Secretion pattern of canine amniotic stem cells derived extracellular vesicles

Extracellular vesicles (EVs) derived from stem cells (SCs) have regenerative potential and the possibility of being used in treating chronic diseases. EVs present lower risk of tumorigenicity and easily to isolation and storage. Therefore, this research aims to compare the morphological characteristics of the EVs (up to 150nm) derived from stem cells obtained from canine amniotic membranes in different passages during the in vitro culture. For this, cells from the amniotic membranes were isolated, cultured, and characterized. In order to answer our aim, the number of cells was normalized at each passage to generate conditioned media for EVs separation. The cells were differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic tissue, to characterize these cells as mesenchymal stem cells (MSC). Moreover, flow cytometry analysis was performed and showed that the MSC were positive for CD90, CD105 and negative for CD34, CD45, mesenchymal and hematopoietic markers, respectively. For EVs analysis, MSC in different passages (P0-P2) were culture until 80% of confluence, then the medium was replaced by EVs depleted medium. After 48h, culture medium was collected and centrifuged to separate EVs, followed by nanoparticle tracking analysis. The EVs were also characterized by western blot and transmission electron microscopy (TEM). EVs were positive for Alix and negative for Cytochrome C as well as presented the traditional cup-shape by transmission electronic microscopy. Our results demonstrated that the concentration in the different passages was increased in P0 compared to P1 and P2 (p<0.05). No differences were found in EVs size (P0=132nm, P1=130nm and P2=120nm). Together, these results demonstrate that P0 of MSC is enriched of EVs when compared to later passages, suggesting that this passage would be the best to be applied in pre-clinical tests. Despite that, more studies are necessary to identify the EVs content and how the cells will respond to treatment with them.(AU)

The role of the oviduct and extracellular vesicles during early embryo development in bovine

The oviduct is an important reproductive structure that connects the ovary to the uterus and takes place to important events such as oocyte final maturation, fertilization and early embryonic development. Thus, gametes and embryo can be directly influenced by the oviductal microenvironment composed by epithelial cells such secretory and ciliated cells and oviductal fluid. The oviduct composition is anatomically dynamic and is under ovarian hormones control. The oviductal fluid provides protection, nourishment and transport to gametes and embryo and allows interaction to oviductal epithelial cells. All these functions together allows the oviduct to provides the ideal environment to the early reproductive events. Extracellular vesicles (EVs) are biological nanoparticles that mediates cell communication and are present at oviductal fluid and plays an important role in gametes/embryo - oviductal cells communication. This review will present the ability of the oviducts based on its dynamic and systemic changes during reproductive events, as well as the contribution of EVs in this process.(AU)

Nanoparticles from culture media are internalized by in vitro-produced bovine embryos and its depletion affect expression of pluripotency genes

Abstract Extracellular vesicles are nanoparticles secreted by cell and have been proposed as suitable markers to identify competent embryos produced in vitro. Characterizing EVs secreted by individual embryos is challenging because culture medium itself contributes to the pool of nanoparticles that are co-isolated. To avoid this, culture medium must be depleted of nanoparticles that are present in natural protein source. The aim of this study was to evaluate if the culture medium subjected to nanoparticle depletion can support the proper in vitro development of bovine embryos. Zygotes were cultured in groups on depleted or control medium for 8 days. Nanoparticles from the medium were characterized by their morphology, size and expression of EVs surface markers. Isolated nanoparticles were labelled and added to depleted medium containing embryos at different developmental stages and evaluated after 24 hours at 2, 8-16 cells, morula and blastocyst stages. There were no statistical differences on blastocyst rate at day 7 and 8, total cell count neither blastocyst diameter between groups. However, morphological quality was better in blastocysts cultured in non-depleted medium and the expression of SOX2 was significantly lower whereas NANOG expression was significantly higher. Few nanoparticles from medium had a typical morphology of EVs but were positive to specific surface markers. Punctuated green fluorescence near the nuclei of embryonic cells was observed in embryos from all developmental stages. In summary, nanoparticles from culture medium are internalized by in vitro cultured bovine embryos and their depletion affects the capacity of medium to support the proper embryo development.

Nanoparticles from culture media are internalized by in vitro-produced bovine embryos and its depletion affect expression of pluripotency genes

Extracellular vesicles are nanoparticles secreted by cell and have been proposed as suitable markers to identify competent embryos produced in vitro. Characterizing EVs secreted by individual embryos is challenging because culture medium itself contributes to the pool of nanoparticles that are co-isolated. To avoid this, culture medium must be depleted of nanoparticles that are present in natural protein source. The aim of this study was to evaluate if the culture medium subjected to nanoparticle depletion can support the proper in vitro development of bovine embryos. Zygotes were cultured in groups on depleted or control medium for 8 days. Nanoparticles from the medium were characterized by their morphology, size and expression of EVs surface markers. Isolated nanoparticles were labelled and added to depleted medium containing embryos at different developmental stages and evaluated after 24 hours at 2, 8-16 cells, morula and blastocyst stages. There were no statistical differences on blastocyst rate at day 7 and 8, total cell count neither blastocyst diameter between groups. However, morphological quality was better in blastocysts cultured in non-depleted medium and the expression of SOX2 was significantly lower whereas NANOG expression was significantly higher. Few nanoparticles from medium had a typical morphology of EVs but were positive to specific surface markers. Punctuated green fluorescence near the nuclei of embryonic cells was observed in embryos from all developmental stages. In summary, nanoparticles from culture medium are internalized by in vitro cultured bovine embryos and their depletion affects the capacity of medium to support the proper embryo development.(AU)

Extracellular vesicles in infectious diseases caused by protozoan parasites in buffaloes

Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound vesicles of growing interest in vetetinary parasitology. The aim of the present report was to provide the first isolation, quantification and protein characterization of EVs from buffalo (Bubalus bubalis) sera infected with Theileria spp. Methods: Infected animals were identified through optical microscopy and PCR. EVs were isolated from buffalo sera by size-exclusion chromatography and characterized using western blotting analysis, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. Subsequently, the proteins from isolated vesicles were characterized by mass spectrometry. Results: EVs from buffalo sera have shown sizes in the 124-140 nm range and 306 proteins were characterized. The protein-protein interaction analysis has evidenced biological processes and molecular function associated with signal transduction, binding, regulation of metabolic processes, transport, catalytic activity and response to acute stress. Five proteins have been shown to be differentially expressed between the control group and that infected with Theileria spp., all acting in the oxidative stress pathway. Conclusions: EVs from buffaloes infected with Theileria spp. were successfully isolated and characterized. This is an advance in the knowledge of host-parasite relationship that contributes to the understanding of host immune response and theileriosis evasion mechanisms. These findings may pave the way for searching new EVs candidate-markers for a better production of safe biological products derived from buffaloes.(AU)

Extracellular vesicles in infectious diseases caused by protozoan parasites in buffaloes

Background: Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound vesicles of growing interest in vetetinary parasitology. The aim of the present report was to provide the first isolation, quantification and protein characterization of EVs from buffalo (Bubalus bubalis) sera infected with Theileria spp. Methods: Infected animals were identified through optical microscopy and PCR. EVs were isolated from buffalo sera by size-exclusion chromatography and characterized using western blotting analysis, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. Subsequently, the proteins from isolated vesicles were characterized by mass spectrometry. Results: EVs from buffalo sera have shown sizes in the 124-140 nm range and 306 proteins were characterized. The protein-protein interaction analysis has evidenced biological processes and molecular function associated with signal transduction, binding, regulation of metabolic processes, transport, catalytic activity and response to acute stress. Five proteins have been shown to be differentially expressed between the control group and that infected with Theileria spp., all acting in the oxidative stress pathway. Conclusions: EVs from buffaloes infected with Theileria spp. were successfully isolated and characterized. This is an advance in the knowledge of host-parasite relationship that contributes to the understanding of host immune response and theileriosis evasion mechanisms. These findings may pave the way for searching new EVs candidate-markers for a better production of safe biological products derived from buffaloes.(AU)

Extracellular vesicles and its advances in female reproduction

Intercellular communication is an essential mechanism for development and maintenance of multicellular organisms. Extracellular vesicles (EVs) were recently described as new players in the intercellular communication. EVs are double-membrane vesicles secreted by cells and are classified according to their biosynthesis, protein markers and morphology. These extracellular vesicles contain bioactive materials such as miRNA, mRNA, protein and lipids. These characteristics permit their involvement in different biological processes. Reproductive physiology is complex and involves constant communication between cells. Different laboratories have described the presence of EVs secreted by ovarian follicular cells, oviductal cells, in vitro produced embryos and by the endometrium, suggesting that EVs are involved in the development of gametes and embryos, in animals and humans. Therefore, is important to understand physiological mechanisms and contributions of EVs in female reproduction in order to develop new tools to improve in vivo reproductive events and assisted reproductive techniques (ARTs). This review will provide the current knowledge related to EVs in female reproductive tissues and their role in ARTs.

Extracellular vesicles and its advances in female reproduction

Intercellular communication is an essential mechanism for development and maintenance of multicellular organisms. Extracellular vesicles (EVs) were recently described as new players in the intercellular communication. EVs are double-membrane vesicles secreted by cells and are classified according to their biosynthesis, protein markers and morphology. These extracellular vesicles contain bioactive materials such as miRNA, mRNA, protein and lipids. These characteristics permit their involvement in different biological processes. Reproductive physiology is complex and involves constant communication between cells. Different laboratories have described the presence of EVs secreted by ovarian follicular cells, oviductal cells, in vitro produced embryos and by the endometrium, suggesting that EVs are involved in the development of gametes and embryos, in animals and humans. Therefore, is important to understand physiological mechanisms and contributions of EVs in female reproduction in order to develop new tools to improve in vivo reproductive events and assisted reproductive techniques (ARTs). This review will provide the current knowledge related to EVs in female reproductive tissues and their role in ARTs.(AU)

Vesículas extracelular: una forma de comunicación intrafollicular / Extracellular vesicles: a form of intrafollicular communication / Vesículas extracelulares: uma forma de comunicação intrafolicular

La producción de leche en el ganado taurina presenta una serie de obstáculos en las regiones tropicales como Brasil. Una de estas barreras es la tensión térmica (ET), lo que implica una pérdida económica importante para los productores. La pérdida de capital debe caer en gran medida en la producción de leche y fallas reproductivas asociadas con ET. Ya se ha demostrado varios cambios reproductivos derivados de la ET. A nivel celular se observó entre las células foliculares de comunicación a través de vesículas extracelulares (EVs). Se observó la comunicación entre las células del cúmulo y células de la granulosa de los vehículos eléctricos. Lo que esta revisión se pretende correlacionar los vehículos eléctricos producidos en el interior de los folículos con los efectos de ET en ovocitos bovinos.(AU)

The production of taurine cattle milk presents a number of obstacles in tropical regions like Brazil. One of these barriers is the thermal stress (ET), which entails a major economic loss for producers. The loss of capital should largely fall in milk production and reproductive failures associated with ET. Already it has been demonstrated several reproductive changes arising from the ET. At the cellular level, it was noted between the communication follicular cells through extracellular vesicles (EVs). Communication was observed between cumulus cells and granulosa cells by EVs. Therefore, this review intends to correlate the EVs produced inside the follicles with the effects of ET on bovine oocytes.(AU)

A produção de leite de bovinos taurinos apresenta uma série de entraves em regiões tropicais como o Brasil. Um desses entraves é o estresse térmico (ET), que acarreta uma perda econômica importante para os produtores. A perda de capital se deve em grande parte à queda na produção de leite e nas falhas reprodutivas associadas ao ET. Já foram demonstradas várias alterações reprodutivas oriundas do ET. A nível celular, foi notada a comunicação entre células foliculares, por meio de vesículas extracelulares (EVs). Foi observada a comunicação entre células do cummuluse células da granulosa por meio de EVs. Sendo assim, esta revisão tem por finalidade correlacionar as EVs produzidas no interior dos folículos com os efeitos do ET sobre os oócitos bovinos.(AU)

Vesículas extracelular: una forma de comunicación intrafollicular / Extracellular vesicles: a form of intrafollicular communication / Vesículas extracelulares: uma forma de comunicação intrafolicular

La producción de leche en el ganado taurina presenta una serie de obstáculos en las regiones tropicales como Brasil. Una de estas barreras es la tensión térmica (ET), lo que implica una pérdida económica importante para los productores. La pérdida de capital debe caer en gran medida en la producción de leche y fallas reproductivas asociadas con ET. Ya se ha demostrado varios cambios reproductivos derivados de la ET. A nivel celular se observó entre las células foliculares de comunicación a través de vesículas extracelulares (EVs). Se observó la comunicación entre las células del cúmulo y células de la granulosa de los vehículos eléctricos. Lo que esta revisión se pretende correlacionar los vehículos eléctricos producidos en el interior de los folículos con los efectos de ET en ovocitos bovinos.

The production of taurine cattle milk presents a number of obstacles in tropical regions like Brazil. One of these barriers is the thermal stress (ET), which entails a major economic loss for producers. The loss of capital should largely fall in milk production and reproductive failures associated with ET. Already it has been demonstrated several reproductive changes arising from the ET. At the cellular level, it was noted between the communication follicular cells through extracellular vesicles (EVs). Communication was observed between cumulus cells and granulosa cells by EVs. Therefore, this review intends to correlate the EVs produced inside the follicles with the effects of ET on bovine oocytes.

A produção de leite de bovinos taurinos apresenta uma série de entraves em regiões tropicais como o Brasil. Um desses entraves é o estresse térmico (ET), que acarreta uma perda econômica importante para os produtores. A perda de capital se deve em grande parte à queda na produção de leite e nas falhas reprodutivas associadas ao ET. Já foram demonstradas várias alterações reprodutivas oriundas do ET. A nível celular, foi notada a comunicação entre células foliculares, por meio de vesículas extracelulares (EVs). Foi observada a comunicação entre células do cummuluse células da granulosa por meio de EVs. Sendo assim, esta revisão tem por finalidade correlacionar as EVs produzidas no interior dos folículos com os efeitos do ET sobre os oócitos bovinos.

AVALIAÇÃO DE microRNA-140 EM VESÍCULAS EXTRACELULARES SECRETADAS POR CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE MEMBRANA SINOVIAL EQUINA

A função parácrina das células-tronco (MSCs) é desempenhada também por vesículas extracelulares (VEs). Assim, as VEs têm impacto funcional nas células-alvo e nos mecanismos de controle de enfermidades por meio da entrega de microRNAs. A exemplo, na osteoartrite, em que a homeostase articular é regulada pelo microRNA-140. O objetivo deste trabalho foi caracterizar vesículas extracelulares (VEs) liberadas por células-tronco mesenquimais derivadas de membrana sinovial (eqSMMSC) e avaliar a expressão de microRNA-140 nas VEs e nas eqSMMSC em dois modelos de cultivo celular, além de, comparar a secreção de VEs e a expressão do microRNA-140 em ambiente inflamatório in vitro. Quatro grupos experimentais foram definidos. Grupos controle, um cultivo de eqSMMSCs 2D e um cultivo de eqSMMSCs 3D. Grupos induzidos, também divididos em 2D-OA e 3D-OA, porém foram expostos ao meio de cultivo simulando o ambiente inflamatório da osteoartrite OA-Like (IL-1 e TNF-). Amostras dos meios de cultivo de todos os grupos foram coletadas após 24, 72 e 120 horas de incubação para isolamento e caracterização de VEs. O isolamento de VEs foi realizado com kit comercial pelo método de precipitação. A caracterização foi realizada pela NTA, MET e expressão de mRNA das tetraspaninas CD9, CD63 e CD81. A análise da expressão do microRNA-140 em VEs e células por RT-qPCR e do mRNA da ADAMTS5 também por RT-qPCR. As VEs puderam ser isoladas e caracterizadas em todos os grupos e momentos experimentais. A expressão do microRNA-140 nas eqSMMSCs, o grupo 3D-OA teve maior expressão em relação aos demais grupos nos momentos 24 h e em 72 h à ambos os controles e ao 2D-OA; no momento 120 h, houve maior expressão do grupo 3D em relação aos tratados 2D-OA e 3D-OA. Já a expressão do microRNA-140 nas VEs, destaca-se no momento 72 h, onde o grupo 3D teve expressão significativa em relação aos demais, e no momento 120 h, a expressão também significativa foi do 2D-OA em relação aos demais. Na análise da expressão do mRNA ADAMTS5, pode-se destacar o momento 120 h, onde o grupo 3D-OA obteve maior expressão em relação aos controles 2D e 3D. Os dados obtidos apontaram que o modelo e as técnicas utilizadas foram eficazes para o isolamento e caracterização das VEs e para a identificação da expressão de microRNA nos diferentes grupos e momentos. A expressão do microRNA-140 em resposta ao ambiente inflamatório é desempenhada por eqSMMSCs, sendo que, em células 3D demonstrou-se ser rápida e em VEs oriundas de células cultivadas em 2D tardia

The paracrine function of stem cells (MSCs) is mainly performed by extracellular vesicles (EVs). Thus, the EV have functional impact on target cells and mechanisms of disease control through delivery microRNAs. For example, in osteoarthritis, in which joint homeostasis is regulated by microRNA-140. The objective of this work was to characterize extracellular vesicles (EVs) released by synovial membrane derived-mesenchymal stem cells (eqSMMSC) and to evaluate the expression of microRNA-140 in EVs and eqSMMSC cultivated in two cell culture models, in addition to comparing the secretion of EVs and the expression of microRNA-140 in an in vitro inflammatory environment. smMSCs were cultured and divided into four experimental groups. Control groups, one cultivation of 2D eqSMMSCs and one cultivation of 3D eqSMMSCs. Treated groups, also divided into 2D-OA and 3D-OA but were exposed to the culture medium simulating the OA-Like osteoarthritis inflammatory environment (IL-1 and TNF-). Culture media samples from all groups were collected after 24, 72 and 120 hours of incubation for isolation and characterization of EVs. Isolation of EVs was performed with a commercial kit using the precipitation method. Characterization was performed by NTA, TEM and mRNA expression of tetraspanins CD9, CD63 and CD81. Analysis of microRNA-140 expression in EVs and cells by RT-qPCR and ADAMTS5 mRNA in EVs also by RT-qPCR. EVs could be isolated and characterized in all groups and time points. The expression of microRNA-140 in eqSMMSCs, the 3D-OA group had greater expression in relation to the other groups at time points 24 h; and in 72 h for both controls and 2D-OA; at 120 h, there was greater expression in the 3D group compared to those treated 2D-OA and 3D-OA. The expression of microRNA-140 in EVs stands out at 72 h, where the 3D group had significant expression in relation to the others, and at 120 h, the expression was also significant for 2D-OA in relation to the others. In ADAMTS5 analysis of mRNA expression, the 120 h time point can be highlighted, where the 3D-OA group showed higher expression compared to control 2D and 3D. The data obtained showed that the model and the techniques used were effective for the isolation and characterization of EVs and for the identification of microRNA expression in different groups and time points. The expression of microRNA-140 in response to the inflammatory environment is performed by eqSMMSCs, and it was shown to be early in 3D cells and late in EVs from cells grown in 2D.

Estudo do perfil de miRNAs de ejaculados suínos com diferentes congelabilidades

Resumo da tese em português: A criopreservação espermática é o método mais eficiente para preservar sêmen a longo prazo em mamíferos. No entanto, o congelamento do sêmen de cachaços ainda é o maior desafio para a indústria suína devido à alta sensibilidade ao choque frio das células espermáticas desta espécie e à variação dos resultados pós-descongelamento entre indivíduos e ejaculados do mesmo reprodutor. Para resolver esse problema, investigamos se os microRNAs (miRNAs) presentes em células espermáticas e pequenas vesículas extracelulares (EVs) do plasma seminal de ejaculados de suínos podem predizer se ejaculados permanecerão com alta qualidade após passarem pelo processo de congelação-descongelação. Para tanto, foram coletados 27 ejaculados de alta qualidade de 27 machos (um de cada), obtidas amostras de miRNAs de espermatozoides e das EVs de plasma seminal in natura através de protocolos de centrifugação e, após o processo de criopreservação, determinamos dois grupos com diferentes congelabilidades considerando as análises de estrutura e funcionalidade dos espermatozoides após a descongelação (P <0,05): Alta congelabilidade (AC; n = 04) e baixa congelabilidade (BC; n = 04). Feito isso, finalmente investigamos o perfil de miRNAs de espermatozoides e EVs de plasma seminal em ambos os grupos com diferentes congelabilidades. Nossos principais resultados mostraram que três miRNAs foram diferentemente abundantes em ejaculados BC, sendo o ssc-miR-503 encontrado em níveis mais elevados em células espermáticas. O ssc-miR-130a e o ssc-miR-9 foram mais abundantes em EVs do plasma seminal (P <0,10). Por meio da análise de enriquecimento, foi possível verificar que esses miRNAs estão relacionados as modificações no desenvolvimento das células germinativas masculinas e na produção de energia utilizada pelos espermatozóides para manter sua viabilidade e funcionalidade. Portanto, por meio deste estudo, podemos demonstrar que o ssc-miR-503, ssc-miR-130a e ssc-miR-9 estão relacionados à baixa criotolerância espermática no sêmen de suínos. Deste modo, esses miRNAs podem ser usados como biomarcadores para predizer sua baixa capacidade de tolerar o processo de criopreservação.

Resumo da tese em inglês: Sperm cryopreservation is the most efficient method to preserve sêmen for the long term in mammals. However, freeze boar sêmen is still the biggest challenge for the swine industry due to the high cold shock sensitivity of boar sperm cells and the variance of post-thaw results among individuals and ejaculates from the same boar. To solve this problem, we investigate if microRNAs (miRNAs) present in sperm cells and small extracellular vesicles (E.V.s) from seminal plasma of raw boar ejaculates can predict high-quality ejaculates after underwent the freeze-thaw process. Therefore, we collected 27 high-quality ejaculates of 27 boars (one of each) obtained miRNAs samples of sperm cells and E.V.s from raw seminal plasma through centrifugation protocols. After the cryopreservation process, we determined two groups with different freezability considering the analysis post-thaw of structure and sperm functionality (P <0.05): High freezability (H.F.; n=04) and low freezability (L.F.; n=04). That done, we finally investigate the miRNAs profile of sperm cells and E.V.s from seminal plasma in both groups with different freezability. Our main results showed that three miRNAs were differently abundant in L.F. ejaculates, being the ssc-miR-503 found in higher levels in sperm cells. The ssc-miR-130a and ssc-miR-9 most abundant in E.V.s from seminal plasma (P <0.10). Through enrichment analysis, it was possible to verify that these miRNAs could be performing modifications in the development of male germ cells and in the production of energy to spermatozoa to maintain their viability and functionality. Therefore, through this study, we can demonstrate that ssc-miR-503, ssc-miR-130a, and ssc-miR-9 are related to low sperm cryotolerance in boars semen. So those miRNAs can be used as a biomarker to predict their low ability to tolerate the cryopreservation process.

Extracellular vesicles secreted by bovine embryos produced in vivo and in vitro: miRNAs content and molecular effects in endometrial and luteal tissues

BRIDI, A. Vesículas extracelulares secretadas por embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro: conteúdo de miRNAs e os efeitos moleculares sobre o endométrio e o corpo lúteo. 254 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP, 2021. Perfis metabólicos, padrões de expressão gênica, desenvolvimento embrionário, capacidade de estabelecer e manter gestações precoces são diferenças encontradas quando embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro são comparados. Para que a gestação tenha sucesso é necessária uma perfeita comunicação entre o embrião e o organismo materno. Vesículas extracelulares pequenas (sEVs) fazem parte dessa comunicação e carregam moléculas bioativas, como miRNAs, que podem atuar em células-alvo dentro do sistema reprodutivo bovino. Com isso, nossa hipótese é que embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro secretam sEVs contendo diferentes miRNAs que podem modular diferencialmente o padrão de expressão gênica endometrial e o perfil de miRNAs do corpo lúteo. Para isso, primeiramente, investigamos o conteúdo de miRNA em blastocistos eclodidos produzidos in vivo ou in vitro e, em sEVs secretadas por eles. Blastocistos eclodidos produzidos in vivo ou in vitro, no dia 9 de desenvolvimento, possuem diferentes perfis de miRNA. EVs pequenas secretadas por eles, do dia 7 até o dia 9 de desenvolvimento, contém miRNAs diferentes. Esses miRNAs diferentemente expressos são preditos por regularem vias envolvidas no desenvolvimento embrionário inicial e na receptividade endometrial. Por meio disso, as primeiras interações entre o embrião e o organismo materno podem ser modificadas, e isso pode afetar o sucesso da gestação. Em segundo lugar, investigamos as alterações no transcriptoma global do endométrio após o co-cultivo de explantes endometriais com um blastocisto produzido in vivo ou in vitro no dia 7 do desenvolvimento. Genes diferentemente expressos foram identificados no endométrio e estão associados com a presença e origem do embrião. Além disso, sEVs presentes nos meios condicionados (C.M.) por essas células embrionárias e endometriais contém diferentes miRNAs, que são preditos por modularem a via de sinalização da oxitocina. Finalmente, para compreender melhor se a comunicação entre o embrião, o endométrio e o corpo lúteo pode ser intermediada por sEVs, explantes luteais foram tratados com sEVs presentes nos C.M. por explantes endometriais cultivados sozinhos ou com um blastocisto bovino produzido in vivo ou in vitro no dia 7 do desenvolvimento. O perfil de miRNAs foi modificado nos explantes luteais tratados com essas sEVs e, nós podemos observar um efeito da presença e origem dos embriões nessas alterações. Juntos, esses resultados sugerem que sEVs intermedeiam a comunicação inicial entre o embrião, endométrio e o corpo lúteo, contribuindo para manter a viabilidade e funcionalidade luteal. Entretanto, futuros experimentos precisam ser realizados para avaliar efeitos biológicos específicos desses miRNAs carreados por essas sEVs no endométrio e no corpo lúteo. Além disso, a origem do embrião (in vivo ou in vitro) modifica as interações entre ele, o endométrio e o corpo lúteo, sugerindo fortemente que esses embriões tenham necessidades distintas para se desenvolverem.

BRIDI, A., Extracellular vesicles secreted by bovine embryos produced in vivo and in vitro: miRNAs content and molecular effects in endometrial and luteal tissues. 2021. 254 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP, 2021. Metabolic profiles, gene expression patterns, embryonic development, and the ability to establish and sustain early pregnancies are differences founded when in vivo- and in vitro- produced bovine embryos are compared. To the establishment of a successful pregnancy the perfect embryo- maternal communication is needed. Small extracellular vesicles (sEVs) are part of this crosstalk and carry bioactive molecules such as miRNAs that can act on target bovine cells within thereproductive system. Thereby, our hypothesis is that in vivo and in vitro bovine embryos secrete sEVs containing different miRNAs that can differentially modulate endometrial gene expression pattern and miRNAs profile in the corpus luteum (CL). To address this hypothesis, firstly, we investigated the miRNA content of in vivo and in vitro hatched blastocysts and in sEVs secreted by them. Day 9 in vivo or in vitro hatched blastocysts have distinct miRNA profiles. Small EVs secreted by them from day 7 up to day 9 of development contain different miRNAs. These miRNAs differently expressed are predicted to regulate pathways involved with early embryonic development and endometrial receptivity. Thereby, early embryo-maternal interactions can be modified and consequently can affect pregnancy success. Secondly, we investigated changes in the endometrial global transcriptome after the co-culture of endometrial explants with a day 7 in vivo or in vitro blastocysts. Differently expressed genes were identified in the endometrium and are associated with the embryo's presence or origin. Moreover, sEVs present in the conditioned media (C.M.) by these embryonic and endometrial cells contain different miRNAs, which are predicted to modulate the oxytocin signaling pathway. Finally, to understand if the communication among embryo, endometrium, and corpus luteum can be mediated by sEVs, luteal explants were treated with sEVs from C.M. by endometrial explants alone or cultured with a day 7 in vivo or in vitro blastocysts. MicroRNAs profile was modified in luteal explants treated with these sEVs, and we can observe an effect of the embryo presence and origin in these alterations. Together these results suggest that sEVs mediate early embryo-endometrium-corpus luteum communication, contributing to maintaining luteal viability and functionality. However, further experiments are needed to evaluate specific biological effects of these miRNAs carried by sEVs in the endometrium and in the corpus luteum. Moreover, the embryo origin (in vivo and in vitro) modify the interactions among embryo-endometrium-corpus luteum, suggesting strongly that these embryos have distinct needed to develop.

ANÁLISE DAS VESÍCULAS EXTRACELULARES NO MICROAMBIENTE FOLICULAR DE ACORDO COM A PRESENÇA DO CORPO LÚTEO EM VACAS LEITEIRAS

Recentemente, descobriu-se que as vesículas extracelulares (VEs), presentes no fluido dos folículos ovarianos são uma importante forma de comunicação celular, com funções biológicas diversificadas. O presente estudo teve como objetivo analisar as VEs recuperadas do fluido folicular de ovários ipsilaterais e contralaterais ao corpo lúteo (CL), em fêmeas bovinas da raça holandesa (Bos taurus taurus) em dois momentos distintos: antes e após a IATF, de acordo com o status gestacional. Foram utilizadas 10 vacas holandesas de uma propriedade produtora de leite, da cidade de Arapoti-Paraná. O fluido folicular foi colhido através da técnica de ovum pick-up (OPU) de vacas lactantes, com 30 dias pós-parto, aptas a reprodução. Em seguida foram submetidas a IATF (inseminação artificial em tempo fixo). O tratamento hormonal utilizado foi a base de P4 e estradiol. A IATF foi realizada utilizando sêmen de um mesmo touro para o grupo de fêmeas deste estudo. Após cerca de 60 dias da IATF, a OPU foi realizada em fêmeas prenhes (N=5) e não prenhes (N=4). As amostras de fluido folicular foram direcionadas para isolamento e análise por sequenciamento de nanoparticulas pelo Nanosigth (NS300; NTA 3.1 Build 3.1.45; Malvern). As variáveis concentração (VEs/mL) e diâmetro (nm) das VEs foram analisadas pelo teste T de Student ou teste Mann-Whitney com significancia de p 0,05. O fluido folicular proveniente de fêmeas prenhes e não prenhes contralateral ao CL apresentou maior concentração de VEs (200nm) quando comparado as amostras obtidas ipsilateral ao CL (2,7x1010 VEs/mL vs. 1,07x1010 VEs/mL; p=0,013) dos mesmos animais. Quando analisamos o grupo de fêmeas não prenhes (N=3) separadamente, a concentração de VEs é maior para contralateral (3,12x1010 VEs/mL) se comparado com o ipsilateral (6,38x109 VEs/mL) ao CL (p=0,024). Porém, quando avaliamos o mesmo grupo (ipsilateral vs. contralateral) para as fêmeas prenhes (N=3), não foi possível observar diferença para a concentração de VEs (p=0,663). Para a avaliação entre CL ipsilateral (prenhe) vs. ipsilateral (não prenhe), as fêmeas prenhes apresentaram maior concentração de VEs (1,50x1010 VEs/mL) em relação as fêmeas não prenhes (6,38x109 VEs/mL; p=0,016). Não houve diferença entre as demais comparações realizadas e para a média do diâmetro das VEs. Em nosso estudo, foi possível concluir que a presença ou ausência de CL, bem como o status gestacional da fêmea, influencia no número de VEs presentes no fluido dos folículos adjacentes.

Recently, it was discovered that extracellular vesicles (EVs), present in the fluid of ovarian follicles are an important form of cellular communication, with diverse biological functions. The present study aimed to analyze the EVs recovered from the follicular fluid of ipsilateral (same side) and contralateral (opposite side) of the corpus luteum (CL) in Holstein cows (Bos taurus taurus) at two different times: before and after timed artificial insemination (TAI), according to the gestational status. Ten cows from a dairy farm in Arapoti-Paraná were used. The follicular fluid was collected using the ovum pick-up technique (OPU), of the lactating Holstein cows, 30 days postpartum, ready for reproduction, and then were submitted to TAI. The hormonal treatment used on the property was based on P4 and estradiol. The TAI was performed using semen from the same bull for all females in this study. After about 60 days from the TAI, the OPU was perfomed in pregnant (N=5) and non-pregnant (N=4) females. The follicular fluid samples, collected were directed to isolation and Nanoparticle tracking analysis by Nanosigth (NS300; NTA 3.1 Build 3.1.45; Malvern). The concentration (EVs/mL) and diameter (nm) of the VEs were analyzed by Student's T test or Mann-Whitney test with significance of p0.05. The follicular fluid of pregnant and non-pregnant females from the ovarian opposite the CL presented higher concentration of EVs (200nm) when compared to ovarian samples with CL (2.7x1010 EVs/mL vs. 1.07x10 10 EVs/ml; p=0.013) from the animals. When we analyzed the group of nonpregnant females (N=3) separately, the nanoparticle concentration is higher for contralateral follicular fluid (3.12x1010 EVs/mL) compared to the ipsilateral (6.38x109 EVs/mL) follicular fluid (p=0.024). However, when evaluating the same group (contralateral vs. ipsilateral) for pregnant females (N=3) was not observed difference in the concentration of EVs (p=0.663). The evaluation between ipsilateral (pregnant) vs. ipsilateral (non-pregnant) on the pregnant females had greater concentration EVs (1,50x1010 EVs/mL) compared to non-pregnant females (6,38x109 EVs/mL; p=0.016). There was no difference between the others comparisons made and for the mean EVs diameter. In our study, it was possible to conclude that the presence or absence of CL, as well as its gestational status influences the number of EVs present in the fluid of adjacent follicles.

Efeitos da comunicação entre células do sistema reprodutivo feminino e oócitos bovinos mediada por vesículas extracelulares de diferentes estágios do ciclo estral

DE ÁVILA, A.C.F.C.M. Efeitos da comunicação entre células do sistema reprodutivo feminino e oócitos bovinos mediada por vesículas extracelulares de diferentes estágios do ciclo estral. 2019. 194 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2019. As técnicas de reprodução assistida (TRA) são alternativas para infertilidade e aumento da produção de animais de interesse. Apesar de amplamente utilizadas, as TRA podem causar consequências negativas aos indivíduos gerados desde o estabelecimento da gestação até a vida adulta. A tentativa de mimetizar o ambiente in vivo é uma opção para aprimorar as TRA. Vesículas extracelulares (VEs) secretadas por células são alvos de estudos recentes devido suas funções de comunicação intercelular no ambiente in vivo. As VEs são encontradas em fluidos corporais e possuem material bioativo, como miRNAs, que regulam o funcionamento de células a partir da modulação pós-transcricional. A hipótese deste estudo é que VEs pequenas secretadas por células foliculares e células do oviduto favoreçam a maturação e a fertilização in vitro de complexos cumulus-oócitos (CCOs). O objetivo do estudo foi caracterizar e avaliar os efeitos de VEs do fluido folicular (FF) e do oviduto obtidos em diferentes momentos do ciclo estral de bovinos durante a produção in vitro. Para isso, VEs foram isoladas de FF e do lavado de oviduto bovino, caracterizadas e utilizadas como suplementação durante a maturação e a fertilização in vitro, respectivamente. Os resultados demonstraram que as VEs do fluido de folículos em diferentes momentos do ciclo estral possuem diferentes perfis de miRNAs. A suplementação com VEs pequenas de FF durante a maturação in vitro (MIV) causou a internalização dessas VEs e do seu RNA pelos CCOs, mas não afetou as taxas de blastocistos. Porém, foi demonstrado que as VEs de diferentes origens foliculares modulam vias como PI3K-Akt e de transporte de RNA e processos biológicos relacionados à maturação oocitária, à ovulação e à resposta imune em células do cumulus. As VEs obtidas do oviduto em diferentes momentos do ciclo estral não afetaram as taxas de produção e a qualidade de blastocistos no modelo utilizado. Em conclusão, este estudo demonstrou que as VEs pequenas são modificadas de acordo com sua origem folicular e que impactam processos biológicos em células do cumulus de bovinos.

DE ÁVILA, A.C.F.C.M. The effects of communication between female reproductive system cells and bovine oocytes mediated by extracellular vesicles of different estrous cycle stages. 2019. 194f. M.Sc. Dissertation Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2019. Assisted reproductive techniques (ART) are alternatives to infertility and to increase animals production. Although these techniques are widely used, they can cause negative consequences since early pregnancy until adult life. Attempts to mimic in vivo environment are applied to improve ARTs. Extracellular vesicles (EVs) secreted by cells are targets of recent studies due to their function in intercellular communication. These vesicles are in body fluids and have bioactive material, as miRNAs, that regulate cell functions by post-transcriptional modulation. The hypothesis of this study is that small EVs secreted by follicular and oviductal cells improve the in vitro maturation and fertilization of cumulus-oocyte complexes (COCs). Our goal was to characterize and to evaluate the effects of small EVs from follicular and oviductal fluids obtained from different bovine estrous cycle stages during in vitro embryo production. For this, EVs were isolated from bovine follicular fluid (FF) and oviductal flushing, characterized and used as supplementation during in vitro maturation and fertilization, respectively. The results demonstrated that small EVs from follicles at different estrous cycle stage have different miRNA profile. The small EVs from FF and their RNA were taken up by COCs during in vitro maturation but did not change blastocyst production rates. However, we demonstrated that small EVs from different follicle origin modulate pathways such as PI3K-Akt and RNA transport and biological processes related to oocyte maturation, ovulation and immune responses in cumulus cells. Small EVs from oviduct at different estrous cycle stage did not improve embryo production rates and embryo quality in our model. Therefore, this study demonstrated that small EVs are modified according to their follicular origin and are able to impact biological processes in bovine cumulus cells.

AVALIAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES LIBERADAS POR CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA MAMÁRIO 4T1 APÓS INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS RAW 264.7

O câncer define-se, em geral, como a proliferação anormal e descontrolada das células, por alterações no DNA que leva à formação de tumores. O câncer de mama é o tipo mais comum e o segundo mais letal na população feminina no mundo todo, devido principalmente à presença de metástases, que caracterizam o tipo mais agressivo da doença. Diversos estudos têm mostrado que interações entre células tumorais e macrófagos no microambiente tumoral são relevantes para aquisição de um fenótipo mais agressivo. Entretanto, até o momento, são inexistentes os trabalhos mostrando a produção de vesículas extracelulares (EVs) durante estas interações. Assim, o intuito do presente trabalho foi avaliar e caracterizar vesículas extracelulares produzidas por células de adenocarcinoma mamário 4T1 antes e após interação com macrófagos em modelo in vitro. Para isto, EVs produzidas por células 4T1 antes e após interação com macrófagos RAW 264.7 foram coletadas e submetidas, tanto a análises físico-químicas como biológicas, para sua caracterização e avaliação de seus efeitos sob macrófagos. Análises de microscopia eletrônica de varredura e quantificação proteica mostraram que células 4T1 após contato com macrófagos tem redução na produção de EVs e possuem menor capacidade de migração quando comparadas com células 4T1 que não entraram em contato com macrófagos. A caracterização das EVs por análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) e por citometria de fluxo revelaram que as EVs produzidas são em maioria de tamanhos entre 100 a 200 nm com quantidades semelhantes de exossomos e microvesículas. Em relação ao efeito biológico, macrófagos tratados com EVs principalmente, aquelas produzidas por células 4T1 antes da interação com macrófagos apresentaram aumento tanto no índice fagocítico como na capacidade de eliminação do material fagocitado. Em conjunto, os resultados aqui apresentados sugerem que macrófagos modulam a produção de EVs nas células 4T1, estas EVs por sua vez, podem ser as responsáveis diretas pelo perfil mais agressivo das células 4T1. Portanto, a redução da produção de EVs por células 4T1, induzida pelo contato com macrófagos pode ser um mecanismos promissor para o controle de tumores altamente agressivos, como é o adenocarcinoma mamário.

Cancer is defined as an abnormal and uncontrolled proliferation of cells by changes in the DNA that leads to tumor formation. Breast cancer is the most common type and the most lethal type in the female population worldwide, mainly due to the presence of metastases, which characterize the most aggressive type of the disease. Several studies have presented the interactions between tumor cells and macrophages not tumor microenvironments are relevant to obtain a more aggressive phenotype. However, to date, the production of extracellular vesicles (EVs) during these interactions has been lacking. Thus, the purpose of the present study was to evaluate and characterize the extracellular cells by 4T1 adenocarcinoma mammary cells before and after interaction with macrophages in vitro model. For this, EVs produced by 4T1 cells before and after interaction with RAW 264.7 macrophages were collected and submitted to both physico-chemical and biological analyzes for their characterization and evaluation of their effects under macrophages. Scanning electron microscopy and protein quantification analyzes showed that 4T1 cells after contact with macrophages had a reduction in the production of EVs and had a lower migration capacity when compared with 4T1 cells that did not come into contact with macrophages.The characterization of EVs by Nanoparticle Trace Analysis (NTA) and by flow cytometry revealed that the EVs produced are on average between 100 and 200 nm with the name of exosomes and microvesicles. Regarding the biological effect, macrophages treated with EVs mainly, those produced by 4T1 cells before the interaction with macrophages showed increase in both the phagocytic index and in the elimination capacity of phagocytic material. The results presented here suggest that macrophages modulate the production of EVs in 4T1 cells, this EVs in turn may be directly responsible for the more aggressive profile of 4T1 cells. Reducing the production of EVs by 4T1 cells induced by contact with macrophages may be one of the promising mechanisms for the control of highly aggressive tumors such as adenocarcinoma mammary.

AVALIAÇÃO ECOCARDIOGRÁFICA DA FUNÇÃO DO VENTRÍCULO DIREITO DE CÃES DA RAÇA BOXER COM CARDIOMIOPATIA ARRITMOGÊNICA DO VENTRÍCULO DIREITO: ESTUDO CASO-CONTROLE

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) é uma doença de origem genética, muito prevalente em cães da raça Boxer. Histologicamente ocorre atrofia dos cardiomiócitos do ventrículo direito (VD) e consequente infiltração fibroadiposa, levando ao aparecimento de arritmias ventriculares. Mesmo sendo as alterações miocárdicas microscópicas em sua maioria, estudos recentes têm identificado disfunção contrátil do ventrículo direito, mesmo em estágios iniciais da doença em humanos, tanto por técnicas convencionais de ecocardiografia quanto por técnicas mais avançadas, como no caso do speckle tracking. Por isso, o objetivo deste estudo foi avaliar se há disfunção miocárdica de VD detectável pela ecocardiografia convencional e pela técnica de speckle tracking bidimensional em cães da raça Boxer portadores da CAVD. Para tanto, utilizou-se cães da raça Boxer com idade superior a quatro anos, distribuídos em dois grupos de acordo com o resultado da avaliação Holter (GC: < 50 EVs/24h, n=11 e GD: > 100 EVs/24h, n=11). Os animais foram submetidos a ecocardiografia e avaliou-se diâmetro e comprimento interno do VD em sístole e diástole, encurtamento fracional da área do VD (FAC), excursão sistólica do plano anular da tricúspide (TAPSE), velocidade miocárdica sistólica do ânulo lateral da tricúspide derivada do Doppler tecidual (S) e deformação (strain) e taxa de deformação (strain rate) longitudinal global da parede livre do VD, derivados da análise por speckle tracking. As variáveis foram comparadas entre os grupos pelo teste t de Student e de Mann-Whitney e a correlação entre variáveis ecocardiográficas convencionais e de speckle tracking e o número e severidade das arritmias pelo teste de correlação de Pearson, com nível de significância de 5%. Os grupos não foram estatisticamente diferentes e não houve correlação entre os dados. Os resultados da pesquisa demonstraram que a ecocardiografia, tanto na avaliação do VD por índices sistólicos convencionais quanto por aqueles derivados da técnica de speckle tracking não foram capazes de detectar disfunção miocárdica do VD em Boxers portadores de CAVD.

Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) is a genetic disease with a high prevalence in Boxer dogs. Histologically, right ventricle (RV) cardiomyocytes atrophy occurs, and thus fibrofatty infiltration, triggering ventricular arrhythmias. Although the myocardial changes are mostly microscopic, recent studies in human beings have identified right ventricular systolic dysfunction even in the early stages of ARVC, both by conventional echocardiographic techniques and advanced methods, such as speckle tracking. Therefore, the aim of this study was to investigate if RV myocardial dysfunction is present in Boxers affected by ARVC, evaluated by conventional echocardiography and bidimensional speckle tracking technique. For this purpose, Boxers older than four years were recruited, and based on 24-hour Holter recording were divided in groups: GC:< 50 VPC/24h (n=11), or GD: > 100 VPC/24h (n=11). The following echocardiographic parameters were analyzed: RV internal dimension during systole and diastole; RV fractional area change (FAC); tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE); myocardial systolic velocity of lateral tricuspid annulus (S), and global longitudinal strain and strain rate. Groups were compared by Student t-test or Mann-Whitney test according distribution, and correlation between conventional and speckle tracking echocardiographic variables, as well as number and severity of the ventricular arrhythmias were accomplished by the Pearson test, assuming a level of significance at 5%. Groups were considered similar, and there was no correlation among the evaluated parameters. Our findings suggesting that the echocardiographic evaluation of RV, either by conventional and speckle tracking techniques, were not able to detect systolic myocardial dysfunction in Boxers affected by ARVC.

Uso de meio condicionado por células estromais mesenquimais uterinas durante o cultivo in vitro de embriões bovinos

As tecnologias de reprodução assistida, tais como a fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões, transgenia e clonagem, ainda não tem o impacto comercial desejado devido a baixa produção embrionária. Apenas 30 a 40% dos blastocistos desenvolvidos são obtidos de oócitos após a MIV, fertilização e cultivo dos embriões, embora 80% dos oócitos maturados in vitro sejam fertilizados com sucesso. O soro fetal bovino (SFB) é o suplemento mais utilizado no cultivo de embriões in vitro, uma vez que melhora o desenvolvimento dos blastocistos. Apesar disso, sua presença está relacionada a alterações do metabolismo embrionário, perda de qualidade e indução de modificações na expressão de vários genes embrionários. Na tentativa de minimizar os efeitos deletérios do SFB, várias citocinas e fatores de crescimento têm sido acrescentados aos meios de cultivo embrionários in vitro, com a intenção de mimetizar as condições de cultivo in vivo. O presente experimento tem como objetivo avaliar e comparar os efeitos da adição do SFB e de meio condicionado por células mesenquimais estromais (MSCs) durante o cultivo embrionário. Os parâmetros analisados foram a viabilidade embrionária, apoptose e o perfil transcricional de genes relacionados à qualidade dos embriões. Não foi observado uma diferença (P0,05) na clivagem dos blastocistos, porém observou-se que a taxa de produção de embriões utilizando SFB no CIV foi maior (P0,05) quando comparada com MC, mas não diferiu (P0,05) do grupo produzido com BSA. A expressão relativa de mRNA para ELOVL6 foi maior no grupo MC, para CASP3 no grupo BSA, e para ACSL3 e VEGF no grupo SFB. Em conjunto, esses dados sugerem que o MC pode ser utilizado como uma alternativa ao SFB. Observamos um perfil de expressão gênica diferente, sugerindo que o MC inibiu o aumento da expressão relativa de mRNA para CASP3. Ademais, o MC favoreceu o número total de células, inibiu a porcentagem de células em apoptose e produziu um embrião de melhor qualidade.

Endometrial mesenchymal stromal cell (eMSCs) secretes bioactive molecules such as cytokines and growth factors which are released as soluble factors or through EVs. CM of the MSCs maintains the immunomodulation and regenerative potential properties of the cells that produced it. This study investigated the use of eMSC-CM plus BSA as an alternative to FBS in bovine embryo culture medium. The developmental ability and quality of bovine embryos were determined by assessing their cell number and gene expression. The percentage of embryos that underwent cleavage was similar (P>0.05) among the groups but blastocyst formation was higher (P<0.05) in FBS group. The total cell number was higher in CM group, but not statistically different from the others (P>0.05). The relative mRNA expression of ELOVL6 was higher in the CM group, of CASP3 in the BSA group and of ACSL3 and VEGF in the FBS group. Taken together, these data suggest that CM can be used as an alternative supplement to FBS. The gene expression profile suggested that the use of CM inhibited an increase in the relative mRNA levels for CASP3. Moreover, the CM favored the total number cells, inhibited the percentage of cells in apoptosis and produces better quality embryo.

Vesículas extracelulares e meio condicionado de células tronco mesenquimais e seu potencial imunomodulador em explantes endometriais bovinos

QUEIROZ, C.M. Vesículas Extracelulares e Meio Condicionado de Células Tronco Mesenquimais e Seu Potencial Imunomodulador em Explantes Endometriais Bovinos - Botucatu, 2017, 90f. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Palavras-chave: exossomos, microvesículas, inflamação, biotecnologia. O presente estudo teve como objetivo isolar, cultivar e caracterizar as células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) bovino, obtenção de vesículas extracelulares e meio condicionado do cultivo celular (MC) e avaliação do seu potencial imunomodulador em cultivo de explantes endometriais bovinos. Para isso, as CTM-TA foram coletadas (n=3) de tecido adiposo e sofreram isolamento, processamento e cultivo. As amostras foram submetidas à análise citogenética, imunofenotípica (CD44, CD29, vimentina, CD34 e MHCII), de viabilidade e de diferenciação (adipogênica, osteogênica e condrogênica), e então criopreservadas. Após descongelamento e expansão, o meio condicionado do cultivo celular foi submetido à ultracentrifugações para obtenção das vesículas extracelulares que foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e Western Blot (Alix e CD9). Explantes de endométrios bovinos (n=7) provenientes de abatedouro foram submetidos a cultivo e desafio com LPS (3µg/mL) por 48 horas. Os grupos experimentais foram CN (controle negativo, sem desafio com LPS), CP (controle positivo, apenas desafio com LPS), V (desafio com LPS e adição de vesículas extracelulares) e MC (desafio com LPS e adição de meio condicionado). Avaliou-se secreção de PGF2 e IL-1 por Elisa, morfologia do tecido através de histopatologia, expressão tecidual de Fas-L, TLR-4, PGDH e PGF2-R por Imunoistoquímica. No cultivo celular das CTM-TA foi obtida uma população celular homogênea e fibroblastóide, com aderência ao plástico, expressando baixos níveis de CD34 e MHCII, e altos níveis de CD29, CD44 e vimentina. As células foram cromossomicamente estáveis, com boa viabilidade antes e após congelamento, e secretaram vesículas de aproximadamente 10 a 200nm de diâmetro, positivas para Alix e CD9 no Western Blot indicando a presença de exossomos (Exos) em uma população mista VEs. Não houve efeito de tratamento para secreção de PGF2 e IL-1, nem na imunomarcação de TLR-4, Fas-L, PGDH e PGF2-R. Houve mudanças morfológicas como hipertrofia, atrofia e hiperplasia celular, bem como dilatação do lúmen glandular, independente do tratamento. Houve diminuição na densidade das glândulas após cultivo, devido à inflamação. Conclui-se que foi possível isolar, cultivar, caracterizar e criopreservar CTM-TA de bovinos, e estas células secretam VEs no meio condicionado de cultivo. Contudo, os achados apontam para inflamação no modelo in vitro de cultivo que se sobrepôs aos efeitos inflamatórios do desafio com LPS. Ademais, os tratamentos com V ou MC não resultaram em efeito imunomodulatório.

QUEIROZ, C.M. Extracellular Vesicles and Conditioned Medium from Mesenchymal Stem Cells and its Immunomodulatory Potential in Bovine Endometrial Explants - Botucatu, 2017, 90f. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, São Paulo State University Júlio de Mesquita Filho. Keywords: exossomes, microvesicles, inflammation, biotechnology. The present study aimed to isolate, culture and characterize bovine adipose tissue mesenchymal stem cells (AT-MSC) and obtain extracellular vesicles (EVs) and conditioned medium (CM) from the cell culture in order to evaluate its in vitro immunomodulatory potential in bovine endometrial explants. For this, adipose tissue were collected (n=3) and underwent isolation, processing and culture. The samples were submitted to cytogenetic, immunophenotypic characterization (CD44, CD29, vimentin, CD34 and MHCII), viability and differentiation (adipogenic, osteogenic and chondrogenic), and then cryopreserved. After thawing and expansion, the CM of the cell culture was subjected to ultracentrifugation to obtain the EVs that were characterized by electron microscopy and Western Blot (Alix and CD9). Bovine endometrium from slaughterhouse (n=7) were cultured and challenged with LPS. The experimental groups were CN (negative control, no challenge with LPS), CP (positive control, challenge with LPS), V (challenge with LPS and addition of EVs) and MC (challenge with LPS and addition of CM). PGF2 and IL-1 secretion was evaluated by Elisa, tissue morphology and Fas-L, TLR-4, PGDH and PGF2-R protein expression by Immunohistochemistry. A monolayer with fibroblastoid cell population having plastic adherence, expressing low levels of CD34 and MHCII, and high levels of CD29, CD44 and vimentin was obtained in CTM-TA cell culture. The cells were chromosomally stable, with good viability before and after cryopreservation, and secreted EVs of approximately 10 to 200 nm in diameter, positive for Alix and CD9 in Western Blot indicating the presence of exosomes (Exos) in a mixed EVs population. There was no treatment effect for PGF2 and IL-1 secretion, nor in the immunolabeling of TLR-4, Fas-L, PGDH and PGF2-R. There were morphological changes such as hypertrophy, atrophy and cellular hyperplasia, as well as dilation of the glandular lumen, regardless of the treatment. There was a decrease in the density of the glands after culture due to inflammation. It was concluded that it is possible to isolate, culture, characterize and cryopreserve CTM-TA from bovines, and these cells secrete EVs in CM. However, the findings point to inflammation in the in vitro culture model that overlapped the inflammatory effects of LPS challenge. In addition, the treatments with EVs or CM did not result in immunomodulatory effect.

MODELOS BIOECONÔMICOS PARA O MELHORAMENTO GENÉTICO DA RAÇA BRANGUS

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar a produtividade de bovinos da raça Brangus, considerando seus índices zootécnicos e econômicos no sul do Brasil, definindo os objetivos e critérios de seleção por meio da estimação de valores econômicos (VEs). Os dados produtivos analisados foram obtidos por meio de questionário sócio econômico e, posteriormente, foi elaborado quatro modelos bioeconômicos para o cálculo das receitas e custos para cada sistema de produção. As características consideradas como critérios de seleção, foram: rendimento de carcaça (RC), taxa de prenhez (TP), peso da carcaça quente (PCQ), peso ao abate (PA), peso da vaca adulta (PVA), contagem de helmintos (OPG), contagem de carrapatos (TICK), taxa de mortalidade (TM) e consumo de matéria seca (CMS). Neste contexto, foram simulados 4 cenários todos em um sistema de produção de ciclo completo da raça Brangus. O cenário 1 foi definido um modelo bioeconômico, com venda de novilhos (as) como reprodutores e parte da produção para o abate, o cenário 2 diferencia-se do primeiro por ter as novilhas comercializadas somente para o abate, o cenário 3, a receita foi proveniente das vendas de bois e novilhas para abate e o cenário 4, a produção dos bois foram vendidos para o abate inferior comparado aos demais cenários. Foram realizadas simulações estocásticas e determinísticas que possibilitaram o desenvolvimento dos VEs, definidos a partir da mudança no resultado operacional (lucro ou prejuízo) anual, aumentando em uma unidade de uma característica, supondo-se que as outras sejam mantidas constantes. Foram definidos importância econômica (IMEC), onde aumentava-se em porcentagem o valor de determinada característica com as demais constantes. Foram estimadas as importâncias relativas através do produto dos VEs e desvio padrão genético das características e classificadas conforme os objetivos de seleção. Os VEs estimados para os cenários 1, 2, 3 e 4 foram respectivamente: -R$93,64, -R$93,64, -R$101,40, -R$89,94 (CMS), -R$74,88, -R$48,68, -R$42,92, -R$ 42,85 (TM), R$21,75, R$ 24,44, R$ 30,78, R$ 30,36 (RC), R$4,74, R$5,45, R$ 6,94, R$ 6,64 (PCQ), R$3,37, R$ 3,37, R$ 3,74, R$ 5,43 (TP), R$0,76, R$0,76, R$1,30, R$1,35 (PA) e as características que mantiveram os mesmos VEs foram: TICK (-R$4,88 e -R$52,89 em log), OPG (-R$1,64 e -R$16,23 em log) e PVA (-R$0,82). Os IMECs estimados foram respectivamente: R$10,62, R$11,96, R$15,27, R$14,92 (RC), R$3,32, R$ 3,31, R$3,69, R$5,39 (TP), R$10,62, R$11,96, R$ 15,27, R$14,92 (PCQ), R$3,79, R$3,79, R$6,50, R$6,73 (PA), -R$3,69, -R$3,68, -R$3,70, -R$3,68 (PVA), -R$1,28, -R$4,00, -R$9,11, -R$ 7,41 (TM), -R$2,81, -R$1,60, -R$3,04, -R$2,70 (CMS) e as características que mantiveram os mesmos IMECs foram: OPG (-R$2,21) e TICK (-R$3,16). O objetivo de seleção qualidade de carcaça apresentou maior importância relativa seguido consumo alimentar, crescimento, resistência a parasitas e reprodutivo. Embora sejam necessários modelos bioeconômicos específicos para diferentes sistemas de produção, uma vez que os requisitos de mercado e o nível médio de produtividade dos rebanhos diferem consideravelmente, os parâmetros obtidos neste trabalho podem ser utilizados como base, adaptando estes modelos a outras circunstâncias de produção.

The objective of this work was to characterize the Brangus breed of cattle, considering their zootechnical and economic indexes in southern Brazil, defining the objectives and selection criteria by means of the estimation of economic values (EVs). The productive data analyzed were obtained through a socioeconomic questionnaire and, later, four bioeconomic models were elaborated to calculate the revenues and costs for each production system. The characteristics considered as selection criteria were: carcass yield (CY), pregnancy rate (PR), warm carcass weight (WCW), slaughter weight (SW), adult cow weight (ACW), helminth count (OPG), tick count (TICK), mortality rate (MR) and dry matter intake (DMI). In this context, 4 scenarios were simulated in a complete Brangus breed system. Scenario 1 was defined as a bioeconomic model, with sale of steers (as) as breeding stock and part of production for slaughter, scenario 2 is different from the first one because heifers were commercialized only for slaughter, scenario 3, revenue came from sales of oxen and heifers for slaughter and scenario 4, the production of oxen were sold for the lower slaughter compared to the other scenarios. Stochastic and deterministic simulations were performed that allowed the development of the EVs, defined as the change in the operating result (profit or loss), increasing by one unit of a characteristic, assuming that the others are kept constant. Economic importance was defined (ECIM) where the value of a certain characteristic was increased in percentage with the other constants. The relative amounts were estimated through the product of the EVs and genetic standard deviation of the characteristics and classified according to the selection objectives. The estimated EVs for scenarios 1, 2, 3 and 4 were respectively: -R$ 93,64, -R$ 93,64, -R$ 101,40, -R$ 89,94 (DMI), -R$ 74,88, R$ 48,68, -R$ 42,92, -R$ 42,85 (MR), R$ 21,75, R$ 24,44, R$ 30,78, R$ 30,36 (CY), R$ 4,74, R$ 3,45, R$ 3,45, R$ 3,43, R$ 5,43 (WCW), R$ 3,37, R$ 3,37, R$ 3,74, R$ 5,43 (PR), R$ 0,76, R$ 0,76, R$ 1,30, R$ 1,35 (SW), and characteristics that maintained the same EVs were: TICK (-R$ 4,88 and -R$ 52,89 in log), OPG (-R$1,64 e -R$16,23 in log) e ACW (-R$0,82). The estimated IMECs were: R$ 10,62, R$ 11,96, R$ 15,27, R$ 14,92 (CY), R$3,32, R$ 3,31, R$3,69, R$5,39 (PR), R$10,62, R$11,96, R$ 15,27, R$14,92 (WCW), R$3,79, R$3,79, R$6,50, R$6,73 (SW), -R$3,69, -R$3,68, -R$3,70, -R$3,68 (ACW), -R$1,28, -R$4,00, -R$9,11, -R$ 7,41 (MR), -R$2,81, -R$1,60, -R$3,04, -R$2,70 (DMI) and the characteristics that maintained the same IMECs were: OPG (-R$ 2,21) and TICK (-R$ 3,16).The objective of selection of carcass quality presented greater relative importance followed food consumption, growth, parasite resistance and survival. Although specific bioeconomic models are required for different production systems, since the market requirements and the average level of productivity of the herds differ considerably, the parameters obtained in this work can be used as a basis, adapting these models to other production circumstances.