An RT-rtPCR assay for detection of rabies virus in bovine specimens / Um ensaio RT-rtPCR para detecção de vírus da raiva em espécimes bovinos

ABSTRACT: Bovine rabies is endemic in most Brazilian States, including Rio Grande do Sul (RS), which has faced an unprecedented rabies outbreak between 2011 and 2018. We described a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-rtPCR) for detection of rabies virus (RABV) in bovine samples. The primers were designed targeting a highly conserved region of the nucleoprotein (N) gene of RABV obtained from cattle. The detection limit corresponded to 13 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate (CV<9%) in all dilutions tested. Amplification of other pathogens associated with neurological disease in cattle or cross-contamination was not observed. Brain samples from cattle suspicious of rabies (n=21) were tested in triplicate by the RT-rtPCR and by the gold-standard direct fluorescent antibody test (DFAT), resulting in 100% of sensitivity and specificity of the RT-rtPCR. Testing of additional 41 bovine brain samples submitted to the routine DFAT testing yielded 37 (90.2%) concordant results (30 positive/7 negative) and 4 (9.7%) inconclusive in DFAT and RT-rtPCR positive. These results showed a good concordance between the tests and a higher sensitivity of the RT-rtPCR. This assay represents an alternative for RABV detection, either as a confirmatory test or for large-scale diagnosis in endemic regions.

RESUMO: A raiva bovina é endêmica na maioria dos estados brasileiros, inclusive no Rio Grande do Sul (RS), que enfrentou um surto de raiva sem precedentes entre 2011 e 2018. Descrevemos um PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (RT-rtPCR) para detecção do vírus da raiva (RABV) em bovinos. Os primers foram desenhados visando uma região altamente conservada do gene da nucleoproteína (N) de RABV obtido de bovinos. O limite de detecção correspondeu a 13 cópias de DNA e a repetibilidade intra e inter-ensaios foi adequada (CV <9%) em todas as diluições testadas. Não foi observada amplificação de outros patógenos associados a doenças neurológicas em bovinos ou contaminação cruzada. Amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva (n = 21) foram testadas em triplicata no RT-rtPCR e pelo teste de anticorpo fluorescente padrão ouro (DFAT), resultando em 100% de sensibilidade e especificidade do RT-rtPCR. O teste de 41 amostras de cérebro bovino adicionais submetidas ao teste de DFAT de rotina rendeu 37 (90,2%) resultados concordantes (30 positivos / sete negativos) e quatro (9,7%) inconclusivos em DFAT e RT-rtPCR positivo. Esses resultados mostraram boa concordância entre os testes e maior sensibilidade do RT-rtPCR. Este ensaio representa uma alternativa para a detecção do vírus da raiva, seja como teste confirmatório ou para diagnóstico em larga escala em regiões endêmicas.

An RT-rtPCR assay for detection of rabies virus in bovine specimens / Um ensaio RT-rtPCR para detecção de vírus da raiva em espécimes bovinos

Bovine rabies is endemic in most Brazilian States, including Rio Grande do Sul (RS), which has faced an unprecedented rabies outbreak between 2011 and 2018. We described a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-rtPCR) for detection of rabies virus (RABV) in bovine samples. The primers were designed targeting a highly conserved region of the nucleoprotein (N) gene of RABV obtained from cattle. The detection limit corresponded to 13 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate (CV<9%) in all dilutions tested. Amplification of other pathogens associated with neurological disease in cattle or cross-contamination was not observed. Brain samples from cattle suspicious of rabies (n=21) were tested in triplicate by the RT-rtPCR and by the gold-standard direct fluorescent antibody test (DFAT), resulting in 100% of sensitivity and specificity of the RT-rtPCR. Testing of additional 41 bovine brain samples submitted to the routine DFAT testing yielded 37 (90.2%) concordant results (30 positive/7 negative) and 4 (9.7%) inconclusive in DFAT and RT-rtPCR positive. These results showed a good concordance between the tests and a higher sensitivity of the RT-rtPCR. This assay represents an alternative for RABV detection, either as a confirmatory test or for large-scale diagnosis in endemic regions.

A raiva bovina é endêmica na maioria dos estados brasileiros, inclusive no Rio Grande do Sul (RS), que enfrentou um surto de raiva sem precedentes entre 2011 e 2018. Descrevemos um PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (RT-rtPCR) para detecção do vírus da raiva (RABV) em bovinos. Os primers foram desenhados visando uma região altamente conservada do gene da nucleoproteína (N) de RABV obtido de bovinos. O limite de detecção correspondeu a 13 cópias de DNA e a repetibilidade intra e inter-ensaios foi adequada (CV <9%) em todas as diluições testadas. Não foi observada amplificação de outros patógenos associados a doenças neurológicas em bovinos ou contaminação cruzada. Amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva (n = 21) foram testadas em triplicata no RT-rtPCR e pelo teste de anticorpo fluorescente padrão ouro (DFAT), resultando em 100% de sensibilidade e especificidade do RT-rtPCR. O teste de 41 amostras de cérebro bovino adicionais submetidas ao teste de DFAT de rotina rendeu 37 (90,2%) resultados concordantes (30 positivos / sete negativos) e quatro (9,7%) inconclusivos em DFAT e RT-rtPCR positivo. Esses resultados mostraram boa concordância entre os testes e maior sensibilidade do RT-rtPCR. Este ensaio representa uma alternativa para a detecção do vírus da raiva, seja como teste confirmatório ou para diagnóstico em larga escala em regiões endêmicas.

Influence of euthanasia, the intensity of inflammatory lesion and viral load in the laboratory diagnosis of rabies in cattle

ABSTRACT: This research reports the use of different diagnostic tests in cattle, naturally infected by Rabies lyssavirus (RABV), and correlates the positivity of the tests with the clinical moment of euthanasia, the intensity of the inflammatory lesion and viral load. It also highlights the possibility of euthanasia in early stages of the disease as a way to improve animal welfare. For that, samples of 34 bovine brains were collected for analysis, preserved in 10% buffered formaline and refrigerated with subsequent freezing. The samples were subjected to direct immunofluorescence antibody technique (DFAT) tests, viral isolation in cell culture (VICC), histopathology with hematoxylin and eosin staining (HE), immunohistochemistry (IHC), Shorr stainied neural tissue smears (DSS), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction by quantitative reverse transcriptase (qRT-PCR). The areas used for analysis were the cerebellum, parietal telencephalon and thalamus. Samples with Negri bodies (NBs) or immunostaining in at least one of the analyzed areas were considered positive. For the study of the intensity of histological lesions, the lesions were classified into grades 0, 1, 2 and 3 and the positivity of the test in the presence or absence of NBs in one of the three areas analyzed. To verify the influence of the disease clinical evolution, 4-four groups of analysis were created according to the animals clinical status at moment of the euthanasia, being: M1 = animal euthanized while standing, M2 = euthanized when in sternal recumbence, M3 = euthanized when in lateral recumbence, M4 = animal with natural death. Of the 34 brains evaluated, IHC was positive in 100% of cases, DFAT was positive in 97.05% of them, and in this negative sample the presence of RABV was confirmed by VICC. NBs ere seen in 88.23% of the cases, and the DSS test was positive in 82.35% of them. All diagnostic techniques showed positive cases in all groups analyzed. Each case was positive in at least two diagnostic methods. All cases that contained NBs were positive for rabies in the other tests. In this study, it was observed that the variables analyzed (intensity of injury and clinical evolution at the moment of euthanasia) had an influence only on HE and DSS techniques, which are based on NB research to form the diagnosis, but did not interfere with the effectiveness of the diagnosis performed by detecting the viral antigen performed by DFAT and IHC. All isolated RABV samples included in the present study have a genetic lineage characteristic of hematophagous bats Desmodus rotundus. The evaluation of qRT-PCR showed that the amount of virus did not interfere in the positivity of the tests. This work shows that IHC and DFAT are safe diagnostic techniques. They are capable of detecting RABV even in euthanized animals in the early stages of clinical evolution with mild intensities of histological lesions.

RESUMO: Esta pesquisa relata a utilização de diferentes testes de diagnóstico em bovinos, naturalmente infectados pelo Rabies lyssavirus (RABV), e correlaciona a positividade dos testes com o momento clínico da eutanásia, a intensidade da lesão inflamatória, e a carga viral. Salienta também a possibilidade da eutanásia em estágios precoces da doença como forma de melhorar o bem-estar animal. Para isso amostras de 34 encéfalos bovinos foram coletados para análise, conservadas em formol tamponado 10% e sob refrigeração com posterior congelamento. As amostras foram submetidas aos testes de imunofluorescência direta (IFD), isolamento viral em cultivo de células (IVCC), histopatologia com coloração de hematoxilina e eosina (HE), imuno-histoquímica (IHQ), esfregaço direto com coloração de Shorr (EDS), reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa (RT-PCR) e reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR). As áreas utilizadas para análise foram o cerebelo, telencéfalo parietal e tálamo. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram Corpúsculo de Negri (CNs) ou imuno-marcação em ao menos uma das áreas analisadas. Para o estudo da intensidade das lesões histológicas, as lesões foram classificadas em graus 0, 1, 2 e 3 e a positividade do teste na presença ou ausência de CN em uma das três áreas analisadas. Para verificar a influência da evolução clínica da doença foram criados 4 grupos de análise conforme o estado clínico do animal no momento da eutanásia, sendo: M1 = animal eutanasiado em estação, M2 = eutanasiado em decúbito esternal, M3 = eutanasiado em decúbito lateral, M4 = animal com morte natural. Dos 34 encéfalos avaliados a IHQ foi positiva em 100% dos casos, a IFD foi positiva em 97,05%, sendo que na amostra negativa a presença de RABV foi confirmada por IVCC. A histologia com HE, através da visualização das CNs, foi positiva em 88,23 % dos casos, e o teste de EDS, foi positivo em 82,35%. Todas as técnicas de diagnóstico apresentaram casos positivos em todos os grupos analisados. Cada caso foi positivo em, pelo menos, dois métodos de diagnóstico. Todos os casos que continham CN foram positivos para raiva nos demais testes. Nesse estudo observou-se que as variáveis analisadas intensidade de lesão e evolução clínica no momento da eutanásia tiveram influência somente nas técnicas de HE e EDS, que se baseiam na pesquisa do CN para formação do diagnóstico, mas não interferiram na eficácia do diagnóstico realizado através da detecção do antígeno viral realizado por IFD e IHQ. Todas as amostras RABV isoladas incluídas no presente estudo apresentam linhagem genética característica de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A avaliação de qRT-PCR demostrou que a quantidade de vírus não interferiu na positividade dos testes. Esse trabalho mostra que a IHQ e a IFD são técnicas seguras de diagnóstico e que mesmo em animais eutanasiados em estágios iniciais de evolução clínica com intensidades leve de lesões histológicas, são capazes de detectar o RABV.

Influence of euthanasia, the intensity of inflammatory lesion and viral load in the laboratory diagnosis of rabies in cattle / Influência da eutanásia, intensidade da lesão inflamatória e carga viral no diagnóstico laboratorial da raiva em bovinos

This research reports the use of different diagnostic tests in cattle, naturally infected by Rabies lyssavirus (RABV), and correlates the positivity of the tests with the clinical moment of euthanasia, the intensity of the inflammatory lesion and viral load. It also highlights the possibility of euthanasia in early stages of the disease as a way to improve animal welfare. For that, samples of 34 bovine brains were collected for analysis, preserved in 10% buffered formaline and refrigerated with subsequent freezing. The samples were subjected to direct immunofluorescence antibody technique (DFAT) tests, viral isolation in cell culture (VICC), histopathology with hematoxylin and eosin staining (HE), immunohistochemistry (IHC), Shorr stainied neural tissue smears (DSS), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction by quantitative reverse transcriptase (qRT-PCR). The areas used for analysis were the cerebellum, parietal telencephalon and thalamus. Samples with Negri bodies (NBs) or immunostaining in at least one of the analyzed areas were considered positive. For the study of the intensity of histological lesions, the lesions were classified into grades 0, 1, 2 and 3 and the positivity of the test in the presence or absence of NBs in one of the three areas analyzed. To verify the influence of the disease clinical evolution, 4-four groups of analysis were created according to the animal's clinical status at moment of the euthanasia, being: M1 = animal euthanized while standing, M2 = euthanized when in sternal recumbence, M3 = euthanized when in lateral recumbence, M4 = animal with natural death. Of the 34 brains evaluated, IHC was positive in 100% of cases, DFAT was positive in 97.05% of them, and in this negative sample the presence of RABV was confirmed by VICC. NBs ere seen in 88.23% of the cases, and the DSS test was positive in 82.35% of them. All diagnostic techniques showed positive cases in all groups analyzed. Each case was positive in at least two diagnostic methods. All cases that contained NBs were positive for rabies in the other tests. In this study, it was observed that the variables analyzed (intensity of injury and clinical evolution at the moment of euthanasia) had an influence only on HE and DSS techniques, which are based on NB research to form the diagnosis, but did not interfere with the effectiveness of the diagnosis performed by detecting the viral antigen performed by DFAT and IHC. All isolated RABV samples included in the present study have a genetic lineage characteristic of hematophagous bats Desmodus rotundus. The evaluation of qRT-PCR showed that the amount of virus did not interfere in the positivity of the tests. This work shows that IHC and DFAT are safe diagnostic techniques. They are capable of detecting RABV even in euthanized animals in the early stages of clinical evolution with mild intensities of histological lesions.(AU)

Esta pesquisa relata a utilização de diferentes testes de diagnóstico em bovinos, naturalmente infectados pelo Rabies lyssavirus (RABV), e correlaciona a positividade dos testes com o momento clínico da eutanásia, a intensidade da lesão inflamatória, e a carga viral. Salienta também a possibilidade da eutanásia em estágios precoces da doença como forma de melhorar o bem-estar animal. Para isso amostras de 34 encéfalos bovinos foram coletados para análise, conservadas em formol tamponado 10% e sob refrigeração com posterior congelamento. As amostras foram submetidas aos testes de imunofluorescência direta (IFD), isolamento viral em cultivo de células (IVCC), histopatologia com coloração de hematoxilina e eosina (HE), imuno-histoquímica (IHQ), esfregaço direto com coloração de Shorr (EDS), reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa (RT-PCR) e reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR). As áreas utilizadas para análise foram o cerebelo, telencéfalo parietal e tálamo. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram Corpúsculo de Negri (CNs) ou imuno-marcação em ao menos uma das áreas analisadas. Para o estudo da intensidade das lesões histológicas, as lesões foram classificadas em graus 0, 1, 2 e 3 e a positividade do teste na presença ou ausência de CN em uma das três áreas analisadas. Para verificar a influência da evolução clínica da doença foram criados 4 grupos de análise conforme o estado clínico do animal no momento da eutanásia, sendo: M1 = animal eutanasiado em estação, M2 = eutanasiado em decúbito esternal, M3 = eutanasiado em decúbito lateral, M4 = animal com morte natural. Dos 34 encéfalos avaliados a IHQ foi positiva em 100% dos casos, a IFD foi positiva em 97,05%, sendo que na amostra negativa a presença de RABV foi confirmada por IVCC. A histologia com HE, através da visualização das CNs, foi positiva em 88,23 % dos casos, e o teste de EDS, foi positivo em 82,35%. Todas as técnicas de diagnóstico apresentaram casos positivos em todos os grupos analisados. Cada caso foi positivo em, pelo menos, dois métodos de diagnóstico. Todos os casos que continham CN foram positivos para raiva nos demais testes. Nesse estudo observou-se que as variáveis analisadas intensidade de lesão e evolução clínica no momento da eutanásia tiveram influência somente nas técnicas de HE e EDS, que se baseiam na pesquisa do CN para formação do diagnóstico, mas não interferiram na eficácia do diagnóstico realizado através da detecção do antígeno viral realizado por IFD e IHQ. Todas as amostras RABV isoladas incluídas no presente estudo apresentam linhagem genética característica de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A avaliação de qRT-PCR demostrou que a quantidade de vírus não interferiu na positividade dos testes. Esse trabalho mostra que a IHQ e a IFD são técnicas seguras de diagnóstico e que mesmo em animais eutanasiados em estágios iniciais de evolução clínica com intensidades leve de lesões histológicas, são capazes de detectar o RABV.(AU)

Influence of euthanasia, the intensity of inflammatory lesion and viral load in the laboratory diagnosis of rabies in cattle / Influência da eutanásia, intensidade da lesão inflamatória e carga viral no diagnóstico laboratorial da raiva em bovinos

This research reports the use of different diagnostic tests in cattle, naturally infected by Rabies lyssavirus (RABV), and correlates the positivity of the tests with the clinical moment of euthanasia, the intensity of the inflammatory lesion and viral load. It also highlights the possibility of euthanasia in early stages of the disease as a way to improve animal welfare. For that, samples of 34 bovine brains were collected for analysis, preserved in 10% buffered formaline and refrigerated with subsequent freezing. The samples were subjected to direct immunofluorescence antibody technique (DFAT) tests, viral isolation in cell culture (VICC), histopathology with hematoxylin and eosin staining (HE), immunohistochemistry (IHC), Shorr stainied neural tissue smears (DSS), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction by quantitative reverse transcriptase (qRT-PCR). The areas used for analysis were the cerebellum, parietal telencephalon and thalamus. Samples with Negri bodies (NBs) or immunostaining in at least one of the analyzed areas were considered positive. For the study of the intensity of histological lesions, the lesions were classified into grades 0, 1, 2 and 3 and the positivity of the test in the presence or absence of NBs in one of the three areas analyzed. To verify the influence of the disease clinical evolution, 4-four groups of analysis were created according to the animal's clinical status at moment of the euthanasia, being: M1 = animal euthanized while standing, M2 = euthanized when in sternal recumbence, M3 = euthanized when in lateral recumbence, M4 = animal with natural death. Of the 34 brains evaluated, IHC was positive in 100% of cases, DFAT was positive in 97.05% of them, and in this negative sample the presence of RABV was confirmed by VICC. NBs ere seen in 88.23% of the cases, and the DSS test was positive in 82.35% of them.(AU)

Esta pesquisa relata a utilização de diferentes testes de diagnóstico em bovinos, naturalmente infectados pelo Rabies lyssavirus (RABV), e correlaciona a positividade dos testes com o momento clínico da eutanásia, a intensidade da lesão inflamatória, e a carga viral. Salienta também a possibilidade da eutanásia em estágios precoces da doença como forma de melhorar o bem-estar animal. Para isso amostras de 34 encéfalos bovinos foram coletados para análise, conservadas em formol tamponado 10% e sob refrigeração com posterior congelamento. As amostras foram submetidas aos testes de imunofluorescência direta (IFD), isolamento viral em cultivo de células (IVCC), histopatologia com coloração de hematoxilina e eosina (HE), imuno-histoquímica (IHQ), esfregaço direto com coloração de Shorr (EDS), reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa (RT-PCR) e reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR). As áreas utilizadas para análise foram o cerebelo, telencéfalo parietal e tálamo. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram Corpúsculo de Negri (CNs) ou imuno-marcação em ao menos uma das áreas analisadas. Para o estudo da intensidade das lesões histológicas, as lesões foram classificadas em graus 0, 1, 2 e 3 e a positividade do teste na presença ou ausência de CN em uma das três áreas analisadas.(AU)

Cattle rabies: the effect of clinical evolution, viral genetic lineage, and viral load on the severity of histological lesions / Raiva bovina: relação do curso clínico, da linhagem genética do vírus e carga viral com a intensidade de lesões histológicas

Our objective was the characterization and staging of histological lesions in different anatomical sites of the central nervous system (CNS) of rabid cattle. The severity of the lesions was compared with the clinical stages of the disease, the variants of viral isolates, and with the load of virus. Thirty-one spontaneously affected rabid cattle the state of Santa Catarina underwent clinical follow-up and were eventually necropsied. CNS tissues were sampled and submitted to direct fluorescent antibody technique (DFAT), immunohistochemistry (IHC), routine histopathology with hematoxylin and eosin stain (HE), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), and polymerase chain reaction in quantitative reverse transcriptase in real time (qRT-PCR). Affected cattle were allotted in four groups according to their clinical stage when euthanized: G1, euthanized while standing; G2, euthanized when in sternal recumbence; G3, euthanized when in lateral recumbence; and G4, affected cattle with natural death. In order to evaluate the degree of severity of the lesions and the presence of Negri bodies (NBs), the brain was sectioned at 9 sites. Additionally, spinal cord and trigeminal ganglion sections were examined. The intensity of the lesions was graded as either absent, mild, moderate, or marked, and the presence or absence of the NBs was noted. Histological lesions were characterized by lymphocytic and monocytic meningoencephalitis with NBs in 28 cases. In all analyzed groups, intensities of histological lesions ranging from mild to severe were observed. Brain regions with the highest inflammatory lesion intensity were the medulla at the level of obex, followed by the colliculus and thalamus. NBs were observed in a higher percentage in the cerebellum, followed by medulla at the obex level, striatum complex, and frontal telencephalon. The duration of the clinical course of the disease did not influence the intensity of the inflammatory lesion, but it did influence the presence of NBs, with a higher percentage of these inclusions in cattle that died naturally than in euthanized cattle. All isolated rhabdovirus included in this study were genetically compatible with samples from hematophagous bats Desmodus rotundus. The evaluation by qRT-PCR did not demonstrate a correlation between lesion intensity and the amount of virus.(AU)

Nosso objetivo foi a caracterização e estadiamento de lesões histológicas em diferentes locais anatômicos do sistema nervoso central (SNC) de bovinos raivosos. A gravidade das lesões foi comparada com os estágios clínicos da doença, as variantes dos isolados virais e com a quantidade de vírus. Trinta e um bovinos do estado de Santa Catarina, afetados naturalmente por raiva, foram acompanhados clinicalmente e, ao final, necropsiados. Os tecidos do SNC foram amostrados e submetidos a imunofluorescência direta, imunohistoquímica, histopatologia de rotina, reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) e reação em cadeia da polimerase em transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os bovinos afetados foram distribuídos em quatro grupos, de acordo com sua fase clínica: G1, eutanasiados quando ainda se mantinham em pé; G2, eutanasiados quando em decúbito esternal; G3, eutanasiados quando em decúbito lateral; e G4, bovinos afetados com morte natural. Para avaliar o grau de gravidade das lesões e a presença de corpúsculos de Negri (CNs), o cérebro foi seccionado em 9 locais. Além disso, seções da medula espinhal e do gânglio trigêmeo foram examinadas. A intensidade das lesões foi graduada como ausente, leve, moderada ou acentuada, e a presença ou ausência dos CNs foi anotada. Lesões histológicas foram caracterizadas por meningoencefalite linfocítica e monocítica com CNs em 28 casos. Em todos os grupos analisados foram observadas intensidades de lesões histológicas variando de leve a grave. As regiões cerebrais com maior intensidade de lesão inflamatória foram o bulbo no nível do obex, seguido do colículo e tálamo. CNs foram mais prevalentes no cerebelo, seguido pelo bulbo ao nível do óbex, corpo estriado e telencéfalo frontal. A duração do curso clínico da raiva não influenciou a intensidade da lesão inflamatória, mas influenciou a presença de CNs, com maior porcentagem dessas inclusões em bovinos que morreram naturalmente do que em bovinos sacrificados. Todos os isolados rabdovírus obtidos neste estudo eram geneticamente compatíveis com amostras provenientes de morcegos hematófagos Desmodus rotundus.(AU)

Cattle rabies: the effect of clinical evolution, viral genetic lineage, and viral load on the severity of histological lesions / Raiva bovina: relação do curso clínico, da linhagem genética do vírus e carga viral com a intensidade de lesões histológicas

Our objective was the characterization and staging of histological lesions in different anatomical sites of the central nervous system (CNS) of rabid cattle. The severity of the lesions was compared with the clinical stages of the disease, the variants of viral isolates, and with the load of virus. Thirty-one spontaneously affected rabid cattle the state of Santa Catarina underwent clinical follow-up and were eventually necropsied. CNS tissues were sampled and submitted to direct fluorescent antibody technique (DFAT), immunohistochemistry (IHC), routine histopathology with hematoxylin and eosin stain (HE), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), and polymerase chain reaction in quantitative reverse transcriptase in real time (qRT-PCR). Affected cattle were allotted in four groups according to their clinical stage when euthanized: G1, euthanized while standing; G2, euthanized when in sternal recumbence; G3, euthanized when in lateral recumbence; and G4, affected cattle with natural death. In order to evaluate the degree of severity of the lesions and the presence of Negri bodies (NBs), the brain was sectioned at 9 sites. Additionally, spinal cord and trigeminal ganglion sections were examined. The intensity of the lesions was graded as either absent, mild, moderate, or marked, and the presence or absence of the NBs was noted. Histological lesions were characterized by lymphocytic and monocytic meningoencephalitis with NBs in 28 cases. In all analyzed groups, intensities of histological lesions ranging from mild to severe were observed. Brain regions with the highest inflammatory lesion intensity were the medulla at the level of obex, followed by the colliculus and thalamus. NBs were observed in a higher percentage in the cerebellum, followed by medulla at the obex level, striatum complex, and frontal telencephalon. The duration of the clinical course of the disease did not influence the intensity of the inflammatory lesion, but it did influence the presence of NBs, with a higher percentage of these inclusions in cattle that died naturally than in euthanized cattle. All isolated rhabdovirus included in this study were genetically compatible with samples from hematophagous bats Desmodus rotundus. The evaluation by qRT-PCR did not demonstrate a correlation between lesion intensity and the amount of virus.(AU)

Nosso objetivo foi a caracterização e estadiamento de lesões histológicas em diferentes locais anatômicos do sistema nervoso central (SNC) de bovinos raivosos. A gravidade das lesões foi comparada com os estágios clínicos da doença, as variantes dos isolados virais e com a quantidade de vírus. Trinta e um bovinos do estado de Santa Catarina, afetados naturalmente por raiva, foram acompanhados clinicalmente e, ao final, necropsiados. Os tecidos do SNC foram amostrados e submetidos a imunofluorescência direta, imunohistoquímica, histopatologia de rotina, reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) e reação em cadeia da polimerase em transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os bovinos afetados foram distribuídos em quatro grupos, de acordo com sua fase clínica: G1, eutanasiados quando ainda se mantinham em pé; G2, eutanasiados quando em decúbito esternal; G3, eutanasiados quando em decúbito lateral; e G4, bovinos afetados com morte natural. Para avaliar o grau de gravidade das lesões e a presença de corpúsculos de Negri (CNs), o cérebro foi seccionado em 9 locais. Além disso, seções da medula espinhal e do gânglio trigêmeo foram examinadas. A intensidade das lesões foi graduada como ausente, leve, moderada ou acentuada, e a presença ou ausência dos CNs foi anotada. Lesões histológicas foram caracterizadas por meningoencefalite linfocítica e monocítica com CNs em 28 casos. Em todos os grupos analisados foram observadas intensidades de lesões histológicas variando de leve a grave. As regiões cerebrais com maior intensidade de lesão inflamatória foram o bulbo no nível do obex, seguido do colículo e tálamo. CNs foram mais prevalentes no cerebelo, seguido pelo bulbo ao nível do óbex, corpo estriado e telencéfalo frontal. A duração do curso clínico da raiva não influenciou a intensidade da lesão inflamatória, mas influenciou a presença de CNs, com maior porcentagem dessas inclusões em bovinos que morreram naturalmente do que em bovinos sacrificados. Todos os isolados rabdovírus obtidos neste estudo eram geneticamente compatíveis com amostras provenientes de morcegos hematófagos Desmodus rotundus.(AU)

Current trends in bovine abortion in Argentina / Tendências atuais do aborto bovino na Argentina

Bovine abortion is an important cause of significant economic losses in beef and dairy herds. This syndrome is usually difficult to diagnose. The aim of this study was to characterize bovine abortion causes in Argentina by standard diagnosis procedures (histology, bacterial and viral isolation) and other diagnostic tests like direct fluorescent antibody test (DFAT), fetal serology, immunohistochemistry (IHC), and PCR, showing their specific advantages and limitations. Necropsies were performed in 150 aborted bovine fetuses submitted to the diagnostic laboratories of Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Balcarce, Argentina. Etiological diagnosis was confirmed in 78 fetuses (52% of the cases). Most causes of abortion were of infectious origin, being Neospora caninum (14.67%), Campylobacter fetus sp. (9.33%), Leptospira spp. (7.33%) and Brucella abortus (6.65%) the main microorganisms identified. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpes virus (BHV) were diagnosed in 2 (1.33%) and 3 (2%) cases, respectively. This study showed a better characterization of bovine abortion compared with previous researches done on this topic.(AU)

O aborto bovino é uma causa importante de perdas econômicas significativas em rebanhos bovinos e leiteiros. Esta síndrome é geralmente difícil de diagnosticar. O objetivo deste estudo foi caracterizar o aborto bovino na Argentina por procedimentos diagnósticos de rotina (histologia, isolamento viral e bacteriana) e outros testes diagnósticos como ensaio directo de anticorpos fluorescentes (DFAT), sorologia fetal, imuno-histoquica (IHC), e PCR; mostrando suas vantagens e limitações específicas. As necropsias foram realizadas em 150 fetos bovinos abortados submetidos aos laboratórios de diagnóstico do Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária (INTA) de Balcarce, na Argentina. O diagnóstico etiológico foi confirmado em 78 fetos (52% dos casos). A maioria das causas de aborto foram de origem infecciosa, sendo Neospora caninum (14,67%), Campylobacter fetus sp. (9,33%), Leptospira spp. (7,33%) e Brucella abortus (6,65%) os principais microrganismos identificados. O vírus da diarréia viral bovina (BVDV) e o herpesvírus bovino (BHV) foram diagnosticados em 2 (1,33%) e 3 (2%) casos, respectivamente. Este estudo mostrou uma melhor caracterização do aborto bovino em comparação com pesquisas anteriores feita sobre este tema.(AU)

Current trends in bovine abortion in Argentina / Tendências atuais do aborto bovino na Argentina

Bovine abortion is an important cause of significant economic losses in beef and dairy herds. This syndrome is usually difficult to diagnose. The aim of this study was to characterize bovine abortion causes in Argentina by standard diagnosis procedures (histology, bacterial and viral isolation) and other diagnostic tests like direct fluorescent antibody test (DFAT), fetal serology, immunohistochemistry (IHC), and PCR, showing their specific advantages and limitations. Necropsies were performed in 150 aborted bovine fetuses submitted to the diagnostic laboratories of Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Balcarce, Argentina. Etiological diagnosis was confirmed in 78 fetuses (52% of the cases). Most causes of abortion were of infectious origin, being Neospora caninum (14.67%), Campylobacter fetus sp. (9.33%), Leptospira spp. (7.33%) and Brucella abortus (6.65%) the main microorganisms identified. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpes virus (BHV) were diagnosed in 2 (1.33%) and 3 (2%) cases, respectively. This study showed a better characterization of bovine abortion compared with previous researches done on this topic.(AU)

O aborto bovino é uma causa importante de perdas econômicas significativas em rebanhos bovinos e leiteiros. Esta síndrome é geralmente difícil de diagnosticar. O objetivo deste estudo foi caracterizar o aborto bovino na Argentina por procedimentos diagnósticos de rotina (histologia, isolamento viral e bacteriana) e outros testes diagnósticos como ensaio directo de anticorpos fluorescentes (DFAT), sorologia fetal, imuno-histoquica (IHC), e PCR; mostrando suas vantagens e limitações específicas. As necropsias foram realizadas em 150 fetos bovinos abortados submetidos aos laboratórios de diagnóstico do Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária (INTA) de Balcarce, na Argentina. O diagnóstico etiológico foi confirmado em 78 fetos (52% dos casos). A maioria das causas de aborto foram de origem infecciosa, sendo Neospora caninum (14,67%), Campylobacter fetus sp. (9,33%), Leptospira spp. (7,33%) e Brucella abortus (6,65%) os principais microrganismos identificados. O vírus da diarréia viral bovina (BVDV) e o herpesvírus bovino (BHV) foram diagnosticados em 2 (1,33%) e 3 (2%) casos, respectivamente. Este estudo mostrou uma melhor caracterização do aborto bovino em comparação com pesquisas anteriores feita sobre este tema.(AU)

Avaliação do ensaio RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus para a detecção do vírus da raiva no Brasil

A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3 do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirus de RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT-qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is characterized by viral acute progressive encephalitis. The RABV belongs to Lyssavirus genus, that includes seventeen others virus. Due to the high lethality, almost 100%, diagnosis techniques for rabies must be accurate and reliable for the accomplishment of diseases control. The gold standard for rabies diagnostic is the direct fluorescent antibody test (dFAT), due to its high sensibility and specificity. Although, sample conservation, low viral title, poor quality inputs, and skilled technicians may hamper results accurate. The RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay is a combination of degenerated and multiple primers with Locked Nucleic Acid (LNA) probe that can be used as secondary test for dFAT, due to its ease manipulation and capacity for detecting the different virus species within the Lyssavirus genus, and due its high sensitivity and specificity. This assay detects and amplifies the leader region 3 and the initial portion of nucleoprotein gene that is considered the most conserved gene within the Lyssavirus. This study aims the LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay standardization and implementation for detecting the different RABV genetic lineages and antigenic variants described in Brazil. Therefore, 324 positive samples compatible with different RABV genetic lineages or antigenic variants were collected and tested in RT-qPCR, using LN34 Pan-Lyssavirus assay. The two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, showed positivity of 87,3%, and 41 samples obtained false negative result. Those false negative samples in the two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay were tested in the one step LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, and 100% of those samples confirmed the true positive result. Based in these results, is possible to infer that the two steps RT-qPCR assay may hamper the detection of different RABV genetic lineages and antigenic variants, probably due to mismatches between sense primer and the target region during the revere transcription technique. On the other hand, the one step RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay were able to detect and amplify those false negative samples in two steps RT-qPCR, showing to be a highly sensitivity test, and showing potential to be used as confirmatory test to dFAT for rabies diagnosis.

Surto de raiva em bovinos no Estado do Piauí, Brasil / Outbreak of rabies in cattle of Piauí state, Brazil

Este trabalho tem por objetivo relatar um surto de raiva ocorrido em bovinos da bacia leiteira de Parnaíba, Piauí. Um total de 127 animais veio a óbito com sintomatologia nervosa. Três animais foram necropsiados e amostras de encéfalo e cerebelo foram colhidas para realização de Imunofluorescência Direta (RIFD), Prova Biológica em Camundongo (PBC) e exame histopatológico. Além disto, 16 morcegos Desmodus rotundus) foram capturados na propriedade e em cavernas circunvizinhas e submetidos à RIFD e PBC. As amostras provenientes dos bovinos e morcegos foram positivas à RIFD e PBC. Além disso; o exame histopatológico das amostras bovinas revelou lesões compatíveis com a doença. Este trabalho relata o primeiro surto de raiva em bovinos da bacia leiteira do Estado do Piauí e demonstra a necessidade de adoção de medidas de prevenção e controle da raiva em locais onde há morcegos hematófagos.

This paper aims to report an outbreak of rabies in cattle of dairy region of Parnaíba, Piauí. A total of 127 animals died with neurological symptoms. Three animals were necropsied and samples from brain and cerebellum were collected to perform Direct Immunofluorescence Test (DFAT) and Biological Test in Mice (BTM). Moreover, 16 bats (Desmodus rotundus) were captured on the property and surrounding caves and, then, submitted to DFAT and BTM. The samples from bovines and bats were positive by DFAT and BTM. In addition, the histopathological examination of bovine samples revealed lesions compatibles with the disease. This work reports the first outbreak of rabies in cattle in the dairy region of Piauí and demonstrates the need to adopt measures to prevent and control rabies in places where there are hematophagous bats.

Surto de raiva em bovinos no Estado do Piauí, Brasil / Outbreak of rabies in cattle of Piauí state, Brazil

Este trabalho tem por objetivo relatar um surto de raiva ocorrido em bovinos da bacia leiteira de Parnaíba, Piauí. Um total de 127 animais veio a óbito com sintomatologia nervosa. Três animais foram necropsiados e amostras de encéfalo e cerebelo foram colhidas para realização de Imunofluorescência Direta (RIFD), Prova Biológica em Camundongo (PBC) e exame histopatológico. Além disto, 16 morcegos Desmodus rotundus) foram capturados na propriedade e em cavernas circunvizinhas e submetidos à RIFD e PBC. As amostras provenientes dos bovinos e morcegos foram positivas à RIFD e PBC. Além disso; o exame histopatológico das amostras bovinas revelou lesões compatíveis com a doença. Este trabalho relata o primeiro surto de raiva em bovinos da bacia leiteira do Estado do Piauí e demonstra a necessidade de adoção de medidas de prevenção e controle da raiva em locais onde há morcegos hematófagos.(AU)

This paper aims to report an outbreak of rabies in cattle of dairy region of Parnaíba, Piauí. A total of 127 animals died with neurological symptoms. Three animals were necropsied and samples from brain and cerebellum were collected to perform Direct Immunofluorescence Test (DFAT) and Biological Test in Mice (BTM). Moreover, 16 bats (Desmodus rotundus) were captured on the property and surrounding caves and, then, submitted to DFAT and BTM. The samples from bovines and bats were positive by DFAT and BTM. In addition, the histopathological examination of bovine samples revealed lesions compatibles with the disease. This work reports the first outbreak of rabies in cattle in the dairy region of Piauí and demonstrates the need to adopt measures to prevent and control rabies in places where there are hematophagous bats.(AU)

Estudo da neuroinvasividade do vírus da raiva em amostras de sistema nervoso central de bovinos

A raiva é uma encefalomielite aguda causada por um vírus da ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus e espécie Rabies virus (RABV). É um vírus RNA de fita simples, senso negativo que acomete todas as espécies de mamíferos. Seu diagnóstico é obtido de modo definitivo por técnicas laboratoriais. A imunofluorescência direta (IFD) é uma prova de triagem rápida, considerada padrão ouro pela OMS e OIE, pois possui alta sensibilidade e especificidade diagnóstica. Esta técnica utiliza como teste confirmatório o isolamento viral em camundongos (IVC) ou em cultura de células (IVCC). Uma vez que o RABV não infecta todas as estruturas do sistema nervoso central (SNC) de modo uniforme, a detecção deste agente pode ter resultados variáveis. Algumas situações exigem o desenvolvimento e implantação de metodologias alternativas, tais como transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e imunohistoquímica (IHQ), que possuem vantagens e apresentaram resultados bastante promissores. Para tanto, foram utilizadas amostras de SNC[tálamo, córtex, hipocampo, cerebelo, tronco encefálico (bulbo, ponte e mesencéfalo) e medula cervical]de 127 bovinos provenientes da Seção de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur, durante o período de março de 2015 a abril de 2016. As diferentes regiões do SNC dos animais foram identificadas e alíquotas foram separadas para a realização das técnicas de identificação viral, totalizando 689 fragmentos. A presença viral foi observada pela IFD e confirmada tanto pelo IVC quanto pelo IVCC. A distribuição do vírus pelas diferentes porções do SNC foi observada pelas técnicas de IFD, IHQ e RT-PCR para detecção do gene N em 40 animais que foram considerados positivos. Os 40 bovinos positivos na IFD confirmaram sua positividade na IHQ e IVC, apresentando concordância de 100% dos resultados. Entretanto houve diferença em relação aos resultados dos isolamentos virais, uma vez que, dos 38 animais positivos que foram submetidosaambas as técnicas, três foram negativos para a presença do RABV no IVCC, indicando uma concordância de 92,1%, (3538) quando comparado ao IVC. Em relação às técnicas moleculares houve diferenças, a RT-PCR apresentou positividade de 100% (4040), enquanto que a RT-qPCR observou-se que 97,5% (39/40) dos bovinos foram positivos. Na IFD, de modo geral, não houve disparidade entre os fragmentos em relação à positividade, porém ocorreu diferença quando se analisou a intensidade de fluorescência entre os fragmentos. Quando comparadas, a IHQ e a IFD apresentaram resultados semelhantes, embora a IHQ tenha apresentado positividade em 100% fragmentos (209209) e a IFD em 99,51% dos fragmentos (205206). Conclui-se, pelos resultados obtidos, diferenças na intensidade da distribuição viral e na concentração de RNA viral nas diferentes porções do SNC (padrões de neuroinvasividade) em bovinos; fato este que poderia interferir nos resultados obtidos no diagnóstico de rotina da raiva.

Rabies is an acute encephalomyelitis caused by a virus belonging to the Mononegavirales order, Rhabdoviridae family, Lyssavirus genus and Rabies virus (RABV) species. It is a single-stranded RNA virus, negative sense that affects all species of mammals. The definitively diagnosis is obtained by laboratory techniques. Direct fluorescent antibody test (dFAT) is a rapid screening, considered the gold standard by WHO and OIE, as it has high diagnostic sensitivity and specificity. However, it´s recommended the mouse inoculation test (MIT) or rabies tissue culture infection test (RTCIT) as a confirmatory test. Once RABV does not infect all central nervous system (CNS) structures uniformly, the detection of this agent may have varying results Some situations require the development and implementation of alternative methods such as RT-PCR, RT-qPCR and immunohistochemistry (IHC), which have advantages and showed very promising results. Therefore, CNS structures [thalamus, cortex, hippocampus, cerebellum, brainstem (medulla, pons and midbrain) and cervical cord] from 127 cattle were selected from the Rabies Diagnostics Section of the Instituto Pasteur during the period March 2015 to April 2016. The different CNS structures were identified and aliquots were separated for carrying out the viral identification techniques, totalizing 689 structures. The viral presence was observed by dFAT and confirmed by both the MIT and the RTCIT. The distribution of the virus by different portions of the CNS was observed by dFAT, IHC and RT-PCR for detection of the N gene in 40 animals considered positive. The 40 positive cattle in the dFAT confirmed their positivity on IHC and MIT, with agreement of 100% of the results. However there was a difference from the viral isolation since the 38 positive animals tested in both techniques, three were negative for the presence of RABV in RTCIT indicating an agreement of 92.1% (35/38) when compared to MIT. The dFAT, in general, showed no disparity among the fragments relative to their positivity, however, a difference was observed when analyzing the fluorescence intensity between the fragments. When compared IHC and dFAT presented similar results, although the IHC has presented a 100% positivity in the fragments (209/209) and 99.51% in dFAT (205/206).Regarding the molecular techniques, RT-PCR showed positivity of 100% (40/40), meanwhile RT-qPCR showed 97,5% (39/40) among the positive animals studied. In conclusion, the results suggest that there is variability in the intensity of virus distribution and in the virus concentration in different parts of the CNS (neuroinvasiveness patterns) in cattle. This fact could affect the results obtained in the diagnosis of rabies routine.

Molecular epidemiology of animal rabies in the semiarid region of Paraíba, Northeastern Brazil

In the semiarid of the state of Paraíba, the anti-rabies vaccination is not common, most of the local inhabitants who deal with the animals do not know the incidence of the disease in the region. In this study, samples of foxes (Pseudalopex vetulus), insectivorous bats (Molossus molossus), raccoons (Procyon cancrivorous) and domestic animals brains were submitted to the diagnosis of rabies, by using the direct fluorescent antibody technique (d-FAT) and mouse inoculation test (MIT). Of the 581 examined materials, 50 (8.60 %) were positive for d-FAT and 47 (8.09 %) for MIT. From the positive samples for rabies, RNAs were extracted and transformed to cDNA, at the Laboratory of Rabies/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. The phylogenetic characterization of the N gene was performed at the Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Universidade Nihon, Faculdade de Ciências Bioresource, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Based on the results of genotyping and phylogenetic analyzes, it is concluded that the epidemiology of rabies is complex in the semiarid of Paraíba, with different viral variants being maintained in domestic dogs, foxes, insectivorous bats and vampire bats. All the isolates examined belong to the genotype I of the genus Lyssavirus and it is possible to state that in the region, foxes are important sylvatic reservoirs of the rabies virus.

No semiárido do Estado da Paraíba, a vacinação antirrábica não é comum, a maioria dos habitantes locais que lidam com os animais não conhece a incidência da doença na região. Neste estudo, amostras do cérebro de raposas (Pseudalopex vetulus), de morcegos insetívoros (Molossus molossus), de guaxinins (Procyon cancrivorous) e de animais domésticos foram submetidas ao diagnóstico da raiva, pela técnica de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC). Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos para IFD e 47 (8,09%) para o ICC. Das amostras positivas para raiva, os RNAs foram extraídos e transformados em DNA, no Laboratório de Raiva/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. A caracterização filogenética do gene N foi realizada no Centro de Investigação Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Ciências Bioresource, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Com base nos resultados das análises filogenéticas e genotipagem, conclui-se que a epidemiologia da raiva é complexa no semiárido da Paraíba, com diferentes variantes virais sendo mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. Todos os isolados analisados pertencem ao genótipo I do gênero Lyssavirus, e é possível afirmar que, na região, as raposas são importantes reservatórios silvestres do vírus da raiva.

Molecular epidemiology of animal rabies in the semiarid region of Paraíba, Northeastern Brazil

In the semiarid of the state of Paraíba, the anti-rabies vaccination is not common, most of the local inhabitants who deal with the animals do not know the incidence of the disease in the region. In this study, samples of foxes (Pseudalopex vetulus), insectivorous bats (Molossus molossus), raccoons (Procyon cancrivorous) and domestic animals brains were submitted to the diagnosis of rabies, by using the direct fluorescent antibody technique (d-FAT) and mouse inoculation test (MIT). Of the 581 examined materials, 50 (8.60 %) were positive for d-FAT and 47 (8.09 %) for MIT. From the positive samples for rabies, RNAs were extracted and transformed to cDNA, at the Laboratory of Rabies/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. The phylogenetic characterization of the N gene was performed at the Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Universidade Nihon, Faculdade de Ciências Bioresource, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Based on the results of genotyping and phylogenetic analyzes, it is concluded that the epidemiology of rabies is complex in the semiarid of Paraíba, with different viral variants being maintained in domestic dogs, foxes, insectivorous bats and vampire bats. All the isolates examined belong to the genotype I of the genus Lyssavirus and it is possible to state that in the region, foxes are important sylvatic reservoirs of the rabies virus.

No semiárido do Estado da Paraíba, a vacinação antirrábica não é comum, a maioria dos habitantes locais que lidam com os animais não conhece a incidência da doença na região. Neste estudo, amostras do cérebro de raposas (Pseudalopex vetulus), de morcegos insetívoros (Molossus molossus), de guaxinins (Procyon cancrivorous) e de animais domésticos foram submetidas ao diagnóstico da raiva, pela técnica de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC). Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos para IFD e 47 (8,09%) para o ICC. Das amostras positivas para raiva, os RNAs foram extraídos e transformados em DNA, no Laboratório de Raiva/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. A caracterização filogenética do gene N foi realizada no Centro de Investigação Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Ciências Bioresource, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Com base nos resultados das análises filogenéticas e genotipagem, conclui-se que a epidemiologia da raiva é complexa no semiárido da Paraíba, com diferentes variantes virais sendo mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. Todos os isolados analisados pertencem ao genótipo I do gênero Lyssavirus, e é possível afirmar que, na região, as raposas são importantes reservatórios silvestres do vírus da raiva.

Molecular epidemiology of animal rabies in the semiarid region of Paraíba, Northeastern Brazil / Epidemiologia molecular da raiva animal no semiárido da Paraíba, Nordeste do Brasil

In the semiarid of the state of Paraíba, the anti-rabies vaccination is not common, most of the local inhabitants who deal with the animals do not know the incidence of the disease in the region. In this study, samples of foxes (Pseudalopex vetulus), insectivorous bats (Molossus molossus), raccoons (Procyon cancrivorous) and domestic animals brains were submitted to the diagnosis of rabies, by using the direct fluorescent antibody technique (d-FAT) and mouse inoculation test (MIT). Of the 581 examined materials, 50 (8.60 %) were positive for d-FAT and 47 (8.09 %) for MIT. From the positive samples for rabies, RNAs were extracted and transformed to cDNA, at the Laboratory of Rabies/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. The phylogenetic characterization of the N gene was performed at the Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Universidade Nihon, Faculdade de Ciências Bioresource, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Based on the results of genotyping and phylogenetic analyzes, it is concluded that the epidemiology of rabies is complex in the semiarid of Paraíba, with different viral variants being maintained in domestic dogs, foxes, insectivorous bats and vampire bats. All the isolates examined belong to the genotype I of the genus Lyssavirus and it is possible to state that in the region, foxes are important sylvatic reservoirs of the rabies virus. (AU)

No semiárido do Estado da Paraíba, a vacinação antirrábica não é comum, a maioria dos habitantes locais que lidam com os animais não conhece a incidência da doença na região. Neste estudo, amostras do cérebro de raposas (Pseudalopex vetulus), de morcegos insetívoros (Molossus molossus), de guaxinins (Procyon cancrivorous) e de animais domésticos foram submetidas ao diagnóstico da raiva, pela técnica de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC). Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos para IFD e 47 (8,09%) para o ICC. Das amostras positivas para raiva, os RNAs foram extraídos e transformados em DNA, no Laboratório de Raiva/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. A caracterização filogenética do gene N foi realizada no Centro de Investigação Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Ciências Bioresource, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Com base nos resultados das análises filogenéticas e genotipagem, conclui-se que a epidemiologia da raiva é complexa no semiárido da Paraíba, com diferentes variantes virais sendo mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. Todos os isolados analisados pertencem ao genótipo I do gênero Lyssavirus, e é possível afirmar que, na região, as raposas são importantes reservatórios silvestres do vírus da raiva.(AU)

Molecular epidemiology of animal rabies in the semiarid region of Paraíba, Northeastern Brazil / Epidemiologia molecular da raiva animal no semiárido da Paraíba, Nordeste do Brasil

In the semiarid of the state of Paraíba, the anti-rabies vaccination is not common, most of the local inhabitants who deal with the animals do not know the incidence of the disease in the region. In this study, samples of foxes (Pseudalopex vetulus), insectivorous bats (Molossus molossus), raccoons (Procyon cancrivorous) and domestic animals brains were submitted to the diagnosis of rabies, by using the direct fluorescent antibody technique (d-FAT) and mouse inoculation test (MIT). Of the 581 examined materials, 50 (8.60 %) were positive for d-FAT and 47 (8.09 %) for MIT. From the positive samples for rabies, RNAs were extracted and transformed to cDNA, at the Laboratory of Rabies/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. The phylogenetic characterization of the N gene was performed at the Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Universidade Nihon, Faculdade de Ciências Bioresource, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Based on the results of genotyping and phylogenetic analyzes, it is concluded that the epidemiology of rabies is complex in the semiarid of Paraíba, with different viral variants being maintained in domestic dogs, foxes, insectivorous bats and vampire bats. All the isolates examined belong to the genotype I of the genus Lyssavirus and it is possible to state that in the region, foxes are important sylvatic reservoirs of the rabies virus.

No semiárido do Estado da Paraíba, a vacinação antirrábica não é comum, a maioria dos habitantes locais que lidam com os animais não conhece a incidência da doença na região. Neste estudo, amostras do cérebro de raposas (Pseudalopex vetulus), de morcegos insetívoros (Molossus molossus), de guaxinins (Procyon cancrivorous) e de animais domésticos foram submetidas ao diagnóstico da raiva, pela técnica de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC). Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos para IFD e 47 (8,09%) para o ICC. Das amostras positivas para raiva, os RNAs foram extraídos e transformados em DNA, no Laboratório de Raiva/Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, SP. A caracterização filogenética do gene N foi realizada no Centro de Investigação Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Ciências Bioresource, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa, Japão. Com base nos resultados das análises filogenéticas e genotipagem, conclui-se que a epidemiologia da raiva é complexa no semiárido da Paraíba, com diferentes variantes virais sendo mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. Todos os isolados analisados pertencem ao genótipo I do gênero Lyssavirus, e é possível afirmar que, na região, as raposas são importantes reservatórios silvestres do vírus da raiva.

Trinta e nove anos de diagnóstico de raiva em quirópteros no Rio Grande do Sul, Brasil (1976 2014)

No Rio Grande do Sul (RS), o diagnóstico oficial da raiva é, atualmente, realizado pelo Laboratório de Virologia do Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF), instituição ligada à Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária (Fepagro Saúde Animal). Os registros presentemente disponíveis de resultados de diagnóstico da raiva no IPVDF datam de 1976. A organização e informatização desses registros permitiram efetuar o monitoramento da infecção até o presente. Neste contexto, este trabalho tem o objetivo de apresentar, em um estudo retrospectivo, o resultado de 39 anos do diagnóstico da raiva em quirópteros, realizado no IPVDF, buscando permitir a visualização da freqüência e distribuição da raiva em quirópteros no RS ao longo desse período. As amostras de quirópteros remetidas ao laboratório foram provenientes das atividades de vigilância de entidades e órgãos públicos diversos. Ao longo desses 39 anos, para o diagnóstico da raiva foram utilizadas as técnicas de Sellers, imunofluorescência direta (IFD) e inoculação em camundongos. Os registros dos resultados do diagnóstico foram organizados em planilha eletrônica Microsoft Excel 7.0® para análise dos dados. Os mapas temáticos de distribuição da raiva foram confeccionados utilizando os softwares livres Tabwin e TerraView. No período entre 1976 e 2014, foram recebidos 4.062 quirópteros para exame. Foram analisadas 3.934 amostras de quirópteros sendo 140 (3,6%) positivas e 3794 negativas para raiva; 128 amostras foram consideradas impróprias para o diagnóstico. Ao todo, foram examinados 19 gêneros diferentes de quatro famílias da ordem quiróptera. Nove gêneros pertencentes a três famílias tiveram resultados positivos para raiva. O maior número de amostras positivas foi detectado nos gêneros Tadarida (n=59), Desmodus (n=11), Myotis (n= 6) e Eptesicus (n=5). Os gêneros Artibeus e Histiotus; Lasiurus e Molossus; e Nyctinomops apresentaram, respectivamente, 4, 2 e 1 indivíduos positivos para raiva. Em relação à época do ano as frequências da raiva em quirópteros foram mais elevadas no verão e outono (entre os meses de dezembro e maio) apresentando picos elevados nos meses de abril e setembro.Houve aumento da frequência de submissões, bem como no número de amostras consideradas positivas a partir do ano de 2000, provavelmente devido ao aumento da vigilância da raiva. Os resultados deste trabalho podem contribuir no estudo da raiva em quirópteros e colaborar nas ações de prevenção e controle dessa infecção pelos órgãos públicos de saúde. Sugere-se a continuação deste estudo para o monitoramento contínuo da raiva em quirópteros.

In Rio Grande do Sul (RS), the official diagnosis of rabies is performed at the Virology Laboratory of the Intituto de Pesquisas Veterinárias Desiderio Finamor (IPVDF), an organ linked to Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária (Fepagro Saúde Animal). The earliest available records of the results of rabies diagnosis date back to 1976. Analysis of such data allows an insight onto the behavior of rabies virus infections over the years within the State. In the present study, the 39 years of diagnosis of rabies in bats were analysed in order to get a better understanding of the frequency of occurrence, seasonality and distribution of rabies in bats in the State. Specimens of bats from different municipalities were sent to the laboratory for rabies diagnosis. The diagnostic methods employed were, initially, the Seller´s method for detection of Negri bodies and intracerebral inoculation of mice. Later, the detection of Negri bodies was superseded by the direct fluorescent antibody technique (DFAT). The mouse inoculation test remained as the confirmatory test to support DFAT. Records of the results of the diagnosis were organized in Microsoft Excel 7.0® spreadsheet for data analysis. The variables were standardized. Thematic maps of rabies distribution were made using free software Tabwin and Terraview. Between 1976 and 2014, 4.062 samples of bats were submitted to the laboratory diagnosis of rabies. Of the samples submitted, 140 (3.6%) were positive and 128 samples (3.15%) were considered unfit for diagnosis. In total, they examined 19 different genera of four families of quiroptera order. Nine genera belonging three families have tested positive for rabies. The genera with the highest frequency of positivity were Tadarida genre with 59 individuals (42.1%), Desmodus with 11 specimens (11.7%), Myotis with 6 samples (6.4%) and Eptesicus with 5 positive individuals (5.3%). Genres Artibeus and Histiotus; Lasiurus and Molossus; and Nyctinomops presented, respectively, 4, 2 and 1 positive individuals. Regarding the time of year that the samples examined were collected, the frequency of rabies in bats were higher in summer and autumn (between the months of December) presenting a high peak in September. There was an increase in the frequency of submissions and the number of samples considered positive from the year 2000, probably due to increased surveillance of rabies. The results of this study may contribute to the anger of the study bats and collaborate in the prevention and control of this infection by public health agencies. It is suggested to continue this study for the continuous monitoring of rabies in bats.

Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram que os siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva.

Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lyssavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian one, more studies on antivirals for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in titres of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, and siRNA 649) were used with antisense strands complementary to rabies virus phosphoprotein (P) mRNA and three other (Le 1, Le 2, Le 3) to the leader RNA. Pasteur virus strain (PV) and strain 4005 (AgV3) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of the RNAs with Lipofectamine-2000. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate (Pasteur Insitutte, Brazil). The plates transfected with siRNA against phosphoprotein mRNA were also incubated for 48 hours and subjected to IFD assay. Virus titres were calculated by the Spearman-Karber method. The results showed that siRNAs against virus leader RNA were not able to inhibit the replication of the virus. The use of siRNAs against P mRNA resulting titres of 3.625logTCID50/ml 3.875logTCID50/ml and 4.125logTCID50/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while, for the control plate, the titre was 4.0logTCID50/ml in plates with PV and 24h incubation period. In plates with strain 4005 and treated with siRNAs, the highest viral titre decrease was obtained with siRNA 360, with a 1.0 log difference compared to the control plate of strain 4005 incubated for 24h. The plates treated with siRNA 649 and siRNA 652 have was also shown a decrease in viral titres, but on a smaller scale (0.25log and 0.125log, respectively) compared to the control. The plates infected with PV and incubated for 48 hours showed titre of 5.625logTCID50/ml, 4.625logTCID50/ml and 4.75logTCID50%/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while for the control plate the titre was 6.0logTCID50C%/ml. The plate with strain 4005 and then treated with siRNA360 and incubated for a total of 48h had the highest viral titre decrease among the three siRNAs, which resulted in a 1.125log difference compared to the control plate. In monolayers treated with siRNA649 and siRNA652 there was also a discrete drop in viral titres (0.875log and 0.295log, respectively) compared to the control plate. For the in vivo assay, 21-day old Swiss albino mice weighing between 11 and 14g were intracerebrally inoculated with PV or 4005 strains (10DL50%). Two hours after inoculation, a solution of siRNA360 with Lipofectamine 2000 was also intracerebrally injected. Mice presenting paralysis and those that survived the 30 days of observation were euthanized. The central nervous system of all animals was collected and submitted to IFD. The use of siRNA360 in mice resulted in survival of 30% of animals in the group inoculated with strain 4005, whereas 90% mortality was observed in the control group. In animals inoculated with the PV strain, and treated with siRNA360, the survival rate was 40% and in the control group the mortality was 100%. The results of the in vitro assay demonstrate that the siRNAs used are effective in inhibiting the replication of rabies virus with a more intense inhibition regarding siRNA 360. In vivo, this siRNA was able to induce partial protection of animals infected with both viral variants. These results also indicate that, despite the need for further studies, RNAi is a promising technology as antiviral against rabies.

RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.