Seroprevalence and risk factors associated with seropositivity for equine encephalomyelitis virus in horses in Rio Grande do Norte, Brazil

The present objective was to investigate the presence of anti-equine viral encephalomyelitis (EVE) antibodies and the possible risk factors for its dissemination in horses raised in the East and West Potiguar mesoregions of the state of Rio Grande do Norte, Brazil. Serological diagnosis for neutralizing antibodies against Eastern (EEEV), Western (WEEV) and Venezuelan (VEEV). Equine viral encephalomyelitis was performed using a seroneutralization technique on 811 blood samples from horses from ninety properties and sixteen municipalities between July 2018 and February 2019. Factors associated with EVE were evaluated using an investigative epidemiological questionnaire, and the data were statistically analyzed using the Epi Info 3.5.2 software with a confidence level of 95%. The seroprevalence of anti-EVE antibodies was 14.2% (115), with 10.36% (84) for EEEV, 6.9% (56) for WEEV, and null for EVE. When analyzing risk factors, it can be concluded that horses raised in properties that do not clean installations and/or rent out their pasture are more likely to have anti-EVE antibodies. These results show evidence that horses raised in the East and West Potiguar mesoregions were exposed to EEEV and WEEV, thus reinforcing the importance of vaccination and serological survey of nonvaccinated horses as a means of monitoring the disease.

Study of Arboviruses in Philander opossum, Didelphis marsupialis and Nectomys rattus captured from forest fragments in the municipality of Belém, Pará, Brazil / Estudo de Arbovírus em Philander opossum, Didelphis marsupialis e Nectomys rattus capturados em fragmentos florestais no município de Belém, Pará

Arboviruses are viruses that maintain their life cycle in the wild and are transmitted to vertebrate hosts by hematophagous diptera. They are zoonotic and can establish an enzootic cycle in the urban areas; in humans, the infection can manifest from being encephalitogenic to hemorrhagic. This study aimed to report the occurrence of arboviruses in mammals of the order Didelphimorphia and Rodentia, captured from the Amazon. Serum samples were subjected to hemagglutination inhibition test using a viral panel of 19 species of arboviruses that are known to occur in the Amazon. Altogether, 14 wild mammals, 12 of Philander opossum, 1 of Didelphis marsupialis, and 1 of Nectomys rattus were captured. Eight of these were reported to be seropositive for arboviruses (57.14%) with monotypic seroprevalence for the Eastern Equine Encephalitis Virus (n=1), the Ilheus Virus (n=2), and the Catu virus (n=4); 4 heterotypic responses were observed for Flavivirus and Orthobunyavirus. In conclusion, several arbovirus species are in active circulation and maintenance, exhibiting enzootic characteristics in the wild mammals of the Amazon region; these animals prove to be potential hosts in the transmission of diseases to humans.(AU)

Os arbovírus são vírus que mantêm o seu ciclo de vida em ambiente silvestre. Eles são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros hematófagos, tem caráter zoonótico podendo estabelecer um ciclo enzoótico no meio urbano, sendo que em humanos a infecção pode ter caráter encefalomiogênico a hemorrágico. Este estudo teve como objetivo relatar a ocorrência de arbovírus em mamíferos da ordem Didelphimorphia e Rodentia capturados na Amazônia. Os soros dos animais foram submetidos a testes de Inibição da Hemaglutinação utilizando um painel viral com as 19 principais espécies de arbovírus que ocorrem na Amazônia. Foram capturados 14 espécimes de mamíferos silvestres, 12 Philander opossum, 1 Didelphis marsupialis e 1 Nectomys rattus. A soropositividade para arbovírus foi observada em 57,14% (8/14) dos espécimes estudados, com soroprevalência monotípica para o vírus da Encefalite Equina do Leste (n = 1), o vírus Ilheus (n = 2) e o vírus Catu (n = 4) e quatro reações heterotípicos para Flavivírus e Orthobyavírus. Conclui-se que há manutenção e circulação de espécies de arbovírus com características enzoóticas em mamíferos silvestres da região amazônica, podendo ser hospedeiros em potenciais na transmissão da doença para humanos.(AU)

Prevalence of antibodies to equine alphaviruses in the State of Pará, Brazil / Prevalência de anticorpos para alphavirus em equinos do estado do Pará, Brasil

The State of Pará comprises 26% of Brazilian Amazon region, where a large diversity of arboviruses has been described. This study sought to assess the prevalence and distribution of hemagglutination inhibition (HI) antibodies against antigens of four alphaviruses (Togaviridae: Alphavirus) from the species: Eastern equine encephalitis (EEEV), Western  equine encephalitis (WEEV), Mayaro virus (MAYV), and Mucambo virus (MUCV) in 753 serum samples of horses in Pará State, Brazil. All investigated arboviruses were detected and indicate that horses are susceptible to these alphaviruses, and show evidences of their active circulation in farm animals in the Brazilian Amazon.

O estado do Pará corresponde a 26% da Amazônia brasileira, onde uma grande diversidade de arbovírus foi descrita. Este estudo procurou avaliar a prevalência e a distribuição de anticorpos inibidores da hemaglutinação (IH) contra antígenos de quatro alfavirus (Togaviridae: Alphavirus), das espécies: Vírus da encefalite equina do leste (EEEV), Vírus da encefalite equina do oeste (WEEV), Vírus mayaro (MAYV) e Vírus mucambo (MUCV), de 753 amostras de soro de equinos no estado do Pará, Brasil. Todos os arbovirus pesquisados foram detectados, indicando que os equinos são suscetíveis a esses Alphavirus e mostrando evidências de sua circulação ativa em animais de fazenda na Amazônia brasileira.

Prevalence of antibodies to equine alphaviruses in the State of Pará, Brazil / Prevalência de anticorpos para alphavirus em equinos do estado do Pará, Brasil

The State of Pará comprises 26% of Brazilian Amazon region, where a large diversity of arboviruses has been described. This study sought to assess the prevalence and distribution of hemagglutination inhibition (HI) antibodies against antigens of four alphaviruses (Togaviridae: Alphavirus ) from the species: Eastern equine encephalitis (EEEV), Western equine encephalitis (WEEV), Mayaro virus (MAYV), and Mucambo virus (MUCV) in 753 serum samples of horses in Pará State, Brazil. All investigated arboviruses were detected and indicate that horses are susceptible to these alphaviruses, and show evidences of their active circulation in farm animals in the Brazilian Amazon.(AU)

O estado do Pará corresponde a 26% da Amazônia brasileira, onde uma grande diversidade de arbovírus foi descrita. Este estudo procurou avaliar a prevalência e a distribuição de anticorpos inibidores da hemaglutinação (IH) contra antígenos de quatro alfavirus (Togaviridae: Alphavirus ), das espécies: Vírus da encefalite equina do leste (EEEV), Vírus da encefalite equina do oeste (WEEV), Vírus mayaro (MAYV) e Vírus mucambo (MUCV), de 753 amostras de soro de equinos no estado do Pará, Brasil. Todos os arbovirus pesquisados foram detectados, indicando que os equinos são suscetíveis a esses Alphavirus e mostrando evidências de sua circulação ativa em animais de fazenda na Amazônia brasileira.(AU)

Prevalence of antibodies to equine alphaviruses in the State of Pará, Brazil / Prevalência de anticorpos para alphavirus em equinos do estado do Pará, Brasil

The State of Pará comprises 26% of Brazilian Amazon region, where a large diversity of arboviruses has been described. This study sought to assess the prevalence and distribution of hemagglutination inhibition (HI) antibodies against antigens of four alphaviruses (Togaviridae: Alphavirus) from the species: Eastern equine encephalitis (EEEV), Western  equine encephalitis (WEEV), Mayaro virus (MAYV), and Mucambo virus (MUCV) in 753 serum samples of horses in Pará State, Brazil. All investigated arboviruses were detected and indicate that horses are susceptible to these alphaviruses, and show evidences of their active circulation in farm animals in the Brazilian Amazon.(AU)

O estado do Pará corresponde a 26% da Amazônia brasileira, onde uma grande diversidade de arbovírus foi descrita. Este estudo procurou avaliar a prevalência e a distribuição de anticorpos inibidores da hemaglutinação (IH) contra antígenos de quatro alfavirus (Togaviridae: Alphavirus), das espécies: Vírus da encefalite equina do leste (EEEV), Vírus da encefalite equina do oeste (WEEV), Vírus mayaro (MAYV) e Vírus mucambo (MUCV), de 753 amostras de soro de equinos no estado do Pará, Brasil. Todos os arbovirus pesquisados foram detectados, indicando que os equinos são suscetíveis a esses Alphavirus e mostrando evidências de sua circulação ativa em animais de fazenda na Amazônia brasileira.(AU)

PERFIL SANITÁRIO DE ASININOS ERRANTES DO NORDESTE BRASILEIRO

A anemia infecciosa equina, a arterite viral equina, a febre do Nilo ocidental, as encefalomielites equinas leste, oeste e venezuelana, as herpesviroses equinas e o mormo são doenças infecciosas que acometem os membros da família Equidae (equinos, asininos e muares). A maioria dos estudos de prevalência dessas doenças foi conduzida em equinos (Equus caballus), com pouca informação comparativa sobre a infecção nas outras espécies da família, como os asininos (jumentos). O Brasil possui uma das maiores populações de jumentos (Equus asinus) do mundo, concentrada principalmente na região nordeste, sendo que muitos deles vivem de forma errante ou abandonados, com status sanitário desconhecido. O presente trabalho teve por objetivo pesquisar através de métodos sorológicos e moleculares a presença do Equine infectious anemia virus (EIAV), do Alphaarterivirus equid, o West nile virus (WNV), Eastern equine encephalitis vírus (EEEV), Western equine encephalitis virus (WEEV), Venezuelan equine encephalitis vírus (VEEV) e dos Equine herpesvirus (EHV), além do mormo em asininos errantes do nordeste brasileiro. Os resultados encontrados, na população estudada, demonstraram que os asininos não estão infectados pela Burkholderia mallei e VEEV, porém os agentes EIAV, EHV, EEEV, WEEV, Alphaarterivirus equid e WNV estão circulando em algumas regiões do nordeste. Esse é o maior estudo feito para essas oito agentes em asininos no mundo, e permite avaliar o impacto dessa espécie como hospedeira natural dos respectivos agentes infecciosos nesta região do Brasil

Equine infectious anemia, equine viral arteritis, West Nile fever, eastern, western and Venezuelan equine encephalomyelitis, equine herpesviruses and glanders are infectious diseases that affect members of the family Equidae (horses, donkeys and mules). The Most studies on prevalence of these diseases have been conducted in horses (Equus caballus), with little comparative information about the infection in other species of the family, such as donkeys. Brazil has one of the largest populations of donkeys (Equus asinus) in the world, concentrated mainly in the northeast region, and many of them live wandering or abandoned, with unknown health status. The present work aimed to investigate the presence of Equine infectious anemia virus (EIAV), Alphaarterivirus equid, West Nile virus (WNV), Eastern equine encephalitis virus (EEEV), Western equine encephalitis virus (WEEV), Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) and Equine herpesvirus (EHV), in addition to glanders in errant donkeys from northeastern Brazil, through serological and molecular methods. The results found in the studied population showed that donkeys are not affected by Burkholderia mallei and VEEV, but the agents EIAV, EHV, EEEV, WEEV, Alphaarterivirus equid and WNV are circulating in some regions of the northeast. This is the largest study carried out on these eight pathogens in donkeys in the world, and allows us to evaluate impact of this species as a natural host of the respective infectious agents in this region of Brazil

Detecção das encefalites virais zoonóticas com ênfase no vírus do Nilo Ocidental (WNV) em equídeos no Brasil

As doenças neurológicas nos equídeos constituem importantes causas de óbitos nestes animais. Entre as diversas etiologias das afecções neurológicas o vírus do Nilo Ocidental (do inglês West Nile virus-WNV), se destaca como importante agente zoonótico responsável por graves epidemias em todo mundo. Este arbovírus (arthropod borne viírus) está amplamente distribuído pelos continentes e mantém seu ciclo de transmissão através da relação entre mosquito vetor e aves reservatório/amplificadoras. Os equídeos, assim como o ser humano, são hospedeiros terminais não desenvolvendo viremia suficiente para transmissão ao vetor. Contudo, estes animais são considerados sentinelas, indicando a presença deste e de outros importantes arbovírus em uma região. A rápida expansão do WNV no continente americano, após sua entrada nos EUA em 1999, representou um desafio no diagnóstico deste vírus nos rebanhos equídeos. Evidências sorológicas indicam a presença do WNV no Brasil desde 2009. O país possui hoje um dos maiores rebanhos equídeos do mundo, apresentando condições ideais, além do clima, presença dos vetores e espécies de aves susceptíveis, para a epidemiologia de WNV e de outras importantes arboviroses. No presente estudo, foi padronizada uma técnica de nested RT-PCR, utilizando primers específicos direcionados à parte da região NS5 do WNV, com a finalidade de aumentar a sensibilidade do teste de diagnóstico molecular e, a partir dessa padronização, investigou-se a etiologia de quadros neurológicos em quatro equídeos (dois equinos e dois asininos) que vieram a óbito com encefalomielite aguda no Estado do Espírito Santo. Obteve-se então a primeira identificação do RNA de WNV em território nacional (capítulo 2). Após, a partir da parceria com o órgão de defesa animal do Estado de Minas Gerais, Laboratório de Sanidade Animal (Instituto Mineiro de Agropecuária, LSA-IMA), foram realizados novos estudos em 76 amostras de sistema nervoso central de equídeos com síndrome neurológica, todas negativas para o vírus da raiva, objetivando o diagnóstico das principais encefalites equinas virais através de técnicas moleculares. O diagnóstico diferencial incluiu o Herpesvírus equino tipo 1 (EHV-1- equine herpesvirus type 1); vírus do gênero Flavivirus, como WNV e Encefalite de Saint Louis (SLEV- saint louis encephalitis virus) e os vírus do gênero Alphavírus, como o vírus da encefalite equina do leste (EEEV- eastern equine encephalitis virus), o vírus da encefalite equina do oeste (WEEV- western equine encephalitis virus) e o vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV-venezuelan equine encephalitis virus). As análises incluíram também histopatologia do SNC e de outros órgãos em 16 amostras. Os dados dos Formulários de Solicitação de Exame de Síndrome Neurológica enviados também foram avaliados quanto a parâmetros relacionados aos animais e as amostras. Como resultado, todas as amostras foram negativas para os flavivírus e alfavírus testados e 5% das amostras foram positivas para EHV-1. Contudo, foram constatadas diversas questões quanto à coleta, conservação e entrega ao laboratório, além da ausência de informações fundamentais, com apenas 43% dos formulários devidamente preenchidos (capítulo 3). Assim, com o objetivo de orientar e auxiliar os médicos veterinários quanto à adequada coleta e conservação de amostras de equídeos com síndrome neurológica, bem como na anamnese e exame clínico, orientações foram elaboradas para contribuir no diagnóstico das doenças neurológicas em equídeos (capítulo 5). Além disso, como estratégia alternativa no diagnóstico da infecção pelo WNV em equídeos, a investigação do vírus nas hemácias de um cavalo com síndrome neurológica resultou na detecção de um animal positivo na região sudeste do país (capítulo 4). Os resultados deste trabalho poderão auxiliar nas estratégias de diagnóstico das encefalites virais nos equídeos e na vigilância epidemiológica de WNV no Brasil, podendo ser valiosas no contexto da Saúde Única.

Neurological diseases in equidae are important causes of death in these animals. Among the various etiologies of neurological disorders, the West Nile virus-WNV, stands out as an important zoonotic agent responsible for serious epidemics worldwide. This arbovirus (arthropod borne virus) is widely distributed across continents and maintains its transmission cycle through the relationship between vector mosquito and reservoir / amplifying birds. Equidae, like humans, are terminal hosts not developing enough viremia to transmit to the vector. However, these animals are considered sentinels, indicating the presence of this and other important arboviruses in a region. The rapid expansion of WNV in the American continent, after its entry into the USA in 1999, represented a technical challenge in the diagnosis of infection in equine herds. In Brazil, one of the largest equine herds in the world, serological evidence indicated the presence of WNV since 2009. The country has ideal climate conditions for WNV transmission, as well as other arboviruses, with presence of vectors and the potential avian reservoirs species. In the present study, a nested RT-PCR technique was standardized, using specific primers directed to the NS5 gene of the WNV. The new technique was standardized investigating four equids (two horses and two donkeys) who died with neurologic signs of acute encephalomyelitis in the state of Espírito Santo. The study resulted in the first identification of WNV RNA in Brazil (chapter 2). Afterwards, based on the partnership with the animal defense agency of the State of Minas Gerais, through the Animal Health Laboratory (Instituto Mineiro de Agropecuária, LSA-IMA), further studies were carried out with 76 CNS samples from equines with neurological syndrome, all shown negative for rabies, aiming at the diagnosis of the main viral equine encephalitis through molecular techniques. The differential diagnosis included equine herpesvirus type 1 (EHV-1); viruses of the genus Flavivirus, such as WNV and Saint Louis Encephalitis (SLEV) and viruses of the Alphavirus genus, such as the Eastern Equine Encephalitis Virus (EEEV), the West Equine Encephalitis Virus (WEEV) and the Equine Encephalitis Virus Venezuelan (VEEV). The analyzes also included histopathology of the CNS and other organs in 16 samples. The Neurological Syndrome Examination Request Forms data sent were also evaluated for parameters related to animals and samples. As a result, all samples were negative for the flaviviruses and alphaviruses tested and 5% of the samples were positive for EHV-1. However, several issues were noted concerning the collection, conservation and delivery to the laboratory, and the absence of key information, with only 43% of forms properly filled (chapter 3). Thus, with the objective of guiding and assisting veterinarians in the field regarding the adequate collection and conservation of samples from equines with neurological syndrome, as well as aspects such as anamnesis and clinical examination, guidelines were developed to contribute to the diagnosis of neurological diseases in equines (chapter 5). In addition, as an alternative strategy in the diagnosis of WNV infection in equidae, the investigation of the virus in the red blood cells of a horse with neurological syndrome resulted in the detection of a positive animal in the southeastern region of the country (chapter 4). The results of this work may assist in the diagnostic strategies for viral encephalitis in equines and in the epidemiological surveillance of WNV in Brazil, which can be valuable in the context of One Health

Serological and molecular investigation of viral agents in freeliving jaguars of the Pantanal wetlands, state of Mato Grosso, Brazil / Investigação sorológica e molecular de agentes virais em onças-pintadas de vida livre no Pantanal de Mato Grosso, Brasil

This study investigates the exposure of free-living jaguars from two federal protected areas in the Pantanal of Mato Grosso, Brazil, to a variety viral agents. These viral agents, particularly causing zoonotic diseases, were analyzed using serological and molecular methods. None of the jaguars was positive by RT-PCR for the molecular detection of avian influenza and West Nile Fever (WNF). Only one animal was serologically positive for Eastern Equine Encephalitis (EEE) by virus neutralization test in VERO cell cultures, representing the first reported case of jaguar exposure to EEE virus. However, all the animals were negative for Western Equine Encephalitis (WEE) virus and Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) virus. Eleven jaguars were tested by two tests for the detection of antibodies against rabies virus (Simplified Fluorescent Inhibition Microtest ­ SFIMT and Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test ­ RFFIT), resulting in five positive animals, two animals in each test and one in both serological tests. Furthermore, three out of 14 samples subjected to the neutralization test were positive for antibodies against canine distemper virus (CDV), and 15 out of 17 samples subjected to the hemagglutination-inhibition test (HI) were positive for antibodies against canine parvovirus (CPV). In view of the findings of this study, it is unlikely that the viruses examined here represent a threat to the jaguar populations in this region.(AU)

Este estudo investigou a exposição de onças-pintadas de vida livre a agentes virais selecionados em duas unidades de conservação federais no Pantanal de Mato Grosso, Brasil. Para a análise desses agentes virais, a maioria de caráter zoonótico, foram utilizados métodos sorológicos e moleculares. Nenhuma das onze onças-pintadas examinadas foi positiva na técnica de real-time RT-PCR para a detecção molecular dos agentes da Influenza aviária e Febre do Nilo Ocidental (WNF). Somente um animal foi positivo sorologicamente para a o vírus da Encefalite Equina do Leste (EEE) pela Microtécnica de vírus neutralização em culturas de células VERO, sendo este o primeiro relato da exposição de onças-pintadas. Todos os animais examinados s foram negativos para o vírus da Encefalite Equina do Oeste (WEE) e Venezuelana (VEE). Amostras de soro colhidas de 11 onças-pintadas foram submetidas a adois testes distintos para a detecção de anticorpos contra o vírus da raiva (Teste Rápido de Inibição de Foco de Fluorescência ­ RFFIT e Microteste Simplificado de Inibição da Fluorescência - SFIMT), resultando em cinco animais positivos, dos quase dois positivos para cada teste e um positivo quando submetido aos dois testes sorológicos. Além disso, três das 14 amostras submetidas a técnica de soroneutralização foram positivas para a pesquisa de anticorpos contra o vírus da cinomose (CDV) e 15 amostras positivas das 17 analisadas para a pesquisa de anticorpos contra o parvovírus canino (CPV) foram identificadas pela técnica de Inibição da Hemaglutinação (HI). De acordo com os resultados deste estudo, é pouco provável que os agentes virais aqui analisados representem ameaça à população de onçaspintadas nesta região.(AU)

Serological and molecular investigation of viral agents in free-living jaguars of the Pantanal wetlands, state of Mato Grosso, Brazil / Investigação sorológica e molecular de agentes virais em onças-pintadas de vida livre no Pantanal de Mato Grosso, Brasil

This study investigates the exposure of free-living jaguars from two federal protected areas in the Pantanal of Mato Grosso, Brazil, to a variety viral agents. These viral agents, particularly causing zoonotic diseases, were analyzed using serological and molecular methods. None of the jaguars was positive by RT-PCR for the molecular detection of avian influenza and West Nile Fever (WNF). Only one animal was serologically positive for Eastern Equine Encephalitis (EEE) by virus neutralization test in VERO cell cultures, representing the first reported case of jaguar exposure to EEE virus. However, all the animals were negative for Western Equine Encephalitis (WEE) virus and Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) virus. Eleven jaguars were tested by two tests for the detection of antibodies against rabies virus (Simplified Fluorescent Inhibition Microtest SFIMT and Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test RFFIT), resulting in five positive animals, two animals in each test and one in both serological tests. Furthermore, three out of 14 samples subjected to the neutralization test were positive for antibodies against canine distemper virus (CDV), and 15 out of 17 samples subjected to the hemagglutination-inhibition test (HI) were positive for antibodies against canine parvovirus (CPV). In view of the findings of this study, it is unlikely that the viruses examined here represent a threat to the jaguar populations in this region.(AU)

Este estudo investigou a exposição de onças-pintadas de vida livre a agentes virais selecionados em duas unidades de conservação federais no Pantanal de Mato Grosso, Brasil. Para a análise desses agentes virais, a maioria de caráter zoonótico, foram utilizados métodos sorológicos e moleculares. Nenhuma das onze onças-pintadas examinadas foi positiva na técnica de real-time RT-PCR para a detecção molecular dos agentes da Influenza aviária e Febre do Nilo Ocidental (WNF). Somente um animal foi positivo sorologicamente para a o vírus da Encefalite Equina do Leste (EEE) pela Microtécnica de vírus neutralização em culturas de células VERO, sendo este o primeiro relato da exposição de onças-pintadas. Todos os animais examinados s foram negativos para o vírus da Encefalite Equina do Oeste (WEE) e Venezuelana (VEE). Amostras de soro colhidas de 11 onças-pintadas foram submetidas a adois testes distintos para a detecção de anticorpos contra o vírus da raiva (Teste Rápido de Inibição de Foco de Fluorescência RFFIT e Microteste Simplificado de Inibição da Fluorescência - SFIMT), resultando em cinco animais positivos, dos quase dois positivos para cada teste e um positivo quando submetido aos dois testes sorológicos. Além disso, três das 14 amostras submetidas a técnica de soroneutralização foram positivas para a pesquisa de anticorpos contra o vírus da cinomose (CDV) e 15 amostras positivas das 17 analisadas para a pesquisa de anticorpos contra o parvovírus canino (CPV) foram identificadas pela técnica de Inibição da Hemaglutinação (HI). De acordo com os resultados deste estudo, é pouco provável que os agentes virais aqui analisados representem ameaça à população de onças pintadas nesta região.(AU)

Eastern equine encephalitis on Federal District of Brazil and surrounding areas / Encefalomielite equina do leste no Distrito Federal e entorno

Background: Eastern equine encephalitis (EEE) is a highly lethal zoonotic disease caused by Eastern equine encephalitisvirus (EEEv), an RNA virus of the genus Alphavirus, family Togaviridae. The transmission of these alphaviruses is throughmosquitoes, mainly species of Culex, Aedes, Anopheles and Culiseta. Horses and humans are considered accidental hostsand the main reservoirs are birds and some wild rodents. The disease has been identified in Brazil by serological studies,but investigations with clinico-pathological descriptions are scarce. The present study aimed to describe the epidemiologyand clinical-pathological findings of four cases of EEE in horses from Midwestern Brazil.Materials, Methods & Results: Four confirmed cases of EEE in horses from the necropsy and histopathology files of theLaboratory of Veterinary Pathology (LPV) of the University of Brasília (UnB) were reviewed. Cases occurred betweenJanuary 2005 and April 2012. Samples of brain and spinal cord samples were fixed in formalin 10%, processed routinelyfor histopathology, and stained by hematoxylin and eosin (HE). Immuno-histochemistry (IHC) with the peroxidase streptoavidin-biotin method was done to confirm the diagnosis of EEEv infection in all cases. The slides were incubated withthe anti-EEEv monoclonal primary antibody (overnight, 1:100 dilution). The disease affected both young and adult horses.One case occurred in the summer and the other three in the fall. Clinical signs more frequently observed included circling,blindness, paresis, paralysis, somnolence, ataxia, head pressing, and recumbence...(AU)

Eastern equine encephalitis on Federal District of Brazil and surrounding areas / Encefalomielite equina do leste no Distrito Federal e entorno

Background: Eastern equine encephalitis (EEE) is a highly lethal zoonotic disease caused by Eastern equine encephalitisvirus (EEEv), an RNA virus of the genus Alphavirus, family Togaviridae. The transmission of these alphaviruses is throughmosquitoes, mainly species of Culex, Aedes, Anopheles and Culiseta. Horses and humans are considered accidental hostsand the main reservoirs are birds and some wild rodents. The disease has been identified in Brazil by serological studies,but investigations with clinico-pathological descriptions are scarce. The present study aimed to describe the epidemiologyand clinical-pathological findings of four cases of EEE in horses from Midwestern Brazil.Materials, Methods & Results: Four confirmed cases of EEE in horses from the necropsy and histopathology files of theLaboratory of Veterinary Pathology (LPV) of the University of Brasília (UnB) were reviewed. Cases occurred betweenJanuary 2005 and April 2012. Samples of brain and spinal cord samples were fixed in formalin 10%, processed routinelyfor histopathology, and stained by hematoxylin and eosin (HE). Immuno-histochemistry (IHC) with the peroxidase streptoavidin-biotin method was done to confirm the diagnosis of EEEv infection in all cases. The slides were incubated withthe anti-EEEv monoclonal primary antibody (overnight, 1:100 dilution). The disease affected both young and adult horses.One case occurred in the summer and the other three in the fall. Clinical signs more frequently observed included circling,blindness, paresis, paralysis, somnolence, ataxia, head pressing, and recumbence...

Occurrence of antibodies anti -Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Leptospira interrogans in a captive deer herd in Southern Brazil / Ocorrência de anticorpos anti -Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Leptospira interrogans em um rebanho de cervídeos de cativeiro do sul do Brasil

A large number of Brazilian zoos keep many endangered species of deer, however, very few disease surveillance studies have been conducted among captive cervids. Blood samples from 32 Brazilian deer (Blastocerus dichotomus, Mazama nana and Mazama americana) kept in captivity at Bela Vista Biological Sanctuary (Foz do Iguaçu, Brazil) were investigated for 10 ruminant pathogens, with the aims of monitoring deer health status and evaluating any potential zoonotic risk. Deer serum samples were tested for Brucella abortus, Leptospira (23 serovars), Toxoplasma gondii, Neospora caninum, bovine viral diarrhea virus, infectious bovine rhinotracheitis virus, foot-and-mouth disease virus, western equine encephalitis virus, eastern equine encephalitis virus and Venezuelan equine encephalitis virus. Antibodies against T. gondii (15.6%), N. caninum (6.2%) and L. interrogans serogroup Serjoe (3.1%) were detected. The serological results for all other infectious agents were negative. The deer were considered to be clinically healthy and asymptomatic regarding any disease. Compared with studies on free-ranging deer, the prevalences of the same agents tested among the captive deer kept at the Sanctuary were lower, thus indicating good sanitary conditions and high-quality management practices at the zoo.(AU)

Um grande número de zoológicos brasileiros abriga espécies de cervídeos ameaçados de extinção, entretanto, estudos de vigilância de doenças em cervídeos de cativeiro são escassos. Amostras de sangue de 32 cervídeos brasileiros (Blastocerus dichotomus, Mazama nana e Mazama americana), mantidos em cativeiro no Refúgio Biológico Bela Vista (Foz do Iguaçu, Brasil), foram investigados para 10 patógenos de ruminantes, visando monitorar o estado de saúde dos cervídeos e avaliar a presença de agentes zoonóticos. As amostras de soro foram testadas para Brucella abortus, Leptospira (23 sorovares), Toxoplasma gondii, Neospora caninum, diarreia viral bovina, rinotraqueíte infecciosa bovina, febre aftosa, encefalomielite equina do oeste, encefalomielite equina do leste e encefalomielite equina venezuelana. Foram detectados anticorpos para T. gondii (15,6%), N. caninum (6,2%) e para L. interrogans sorogrupo Serjoe (3,1%). As sorologias apresentaram resultado negativo para as demais doenças. Os cervídeos foram considerados clinicamente sadios e assintomáticos para doenças. Comparados aos estudos de populações de vida livre, as soroprevalências para os mesmos agentes testados foram menores para os cervídeos mantidos no Refúgio, indicando as boas condições sanitárias e a qualidade das práticas de manejo no zoológico.(AU)

Inquérito sorológico da infecção pelos vírus da encefalomielite equina no estado de Minas Gerais, Brasil / Serological survey of equine encephalomyelitis virus infection in the state of Minas Gerais, Brazil

Foi investigada a ocorrência da infecção pelos vírus da Encelafalomielite Equina do Leste (EEE), Encefalomielite Equina do Oeste (WEE) e Encefalomielite Equina Venezuelana (VEE) em equídeos não vacinados contra tais agentes, criados em dez delegacias regionais do estado de Minas Gerais (Almenara, Bambuí, Curvelo, Governador Valadares, Montes Claros, Oliveira, São Gonçalo do Sapucaí, Teófilo Otoni, Unaí e Viçosa), empregando-se a técnica de soroneutralização em microplacas. Dos 826 animais examinados, 30,2% ((250/826) foram soropositivos para EEE e 1,9% (16/826) para o zuelano de Encefalomielite Equina circulam na população equina do estado de Minas Gerais.(AU)}

The occurrence of Equine Eastern Encephalomyelitis (EEE), Equine Western Encephalomyelitis (WEE) and Equine Venezuelan Encephalomyelitis (VEE) virus infection was investigated in equids not vaccinated against these viruses. The animals were distributed in ten regional districts of the state of Minas Gerais (Almenara, Bambuí, Curvelo, Governador Valadares, Montes Claros, Oliveira, São Gonçalo do Sapucaí, Teófilo Otoni, Unaí e Viçosa). Microplate serum neutralization test was used to detect antibodies against encephalitis virus. Two hundred and fifty animals (30.2%, 250/826) were EEE-seropositive, while 1.9% of them (16/826) were VEE-seropositive. No animals were found to be seropositive for WEE. In conclusion, either EEE or VEE viruses circulate in the equid population of the state of Minas Gerais.(AU)

Surto de encefalomielite equina Leste na Ilha de Marajó, Pará / Eastern equine encephalitis on Marajó Island, Pará state, Brazil

Nove casos de encefalomielite equina foram estudados na Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Os equinos apresentavam dificuldade em se manter em estação, andavam em círculo, tinham acentuada depressão, pálpebras cerradas, paralisia da língua, tremores musculares, bruxismo, anorexia e desidratação. Alguns apresentavam diminuição dos reflexos auricular, palpebral, de ameaça, diminuição do tônus da língua e taquicardia. Posição de auto-auscultação foi observada com frequência. Os animais muitas vezes eram encontrados apoiados em troncos e cercas para se manterem em estação. À necropsia verificou-se hemorragia das leptomeninges e da medula, alguns apresentaram ainda aderência das leptomeninges. À histopatologia verificou-se encefalite difusa que afetava principalmente a substância cinzenta, com meningite e coroidite. Foi observada perivasculite mononuclear. Em dois equinos identificou-se o vírus da encefalomielite equina Leste pela reação de Semi-Nested transcrição reversa de polimerase em cadeia (Semi-Nested RT-PCR).(AU)

Nine cases of equine encephalomyelitis on Marajó Island, state of Pará, Brazil, were studied. The affected horses had difficulty to stand, walked in circles, with marked depression, closed eyelids, tongue paralysis, muscle tremors, bruxism, anorexia and dehydration. Some had their ear and eyelid reflexes diminished, decreased tongue tone and tachycardia; laid down frequently they kept their head on the chest. Often they were seen resting their head on tree trunks or fences. At necropsy, hemorrhages of the meninges and spinal cord, and in some animals also adhesion of the meninges were found. Histologically there was diffuse encephalitis affecting mainly the gray matter, with meningitis and choroiditis. Presence of perivascular cuffs consisting of mononuclear inflammatory cells was observed. From two horses the Eastern equine encephalitis virus was identified by semi-nested reverse transcription polymerase chain reaction (semi-nested RT-PCR).(AU)

Prevalência de anticorpos contra agentes virais em equídeos no sul do estado de são paulo

ABSTRACT Sera from 163 Equidae (143 equines and 20 mules) from 16 municipalities in the southern region of São Paulo State, Brazil, were selected in a two-stage stratified probabilistic sample survey. Serum samples were collected from October 2004 to June 2005. The antibody prevalence was estimated against eastern (EEE), western (WEE) and Venezuelan (VEE) equine encephalitis, equine herpesvirus (EHV), equine viral arteritis (EVA), equine influenza 1 and 2 (EI 1 and 2) and vesicular stomatitis (Indiana 2 Cocal virus COCV and Indiana 3 Alagoas virus (VSAV). The results showed positivity of 26% for EHV, 21% for COCV, 5% for VCAV, 16% for EEE, 2.26% for VEE, 11% for influenza Equi/2 and 2.7% for influenza Equi/1. No antibodies were detected against WEE and AVE. These results suggest that the equine population in the south of São Paulo State is exposed to infection risk of HVE, IE Equi-1(H7N7) and Equi-2 (H3N8), EEE, VEE and Indiana 2 Cocal (COCV) Indiana 3 Alagoas (VSAV).

RESUMO Foram analisados soros de 163 equídeos (143 equinos e 20 muares) provenientes de 16 municípios do sul do Estado de São Paulo, parte no Vale do Ribeira e parte no litoral. Utilizouse uma amostra probabilística estratificada em dois estágios, sendo a unidade amostral de primeiro estágio constituída pela unidade de produção agropecuária (UPA) e a de segundo estágio pelo animal dentro da UPA sorteada. Os soros foram coletados no período de outubro de 2004 a junho de 2005. Foram estimadas as prevalências de anticorpos contra os vírus das encefalites equinas do tipo leste (EEE), oeste (WEE) e venezuelana (VEE), herpesvírus equino (HVE), arterite viral dos equinos (AVE), influenza equina 1 e 2 (IE-1 e 2) e estomatite vesicular Indiana 2 Cocal (COCV) e Indiana 3 Alagoas (VSAV). Foram utilizadas as técnicas de inibição da hemoaglutinação para a detecção de anticorpos contra os vírus IE-1 e 2 e de soroneutralização para os demais vírus estudados. Dos animais testados, 26% apresentaram anticorpos contra o HVE, 21% para COCV, 5% para VSAV, 16% para EEE, 2,26% para VEE, 11% para influenza Equi/2 e 2,7% para influenza Equi/1. Não se encontraram animais reagentes para WEE e AVE. A soroprevalência obtida sugere a circulação do HVE, dos vírus da IE Equi-1(H7N7) e Equi-2 (H3N8), dos vírus EEE e VEE e dos vírus da estomatite vesicular Indiana 2 Cocal (COCV) e Indiana 3 Alagoas (VSAV) no rebanho de equídeos do sul do Estado de São Paulo.

Prevalência de anticorpos contra agentes virais e bacterianos em eqüídeos do município de Monte Negro, Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira / Seroprevalence of viral and bacterial agents in equids from Monte Negro municipality, State of Rondônia. Brazilian western Amazon

Foram examinados 176 eqüídeos (15 muares e 161 eqüinos) do município de Monte Negro, Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira, frente a agentes virais e bacterianos. A amostra correspondeu ao total de eqüídeos no município, considerando um nível de confiança de 99%, prevalência esperada de 50% e erro padrão de 10%. As infecções virais foram investigadas pelas provas de Imunodifusão em gel de Agar (Anemia Infecciosa Eqüina - AIE), Inibição da hemaglutinação (Influenza eqüina tipos 1 e 2 - IE-1 e 2) e Soroneutralização em cultura celular (Arterite Viral Eqüina - AVE, Herpesvírus Eqüino tipo 1 - HVE1, Estomatite Vesicular - EV e Encefalomielite Eqüina do Leste - EEE, do Oeste - WEE e Venezuela - VEE). Para o diagnóstico da leptospirose, foi utilizada a prova de Soroaglutinação Microscópica (SAM); para o diagnóstico da brucelose, o teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) foi utilizado como teste de triagem e as provas de Soroaglutinação Lenta em Tubos (SLT) e 2- mercaptoetanol como testes diagnósticos. Foram constatados 9,6% dos eqüídeos reativos para AIE, 22,7% para HVE1, 19,9% para IE- 1, 42,0% para IE-2, 21,0% para EEE, 11,3% para VEE, 3,4% para Brucella spp. e 91,4% para Leptospira spp. Os sorovares de leptospira mais freqüentes foram Bratislava (10,5%), Icterohaemorrhagiae (8,7%) e Autumnalis (8,7%) nos eqüinos e Patoc (26,6%) nos muares. Não foram encontrados animais com anticorpos contra AVE, EV e WEE.(AU)

Sera from 174 equidaes (15 mules and 161 equines) of Monte Negro municipality, Rondônia State were analyzed against viral and bacterial agents. The serum sample corresponded the total equid population in the municipality considering a confidence interval of 99%, expected prevalence of 50% and absolute desired of 10%. For the viral agents, sera were tested by the Agar Gel Immunodiffusion Test (Equine Infection Anemia - EIA), Inhibition Haemagglutination Test (Equine Influenza 1 and 2 - EI - 1 and 2), and Virusneutralizating Tests (Equine Viral Arteritis - EVA, Equine Herpesvirus 1 - EHV1, Vesicular Stomatitis - VS, Equine Encephalitis Eastern - EEE, Western - WEE and Venezuelan VEE). The diagnosis for brucellosis was made by Agglutination Tests and the Microscopic Agglutination Test was used for leptospirosis. The results showed positivity of 9.6% for EIA, 22.7% for HVE1, 19.9% for IE-1, 42.0% for IE-2, 21.0% for EEE, 11.3% for VEE, 3.4% for brucellosis, and 91.4% for leptospirosis. The most frequent serovars detected were Bratislava (10.5%), Icterohaemorrhagiae (8.7%), Autumnalis (8.7%) for equines and Patoc (26.6%) for mules. No one of the examined samples reacted to EVA, VS, or WEE.(AU)

Encefalomielite equina Leste na Ilha de Marajó, Pará

Nove casos de encefalomielite equina foram estudados na Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Os animais apresentavam dificuldade em se manter em estação, andar em círculo, acentuada depressão, pálpebras cerradas, paralisia da língua, tremores musculares, bruxismo, anorexia e desidratação. Alguns apresentavam diminuição dos reflexos auricular, palpebral, de ameaça, diminuição do tônus da língua e taquicardia. Posição de auto-auscultação foi observada com frequência. Os animais muitas vezes eram encontrados apoiados em troncos e cercas para se manterem em estação. À necropsia verificou-se hemorragia das leptomeninges e medula, alguns animais apresentaram ainda aderencia das leptomeninges. Na histopatologia verificou-se encefalite difusa afetando principalmente a substância cinzenta, com meningite e coroidite. Foi observada presença de manguitos perivasculares constituídos por células inflamatórias mononucleadas. Em dois animais identificou-se o Eastern equine encephalitis virus por semi nested transcrição reversa reação de polimerase em cadeia (Semi-Nested RT-PCR)

Nine cases of equine encephalomyelitis on Marajó Island, state of Pará, Brazil, were studied. The affected horses had difficulty to stand, walked in circles, with marked depression, closed eyelids, tongue paralysis, muscle tremors, bruxism, anorexia and dehydration. Some had their ear and eyelid reflexes diminished, decreased tongue tone and tachycardia; laid down frequently they kept their head on the chest. Often they were seen resting their head on tree trunks or fences. At necropsy, hemorrhages of the meninges and spinal cord, and in some animals also adhesion of the meninges were found. Histologically there was diffuse encephalitis affecting mainly the gray matter, with meningitis and choroiditis. Presence of perivascular cuffs consisting of mononuclear inflammatory cells was observed. From two horses the Eastern equine encephalitis virus was identified by semi-nested reverse transcription polymerase chain reaction (semi-nested RT-PCR).

Encefalomielite equina Leste na Ilha de Marajó, Pará

Nove casos de encefalomielite equina foram estudados na Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Os animais apresentavam dificuldade em se manter em estação, andar em círculo, acentuada depressão, pálpebras cerradas, paralisia da língua, tremores musculares, bruxismo, anorexia e desidratação. Alguns apresentavam diminuição dos reflexos auricular, palpebral, de ameaça, diminuição do tônus da língua e taquicardia. Posição de auto-auscultação foi observada com frequência. Os animais muitas vezes eram encontrados apoiados em troncos e cercas para se manterem em estação. À necropsia verificou-se hemorragia das leptomeninges e medula, alguns animais apresentaram ainda aderencia das leptomeninges. Na histopatologia verificou-se encefalite difusa afetando principalmente a substância cinzenta, com meningite e coroidite. Foi observada presença de manguitos perivasculares constituídos por células inflamatórias mononucleadas. Em dois animais identificou-se o Eastern equine encephalitis virus por semi nested transcrição reversa reação de polimerase em cadeia (Semi-Nested RT-PCR)

Nine cases of equine encephalomyelitis on Marajó Island, state of Pará, Brazil, were studied. The affected horses had difficulty to stand, walked in circles, with marked depression, closed eyelids, tongue paralysis, muscle tremors, bruxism, anorexia and dehydration. Some had their ear and eyelid reflexes diminished, decreased tongue tone and tachycardia; laid down frequently they kept their head on the chest. Often they were seen resting their head on tree trunks or fences. At necropsy, hemorrhages of the meninges and spinal cord, and in some animals also adhesion of the meninges were found. Histologically there was diffuse encephalitis affecting mainly the gray matter, with meningitis and choroiditis. Presence of perivascular cuffs consisting of mononuclear inflammatory cells was observed. From two horses the Eastern equine encephalitis virus was identified by semi-nested reverse transcription polymerase chain reaction (semi-nested RT-PCR).(AU)

Soroprevalência da encefalomielite eqüina do leste e do oeste no Município de Uruará, PA, Brasil / Seroprevalence of holders farms for eastern equine encephalitis and western equine encephalomyelitis in Uruará Municipality, Pará State, Northen Brazil

O objetivo do presente foi estimar a soroprevalência de anticorpos contra o vírus da EEE e da WEE utilizando como unidades de análise os eqüídeos e as propriedades rurais do tipo familiar do município de Uruará, PA. Os anticorpos contra o vírus das EEE e da WEE foram pesquisados pela microtécnica de soroneutralização. As seguintes prevalências de animais sororeatores para os diferentes vírus foram observadas: EEE 27,37% (IC 15,33 - 39,21%), WEE 1,05% (IC 0,06 - 6,78%). Para as propriedades obtivemos as seguintes prevalências: EEE 53,12% (IC 35,03 - 70,49%), WEE 3,12% (IC 0,16-18,00%).(AU)

The aim of this study was to verify the prevalence of herds with EEEV and WEEV infected animals, in Uruará municipal district, Pará State-Brazil. In view of that, the serum neutralization test was utilized. The following prevalence of positive herds were observed: 17 positive herds for EEEV out of 32 herds, therefore, prevalence is 53.12% (IC 35.03 - 70.49%). One positive herd was found for WEEV out of the 32 studied herds, thus performing 3.12% (IC 0.16 - 18.00%) prevalence. The prevalence of serum reactors animals were observed: 27,37% (IC 15,33 - 39,21 %), WEE 1,05% (IC 0,06 - 6,78%).(AU)

Diagnóstico da raiva e das encefalites equinas do Leste e Oeste em equídeos pelo emprego da técnica de multiplex hemi-nested RT-PCR / Diagnosis of rabies and Eastern and Western Equine Viral Encephalitides in equids by multiplex hemi-nested RT-PCR technique

Várias zoonoses virais acometem equídeos causando quadros neurológicos, entre as quais a raiva e as encefalites equinas do Leste (EEE) e Oeste (WEE). O diagnóstico clínico geralmente não é conclusivo, o que torna imprescindível o diagnóstico laboratorial. Dados do Laboratório de Diagnóstico de Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo, entre os anos 2000 e 2010, mostram que aproximadamente 75% das amostras enviadas foram negativas para raiva, ressaltando a relevância da realização de um diagnóstico diferencial para as encefalites equinas causadas por alfavírus. Os objetivos do estudo foram testar a adequação do uso de multiplex hemi-nested RT-PCR para o diagnóstico de raiva, EEE e WEE em amostras de sistema nervoso central de equídeos e realizar uma análise de custo das reações de cada técnica. Foram utilizados os primers 21G, 304 e 504 dirigidos ao gene N do vírus da raiva, e os primers cM3W, M2W, nEEE e nWEE dirigidos ao gene NSP1 dos vírus da EEE e WEE. Procedeu-se a um estudo preliminar dos primers e de seu uso em uma hemi-nested RT-PCR, avaliando a temperatura ótima de anelamento, a sensibilidade e especificidade analíticas e a reprodutibilidade da técnica em amostras de campo positivas para raiva e para EEE. A partir do protocolo estabelecido na reação de hemi-nested RT-PCR, realizaram-se variações de concentração de reagentes no protocolo para a reação de multiplex hemi-nested RT-PCR. Após o estabelecimento do protocolo para esta reação, os mesmos testes para verificação da sensibilidade e especificidade analíticas e da reprodutibilidade foram realizados, comparando-se os resultados com os obtidos pela hemi-nested RT-PCR. No teste de limiar de detecção, a sensibilidade analítica foi semelhante para as duas técnicas, obtendo-se 10-1,7 para os três vírus padrão CVS, EEEV e WEEV. No teste de limiar de detecção utilizando uma amostra com os três vírus verificou-se uma alta especificidade dos primers, sendo que na reação de multiplex hemi-nested RT-PCR foi possível detectar simultaneamente os três vírus padrão. Não houve diferença nas proporções de amostras detectadas como positivas para raiva obtidas pelas duas técnicas, analisando-se pelo teste exato de Fisher (P=1,0000). No entando, para amostras de campo positivas para EEE, a proporção de amostras detectadas como positivas pela hemi-nested RT-PCR foi maior do que a proporção obtida pela multiplex hemi-nested RT-PCR (P<0,0001). Apesar de não ter sido possível o uso de amostras de campo positivas para WEE nesse estudo, os resultados sugerem que seria possível a detecção pela multiplex hemi-nested RT-PCR. Estes dados sugerem que a técnica de multiplex hemi-nested RT-PCR poderia ser aplicada para detecção de raiva e WEE, mas com limitações para a detecção de EEE. Pela análise de custo dos reagentes, o valor de uma reação de multiplex hemi-nested RT-PCR é semelhante ao de uma hemi-nested RT-PCR, podendo representar uma economia de pelo menos 49,17%

Several viral zoonoses affect the equids causing neurological diseases, including rabies and Eastern and Western equine encephalitides (EEE and WEE). Clinical diagnosis is often not conclusive, in a way that laboratory diagnosis is essential. Data from the Laboratory of Rabies Diagnosis at the Pasteur Institute of São Paulo, between 2000 and 2010, demonstrate that approximately 75% of submitted equid samples were negative for rabies, emphasizing the importance of achieving a differential diagnosis for equine encephalitis caused by alphaviruses. The aims of this study were to test the suitability of using multiplex hemi-nested RT-PCR for the diagnosis of rabies, EEE and WEE in equids central nervous system samples and to perform a cost analysis of the reactions of each technique. We used the primers 21G, 304 and 504 directed to the N gene of rabies virus, and the primers cM3W, M2W, nEEE and nWEE directed the NSP1 gene of WEE and EEE viruses. A preliminary study of the primers was carried out, as well as their use in a hemi-nested RT-PCR, evaluating the optimal annealing temperature, the analytical sensitivity and specificity and the reproducibility of the technique in positive field samples for rabies and EEE. From the protocol established for the hemi-nested RT-PCR, variations in reagents concentrations for the multiplex hemi-nested RT-PCR protocol were perfomed. After establishing the protocol for this reaction, the same tests to verify the analytical sensitivity and specificity and reproducibility were performed and the results compared to those obtained by hemi-nested RT-PCR. In the detection threshold test, the analytical sensitivity was similar for both techniques, resulting in 10-1.7 for the three virus standard CVS, and EEEV WEEV. In the detection threshold test using a sample with the three viruses, a high specificity of the primers was verified and the multiplex hemi-nested RT-PCR was able to detect the three viruses simultaneously. There was no difference in the proportions of samples detected as positive for rabies obtained by both techniques, according to the Fisher exact test (P = 1.0000). However, for EEE positive field samples, the proportion of samples detected as positive by the hemi-nested RT-PCR was higher than the proportion obtained by multiplex hemi-nested RT-PCR (P <0.0001). Although it was not possible to use WEE positive field samples in this study, the results suggest that its detection would be possible by multiplex hemi-nested RT-PCR. Thus, data suggest that the multiplex hemi-nested RT-PCR technique could be applied to detect rabies and WEE, but with limitations for the EEE detection. For the analysis of reagent costs, the cost of one multiplex hemi-nested RT-PCR is similar to one hemi-nested RT-PCR, and may represent a saving of 49,17% at least