), ou seja, em última análise, ocorre a diminuição da viabilidade das células, principalmente, porque a membrana espermática é submetida a rearranjos estruturais envolvendo lípideos e proteínas. Assim, quanto menor for o processamento, mais células viáveis estarão disponíveis no momento da fecundação e, consequentemente, aumentará a prenhez. Na tentativa de diminuir as perdas celulares, o uso do sêmen refrigerado ressurge com a possibilidade de aumentar a prenhez nos protocolos de IATF.

The use of cooled semen (CS) has been increase every day, however more researches are needed to validate and spread this biotech, improves pregnancy rates higher than when compared to the frozen semen of same bull. Plasma membrane is the part of the sperm structure most susceptible to modifications during the cryopreservation process caused by changes in temperature that the cell undergoes (cooling and freezing curve besides the process of post-thawing), that is, in the last analysis, there is a decrease in cell viability, mainly because the sperm membrane is submitted to structural rearrangements involving lipids and proteins. Thus, the smaller the processing, the more viable cells will be available at the time of fertilization and consequently, the pregnancy will increase. In an attempt to decrease cell losses, the use of cooled semen resurfaces with the possibility of increasing pregnancy in the IATF protocols.

QUALIDADE ESPERMÁTICA DURANTE A CURVA DE RESFRIAMENTO DO SÊMEN SUÍNO DILUÍDO EM ÁGUA DE COCO EM PÓ VISANDO SUA CRIOPRESERVAÇÃO

Abstract Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 ºC for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution - BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Resumo A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 ºC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution - BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Use of alternative extender added of fructose aiming the cryopreservation of boar semen / Utilização de diluente alternativo acrescido de frutose visando à criopreservação de sêmen suíno

This study aimed to analyze skimmed milk powder (SMP) and fructose in a new cooling curve to freeze boar semen. A total of 49 semen samples from seven boars were cryopreserved using the new curve with addition of glucose and fructose to the refrigerating diluents: Beltsville Thawing Solution (BTS + G; BTS + F) and Skimmed milk powder (SMP + G; SMP + F), totaling four experimental groups for analysis. To finish the curve, aliquots of semen were packaged in 0.5 ml straws and kept in liquid nitrogen. During the cooling curve, SMP mean spermatic vigor and motility were greater than the BTS (p < 0.05). After thawing, a decrease of spermatic force and motility in both extenders was observed, where the BTS presented spermatic vigor (2.1 ± 0.55) and motility (38 ± 21.8), presenting better results (p < 0.05). There was no statistical difference between sugars added to the BTS and SMP in spermatic force and motility (p > 0.05), although the use of fructose allowed an equalization of motility between the SMP and BTS (p > 0.05). Functionality of membrane was better preserved with the addition of fructose, in both extenders. The rate of sperm viability was significantly higher in extender containing glucose and SMP (71.8 ± 12.5). The percentage of intact acrosome was higher on the treatment containing glucose, independent of the extender (BTS + G: 81.8 ± 7.2, SMP + G: 81.4 ± 14.2). To conclude, the results suggest that the BTS is still the best option to cryopreserve and fructose could be used in boar semen cryopreservation in new cooling curve.(AU)

O presente trabalho analisou o emprego do leite em pó desnatado (LPD) adicionado de frutose em uma nova curva de resfriamento para criopreservação de sêmen suíno. Um total de 49 ejaculados, de sete varrões foram criopreservados utilizando a nova curva de resfriamento com glicose e frutose adicionada aos diluentes Beltsville Thawing Solution (BTS + D; BTS + F) e Leite em pó desnatado (LPD + D; LPD + F), totalizando quatro grupos experimentais para análises. Ao final da curva, as alíquotas de sêmen foram envasadas em palhetas de 0,5 mL e mantidas em nitrogênio líquido. Durante a curva de resfriamento, a média de vigor e motilidade espermática do LPD foi maior do que do BTS (p < 0.05). Após descongelação, observou-se queda do vigor e motilidade em ambos diluentes, com o BTS apresentando melhores resultados de vigor (2,1 ± 0,55) e de motilidade (38 ± 21,8) (p < 0,05). Entretanto, o uso da frutose permitiu equiparação dos valores da motilidade entre LPD e BTS (p > 0,05). A funcionalidade de membrana foi melhor preservada com adição da frutose, em ambos os diluentes. Os dados de vitalidade espermática foram significativamente maiores no diluente contendo glicose e LPD (71,8 ± 12,5). A porcentagem de acrossomas intactos foi maior no tratamento que continha glicose, independentemente do diluente utilizado (BTS + G: 81,8 ± 7,2, SMP + G: 81,4 ± 14,2). Os resultados obtidos indicaram que o BTS, ainda é a melhor opção de criopreservação e que a frutose pode ser utilizada para criopreservação de sêmen de varrão na nova curva de resfriamento.(AU)

Use of alternative extender added of fructose aiming the cryopreservation of boar semen / Utilização de diluente alternativo acrescido de frutose visando à criopreservação de sêmen suíno

This study aimed to analyze skimmed milk powder (SMP) and fructose in a new cooling curve to freeze boar semen. A total of 49 semen samples from seven boars were cryopreserved using the new curve with addition of glucose and fructose to the refrigerating diluents: Beltsville Thawing Solution (BTS + G; BTS + F) and Skimmed milk powder (SMP + G; SMP + F), totaling four experimental groups for analysis. To finish the curve, aliquots of semen were packaged in 0.5 ml straws and kept in liquid nitrogen. During the cooling curve, SMP mean spermatic vigor and motility were greater than the BTS (p < 0.05). After thawing, a decrease of spermatic force and motility in both extenders was observed, where the BTS presented spermatic vigor (2.1 ± 0.55) and motility (38 ± 21.8), presenting better results (p < 0.05). There was no statistical difference between sugars added to the BTS and SMP in spermatic force and motility (p > 0.05), although the use of fructose allowed an equalization of motility between the SMP and BTS (p > 0.05). Functionality of membrane was better preserved with the addition of fructose, in both extenders. The rate of sperm viability was significantly higher in extender containing glucose and SMP (71.8 ± 12.5). The percentage of intact acrosome was higher on the treatment containing glucose, independent of the extender (BTS + G: 81.8 ± 7.2, SMP + G: 81.4 ± 14.2). To conclude, the results suggest that the BTS is still the best option to cryopreserve and fructose could be used in boar semen cryopreservation in new cooling curve.(AU)

O presente trabalho analisou o emprego do leite em pó desnatado (LPD) adicionado de frutose em uma nova curva de resfriamento para criopreservação de sêmen suíno. Um total de 49 ejaculados, de sete varrões foram criopreservados utilizando a nova curva de resfriamento com glicose e frutose adicionada aos diluentes Beltsville Thawing Solution (BTS + D; BTS + F) e Leite em pó desnatado (LPD + D; LPD + F), totalizando quatro grupos experimentais para análises. Ao final da curva, as alíquotas de sêmen foram envasadas em palhetas de 0,5 mL e mantidas em nitrogênio líquido. Durante a curva de resfriamento, a média de vigor e motilidade espermática do LPD foi maior do que do BTS (p < 0.05). Após descongelação, observou-se queda do vigor e motilidade em ambos diluentes, com o BTS apresentando melhores resultados de vigor (2,1 ± 0,55) e de motilidade (38 ± 21,8) (p < 0,05). Entretanto, o uso da frutose permitiu equiparação dos valores da motilidade entre LPD e BTS (p > 0,05). A funcionalidade de membrana foi melhor preservada com adição da frutose, em ambos os diluentes. Os dados de vitalidade espermática foram significativamente maiores no diluente contendo glicose e LPD (71,8 ± 12,5). A porcentagem de acrossomas intactos foi maior no tratamento que continha glicose, independentemente do diluente utilizado (BTS + G: 81,8 ± 7,2, SMP + G: 81,4 ± 14,2). Os resultados obtidos indicaram que o BTS, ainda é a melhor opção de criopreservação e que a frutose pode ser utilizada para criopreservação de sêmen de varrão na nova curva de resfriamento.(AU)

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution – BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution – BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

Qualidade espermática durante a curva de resfriamento do sêmen suíno diluído em água de coco em pó visando sua criopreservação / Sperm quality during the cooling curve of swine semen diluted in coconut water extender aiming your cryopreservation

A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 oC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.(AU)

Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 °C for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.(AU)

CURVAS DE RESFRIAMENTO DO SÊMEN DO VARRÃO DILUÍDO EM ACP®103 ADICIONADO DE GEMA DE OVO EM CONCENTRAÇÃO FIXA

Abstract The conservation of boar semen at lower temperatures might contribute to the further expansion of artificial insemination in this species. Egg yolk cryoprotectant properties have already been extensively tested on sperm cryopreservation of several species. This study aimed to test different temperature curves for the conservation of boar semen diluted with coconut milk powdered (ACP®-103) add 7% egg yolk and to verify which one better maintains sperm viability. For this, 36 ejaculates were diluted and stored at 17, 10 and 5 °C. Daily analysis of vigor and motility were performed, and on days D0, D2, and D4 semen was evaluated regarding vitality, morphology, and osmotic resistance. For the statistical analysis we performed the tests of Kruska-Wallis with Dunns post-test (nonparametric data) and ANOVA and Tukey test (parametric data). The storage temperature of 10 °C was the best one to maintain spermatic motility at appropriate levels to be used in an artificial insemination program. Analyses of viability, morphology, and hypoosmotic test did not show statistical difference among the treatments. In conclusion, the best temperature curve was 10 °C with diluted semen previously kept at 17 °C to maintain the viability of sperm cells in pigs for a longer period.

Resumo A conservação do sêmen suíno em temperaturas mais baixas pode permitir uma maior expansão da inseminação artificial nessa espécie. A gema de ovo apresenta propriedades crioprotetoras já amplamente testadas na conservação seminal de diversas espécies. Este trabalho teve por objetivo testar diferentes curvas de temperatura na conservação do sêmen suíno diluído em água de coco em pó (ACP®-103) acrescido de 7% de gema de ovo e verificar qual delas mantém por mais tempo a viabilidade espermática. Para tanto, o sêmen de 36 ejaculados foi diluído e conservado a 17, 10 e 5 °C. Diariamente foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias D0, D2 e D4 o sêmen foi avaliado quanto à sua viabilidade, morfologia acrossomal e resistência osmótica. Para a análise estatística foram utilizados os testes de Kruska-Wallis, com pós-teste de Dunns (dados não paramétricos) e Anova com teste de Tukey (dados paramétricos). A conservação à temperatura de 10 °C foi a que melhor manteve o vigor espermático e a motilidade em níveis adequados para ser utilizado em um programa de inseminação artificial. As análises de vitalidade, morfologia e teste hiposmótico não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos avaliados. Em conclusão, a melhor curva de temperatura foi a de 10 °C com sêmen diluído por manter por um período maior a viabilidade da célula espermática suína.

Curvas de resfriamento do sêmen do varrão diluído em ACP®103 adicionado de gema de ovo em concentração fixa / Cooling curves of the boar semen diluted in ACP®103 extender added of powdered egg yolk in fixed concentration

The conservation of boar semen at lower temperatures might contribute to the further expansion of artificial insemination in this species. Egg yolk cryoprotectant properties have already been extensively tested on sperm cryopreservation of several species. This study aimed to test different temperature curves for the conservation of boar semen diluted with coconut milk powdered (ACP®-103) add 7% egg yolk and to verify which one better maintains sperm viability. For this, 36 ejaculates were diluted and stored at 17, 10 and 5 C. Daily analysis of vigor and motility were performed, and on days D0, D2, and D4 semen was evaluated regarding vitality, morphology, and osmotic resistance. For the statistical analysis we performed the tests of Kruska-Wallis with Dunns post-test (nonparametric data) and ANOVA and Tukey test (parametric data). The storage temperature of 10 C was the best one   to maintain spermatic motility at appropriate levels to be used in an artificial insemination program. Analyses of viability, morphology, and hypoosmotic test did not show statistical difference among the treatments. In conclusion, the best temperature curve was 10 C with diluted semen previously kept at 17 C to maintain the viability of sperm cells in pigs for a longer period.

A conservação do sêmen suíno em temperaturas mais baixas pode permitir uma maior expansão    da inseminação artificial nessa espécie. A gema de ovo apresenta propriedades crioprotetoras já amplamente testadas na conservação seminal de diversas espécies. Este trabalho teve por objetivo testar diferentes curvas de temperatura na conservação do sêmen suíno diluído em água de coco    em pó (ACP®-103) acrescido de 7% de gema de ovo e verificar qual delas mantém por mais tempo  a viabilidade espermática. Para tanto, o sêmen de 36 ejaculados foi diluído e conservado a 17,        10 e 5 C. Diariamente foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias D0, D2 e D4 o sêmen foi avaliado quanto à sua viabilidade, morfologia acrossomal e resistência osmótica. Para a análise estatística foram utilizados os testes de Kruska-Wallis, com pós-teste de Dunns (dados não paramétricos) e Anova com teste de Tukey (dados paramétricos). A conservação à temperatura de 10 C foi a que melhor manteve o vigor espermático e a motilidade em níveis adequados para ser utilizado em um programa de inseminação artificial. As análises de vitalidade, morfologia e teste hiposmótico não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos avaliados. Em conclusão, a melhor curva de temperatura foi a de 10 C com sêmen diluído por manter por um período maior a viabilidade da célula espermática suína.

Curvas de resfriamento do sêmen do varrão diluído em ACP®103 adicionado de gema de ovo em concentração fixa / Cooling curves of the boar semen diluted in ACP®103 extender added of powdered egg yolk in fixed concentration

The conservation of boar semen at lower temperatures might contribute to the further expansion of artificial insemination in this species. Egg yolk cryoprotectant properties have already been extensively tested on sperm cryopreservation of several species. This study aimed to test different temperature curves for the conservation of boar semen diluted with coconut milk powdered (ACP®-103) add 7% egg yolk and to verify which one better maintains sperm viability. For this, 36 ejaculates were diluted and stored at 17, 10 and 5 C. Daily analysis of vigor and motility were performed, and on days D0, D2, and D4 semen was evaluated regarding vitality, morphology, and osmotic resistance. For the statistical analysis we performed the tests of Kruska-Wallis with Dunns post-test (nonparametric data) and ANOVA and Tukey test (parametric data). The storage temperature of 10 C was the best one   to maintain spermatic motility at appropriate levels to be used in an artificial insemination program. Analyses of viability, morphology, and hypoosmotic test did not show statistical difference among the treatments. In conclusion, the best temperature curve was 10 C with diluted semen previously kept at 17 C to maintain the viability of sperm cells in pigs for a longer period. (AU)

A conservação do sêmen suíno em temperaturas mais baixas pode permitir uma maior expansão    da inseminação artificial nessa espécie. A gema de ovo apresenta propriedades crioprotetoras já amplamente testadas na conservação seminal de diversas espécies. Este trabalho teve por objetivo testar diferentes curvas de temperatura na conservação do sêmen suíno diluído em água de coco    em pó (ACP®-103) acrescido de 7% de gema de ovo e verificar qual delas mantém por mais tempo  a viabilidade espermática. Para tanto, o sêmen de 36 ejaculados foi diluído e conservado a 17,        10 e 5 C. Diariamente foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias D0, D2 e D4 o sêmen foi avaliado quanto à sua viabilidade, morfologia acrossomal e resistência osmótica. Para a análise estatística foram utilizados os testes de Kruska-Wallis, com pós-teste de Dunns (dados não paramétricos) e Anova com teste de Tukey (dados paramétricos). A conservação à temperatura de 10 C foi a que melhor manteve o vigor espermático e a motilidade em níveis adequados para ser utilizado em um programa de inseminação artificial. As análises de vitalidade, morfologia e teste hiposmótico não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos avaliados. Em conclusão, a melhor curva de temperatura foi a de 10 C com sêmen diluído por manter por um período maior a viabilidade da célula espermática suína. (AU)

The use of skimmed dried milk as an alternative diluent for the cooling step during the boar sêmen freezing procedure / Leite em pó desnatado como diluente alternativo na etapa de resfriamento durante protocolo de congelação do sêmen suíno

One of the critical points in the cryopreservation process is the use of a proper diluent while lowering the temperature following the resuspension and thawing processes. Here, we tested an alternative diluent for the process of freezing boar semen. We used skimmed dried milk (SDM) during the cooling and post-thawed resuspension steps. To do so, we collected semen from 15 Dalland boars using the glovedhand technique, and incubated each ejaculate sample at 30 C. We then removed two semen aliquots from a pre-dilution. We diluted one of the aliquots in Beltsville thawing solution (BTS - control), and the remaining sample was diluted in SDM. Both aliquots were subsequently held at 30º C for 45 min (1st period of stabilization). At the end of this period, we analysed vigor and motility to determine sperm metabolic activity. We then held the diluted semen at 25 C for 30 min (2nd period of stabilization) and at 17 C for 2 h (3rd period stabilization). We centrifuged the semen at 800 × g and 1600 × g at 5º C for 15 min, discarded the supernatant, and resuspended the sperm pellet in 2 mL of the cooling diluent at 5 C for 1h. We again diluted the samples in 2 mL of the freezing diluent, poured them into straws, and cooled and plunged them into liquid N2. The sêmen samples were thawed in a 39º C water bath, and were resuspended in their respective diluents at the same temperature. We determined the following sperm features: vigor, motility, vitality, acrosomal integrity and membrane functionality. During the first phase of temperature cooling (30º C), semen diluted in SDM exhibited a higher vigor (3.4 ± 0.6) and motility (78.6 ± 13.0) than those diluted BTS (vigor: 3.1 ± 0.7; motility: 69.4±14.3).(AU)

Esse estudo objetivou testar um diluente alternativo, a base de leite em pó desnatado, durante as etapas de resfriamento e ressuspensão pós descongelação durante a congelação do sêmen suíno. Para isso o sêmen de 15 varrões da raça Dalland, foi coletado através da técnica da mão enluvada. Visando o início da curva de congelação, cada ejaculado foi incubado a 30 C. Em seguida, foram retiradas duas alíquotas de sêmen para uma pré-diluição. Uma das alíquotas foi diluída no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS - Controle) e a outra em leite em pó desnatado (LPD), onde permaneceram a essa temperatura por 45 minutos. O sêmen pré-diluído passou por três tempos de estabilização. Ao final do primeiro tempo (30 C - 45 minutos) foi realizada análise de vigor e motilidade a fim de acompanhar a atividade metabólica espermática. Em seguida o sêmen diluído passou pelas temperaturas: 25C 30 minutos e 17 C - 2 horas. Ao final, o sêmen foi centrifugado (à 5 C - 800g - 1600 rpm - 15 minutos), sendo desprezado o sobrenadante, enquanto que o pellet de espermatozoides foi ressuspenso em 2 mL do diluente de resfriamento e mantido a 5 C por 1 hora. Ao final, foi realizada a 2ª diluição com 2 mL do diluente de congelação, seguida do envaze das amostras, rampa de congelação e submergidas em N2 líquido. O sêmen foi descongelado em banho-maria (39 C), ressuspendido em seus respectivos diluentesà mesma temperatura e só então analisado quanto às características de vigor, motilidade, vitalidade,integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante a primeira fase de abaixamento de temperatura (30 °C), observou-se que o sêmen diluído em LPD em comparação ao BTS, apresentou valores superiores de vigor (3,4±0,6 e 3,1±0,7, respectivamente) e motilidade (78,6±13,0 e 69,4±14,3 respectivamente).(AU)

The use of skimmed dried milk as an alternative diluent for the cooling step during the boar sêmen freezing procedure / Leite em pó desnatado como diluente alternativo na etapa de resfriamento durante protocolo de congelação do sêmen suíno

One of the critical points in the cryopreservation process is the use of a proper diluent while lowering the temperature following the resuspension and thawing processes. Here, we tested an alternative diluent for the process of freezing boar semen. We used skimmed dried milk (SDM) during the cooling and post-thawed resuspension steps. To do so, we collected semen from 15 Dalland boars using the glovedhand technique, and incubated each ejaculate sample at 30 C. We then removed two semen aliquots from a pre-dilution. We diluted one of the aliquots in Beltsville thawing solution (BTS - control), and the remaining sample was diluted in SDM. Both aliquots were subsequently held at 30º C for 45 min (1st period of stabilization). At the end of this period, we analysed vigor and motility to determine sperm metabolic activity. We then held the diluted semen at 25 C for 30 min (2nd period of stabilization) and at 17 C for 2 h (3rd period stabilization). We centrifuged the semen at 800 × g and 1600 × g at 5º C for 15 min, discarded the supernatant, and resuspended the sperm pellet in 2 mL of the cooling diluent at 5 C for 1h. We again diluted the samples in 2 mL of the freezing diluent, poured them into straws, and cooled and plunged them into liquid N2. The sêmen samples were thawed in a 39º C water bath, and were resuspended in their respective diluents at the same temperature. We determined the following sperm features: vigor, motility, vitality, acrosomal integrity and membrane functionality. During the first phase of temperature cooling (30º C), semen diluted in SDM exhibited a higher vigor (3.4 ± 0.6) and motility (78.6 ± 13.0) than those diluted BTS (vigor: 3.1 ± 0.7; motility: 69.4±14.3).

Esse estudo objetivou testar um diluente alternativo, a base de leite em pó desnatado, durante as etapas de resfriamento e ressuspensão pós descongelação durante a congelação do sêmen suíno. Para isso o sêmen de 15 varrões da raça Dalland, foi coletado através da técnica da mão enluvada. Visando o início da curva de congelação, cada ejaculado foi incubado a 30 C. Em seguida, foram retiradas duas alíquotas de sêmen para uma pré-diluição. Uma das alíquotas foi diluída no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS - Controle) e a outra em leite em pó desnatado (LPD), onde permaneceram a essa temperatura por 45 minutos. O sêmen pré-diluído passou por três tempos de estabilização. Ao final do primeiro tempo (30 C - 45 minutos) foi realizada análise de vigor e motilidade a fim de acompanhar a atividade metabólica espermática. Em seguida o sêmen diluído passou pelas temperaturas: 25C 30 minutos e 17 C - 2 horas. Ao final, o sêmen foi centrifugado (à 5 C - 800g - 1600 rpm - 15 minutos), sendo desprezado o sobrenadante, enquanto que o pellet de espermatozoides foi ressuspenso em 2 mL do diluente de resfriamento e mantido a 5 C por 1 hora. Ao final, foi realizada a 2ª diluição com 2 mL do diluente de congelação, seguida do envaze das amostras, rampa de congelação e submergidas em N2 líquido. O sêmen foi descongelado em banho-maria (39 C), ressuspendido em seus respectivos diluentesà mesma temperatura e só então analisado quanto às características de vigor, motilidade, vitalidade,integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante a primeira fase de abaixamento de temperatura (30 °C), observou-se que o sêmen diluído em LPD em comparação ao BTS, apresentou valores superiores de vigor (3,4±0,6 e 3,1±0,7, respectivamente) e motilidade (78,6±13,0 e 69,4±14,3 respectivamente).

Sonicação e centrifugação na criopreservação de sêmen equino

Com o aumento do potencial de criação equina, biotecnologias reprodutivas se tornam 11 importantes ferramentas na produção, com destaque para a inseminação artificial. 12 Nos protocolos estabelecidos para manutenção do ejaculado são utilizados diluidores 13 que possuem em sua constituição, nutrientes para manter o metabolismo celular, além 14 de substâncias para proteção celular como a gema de ovo, sendo fundamentais para 15 os processos de resfriamento e congelamento. O objetivou deste estudo foi diminuir 16 os tamanhos das partículas da lipoproteína de baixa densidade, através de processos 17 de sonicação no diluente Tris gema para o congelamento das células espermáticas 18 equinas. Nesse experimento foram utilizados 19 animais com idade entre 4 a 8 anos 19 da raça Crioula, a coleta do sêmen foi realizada com o método de vagina artificial. As 20 amostras deveriam apresentar um padrão de motilidade 70% e patologias 30%. Os 21 ejaculados foram testados em 4 tratamentos diferentes: Tratamento 1 (T1) controle 22 Tris-gema; Tratamento 2 (T2) Tris-gema centrifugado três vezes consecutivamente 23 à 10.000 RCF na temperatura de 4ºC/45 min; Tratamento 3 (T3) Tris-gema sonicado 24 por 30 min em amplitude de 50% com ponteira de sonda de 3mm; Tratamento 4 (T4) 25 Tris-gema centrifugado três vezes consecutivamente à 10.000 G na temperatura de 26 4ºC/45 min e sonicado por 30 min em amplitude de 50% com ponteira de sonda de 27 3mm. Posteriormente se realizou o processo de criopreservação com curva de 28 congelamento de 0,5ºC/min até 5ºC, estabilização por 30 min, seguida de adição de 29 crioprotetor e envase em palhetas de 0,5 ml e expostas ao vapor de nitrogênio líquido 30 (-80 º C) por 10 min e congeladas a -196°C. Pós descongelamento se realizou 31 avaliações in vitro de cinética espermática em sistema computadorizado (CASA), e 32 avaliações de integridade estrutural em microscopia de fluorescência para parâmetros 33 de integridade de membrana, DNA e acrossoma e funcionalidade mitocondrial. Para 34 avaliação estatística foi utilizado o programa computacional Statistix 9® (Statistix, 35 Statistix 9 for Windows, Analytical Software, Tallahassee, FL, USA, 2008). O nível de 36 significância foi de p<0,05. O diluente que utilizou a sonicação como alternativa para 37 diminuir as partículas de LDL apresentaram melhora nos parâmetros de motilidade 38 total e progressiva, A funcionalidade de mitocondria não apresentou diferença entre 39 os tratamentos. A percentagem de DNA integro e integridade de acrossoma o controle 40 com tris-gema foi superior aos demais tratamentos. A composição química do LDL é 41 pouco complexa quando comparada a um diluente de gema de ovo, assim, direta ou 42 indiretamente o LDL tem a capacidade de diminuir as alterações na membrana 43 plasmática, e os processos de sonicação promove uma redução na partícula da LDL. 44 Com base nos resultados obtidos neste estudo, o tratamento que obteve resultados 45 similares ao controle em integridade de membrana celular foi o T3, sendo que todos os testados foram superiores ao controle no parâmetro de motilidade total e progressiva.

With the increase in the potential for equine breeding, reproductive biotechnologies 11 become important tools in production, with emphasis on artificial insemination. In the 12 protocols established for the maintenance of ejaculate, thinners are used that have 13 nutrients to maintain cellular metabolism, in addition to substances for cellular 14 protection such as egg yolk, which are fundamental for the cooling and freezing 15 processes. The objective of this study was to reduce the particle sizes of low density 16 lipoprotein, through sonication processes in the tri-yolk diluent for the freezing of 17 equine sperm cells. In this experiment, 19 Creole animals aged 4 to 8 years were used, 18 semen collection was performed using the artificial vagina method. The samples 19 should show a motility pattern 70% and pathologies 30%. Ejaculates were tested in 20 4 different treatments: Treatment 1 (T1) Tris egg-yolk control; Treatment 2 (T2) Tris 21 egg-yolk centrifuged three times consecutively at 10,000 RCF at a temperature of 4ºC 22 / 45 min; Treatment 3 (T3) Tris egg-yolk sonicated for 30 min in 50% amplitude with a 23 3mm probe tip; Treatment 4 (T4) Tris egg-yolk centrifuged three times consecutively 24 at 10,000 G at a temperature of 4ºC / 45 min and sonicated for 30 min at 50% amplitude 25 with a 3mm probe tip. Subsequently, the cryopreservation process was carried out with 26 a freezing curve of 0.5ºC / min to 5ºC, stabilization for 30 min, followed by the addition 27 of cryoprotectant and filling in 0.5 ml straws and exposed to liquid nitrogen vapor (-80 28 º C) for 10 min and frozen at -196 ° C. After thawing, in vitro evaluations of sperm 29 kinetics were performed in a computerized system (CASA), and structural integrity 30 evaluations under fluorescence microscopy for parameters of membrane integrity, 31 DNA and acrosome and mitochondrial functionality. For statistical evaluation, the 32 computer program Statistix 9® (Statistix, Statistix 9 for Windows, Analytical Software, 33 Tallahassee, FL, USA, 2008) was used. The level of significance was p <0.05. The 34 diluent that used sonication as an alternative to decrease LDL particles showed 35 improvement in the parameters of total and progressive motility. The functionality of 36 mitochondria showed no difference between treatments. The percentage of whole 37 DNA and acrosome integrity in the control with tris egg-yolk was higher than the other 38 treatments. The chemical composition of LDL is not very complex when compared to 39 an egg yolk diluent, thus, directly or indirectly LDL has the ability to decrease changes 40 in the plasma membrane, and the sonication processes promote a reduction in the LDL 41 particle. Based on the results obtained in this study, the treatment that obtained results 42 similar to the control in cell membrane integrity was T3, and all those tested were 43 superior to the control in the parameter of total and progressive motility.

Danos causados a embriões de Piaractus mesopotamicus, em diferentes estádios de desenvolvimento, após técnica de resfriamento / Post-cooling damage to Piaractus mesopotamicus embryos at different stages of development

The present study investigated the effects of 6h- and 10h-storage at -8ºC on the quality and hatch rate of Piaractus mesopotamicus embryos at 4 stages of development. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution, cooled down at a rate of 1ºC.min-1 to -8ºC, and stored at this temperature for 6h and 10h, respectively. For control treatment, viable embryos at the 4 developmental stages studied, were selected and taken immediately to the incubator, without going through cooling. The results were evaluated using a multivariate statistical technique (factor analysis). Damage was characterized according to the following variables: uniformity, adhesion, symmetry, margins, and inclusion. Two factors that best explained the variance of each parameter were defined. The control group had the highest hatch rates, and a weak relationship with embryo damage. Although treatments involving 6h and 10h cooling exhibited lower hatch rates and a higher association to damage. The information obtained in this study is useful in promoting improved cryopreservation techniques for fish embryos, indicating the probable conditions under which certain injuries are more frequent.

O presente estudo investigou o efeito da estocagem de embriões de Piaractus mesopotamicus em quatro diferentes estádios de desenvolvimento, durante 6 e 10 horas a -8ºC na qualidade e taxa de eclosão. Os embriões foram expostos à solução crioprotetora e passaram por curva de resfriamento de 1ºC.min-1 até atingir -8ºC, onde foram mantidos por 6 e 10 horas, respectivamente. Para o tratamento controle, embriões viáveis nos quatro estádios de desenvolvimento estudados, foram selecionados e levados a incubadoras, sem passar por resfriamento. Os resultados foram avaliados usando estatística multivariada (análise de fatores). Os danos causados pelo resfriamento foram caracterizados de acordo com as variáveis: uniformidade, adesão, simetria e bordas das células, além de inserção no vitelo. Foram definidos dois fatores que conseguiram reter maior variância contida nos dados. O grupo controle apresentou alta taxa de eclosão e baixa relação aos danos verificados nos embriões. Enquanto os tratamentos com 6 e 10 horas após resfriamento tiveram taxas de eclosão mais baixas e alta associação aos danos. Os resultados encontrados são importantes, pois indicam condições prováveis em que ocorrem lesões durante o processo de resfriamento das células, contribuindo assim para o aperfeiçoamento da técnica de criopreservação de embriões.

Danos causados a embriões de Piaractus mesopotamicus, em diferentes estádios de desenvolvimento, após técnica de resfriamento / Post-cooling damage to Piaractus mesopotamicus embryos at different stages of development

The present study investigated the effects of 6h- and 10h-storage at -8ºC on the quality and hatch rate of Piaractus mesopotamicus embryos at 4 stages of development. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution, cooled down at a rate of 1ºC.min-1 to -8ºC, and stored at this temperature for 6h and 10h, respectively. For control treatment, viable embryos at the 4 developmental stages studied, were selected and taken immediately to the incubator, without going through cooling. The results were evaluated using a multivariate statistical technique (factor analysis). Damage was characterized according to the following variables: uniformity, adhesion, symmetry, margins, and inclusion. Two factors that best explained the variance of each parameter were defined. The control group had the highest hatch rates, and a weak relationship with embryo damage. Although treatments involving 6h and 10h cooling exhibited lower hatch rates and a higher association to damage. The information obtained in this study is useful in promoting improved cryopreservation techniques for fish embryos, indicating the probable conditions under which certain injuries are more frequent.(AU)

O presente estudo investigou o efeito da estocagem de embriões de Piaractus mesopotamicus em quatro diferentes estádios de desenvolvimento, durante 6 e 10 horas a -8ºC na qualidade e taxa de eclosão. Os embriões foram expostos à solução crioprotetora e passaram por curva de resfriamento de 1ºC.min-1 até atingir -8ºC, onde foram mantidos por 6 e 10 horas, respectivamente. Para o tratamento controle, embriões viáveis nos quatro estádios de desenvolvimento estudados, foram selecionados e levados a incubadoras, sem passar por resfriamento. Os resultados foram avaliados usando estatística multivariada (análise de fatores). Os danos causados pelo resfriamento foram caracterizados de acordo com as variáveis: uniformidade, adesão, simetria e bordas das células, além de inserção no vitelo. Foram definidos dois fatores que conseguiram reter maior variância contida nos dados. O grupo controle apresentou alta taxa de eclosão e baixa relação aos danos verificados nos embriões. Enquanto os tratamentos com 6 e 10 horas após resfriamento tiveram taxas de eclosão mais baixas e alta associação aos danos. Os resultados encontrados são importantes, pois indicam condições prováveis em que ocorrem lesões durante o processo de resfriamento das células, contribuindo assim para o aperfeiçoamento da técnica de criopreservação de embriões.(AU)

Comparação entre os sistemas automatizado e convencional de criopreservação de sêmen bovino

The objective of this study was to compare the efficiency of bovine semen cryopreservation using the controlled-rate freezing machine versus the conventional method (uncontrolled curve) by the parameters of sperm quality and viability in post-thaw period. Semen from four adult crossbreed bulls was cryopreserved in Tris-yolk-glycerol medium. The computer assisted analysis of thawed semen detected the following results: PM 56.50±22.25%; VAP 34.77±4.25µm/s; VSL 28.17±4.25µm/s; VCL 58.45±6.85µm/s; STR 82.00±2.31%; LIN 49.50±3.32%, to automated system and PM 57.00±13.11%; VAP 25.75±1.66µm/s; VSL 23.32±1.99µm/s; VCL 63.32±1.79µm/s; STR 82.25±3.59µm/s; LIN 50.00±4.97µm/s to conventional cryopreservation system. The results of plasma membrane and acrosome integrity evaluation were 54.7±12.55% and 36.13±22.20% for the automated system and 53.22±13.22% and 47.26±5.74% for the conventional system, respectively. The parameters evaluated demonstrated that there was no statistical difference between the cryopreservation systems. Thus, the choice of the bovine semen cryopreservation method to be used on a farm is a responsibility of the technician, and should be based on the reality of each farm. Therefore, it is always necessary to consider that the conventional system of bovine semen cryopreservation can vary more than the automated system, which, despite the cost of the equipment, can ensure repeatability of the results and consequent quality of cryopreserved bovine semen.

O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência do sistema automatizado (curva de resfriamento controlada eletronicamente) de congelação de sêmen bovino versus o sistema convencional (curva não controlada) por meio dos parâmetros de qualidade e viabilidade espermática no período pós-descongelação. O sêmen de quatro touros azebuados adultos foram criopreservados simultaneamente em meio tris, gema e glicerol 7%. A avaliação computadorizada do sêmen descongelado detectou os seguintes parâmetros: MP 56,50±22,25%; VAP 34,77±4,25µm/s; VSL 28,17±4,25 µm/s; VCL 58,45±6,85µm/s; STR 82,00±2,31%; LIN 49,50±3,32%, para o sistema automatizado e MP. 57,00±13,11%; VAP 25,75±1,66µm/s; VSL 23,32±1,99µm/s; VCL 63,32±1,79µm/s; STR 82,25±3,59µm/s; LIN 50,00±4,97µm/s para o sistema convencional. Os valores médios das avaliações de integridade de membrana plasmática e integridade acrossomal foram de 54,72±12,55% e 36,13±22,20% para o sistema automatizado e 53,22±13,22% e 47,26±5,74% para o sistema convencional, respectivamente. Com os parâmetros avaliados foi possível identificar que não houve diferença estatística entre os sistemas de criopreservação. Desta forma, a escolha do método de criopreservação do sêmen bovino para utilização direta na propriedade fica a critério do técnico responsável, que deverá se basear na realidade de cada propriedade. Para tanto, sempre se deve considerar que o sistema convencional pode trazer mais variações que o sistema automatizado que, apesar do custo do equipamento, pode garantir repetibilidade nos resultados e consequente qualidade do sêmen bovino criopreservado.

Criopreservação do sêmen de Jundiá Amazônico (Leiarius marmoratus) e refrigeração de sêmen equino

Este estudo avaliou os efeitos da adição de goma xantana no diluente de resfriamento de sêmen equino e de dois protocolos distintos de criopreservação de sêmen de peixes Leiarius marmoratus, sobre parâmetros de qualidade espermática analisados in vitro. No experimento realizado nas amostras de sêmen da espécie equina, (n=20) armazenadas sob refrigeração (5°C) os grupos experimentais foram: controle (Kenney) e controle adicionado de goma xantana (0,01%, 0,12% e 0,25%). Parâmetros espermáticos, como motilidade, funcionalidade mitocondrial e integridade da membrana, acrossoma e DNA foram avaliados após 0h, 24h, 48h e 72h de armazenamento. Nos experimentos realizados nas amostras de sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus (n=8) foram utilizados dimetilsulfóxido (DMSO): 5, 10, 15 e 20% e trealose: 50, 100, 150, 200mM. As amostras foram diluídas (1:9 v/v), congeladas em recipiente de vapor de nitrogênio (dryshipper), e armazenadas em nitrogênio líquido a -196°C. Após o descongelamento foram analisados parâmetros de motilidade espermática (CASA), tempo de motilidade, integridade de membrana, DNA e funcionalidade mitocôndria. No experimento realizado nas amostras de sêmen da espécie equina a motilidade espermática diminuiu ao longo do período de resfriamento no grupo que recebeu 0,25% de goma xantana em comparação com o grupo controle (60.5 e 44.73% respectivamente). Nos experimentos realizados nas amostras de sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus, com o uso de protocolo de criopreservação baseado na utilização de diferentes concentrações de DMSO, quanto as motilidades totais e progressivas, linha curva de velocidade (VCL), linha reta de velocidade (VSL) e linearidade, o tratamento contendo 5% de DMSO apresentou resultados inferiores aos tratamentos contendo 15 e 20% de DMSO (P<0,05). O tratamento contendo 10% de DMSO não diferiu dos demais tratamentos (P>0,05). Já no protocolo baseado no uso da trealose, motilidades totais e progressivas superiores foram observadas nos grupos que receberam as maiores concentrações 150mM (22,9 e 17,7%, respectivamente) e 200mM (31,4 e 26,3%, respectivamente) (P <0,05) quando comparadas aos demais grupos, no entanto, não diferindo do tratamento com trealose 100mM (18,6 e 15,3%, respectivamente). Assim, nas condições testadas nesse estudo a adição de goma xantana não é prejudicial à estrutura espermática equina, apesar de reduzir a motilidade total das células. O DMSO não foi eficiente para preservar a qualidade seminal do sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus. Além disso o tratamento com trealose em altas concentrações demonstraram resultados superiores quando comparados a outros tratamentos em parâmetros de motilidade in vitro para L. marmoratus.

This study assessed the effects on sperm quality when Xanthan gum was added to stallion sperm in a cooling protocol and two cryoprotectants added to fish semen (Leiarius marmoratus) in two freezing protocols. The stallion semen (n=20) samples were stored cooled (5°C) using different concentrations of xanthan gum added to the standard extender (Kenney): control (no xanthan added), 0.01%, 0.12%, and 0.25%). Sperm parameters, such as motility, mitochondrial function, membrane integrity, acrosome integrity, and DNA integrity, were analyzed after 0, 24, 48, and 72 hours of storage. In the fish species L. marmoratus (n=8), semen samples were diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 5, 10, 15, and 20% concentrations and in trehalose at 50, 100, 150, and 200 mM concentrations. Samples were diluted (1:9, v/v), frozen in nitrogen vapor vessel (dry shipper), and stored in liquid nitrogen vessel at -196°C. The semen parameters sperm motility (CASA), motility duration, membrane integrity, DNA, and mitochondrial function were assessed post-thawing. Regarding the cooling protocol, the sperm motility was decreased during cooling process in the group 0.25% xanthan gum when compared to the control group (60.5% and 44.73%, respectively). The cryopreservation protocol using trehalose at 50 mM obtained 15.6 and 9.5 % of total and progressive motilities, respectively, being these results inferior to the treatments containing trehalose at 150 mM (22.9 and 17.7%, respectively) and 200 mM (31.4 and 26.3%, respectively) (P<0.05). However, it did not differ from treatment with trehalose at 100 mM (18.6 and 15.3 of total and progressive motilities respectively). In the cryopreservation protocol using DMSO, the parameters total and progressive motilities, velocity curved line (VCL), velocity straight line (VSL) and linearity (LIN) were inferior in the treatment at 5% DMSO concentration when compared to treatments containing DMSO at 15 and 20% concentrations (P<0.05). Treatment containing DMSO at 10% did not differ from other treatments (P>0.05). Therefore, in these experimental conditions the addition of xanthan gum to stallion sperm is not harmful to the sperm cell structure, despite of reducing total motility. DMSO was not efficient to preserve semen quality and the addition of trehalose at high concentrations exhibited superior results when compared to other treatments in in vitro motility parameters in L. marmoratus.