Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus / Diferentes métodos de PCR em tempo real para detecção do vírus da pseudorraiva

Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140.

Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140.

Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus / Diferentes métodos de PCR em tempo real para detecção do vírus da pseudorraiva

Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140. (AU)

Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140. (AU)

Descrição das ações de vigilância em focos da doença de Aujeszky / Description of surveillance actions in outbreaks of Aujeszky´s disease

Aujeszkys disease (AD) is known for causing huge productive and economical losses in the swine industry. This study focused on describing the actions of the official animal health protection used on identification of AD outbreaks. Two outbreaks that occurred in Cerqueira César city were selected, a case presenting only seropositive animals (outbreak 1) and  another one where there were animals with clinical signs of the disease (outbreak 2). The methods used to identify the outbreaks in surveillance actions and to diagnose the epidemiological situation were described. The measures implemented to eliminate the outbreaks in infected pig production systems were appointed in animal health protection laws and were able to eliminated all outbreaks identified. In conclusion, the official animal health protection measures and the appliance of the sanitary legislation were effective in eradicating AD, reassuring that notifications of suspicous cases of AD facilitate animal health surveillance activities.

A doença de Aujeszky (DA) é conhecida na suinocultura pelo seu grande impacto produtivo e econômico. Este trabalho teve como objetivo a descrição das ações de defesa sanitária animal utilizadas na identificação de focos dessa enfermidade. Foram selecionadas duas situações de foco de DA que ocorreram no Município de Cerqueira César, um caso apresentando somente animais sororreagentes (Foco 1) e outro em que havia animais com sinais clínicos da enfermidade (Foco 2). Estão descritos os métodos de identificação de focos utilizados nas ações de vigilância e o diagnóstico da situação epidemiológica encontrada. As medidas aplicadas na erradicação dos focos nos sistemas de produção de suínos infectados foram as prescritas na legislação de defesa sanitária animal e  todos os focos identificados foram eliminados. Ao final, concluiu-se que as ações de defesa sanitária e a legislação em vigor foram eficazes, demonstrando que os sistemas de notificações das suspeitas da enfermidade são facilitadores das ações de vigilância.

Descrição das ações de vigilância em focos da doença de Aujeszky / Description of surveillance actions in outbreaks of Aujeszky´s disease

Aujeszkys disease (AD) is known for causing huge productive and economical losses in the swine industry. This study focused on describing the actions of the official animal health protection used on identification of AD outbreaks. Two outbreaks that occurred in Cerqueira César city were selected, a case presenting only seropositive animals (outbreak 1) and  another one where there were animals with clinical signs of the disease (outbreak 2). The methods used to identify the outbreaks in surveillance actions and to diagnose the epidemiological situation were described. The measures implemented to eliminate the outbreaks in infected pig production systems were appointed in animal health protection laws and were able to eliminated all outbreaks identified. In conclusion, the official animal health protection measures and the appliance of the sanitary legislation were effective in eradicating AD, reassuring that notifications of suspicous cases of AD facilitate animal health surveillance activities.(AU)

A doença de Aujeszky (DA) é conhecida na suinocultura pelo seu grande impacto produtivo e econômico. Este trabalho teve como objetivo a descrição das ações de defesa sanitária animal utilizadas na identificação de focos dessa enfermidade. Foram selecionadas duas situações de foco de DA que ocorreram no Município de Cerqueira César, um caso apresentando somente animais sororreagentes (Foco 1) e outro em que havia animais com sinais clínicos da enfermidade (Foco 2). Estão descritos os métodos de identificação de focos utilizados nas ações de vigilância e o diagnóstico da situação epidemiológica encontrada. As medidas aplicadas na erradicação dos focos nos sistemas de produção de suínos infectados foram as prescritas na legislação de defesa sanitária animal e  todos os focos identificados foram eliminados. Ao final, concluiu-se que as ações de defesa sanitária e a legislação em vigor foram eficazes, demonstrando que os sistemas de notificações das suspeitas da enfermidade são facilitadores das ações de vigilância.(AU)

DESCRIÇÃO DAS AÇÕES DE VIGILÂNCIA EM FOCOS DA DOENÇA DE AUJESZKY

title>Abstract /title> p>Aujeszkys disease (AD) is known for causing huge productive and economical losses in the swine industry. This study focused on describing the actions of the official animal health protection used on identification of AD outbreaks. Two outbreaks that occurred in Cerqueira César city were selected, a case presenting only seropositive animals (outbreak 1) and another one where there were animals with clinical signs of the disease (outbreak 2). The methods used to identify the outbreaks in surveillance actions and to diagnose the epidemiological situation were described. The measures implemented to eliminate the outbreaks in infected pig production systems were appointed in animal health protection laws and were able to eliminated all outbreaks identified. In conclusion, the official animal health protection measures and the appliance of the sanitary legislation were effective in eradicating AD, reassuring that notifications of suspicous cases of AD facilitate animal health surveillance activities. /p>

title>Resumo /title> p>A doença de Aujeszky (DA) é conhecida na suinocultura pelo seu grande impacto produtivo e econômico. Este trabalho teve como objetivo a descrição das ações de defesa sanitária animal utilizadas na identificação de focos dessa enfermidade. Foram selecionadas duas situações de foco de DA que ocorreram no Município de Cerqueira César, um caso apresentando somente animais sororreagentes (Foco 1) e outro em que havia animais com sinais clínicos da enfermidade (Foco 2). Estão descritos os métodos de identificação de focos utilizados nas ações de vigilância e o diagnóstico da situação epidemiológica encontrada. As medidas aplicadas na erradicação dos focos nos sistemas de produção de suínos infectados foram as prescritas na legislação de defesa sanitária animal e todos os focos identificados foram eliminados. Ao final, concluiu-se que as ações de defesa sanitária e a legislação em vigor foram eficazes, demonstrando que os sistemas de notificações das suspeitas da enfermidade são facilitadores das ações de vigilância. /p>

Os desafios da doença de Aujeszky em suínos para a defesa sanitária animal / The challenges of Aujeszky's disease in swine for animal health protection / Los retos de la enfermedad de Aujeszky en cerdos animales en defensa de la salud

A doença de Aujeszky (DA), causada pelo herpesvirus suíno tipo 1 é uma enfermidade de grande importância na suinocultura mundial, pois causa enormes prejuízos nas diversas categorias da criação desses animais. Apesar de não ser uma enfermidade com normas que restringem as exportações, sua presença pode comprometer o comércio internacional devido a restrições dos próprios países importadores. Devido a este fato, muitos países estão com programas de controle e erradicação da DA em andamento, inclusive o Brasil. As legislações brasileiras vigentes para o controle desta enfermidade têm seu embasamento legal em lei federal desde 1934, ocasião que foi aprovado o serviço de defesa sanitária animal e fez da DA enfermidade de notificação obrigatória, passível de medidas de defesa sanitária animal. Ao mesmo tempo, também os Estados têm sua legislação específica que regulamenta o assunto. Para o êxito da erradicação vários fatores são imprescindíveis como: adesão do Estado ao programa, inquérito soroepidemiológico, estratégias de combate à doença, sendo fundamental a existência de um serviço de defesa sanitária animal que dê suporte às ações do programa de erradicação.

Aujeszky's disease (AD), caused by Swine herpesvirus 1 (SHV-1) is a disease of major importance in the swine industry worldwide, it causes huge losses in the various categories of the creation of such animals. Although not an illness with rules restricting exports, its presence may jeopardize international trade due to restrictions of importing countries themselves. Due to this fact, many countries have programs to control and eradicate AD underway, including Brazil. The laws in force in that country to control this disease have their legal foundation in federal law since 1934, when it was approved service of animal health protection and the AD made notifiable disease, countervail able of animal health protection. At the same time, states also have their specific legislation regulating the matter. For successful eradication as several factors are essential: the accession of the state program, seroepidemiological survey, strategies to combat the disease, being fundamental to the existence of a service animal health protection that supports the actions of the eradication program.

La enfermedad de Aujeszky (EA), causada por el herpes-vírus porcino tipo 1 es una enfermedad de gran importancia en la indústria porcina a nível mundial, que causa grandes pérdidas en las distintas categorías de la creación de este tipo de animales. A pesar que no es una enfermedad con normas que restringen las exportaciones, su presencia puede comprometer el comercio internacional debido a las restricciones de los propios países importadores. Debido a este hecho, muchos países están con los programas de control y erradicación de la DA en curso, incluido Brasil. Las legislaciones brasileñas en vigor para el control de esta enfermedad tienen su fundamento jurídico en la ley federal desde 1934, ocasión que fue aprovado el servicio de defensa sanitária animal y hizo de la AD enfermedad de notificación obligatoria, responsable de las medidas de defensa sanitária animal. Al mismo tiempo, los estados tienen sus legislaciones específicas que regulan el asunto. Para el éxito de la erradicación varios factores son esenciales como la adhesión del estado al programa, investigaciones seroepidemiológicos, estratégias para combatir la enfermedad, siendo imprescindible disponer de un servicio de protección de la salud animal que apoye las acciones del programa de erradicación.

Principais causas de problemas reprodutivos em porcas / Main causes of reproduction disorders in sows

Esta revisão de literatura visa abordar os principais problemas reprodutivos dentro de uma granja suína. O aborto pode ser categorizado em dois tipos: oriundo de causas infecciosas e oriundo de causas não infecciosas. O percentual de aborto aceitável na suinocultura tecnificada encontra-se entre 1 a 1,5%, entretanto, alguns estudos relatam taxa um pouco maiores em alguns rebanhos suínos. Existem diversos fatores predisponentes, tais como abortos sazonais, stress calórico e ambiental, baixo nível de higiene, deficiências nutricionais, entre outros. Entre as causas infecciosas, podemos destacar: doença de Aujeszky, parvovirose, leptospirose, circovirose, peste suína clássica, brucelose e PRRS. Observando todos esses fatores de influência no sucesso reprodutivo de uma granja, devemos sempre estar atentos a suas causas, de modo a prevenir sua ocorrência. (AU)

The literature review focused on the main reproductive disorders in pig herds, Abortion are general divided into two categories: abortions caused by infectious agents and caused by non-infectious agents. The acceptable rate of abortion in intensive pig farming is between 1 and 1,5%, however, studies shows higher rates are common in breeding farms. Several predisponent factors such as: seasonal abortion, caloric and environmental stress, sunburns, low level of hygiene, nutritional deficiency, and others, help to raise those rates. Among the infectious agents, which can cause abortion, there are Aujeszky disease virus, parvovirus, leptospirosis, circovirus, classic swine fever virus, brucellosis, PRRS virus and others. Looking through all those factors that have broad influence on the reproductive success of a pig herd, we it is recommended always being aware of the causes so it is possible to prevent them. (AU)

Principais causas de problemas reprodutivos em porcas / Main causes of reproduction disorders in sows

Esta revisão de literatura visa abordar os principais problemas reprodutivos dentro de uma granja suína. O aborto pode ser categorizado em dois tipos: oriundo de causas infecciosas e oriundo de causas não infecciosas. O percentual de aborto aceitável na suinocultura tecnificada encontra-se entre 1 a 1,5%, entretanto, alguns estudos relatam taxa um pouco maiores em alguns rebanhos suínos. Existem diversos fatores predisponentes, tais como abortos sazonais, stress calórico e ambiental, baixo nível de higiene, deficiências nutricionais, entre outros. Entre as causas infecciosas, podemos destacar: doença de Aujeszky, parvovirose, leptospirose, circovirose, peste suína clássica, brucelose e PRRS. Observando todos esses fatores de influência no sucesso reprodutivo de uma granja, devemos sempre estar atentos a suas causas, de modo a prevenir sua ocorrência.

The literature review focused on the main reproductive disorders in pig herds, Abortion are general divided into two categories: abortions caused by infectious agents and caused by non-infectious agents. The acceptable rate of abortion in intensive pig farming is between 1 and 1,5%, however, studies shows higher rates are common in breeding farms. Several predisponent factors such as: seasonal abortion, caloric and environmental stress, sunburns, low level of hygiene, nutritional deficiency, and others, help to raise those rates. Among the infectious agents, which can cause abortion, there are Aujeszky disease virus, parvovirus, leptospirosis, circovirus, classic swine fever virus, brucellosis, PRRS virus and others. Looking through all those factors that have broad influence on the reproductive success of a pig herd, we it is recommended always being aware of the causes so it is possible to prevent them.

Soroprevalência de pseudorraiva, peste suína clássica e brucelose em suínos do estado do Piauí / Seroprevalence of pseudorabies, classical swine fever and brucellosis in swine in the state of Piauí

Este trabalho teve como objetivo determinar a soroprevalência de pseudorraiva, peste suína clássica (PSC) e brucelose suína em suínos do estado do Piauí, Brasil. Foram coletadas amostras sanguíneas de 384 suínos de criações intensivas e extensivas do estado. Anticorpos anti-Brucella spp. foram detectados pelo teste do antígeno acidificado tamponado e confirmados pelo teste 2-mercaptoetanol, enquanto a detecção de anticorpos contra os vírus da PSC e pseudorraiva foi realizada por ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando-se kits comerciais específicos. Anticorpos anti-Brucella spp. foram detectados em 1,04% (2/192) dos suínos de criações intensivas. Dos rebanhos avaliados, 0,78% (3/384) dos animais exibiram anticorpos contra o vírus da PSC, sendo 1,04% (2/192) de criações intensivas e 0,52% (1/192) de criações extensivas. Anticorpos contra o vírus da pseudorraiva foram detectados apenas em suínos de criação extensiva, com prevalência de 5,2% (10/192). Esses são os primeiros dados sobre a soroprevalência da brucelose suína, pseudorraiva e PSC em rebanhos do Piauí. A detecção de 10 amostras positivas para pseudorraiva causa preocupação sobre a possibilidade da circulação viral na população suídea desse estado e revela uma necessidade premente de realização de estudos mais extensos para melhor compreender a importância dessas enfermidades de notificação obrigatória em estados da região Nordeste brasileira.(AU)

This study aimed to determine the prevalence of Pseudorabies, Classical Swine Fever (CSF) and Swine Brucellosis in swine in the state of Piauí, Brazil. Blood samples were collected from 384 pigs from intensive and small outdoor systems in the state. Anti-Brucella spp. antibodies were detected by Buffered Acidified Antigen Test and positive results confirmed by 2-Mercaptoethanol Test. Detection of antibodies against CSF and Pseudorabies virus were performed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using specific commercial kits. Only two samples (1.04% - 2/192) from the intensive system were seropositive to Brucella spp. In the evaluated herds, 0.78% (3/384) of animals had antibodies against CSF virus, two from outdoor pigs (1.04% - 2/192) and one from intensive systems (0.52% - 1/192). Antibodies against the Pseudorabies virus were detected only in outdoor pigs, with seroprevalence of 5.2% (10/192). This is the first report on seroprevalence of Pseudorabies, CSF and Brucellosis in hog farms in Piauí, Brazil. The detection of 10 positive cases raises a concern regarding Pseudorabies virus circulation in the swine population in the state and reveals a need for further studies to better understand the real situation and status of obligatory notified diseases in the swine herds in the Northestern states of Brazil.(AU)

PCR em tempo real para detecção do vírus da doença de Aujeszky / Real time PCR for detection of Aujeszky's disease virus

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma PCR em tempo real (qPCR) para o diagnóstico rápido e sensível da doença de Aujeszky. Os iniciadores amplificaram um fragmento de 123 pares de base do gene codificante da glicoproteína D. A qPCR foi testada em 25 amostras de cérebro de suíno positivas e 85 amostras negativas para DA no isolamento viral e na soroneutralização. A sensibilidade analítica foi calculada com acréscimo de um isolado brasileiro do SuHV-1 titulado em amostras de cérebro de suíno negativas na soroneutralização e na PCR. A técnica apresentou sensibilidade analítica de 10-0,5 TCID50/50µL. A qPCR foi capaz de distinguir reações inespecíficas devido a dímero de oligonucleotídeos iniciadores ou amplificações, além do alvo designado (evitando, assim, os falso-positivos), e de obter resultados rápidos.(AU)

The aim of this study was to validate a low-cost real-time PCR for a quick and sensitive diagnosis of the disease. The fluorofore used was a DNA intercalating agent, one of the cheaper detection systems. Primers amplified a 123 base pairs fragment of the gene coding for glycoprotein D. PCR was tested on 25 samples of pig brain positive for AD and 85 samples negative in viral isolation and serum neutralization. The detection limit was calculated on samples of pig brain contaminated with a Brazilian isolate of SuHV-1. The technique had a detection limit of 10-0,5 TCID50/50µL. PCR was able to distinguish nonspecific reactions due to primer dimers (thus avoiding false positives) and get faster results.(AU)

Pseudorabies virus can be classified into five genotypes using partial sequences of UL44

Suid herpesvirus 1 (SuHV-1) is the causative agent of pseudorabies (PR), a disease of great importance due to the huge losses it causes in the swine industry. The aim of this study was to determine a method for genotyping SuHV-1 based on partial sequences of the gene coding for glycoprotein C (gC) and to elucidate the possible reasons for the variability of this region. A total of 109 gCsequences collected from GenBank were divided into five major groups after reconstruction of a phylogenetic tree by Bayesian inference. The analysis showed that a portion of gC (approximately 671 bp) is under selective pressure at various points that coincide with regions of protein disorder. It was also possible to divide SuHV-1 into five genotypes that evolved under different selective pressures. These genotypes are not specific to countries or continents, perhaps due to multiple introduction events related to the importation of swine.(AU)

Estratégia para erradicação de focos da Doença de Aujeszky em suínos no Estado de São Paulo / Strategy for eradication of outbreaks of Aujeszky's Disease in pigs in the São Paulo state

Este trabalho teve como objetivo a avaliação de duas estratégias para erradicação de focos da doença de Aujeszky (DA) em suínos criados comercialmente no estado de São Paulo. Foram identificados dois focos da enfermidade, no município de Cerqueira César, um apresentando somente animais sororreagentes (Foco 1) e outro, casos clínicos da doença (Foco 2). Foram avaliadas duas estratégias de erradicação, uma por eliminação dos sororreagentes e outra por despovoamento gradual, com acompanhamento durante 12 meses. A erradicação por eliminação dos sororreagentes foi aplicada no Foco 1 e compreendeu na identificação por exame sorológico, isolamento e abate dos positivos; vacinação dos negativos e reposição no plantel com animais provenientes de propriedade livre. No início dos trabalhos, 68% do plantel era positivo e ao final 51%. No Foco 2 utilizou-se o despovoamento gradual, onde todos os animais foram enviados ao abate sanitário, realizado vazio sanitário nas instalações, seguido pelo repovoamento com animais livres. Esta última estratégia, nas condições desse trabalho, mostrou-se a mais eficaz, pois erradicou a DA.(AU)

This study aimed to evaluate strategies for eradication of Aujeszky Disease (AD) virus infection after outbreaks in swine production systems in Sao Paulo state. Two outbreaks were identified in Cerqueira César county. The first outbreak coursed with seropositive pigs (outbreak 1), and the other with pigs presenting clinical signs (outbreak 2). In order to eradicate the infection, two sanitary strategies were tested: (1) eradication of animals with positive serology and (2) by gradual depopulation, with a follow up of 12 months. The serology eradication was used in outbreak 1, and included the identification, isolation and slaughter of positive animals; followed by vaccination of negative animals and replacement with pigs from farms free of the disease. At the beginning, 68% of pigs were positive, and at the end it declined to 51%. In outbreak 2, gradual depopulation was used, and all animals were sent to sanitary slaughter, until facilities were completely empty. Afterwards, animals free of the disease were used for repopulation. It was seen that the last strategy was more effective because eradicated the infection.(AU)

ELISA PARA DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE AUJESZKY EMPREGANDO gE RECOMBINANTE ESTABILIZADA COMO PROTEÍNA FUSIONADA À TIORREDOXINA

O impacto econômico causado pela Doença de Aujeszky (DA) tem diminuído com uso de vacinas deletadas para o gene gE do Vírus da DA e testes diagnósticos para detecção de anticorpos específicos para a proteína correspondente ao gene deletado, para diferenciação dos animais infectados dos vacinados - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a porção extramembranar da glicoproteína gE do vírus da DA em sistema de expressão E. coli utilizando gene sintético com códons otimizados e proteína fusionada a tiorredoxina (Trx), e avaliar seu potencial uso em ELISA. Após a clonagem, expressão e a identificação da proteína gE recombinante (gErec*Trx) em Western blotting com anticorpo anti-His, a gErec*Trx (aproximadamente 60 kDa) foi usada como antígeno em ELISA (ELISAgErec) utilizando Proteina G peroxidase como conjugado. Amostras previamente testadas em virusneutralização (VN) e em ELISA comercial foram testadas no ELISAgErec, e o ponto de corte (>0,13) foi definido por análise da curva ROC. Foram utilizados 599 soros de suínos, sendo 208 positivos virusneutralização (VN) e 391 negativos em ELISA comercial para detecção de anticorpos antigE do vírus da DA, sendo 300 oriundas de Granjas de Reprodutores Suínos Certificadas (GRSCs) e 91 de propriedades tecnificadas do estado de Pernambuco. O ELISAgErec apresentou sensibilidade de 97,6% e especificidade de 96,4%. Para avaliar a sensibilidade analítica e o limite de detecção foi testado o soro internacional de referência para a DA, e para avaliação da especificidade analítica foram testados soros de suínos Livre de Patógenos Específicos (SPF) vacinados com as principais vacinas usadas em suínos. O ELISAgEr apresentou maior sensibilidade que o ELISA comercial demonstrando assim sua capacidade de distinguir animais sadios e vacinados dos animais infectados. Além de apresentar boa solubilidade a gErec se manteve imunorreativa no mesmo título no ELISAgErec após vários meses estocada a 4 °C, e mesmo após estresse térmico a 70 °C apresentou mesmos resultados.

The economic impact caused by Aujeszky's disease (AD) has decreased with the use of vaccines deleted for the gE gene of the AD Virus and diagnostic tests for the detection of antibodies specific to the protein corresponding to the deleted gene for differentiation of infected animals from the vaccinated - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). The goal of this work was to clone and express the gene related to the extramembrane portion of the gE glycoprotein of the DA virus in E. coli expression system using synthetic gene with optimized codons and thioredoxin fused protein (Trx), and to evaluate its potential use in ELISA. After cloning, expression and identification of recombinant gE protein (gErec*Trx) in Western blotting with anti-His antibody, gErec*Trx (approximately 60 kDa) was used as antigen in ELISA (ELISAgErec) using Protein G peroxidase as conjugate. Samples previously tested in virus neutralization (VN) and in commercial ELISA were tested in ELISAgErec, and the cutoff point (> 0.13) was defined by ROC curve analysis. A total of 599 sera from pigs were used, of which 208 were positive VN and 391 negative in commercial ELISA for the detection of antigE antibodies from the DA virus, of which 300 originated from Certified Porcine Breeding Farms (GRSCs) and 91 from Technological properties of the State of Pernambuco. ELISAgErec presented sensitivity of 97.6% and specificity of 96.4%. To evaluate the analytical sensitivity and limit of detection, the international reference serum for AD was used, and for analysis of the analytical specificity were tested sera from pigs Pathogen-Specific Free (SPF) vaccinated with the main vaccines used in pigs. ELISAgEr showed greater sensitivity than the commercial ELISA thus demonstrating its ability to distinguish healthy and vaccinated animals from infected animals. In addition, to showing good solubility, gErec remained immunoreactive in the same titre in ELISAgErec after several months stored at 4 °C, and even after thermal stress at 70 °C it presented the same results.

Avaliação in vitro do potencial antiviral de Guettarda angelica contra herpesvírus animais / In vitro evaluation of the antiviral potential of Guettarda angelica against animal herpesviruses

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with significant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1. Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts was calculated by difference of virus titer between treated infected cells and non-treated infected cells. Only the aqueous extract from seeds (AEs) showed a significant antiviral activity (P < 0.01, ANOVA followed by Tukey test) against all herpesviruses leading continuous studies. Thus, the selectivity index (SI) of this extract was determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] colorimetric assay by calculating the ratio CC50 over IC50. The 50% cytotoxic concentration (CC50) was defined as the extract concentration that reduced the cell viability by 50% when compared to untreated controls; the 50% inhibitory concentration (IC50) was defined as the concentration of the extract that inhibited 50% of viral replication when compared to the virus control. The CC50 and IC50 were obtained from nonlinear regression analysis of concentration-effect curves by the GraphPad Prism 5 Demo program and represented the means ± standard deviation of three independent experiments. The CC50 for Vero cells was 400.60 ± 0.20 µg/mL, while the CC50 for MDBK cells was 920.50 ± 0.19 µg/mL. The IC50 values of the AEs on the BoHV-1, SuHV-1 and EHV-1 were 22.79 µg/mL, 91.30 µg/mL and 19.95 µg/mL, respectively. The SI values of this extract for each virus obtained from these data were 40.39, 10.08 and 20.08 for BoHV-1, SuHV-1, and EHV-1, respectively. Discussion: To ensure the antiviral activity of a plant extract and consequently its future use as antiviral agent is crucial the obtainment of its selectivity index or safety index. It is guarantee of a true antiviral effect and not the result of cytotoxicity of the extract on cells, and that could be confused with an antiviral activity. Other important point are the extract IC50 values less than 100 µg/mL. The results of the AEs of G. angelica are in accordance with these considerations indicating that the G. angelica seeds may be a potential source of antiviral compounds insurance and encouraging further investigation of them.

Epidemiologia e controle dos focos de doença de Aujeszky no rio grande do sul, Brasil, em 2003

Este estudo objetivou avaliar o uso de anestesia local infiltrativa com bupivacaína a 0,5% na área da incisão cirúrgica como parte de uma abordagem analgésica multimodal em cães submetidos à ovariohisterectomia (OVH) por celiotomia ou vídeo-assistida por dois portais. Para isso foram selecionadas vinte e oito cadelas adultas (2,08±1,45 anos) hígidas, pesando 12,67±1,94kg. Os animais foram pré medicados com maleato de acepromazina (0,05mg.kg-1, IM), anestesiados com propofol (4mg.kg-1, IV), seguida de manutenção da anestesia geral com isoflurano vaporizado em oxigênio a 100%. A analgesia transoperatória foi promovida com fentanil em infusão contínua (20g.kg-1hora-1), precedida de dose bolus (2,5g.kg-1, IV). Os animais foram alocados aleatoriamente em quatro grupos: grupo controle celiotomia (CC, n=7), grupo bloqueio celiotomia (BC, n=7), grupo controle vídeo-assistido (CV, n=7), e grupo bloqueio vídeo-assistido (BV, n=7). Nos grupos em que foi realizado bloqueio (BC e BV), a bupivacaína a 2mg.kg-1 foi administrada por via subcutânea na linha de incisão ou na entrada dos portais. Nos grupos controle, foi infiltrado 3 ml de solução salina nos mesmos locais. Foi administrado meloxicam (0.2mg.kg-1) ao final da cirurgia e a c formulação comercial de metamizol sódico e hioscina N-butilbromida a cada 8 horas durante dois dias. Todos os animais tiveram a dor pós-operatória avaliada por três avaliadores experientes e cegos para o tratamento e cirurgia, usando as escalas de dor de Melbourne e visual analógica a cada hora nas primeiras 8 horas e às 12, 18, 24, 36 e 48 horas após a extubação. A glicemia e o cortisol sérico também foram avaliados. Não houve resgate analgésico em nenhum dos animais de grupos que receberam bloqueio anestésico (BC e BV). Em todos os animais do CC e um em CV receberam resgate analgésico até a segunda hora de pós-operatório. O bloqueio infiltrativo anestésico realizado com 2,0mg.kg-1 de bupivacaína foi eficiente na promoção do conforto pósoperatório quando utilizado em OVH por celiotomia e vídeoassistidas.

This study aimed to investigate the use of local infiltrative anesthesia with 0.5% bupivacaine in surgical incision site as part of a multimodal analgesic approach in dogs submitted to ovariohysterectomy (OVH) by celiotomy or video-assisted by two-port. Twenty-eight adult (2.08 ± 1.45 years) and healthy bitches, weighing 12.67 ± 1.94 kg, with aptitude confirmed by clinical and laboratory tests were selected. Dogs were pre-medicated with acepromazine (0.05mg.kg-1, IM), induced and maintained in general anesthesia with propofol (4mg.kg-1, IV) and isoflurane vaporized in 100% oxygen, respectively. Intraoperative analgesia was promoted with fentanyl in continuous infusion (20g.kg -1.hour-1), preceded by a loading dose (2,5g.kg-1, IV). Dogs were divided into four groups: control group celiotomy (CC, n = 7), blocking group celiotomy (BC, n = 7), control video-assisted group (CV) and blocking video-assisted group (BV). In the blocked groups (BC and BV), bupivacaine (2mg.kg-1) was administered subcutaneously in the incision line or port entry sites. Control groups received 3 ml of saline solution at the same sites. Meloxicam (0.2mg.kg-1) administered at the end of the surgery with the combination of metamizole sodium and Hyoscine N-butyl bromide every 8 hours for 2 days. Postoperative pain was evaluated by three evaluators blinded to surgery and treatment established, using Melbourne Pain Scale and visual analogue scale. Pain was assessed hourly in the first 8 hours and, then, at 12, 18, 24, 36 and 48 hours post-extubation. Glycemia and serum cortisol were evaluated too. Rescue analgesia was administered to one animal in CV after one hour postoperative, while seven dogs in CC received additional analgesia in the first two hours postoperative and was not required by any of the animals that received anesthetic block (BC and BV). Statistical analysis suggested that the anesthetic infiltrative blockade performed with 2,0mg.kg-1 bupivacaine was efficient in promoting postoperative comfort when used in both celiotomy and video-assisted OVH..

Neurological disorder in cattle associated with bovine herpesvirus 4 / Desordem neurológica em bovinos associada ao herpevírus bovino 4

A nested PCR assay was used to diagnose bovine encephalitis through herpesviruses including bovine herpesvirus 5 (BHV-5), bovine herpesvirus 1 (BHV-1), Aujeszky's disease virus (SHV-1), and ovine herpesvirus 2 (OHV-2) in 14 fragments of central nervous system (CNS) from cattle that died with neurological signs. In addition, as some samples of bovine herpesvirus type 4 (BHV-4) have been isolated from neural tissue, it was also tested by nested PCR. The cases of encephalitis occurred in isolation at different times of the year and did not present any seasonality. The duration of the clinical course ranged between 1 to 15 days, and in 64.3 percent of the cases it manifested between 1 to 2 days. The most frequently observed neurological signs were ataxia, recumbency, unsteadiness and inability to stand, opisthotonus, paddling movements, nystagmus and ptyalism. In the nested assay, there was no evidence of: BHV-1, SHV-1 or OHV-2 in the DNA obtained from the CNS in any of the samples. But the presence of BHV-4 was found in all fragments of the CNS in cattle which died presenting neurological signs. Moreover, BHV-5 was found in association with BHV-4 in two of these samples.(AU)

Nested PCR foi utilizada para o diagnóstico de encefalite bovina por herpesvírus incluindo o herpesvírus bovino 5 (BHV-5), o herpesvírus bovino 1 (BHV-1), o vírus da doença de Aujeszky (SHV-1) e o herpesvírus ovino 2 (OHV-2) em 14 fragmentos do sistema nervoso central (SNC) de bovinos que morreram com sinais neurológicos. Embora o BHV-4 não seja reconhecido como vírus neurotrófico, foi detectado nos casos de encefalite que ocorreram isoladamente em diferentes épocas do ano e não apresentaram nenhuma sazonalidade. A duração do curso clínico variou entre 1 e 15 dias, e em 64,3 por cento dos casos manifestou-se entre 1 e 2 dias. Os sinais neurológicos mais freqüentemente observados foram ataxia, apatia, instabilidade, opistótono, movimentos de pedalagem, nistagmo e sialorréia. Nos ensaios de PCR nested realizados a partir do DNA obtido do SNC, não foi encontrado evidência de: BHV-1, SHV-1 ou OHV-2 em nenhuma das amostras. Mas, a presença de BHV-4 foi encontrada em todos os fragmentos do SNC de bovinos que morreram com sinais neurológicos. Além disso, o BHV-5 foi encontrado em associação com o BHV-4 em duas dessas amostras.(AU)

PCR duplex para diferenciação de amostras vacinais e selvagens do vírus da doença de Aujeszky / A duplex PCR for differentiation of wild and vaccine virus of Aujeszkyïs disease

A duplex PCR was developed to differentiate the wild-type virus from the attenuated virus used in vaccinations. The PCR was able to amplify fragments of 493bp for glycoprotein E (gE) gene and 207bp for glycoprotein B (gB) gene. The analytical sensitivity was determined by addition of a virus field sample titled in the brain samples of pigs. The standard virus strain Shope, the vaccine strain Bartha, and ten other field isolates were subjected to PCR. The PCR was able to amplify fragments of gE and gB in all field samples and only fragments of gB were amplified in the attenuated virus, as expected. The technique was able to detect up to 100.5 TCID50/50mL virus in samples of brain. Duplex PCR proved to be an important tool for differentiation of naturally-infected animals and animals vaccinated with the virus deleted for gE.(AU)

Development of a polymerase chain reaction assay for the detection of pseudorabies virus in clinical samples

Aujeszky's disease, also known as pseudorabies causes severe economic losses in swine industry and affects the pig husbandry all over the world. The conventional diagnostic procedure is time-consuming and false-negative results may occur in submissions from latently infected animals. The development, optimization and evaluation of a polymerase chain reaction (PCR) assay are presented for the diagnosis of pseudorabies infection. This assay was based on the amplification of a highly conserved viral gD gene fragment. PCR products of the expected size were obtained from PRV strains. Non-specific reactions were not observed when a related herpesvirus, other porcine DNA genome viruses and uninfected cells were used to assess PCR. The analytical sensitivity of the test was estimated to be 1.34 TCID50/50 uL. The analysis of tissue homogenate samples from naturally infected animals proved the potential usefulness of the method for a rapid disease diagnosis from field cases. A rapid, sensitive and specific PCR-based diagnostic assay to detect pseudorabies virus in clinical samples is provided.

A doença de Aujeszky, também conhecida como pseudo-raiva, causa perdas econômicas graves na indústria suína e afeta a criação de suínos em todo o mundo. O procedimento de diagnóstico convencional é demorado, podendo ocorrer resultados falso-negativos em animais infectados de forma latente. Este estudo apresenta o desenvolvimento, otimização e avaliação de um ensaio de Reação de Polimerase em Cadeia para o diagnóstico da pseudo-raiva. O ensaio baseou-se na amplificação do fragmento genético viral gD altamente conservado. Os produtos da PCR de tamanho esperado foram obtidos a partir de isolados de PRV. Não foram observadas reações inespecíficas quando foram testados herpes-vírus relacionados, outros vírus DNA de suínos e células não infectadas. A sensibilidade analítica estimada do teste foi 1,34 TCID50/50 uL. A análise de homogenatos feitos com tecidos de animais naturalmente infectados mostrou que o método é útil para o diagnóstico rápido da doença no campo, sendo um ensaio rápido, sensível e específico para detectar o vírus da pseudo-raiva em amostras clinicas.

Development of a polymerase chain reaction assay for the detection of pseudorabies virus in clinical samples

Aujeszky's disease, also known as pseudorabies causes severe economic losses in swine industry and affects the pig husbandry all over the world. The conventional diagnostic procedure is time-consuming and false-negative results may occur in submissions from latently infected animals. The development, optimization and evaluation of a polymerase chain reaction (PCR) assay are presented for the diagnosis of pseudorabies infection. This assay was based on the amplification of a highly conserved viral gD gene fragment. PCR products of the expected size were obtained from PRV strains. Non-specific reactions were not observed when a related herpesvirus, other porcine DNA genome viruses and uninfected cells were used to assess PCR. The analytical sensitivity of the test was estimated to be 1.34 TCID50/50 uL. The analysis of tissue homogenate samples from naturally infected animals proved the potential usefulness of the method for a rapid disease diagnosis from field cases. A rapid, sensitive and specific PCR-based diagnostic assay to detect pseudorabies virus in clinical samples is provided.

A doença de Aujeszky, também conhecida como pseudo-raiva, causa perdas econômicas graves na indústria suína e afeta a criação de suínos em todo o mundo. O procedimento de diagnóstico convencional é demorado, podendo ocorrer resultados falso-negativos em animais infectados de forma latente. Este estudo apresenta o desenvolvimento, otimização e avaliação de um ensaio de Reação de Polimerase em Cadeia para o diagnóstico da pseudo-raiva. O ensaio baseou-se na amplificação do fragmento genético viral gD altamente conservado. Os produtos da PCR de tamanho esperado foram obtidos a partir de isolados de PRV. Não foram observadas reações inespecíficas quando foram testados herpes-vírus relacionados, outros vírus DNA de suínos e células não infectadas. A sensibilidade analítica estimada do teste foi 1,34 TCID50/50 uL. A análise de homogenatos feitos com tecidos de animais naturalmente infectados mostrou que o método é útil para o diagnóstico rápido da doença no campo, sendo um ensaio rápido, sensível e específico para detectar o vírus da pseudo-raiva em amostras clinicas.

Erradicação da doença de Aujeszky em Santa Catarina: importância da condição sanitária das leitoas de reposição / Aujeszky's diasease eradication in Santa Catarina State: relevance of sanitary status of replacement gilts

A doença de Aujeszky (DA) é uma infecção causada por um herpesvírus, o vírus da DA (VDA), primariamente em suínos. Esta doença está presente no Estado de Santa Catarina (SC) desde 1984. Devido ao impacto da DA no mercado exportador de carne suína, no comércio de reprodutores e nas perdas de produtividade, um programa de erradicação, financiado por uma parceria entre a indústria e a associação de produtores tem tido sucesso em eliminar gradualmente a DA de rebanhos suínos de SC. O último caso de DA no estado foi identificado em julho de 2004. Durante o processo de despovoamento/repovoamento, foi detectado um rebanho suíno positivo para o VDA localizado no oeste de SC. Estudos de rastreabilidade da origem daqueles animais indicaram que a fonte era uma granja que distribuía reprodutores ilegalmente sem certificação sanitária. Este suinocultor mantinha um sistema de integração que incluía 40 diferentes produtores para quem eram comercializados reprodutores e/ou suínos para terminação. Testes de soroprevalência detectaram anticorpos anti-VDA em 12 daqueles rebanhos. Devido a sua localização dentro do raio de 2,5km do foco inicial, uma outra granja, onde havia uma central de inseminação artificial que distribuía sêmen suíno para outras 5 granjas do mesmo proprietário, foi testada e também resultou positiva. Os objetivos deste artigo são descrever as condições sanitárias frente ao VDA naquelas granjas que receberam suínos ou sêmen suíno daqueles suinocultores, as medidas para controlar e eliminar o VDA dos rebanhos positivos e a situação atual decorrente deste trabalho. Além disso, o artigo busca alertar que medidas de vigilância ativa e normas sanitárias para comércio e distribuição de material genético devem ser seguidas, caso contrário, a DA pode recrudescer e tornar-se fora de controle como ocorria antes do início deste programa.(AU)

Aujeszky's disease (AD) is an herpesvirus infection, caused by the pseudorabies virus (PRV), primarily in swine and present in Santa Catarina State (SC) since 1984. Due to the impacts of AD in the pork export, breeder's trade and productivity losses, an eradication program, financed by industry and swine producers association, has successfully eradicated the AD of swine herds in SC State. The last case of AD in the State was identified in July of 2004. During the depopulation/repopulation process, a PRV positive swine herd located in the west region of SC State was detected. Traceability studies of the origin of those animals indicated that the source was a swine farm which illegally distributed breeders without sanitary certification. This swine producer maintained an integration system which included 40 different producers, to whom were commercialized breeders and/or finishers. Serum-prevalence tests detected PRV antibodies in 12 of those herds. Due to the location into the 2.5km of radius from the initial outbreak, another swine farm, which had an artificial insemination center that distributed swine semen to another 5 herds of the same owner was tested positive as well. The objectives of this paper are to describe the sanitary status related to AD on the farms which have received pigs or swine semen from these swine producers, the measures to control and eliminate ADV from positive herds and the outcome of this work. Beyond that, to alert that measures of active surveillance and sanitary rules for commerce and distribution of genetic materials must be properly fulfilled, otherwise, AD can reactivate and become out of control as occurred before the eradication program.(AU)