Resumo

Objetivou-se avaliar a eficácia da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) utilizando o fotossensibilizador (FS) Safranina-O (Sf) em leite e cupons de aço inox experimentalmente contaminados com cepas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas fluorescens, isolados de leite bovino, caprino e ovino, assim como a eficiência do uso de um hidrogel termorresponsivo e fotoativo de Sf em aplicações pós dipping, visando a redução da contaminação do leite de vacas, cabras e ovelhas. No primeiro estudo, cepas de S. aureus (SV1, SV3, SV5, SC5, SC6, SC8) e P. fluorescens (PV1, PVh, PC3) foram previamente isoladas de leite bovino e caprino, identificadas geneticamente e submetidas a quatro tratamentos: Tratamento 1: Controle (somente leite/caldo); Tratamento 2: TFDa (leite/caldo + agente fotossensibilizador (Sf) + iluminação com LED); Tratamento 3: LED (leite/caldo + iluminação com LED); Tratamento 4: Fotossensibilizador (Sf) (leite/caldo + agente fotossensibilizador Sf). Para verificar o efeito da fotoinativação na eliminação de biofilmes bacterianos, em cada poço foi adicionado um cupom de aço inox (8 mm x 8 mmx 1 mm). Os ensaios de antibiograma evidenciaram a resistência dos isolados de S. aureus frente a Ampicilina, Trimetoprim e Tetraciclina. Nos ensaios in vitro em leite bovino, houve redução de 17,4% nas contagens de P. fluorescens (PV1) quando comparado ao tratamento controle (p<0,05). Em leite caprino, a TFDa reduziu o crescimento de Staphylococcus aureus em até 24,43% (SC8) (p<0,05), e para P. fluorescens (PC3) a inativação foi de 50,25%. Na formação de biofilmes, houve redução de 66,66% (SV1) e 38,27% (SC5) na adesão de Staphylococcus aureus em cupons de aço inox. Para aplicações in vivo, a Sf fotoativada manteve as contagens bacterianas no leite bovino semelhantes ao tratamento controle (ácido lático) (p>0,05). Ao longo do período experimental (28 dias) houve redução de 23,23% e 28,85% nas contagens de estafilococos e de Pseudomonas spp. no leite de vacas, e de 76,13% para Pseudomonas spp. no leite de cabras (p<0,05). Não houve diferença significativa na contagem de células somáticas (CCS) no leite de vacas e cabras. No segundo estudo, leite e caldo Muller Hinton (CHM) foram experimentalmente contaminados com cepas de S. aureus (SO1, SO3, SO4) e uma cepa de Staphylococcus coagulase negativo (SO2) previamente isolada e identificada geneticamente através dos genes nuc e coa. Para verificar o efeito da fotoinativação na eliminação de biofilmes bacterianos, em cada poço foi adicionado um cupom de aço inox (8 mm x 8 mmx 1 mm). Todos os microrganismos se mostraram sensíveis a TFDa. Quando submetidas à análise de resistência a antibióticos, a cepa SO4 foi resistente a Ampicilina e Trimetropim. Quando cultivados em leite e CMH, houve redução nas contagens de estafilococos em até 97,33% e 99,63%, respectivamente. Em cupons de aço inox, a fotoinativação reduziu em até 45,92% (leite) e 99,5% (CMH) a adesão de S. aureus (p<0,05). A Sf fotoativada foi similar ao uso de ácido lático comercial quando aplicada como pós dipping. Estes resultados indicam que a TFDa, mediada por Sf, é eficaz na inativação de microrganismos deteriorantes e patógenos do leite, assim como é eficaz em reduzir a contaminação do leite quando aplicada como pós-dipping.

This study aimed to evaluate the effectiveness of antimicrobial Photodynamic Therapy (PDTa) using the photosensitizer (PS) Safranin-O (Sf) in milk and stainless-steel couponsexperimentally contaminated with Staphylococcus aureus and Pseudomonasfluorescensisolated from bovine, goat and sheep milk, as well as the efficiency of using a thermo- responsive and photoactive Sf hydrogel in post dipping applications, aiming to reduce thecontamination of milk from cows, goats and sheep. In the first study, the strains of S. aureus(SV1, SV3, SV5, SC5, SC6, SC8) and P. fluorescens (PV1, PVh, PC3) were previously isolated from bovine and goat milk, and then genetically identified and subjected to four treatments: Treatment 1: Control (only milk/broth); Treatment 2: PDTa (milk/broth + photosensitizing agent (Sf) + LED lighting); Treatment 3: LED (milk/broth + LED lighting); Treatment 4: Photosensitizer (Sf) (milk/broth + Sf photosensitizing agent). To verify the effect of photoinactivation in eliminating bacterial biofilms, in each well a stainless-steel coupon (8 mm x 8 mm x 1 mm) was added. Antibiogram tests showed the resistance of S. aureus isolates to Ampicillin, Trimethoprim and Tetracycline. In in vitroassays in bovine milk, there was a reduction of 17.4% in P. fluorescens (PV1) counts when compared to the control treatment (p<0.05). In goat milk PDTa reducedthe growth of Staphylococcus aureus by up to 24.43% (SC8) (p<0.05), and for P. fluorescens (PC3) the inactivation was 50.25%. In the formation of biofilms, there was a reduction of 66.66% (SV1) and 38.27% (SC5) in the adhesion of S. aureus to stainless steel coupons.For in vivo applications, photoactivated Sf maintained bacterial counts in bovine milk similar to the control treatment (lactic acid) (p>0.05). During the experimental period (28days) there was a reduction of 23.23% and 28.85% in staphylococci and Pseudomonas spp. in cow's milk, and 76.13% for Pseudomonas spp. in goat milk (p<0.05). There was no significant difference in somatic cell count (CCS) in milk from cows and goats. In thesecond study, the Muller Hinton milk and broth (CHM) were experimentally contaminated with strains of S. aureus (SO1, SO3, SO4) and a strain of coagulase negative Staphylococcus (SO2) was previously isolated and genetically identified through the gene nucand coa. To verify the effect of photoinactivation in eliminating bacterial biofilms, in each well a stainless-steel coupon (8 mm x 8 mmx 1 mm) was added. All microorganisms were sensitive to PDTa. When submitted to antibiotic resistance analysis, the SO4 strain was resistant to Ampicillin and Trimethoprim. When cultivated in milk and HCM, there was a reduction in staphylococcal counts of up to 97.33% and 99.63%, respectively. In stainless-steel coupons, photoinactivation reduced up to 45.92% (milk) and 99.5% (CMH) theadhesion of S. aureus (p<0.05). Photoactivated Sf was similar to the use of commercial lactic acid when applied as a dipping post. These results indicate that Sf- mediated PDTa is effective in inactivating spoilage microorganisms and milk pathogens,as well as being effective in reducing milk contamination when applied as a post-dipping.

Resumo

[...] As bactérias foram isoladas de amostras de leite compostas de todos os quartos mamários de cada vaca após descartar os primeiros três ou quatro jatos de leite. Para acessar os potenciais fatores de risco, características dos animais foram obtidas através de uma entrevista com os produtores. Os exames laboratoriais foram realizados de acordo com as recomendações do National Mastitis Council. Um total de 242 isolados foi obtido de 195 vacas a partir da amostra do rebanho total (251 vacas). A prevalência de infecções foi descrita em grupos de acordo com o perfil epidemiológico: bactérias ambientais, contagiosas e outras. Estas perfizeram 57,3 por cento, 26,3 por cento e 11,2 por cento, respectivamente, dos animais amostrados. Testes de suscetibilidade antimicrobiana contra 12 diferentes antimicrobianos foram realizados em 159 isolados. No total, 30 por cento dos isolados testados mostraram resistência a pelo menos três grupos diferentes de antimicrobianos e foram classificados como multirresistentes. Foram observadas as freqüências mais elevadas de resistência contra a ampicilina para os estafilococos coagulase-negativo, seguida de eritromicina para estafilococos coagulase-positivo e tetraciclina para estreptococos. A análise de regressão logística mostrou uma relação significativa entre a idade das vacas e a presença de estafilococos coagulase-positivo multirresistentes e distribuição de classes diferentes de bactérias nos diferentes estratos etários, o que sugere uma concorrência dinâmica ao longo do tempo (p < 0,05). Animais com três a quatro anos tiveram 13,7 vezes mais chances (IC95 por cento 1,4 - 130,2, p = 0,02) de ter estafilococos coagulase-positivo multirresistentes em comparação com aqueles com dois ou três anos. O tempo de exposição a agentes infecciosos e consequentes terapias sugere uma maior chance de colonização do úbere por patógenos resistentes devido à pressão de seleção repetida durante a vida.

[...] Bacteria were isolated from composite milk samples obtained from all quarters of each cow after discarding the initial three or four streams of milk. To access potential risk factors, animal characteristics were obtained through an interview with the producers. Laboratory tests were done according to National Mastitis Council recommendations. A total of 242 isolates was obtained from 195 cows out of 251 cows sampled. The prevalence of animal infections was described in groups according to the epidemiological profile: environmental, contagious and other bacteria. These were 57.3 percent, 26.3 percent and 11.2 percent, respectively of the sampled animals. Antimicrobial susceptibility tests against 12 different antimicrobials were performed in 159 isolates. Altogether, 30 percent of the isolates tested showed resistance to at least three different antimicrobial groups and were classified as multidrug-resistant. Higher frequencies of resistance were observed against ampicillin to coagulase-negative staphylococci, followed by erythromycin to coagulase-positive staphylococci and tetracycline to streptococci. The logistic regression analysis showed a significant relationship between age of the cows and presence of multidrug-resistant coagulase-positive staphylococci and distribution of different class of bacteria, suggesting a competition dynamic throughout the ages (p < 0.05). Animals with three to four years old had 13.7 times more chances (IC95 percent 1.4 - 130.2; p = 0,02) to have multidrug-resistant coagulase-positive staphylococci compared to those with two to three years. Time of exposure to infectious agents and consequent therapies suggests a greater chance of udder's colonization by resistant pathogens due to repeatedly selection pressure during lifetime.

Resumo

The present study evaluated the pheno- and genotypical antimicrobial resistance profile of coagulase-negative Staphylococcus (CNS) species isolated from dairy cows milk, specially concerning to oxacillin. Of 100 CNS isolates, the S. xylosus was the prevalent species, followed by S. cohnii, S. hominis, S. capitis and S. haemolyticus. Only 6% were phenotypically susceptible to the antimicrobial agents tested in disk diffusion assay. Penicillin and ampicillin resistance rates were significantly higher than others antimicrobials. Four isolates were positive to mecA gene (4%), all represented by the S. xylosus species. The blaZ gene was detected in 16% of the isolates (16/100). It was noticed that all mecA + were also positive to this gene and the presence of both genes was correlated to phenotypic beta-lactamic resistance. We conclude that CNS species from bovine milk presented significantly distinct antimicrobial resistance profiles, evaluated by phenotypic and genotypic tests, which has implications for treatment and management decisions.

O presente estudo avaliou o perfil fenogenotípico de resistência aos antimicrobianos em espécies de Staphylococcus coagulase-negativo (ECN) isoladas do leite de vacas com mastite, em especial considerando a oxacilina. Dos 100 isolados de ECN, S.xylosus foi a espécie predominante, seguida por S. cohnii, S. hominis, S. capitis and S. haemolyticus Apenas 6% dos isolados foram fenotipicamente suscetíveis aos agentes antimicrobianos testados no ensaio de difusão em disco. O percentual de resistência à penicilina e ampicilina foi significativamente maior que aos outros antimicrobianos. Quatro isolados foram positivos para o gene mecA (4%), sendo todos representados pela espécie S.xylosus. O gene blaZ foi detectado em 16% dos isolados (16/100), sendo todos mecA positivos e a presença de ambos os genes foi correlacionada com a resistência fenotípica aos beta-lactâmicos. Foi possível concluir que as espécies de ECN provenientes de leite bovino apresentaram distintos perfis de resistência antimicrobiana, avaliados por testes fenotípicos e genotípicos, podendo dificultar a adoção de medidas de tratamento e manejo dos animais.

Resumo

This study was conducted to establish the relationship between somatic cell count (SCC) and bacterial shedding from mammary quarters according to mastitis pathogens. Milk samples from 638 mammary quarters were examined for mastitis pathogens, SCC and total bacterial count (TBC). The raw data of SCC and TBC were used to perform descriptive statistics. The significance of the arithmetic mean differences between SCC and TBC according to bacteriological examination results was determined by a two-tailed unpaired t-test. Pearson and Spearman´s correlations were done with logarithmic data and linear regression analyses. The geometric means of the bacteriological examination results were (cells mL-1; CFU mL-1): no growth (52,000; 12,000), coagulase-negative staphylococci (85,000; 17,000), Staphylococcus aureus (587,000; 77,000); other streptococci (432,000; 108,000) and Streptococcus agalactiae (1,572,000; 333,000). The Pearson and Spearman's correlations between SCC and TBC were higher than 0.60 for all mastitis pathogens. The regression analyses slopes showed different increase in TBC with the same increase in SCC according to mastitis pathogens. The slope for S. agalactiae (0.542) was higher than that for other mastitis pathogens. The results suggest that the intensity of inflammatory process was associated with number of mastitis pathogens shedding from the mammary gland.

Este estudo foi realizado com objetivo de estabelecer a relação entre contagem de células somáticas (CCS) e a liberação de bactérias de quartos mamários de acordo com os patógenos da mastite. Amostras de leite de 638 quartos mamários foram examinadas para identificação dos patógenos da mastite, CCS e contagem total de bactérias (CTB). Estatísticas descritivas foram utilizadas para avaliar os dados brutos de CCS e CTB. A diferença entre médias para CCS e CTB de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foi avaliada pelo teste T para amostras independentes. Foram realizadas a correlação de Pearson, de Spearman e regressão linear com os dados transformados. As médias geométricas de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foram (células mL-1; UFC mL-1): sem crescimento (52.000; 12.000), estafilococos coagulase negativo (85.000; 17.000), Staphylococcus aureus (587.000; 77000); outros estreptococus (432.000; 108.000) e Streptococcus agalactiae (1.572.000; 333.000). A correlação de Pearson e Spearman entre CCS e CTB foi maior que 0,60 para todos os patógenos da mastite. O coeficiente angular das regressões lineares mostrou diferentes aumentos da CTB como o mesmo aumento da CCS de acordo com os patógenos da mastite. O coeficiente angular para o S. agalactiae (0.542) foi maior em relação aos outros patógenos da mastite. Os resultados sugerem que a intensidade do processo inflamatório foi associada com a quantidade de bactérias da mastite liberada pela glândula mamária.

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da suplementação de selênio orgânico (levedura selenizada) vinculado ao concentrado, nos níveis sanguíneos, na produção e concentração no leite, possíveis alterações na composição do leite, nos parâmetros indicativos de mastite e na análise sensorial, durante o período de lactação de cabras leiteiras. Foram utilizadas 16 cabras, mestiças Saanen com Toggenburg, em delineamento inteiramente casualizado, em dois tratamentos, com e sem adição de selênio no concentrado. As fêmeas eram criadas em sistema semi-intensivo, sendo que pela manhã ficavam em pasto nativo, e à tarde recebiam concentrado padrão a base de milho, farelo de soja e calcário, capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum.) e cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), no cocho, após a ordenha. Semanalmente, foram realizadas a pesagem, a avaliação do escore da condição corporal e o controle leiteiro. Antes das fêmeas entrarem nos tratamentos e a cada 21 dias de lactação foi realizada coleta de sangue para determinação do teor de selênio. Com 20, 40 e 60 dias do ciclo lactacional, foram coletadas amostras individuais de leite para determinação de composição, caseína, nitrogênio ureico, Contagem de Células Somáticas, pH, condutividade elétrica, teor de cloretos e teor de selênio. Foi realizada análise sensorial do leite proveniente dos dois tratamentos. Observou-se efeito do Se orgânico na dieta das cabras suplementadas sobre o Se no sangue (P<0,05). Não houve diferença significativa (P>0,05) para desempenho corporal, Escore da Condição Corporal, concentração de Se no leite, produção de leite, composição do leite, nitrogênio ureico e indicativos de mastite entre os dois tratamento. Observou-se que na 1a coleta, que uma amostra (12,5%) de leite de cabras do grupo não suplementado, apresentou isolamente de estafilococos coagulase- negativo (ECN). Na segunda coleta, uma amostra apresentou isolamento de ECN, sendo esta amostra proveniente do tratamento não suplementado. Na terceira coleta, das cabras com suplementação, houve o isolamento de 4 amostras (50%) de ECN e àquelas não suplementadas de 2 amostras (25%) de ECN. Não foi observado diferença entre as amostras de leite provenientes dos dois tratamentos ao serem submetidos a análise sensorial. A suplementação com selênio orgânico aumentou as concentrações do micromineral no sangue, porém não influenciou nos outros parâmetros avaliados.

The objective of this study was to evaluate the influence of organic selenium (selenized yeast) supplementation, bound to the concentrate, on blood levels, milk production and concentration, possible changes in milk composition, mastitis indicative parameters and Sensory analysis, during the lactation period of dairy goats. Were used sixteen goats, crossbreed Saanen with Toggenburg, in a completely randomized design, in two treatments, with or without addition of selenium in the concentrate. The females were raised in a semi-intensive system, in the morning they were kept in native pasture, and in the afternoon they received standard concentrate based on corn, soybean meal and limestone, elephant grass (Pennisetum purpureum Schum.) and sugarcane Sugar (Saccharum officinarum) in the trough, after milking. Weekly, weighed, body condition score and dairy control of females wereperformed. Before the females entered the treatments and each every 21 days of lactation was performed blood collection to determine the selenium content. With 20, 40 and 60 days from the lactacinal cycle, were collect individuals samples of milk to determine composition, casein, urea nitrogen, somatic cell count, pH, electrical conductivity, chloride content and selenium content. Sensorial analysis of milk from both treatments was performed. The effect of organic Se in the diet of the supplemented goats on the Se in the blood was observed (P <0,05). There was no significant difference (P> 0.05) for body performance, Body Condition Score, Se concentration in milk, milk production, milk composition, urea nitrogen and indicative of mastitis between the two treatments. In the first collect the treatment without supplementation showed 1 sample (12.5%) isolation coagulase-negative staphylococci (ECN). In the second collect, 1 sample showed isolation ECN, being this sample comes from the treatment without supplementation. In the thirdm the treatment with supplementation identified 4 samples (50%) of ECN and without supplementation were 2 samples (25%). No difference was observed between the milk from the two treatments when undergoing sensory analysis. The supplementation with organic selenium increased the concentrations of the micromineral in the blood, but did not influence the other parameters studied.

Resumo

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do congelamento e da incubação do leite de ovelhas da raça Santa Inês sobre os resultados da cultura bacteriológica. Desta forma, 45 amostras de leite ovino foram coletadas, e submetidas aos seguintes tratamentos: cultura bacteriológica (T1), e simultaneamente incubadas a 37°C por 18 horas (T2) e congeladas a -20°C por 24 horas (T3). Após esses períodos, as amostras dos T2 e T3 foram submetidas à cultura bacteriológica. O T2 possibilitou aumento no isolamento de estafilococos coagulase-negativo (ECN) comparadas ao T1, não ocorrendo o mesmo com o T3. No entanto, o T2 permitiu o desenvolvimento de bactérias normalmente presentes na microbiota dos ductos dos tetos em ovelhas sadias, como o Bacillus spp. Os resultados do presente estudo indicam que a incubação pode ser aplicada para a detecção de ECN na tentativa de reduzir resultados falso-negativos na cultura bacteriológica do leite de ovelhas da raça Santa Inês, determinando o uso mais eficiente dos recursos laboratoriais e a redução dos custos para os proprietários.

Milk samples from 45 halves were collected from lactating ewes to evaluate the effect of freezing and incubation of the whole milk on the qualitative results of bacteriologic culture. Thus, these milk samples were submitted to the following treatments: standard culture technique (T1), incubation for 18h at 37°C (T2) and thawing at -20°C for 24h (T3). After these periods, the milk samples from T2 and T3 were submitted to standard culture technique. The T2 showed an increase in the proportion of coagulase-negative staphylococci (CNS) recovery compared to T1, although the same cannot be predicted by T3. Conversely, the T2 allows the growth of some bacteria present in clinically healthy teats ducts as Bacillus spp.. The results of the present study indicated that the incubation of the whole milk can be applied to detection of CNS in ewes' milk in attempt to reduce the false-negative culture milk samples that can lead to a more efficient use of laboratory resources and reduce costs to herd owners.

Resumo

Mastite, geralmente definida como a inflamação da glândula mamária, é a enfermidade de maior custo para a pecuária leiteira mundial. O maior obstáculo para reduzir da incidência da mastite, e consequentemente as implicações na produção e qualidade do leite, é a implementação de medidas efetivas no controle da mastite nas fazendas leiteiras, que depende principalmente da melhor compreensão da complexa interação patógeno-hospedeiro. A interação patógeno hospedeiro é uma importante e ampla área de pesquisa básica e clínica. Desta forma, o presente trabalho buscou elucidar alguns aspectos da interação patógeno-hospedeiro: 1) revisão sobre a importância dos receptores do tipo Toll na mastite bovina, especialmente considerando os patógenos: Escherichia coli e Staphylococcus aureus; 2) avaliação do diagnóstico da infecção intramamária pelo exame microbiológico do leite de amostras individuais por quarto, em duplicata por quarto e compostas e sua relação com a contagem de células somáticas; 3) avaliação por citometria de fluxo da interdependência dos quartos mamários pela função neutrofílica e perfil linfocítico; 4) estudo da função neutrofílica e perfil linfocítico em quartos mamários infectados por Streptococcus dysgalactiae; 5) determinação a capacidade de aderência e internalização em células epiteliais mamárias por S. aureus, S. fleurettii, e duas cepas de S. chromogenes; e 6) efeito da vacinação sobre a dinâmica da infecção intramamária por S. aureus e estafilococos coagulase-negativo

Mastitis, generally defined as the inflammation of the mammary gland, is the most costly of the infectious, endemic diseases to affect dairy cows and other dairy species. The greatest obstacle to reduce mastitis is the implementation of effective mastitis control measures in dairy farmers, which mainly depends on a better understanding of the complex interaction between an infecting pathogen and the host immune system. Host-pathogen interaction is a broad, important area of research encompassing both basic and clinical sciences. Thus, here it was addressed some aspects of the host-pathogen interactions, as follows: 1) Review of the role of pattern-recognition receptors in the innate immunity of bovine mastitis with focuses on the major mastitis pathogens: Escherichia coli and Staphylococcus aureus; 2) Determine a set of rules for classifying the infection status of an udder at quarter (single and duplicate milk samples) and cow (composite milk sample) levels and compare with distincts somatic cell count (SCC) thresholds (at quarter and cow levels); 3) Evaluation of the interdependence of the quarters by evaluating milk neutrophil function and milk lymphocyte profiles in uninfected quarters from infected and uninfected udders by flow cytometry analysis; 4) Function of milk neutrophils and the milk lymphocyte profile in Streptococcus dysgalactiae-infected mammary glands; 5) Capacity of S. aureus, S. fleurettii, and two dissimilar strains of S. chromogenes species to adhere and internalize into bovine mammary epithelial cells; 6) Efficacy of a commercial vaccine under field condition in two dairy herds with high bulk milk somatic cell count (SCC) and a high prevalence of IMIs by S. aureus.

Resumo

Objetivou-se determinar atividade antisséptica de um novo produto na presença de matéria orgânica, assim como avaliar a eficácia do produto experimental na redução da contagem de microrganismos presentes na pele de tetos de vacas leiteiras e ação sobre a qualidade sanitária e composição do leite das vacas. A composição química do óleo essencial de alecrim pimenta utilizado para o preparo do novo produto foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), sendo detectados 53 compostos, dos quais 16 foram identificados (>0,1% área total). O carvacrol (32,7%), p-cimeno (23%), timol metil éter, cariofileno (7,98%) e o -terpineno (5,40%) foram os componentes mais abundantes. A concentração inibitória mínima do óleo essencial para Staphylococcus aureus ATTCC 25923 e para Escherichia coli ATTCC 8739 foi de 60 µL/mL, enquanto que para Salmonella cholerasuis ATTCC 35640 esta foi de 90 µL/mL. Já o novo produto apresentou a concentração inibitória minina de 120 µL/mL para cepas S. aureus ATTCC 25923 e 60 µL/mL para E. coli ATTCC 8739 e S. cholerasuis ATCC 35640. A concentração bactericida mínima do óleo essencial e do novo produto foi de 120µL/mL para as três bactérias. Avaliou-se a atividade antisséptica do óleo essencial na concentração de 120µL/mL e do novo produto na presença de leite bovino sobre as mesmas cepas bacterianas. O óleo e o novo produto em estudo apresentaram efeito inibitório do crescimento das cepas em diferentes tempos de ação (p<0,05). S. aureus apresentou maiores índices de inibição após 5 min de contato e E. coli e S. cholerasuis após 15 min. A eficácia antisséptica do novo produto (192 tetos) foi comparado a produtos comerciais (192 tetos) no período de 42 dias de tratamento com realização de pré dipping e pós dipping. Foram utilizadas 16 vacas multíparas com 100 a 200 de lactação e livres de mastite clinica. Diariamente, os tetos foram acompanhados clinicamente e, semanalmente avaliou-se a microbiota presente na pele dos tetos quanto à redução na contagem de S. aureus, Estafilococos coagulase negativo (SCN), E. coli e aeróbios mesófilos, e realizou-se diagnóstico de mastite subclínica, pesagem e coleta de amostras de leite para avaliação da qualidade sanitária e bromatológica. Os dois tratamentos mantiveram a integridade da pele dos tetos, e ausência de mastite clinica durante o período experimental. Ao avaliar a contagem em Log.UFC.mL-1 dos microrganismos presentes na pele dos tetos, ambos tratamentos apresentaram efeito semelhante (p>0,05) na redução de SCN, E. coli e aeróbios mesofilos. A contagem de células somáticas, contagem bacteriana total do leite, assim como os teores de gordura, proteína e extrato seco desengordurado apresentaram-se dentro dos limites exigidos pela Instrução Normativa 62. Foi observada correlação positiva entre integridade dos tetos e a CCS, proteína e extrato seco desengordurado e a CCS foi negativa para lactose. O óleo essencial de alecrim-pimenta demonstrou ser um potencial antimicrobiano, mesmo na presença de matéria orgânica constituída de uma matriz nutricional complexa que é o leite bovino. O produto experimental apresentou eficácia semelhante aos produtos convencionais quanto à antissepsia dos tetos sem promover reações locais na pele, evitando a ocorrência de mastite clinica e não interferindo na qualidade do leite. O novo produto elaborado com óleo essencial de alecrim pimenta poderá vir a ser utilizado como produto alternativo no manejo de ordenha de vacas leiteiras.

This work aimed to determine the anti-septic activity of a new product in the presence of organic matter as well as to evaluate the efficiency of the experimental product in the reduction of the count of microorganisms on the skin of dairy cows udder and action on sanitary quality and cow milk composition. The essential oil chemical composition of rosemary pepper used to prepare the new product was determined by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and detected 53 compounds, of which 16 were identified (> 0.1% total area). The carvacrol (32.7%), p-cymene (23%), thymol methyl ether, caryophyllene (7.98%) and -terpinene (5.40%) were the most abundant components. The minimum inhibitory concentration of the essential oil for the Staphylococcus aureus ATTCC 25923 and Escherichia coli ATTCC 8739 was 60 uL / mL, whereas for Salmonella cholerasuis ATTCC 35640 was 90 uL / mL. Yet the new product presented a minimum inhibitory concentration of 120 uL / mL for S. aureus ATTCC 25923 strains and 60 uL / mL for E. coli ATTCC 8739 and S. Cholerasuis ATCC 35640. The minimum bactericidal concentration of the essential oil and the new product was 120L/ml for all the three bacteria. The antiseptic activity of the essential oil in the concentration of 120L/mL was evaluated and the new product in the presence of bovine milk on the same bacterial strains. The oil and the new product studied presented inhibitory effect in the strains growth in different action times (p<0.05). S. aureus presented higher inhibition rates after 5 minutes of contact and E. coli and S. Cholerasuis after 15 min. The antiseptic effectiveness of the new product (192 ubbers) was compared to commercial products (192 ubbers) within 42 days of treatment conducting pre and post dipping. Sixteen multiparous cows with 100-200 days of lactation and free of clinical mastitis were used. Daily, the udder was followed clinically and weekly evaluated concerning the microbiota present in the udder skin concerning the reduction in the count of S. aureus, coagulase negative staphylococci (CNS), E. coli and aerobic mesophilic; and diagnosis of subclinical mastitis has been performed, also weighing and collection of milk samples for the assessment of sanitary and bromatological quality. Both treatments maintained the integrity of the udder skin and absence of clinical mastitis during the experimental period. When assessing the count in Log.UFC.mL-1 of microorganisms on the teats skin, both treatments showed similar effects (p>0.05) in reducing SCN, E. coli and aerobic mesophilic. The somatic cell count, total bacterial count of the milk as well as fat, protein and fat dry extract were within the limits required by the Normative Instruction 62. There was a positive correlation between the integrity of the udder and the CCS, protein and nonfat dry extract and the CCS was negative for lactose. The essential oil of rosemary peppermint showed to have an antimicrobial potential even in the presence of organic matter made up of a complex nutritional matrix that is bovine milk. The experimental product had similar efficacy to conventional products as the udder antisepsis without promoting local skin reactions, preventing the occurrence of clinical mastitis and not interfering with the quality of milk. The new product made with essential oil of rosemary pepper is likely to be used as an alternative product in the management of dairy cows.

Resumo

The present study was carried out in 11 dairy herds in four municipal districts of the rural area of the State of Pernambuco, Brazil. Out of 984 quarter milk (246 cows), 10 (1.0%) were positive for clinical mastitis, 562 (57.1%) for subclinical mastitis and 412 (41.9%) were negative. A total of 81 Staphylococcus spp. isolates were obtained from milk samples from the cows diagnosed with subclinical mastitis. From these, 53 (65.0%) were S. aureus, 16 (20.0%) coagulase-positive staphylococci (CPS) and 12 (15.0%) coagulase-negative staphylococci (CNS). The isolates were further investigated for the presence of toxin genes by multiplex and uniplex PCR. The main gene observed was seg followed by seh, sei and sej. The distribution of these observed genes among the isolates obtained from different areas showed a regional pattern for the SEs. The presence of toxin genes in the strains isolated from bovine milk demonstrates a potential problem for public health.(AU)

O presente estudo foi realizado em 11 rebanhos leiteiros de quatro municípios da área rural do estado de Pernambuco, Brasil. Dos 984 quartos mamários examinados (246 vacas), 10 (1,0%) foram positivos para a mastite clínica, 562 (57,1%) para a mastite subclínica e 412 (41,9%) foram negativos para mastite. Foram isoladas 81 linhagens de Staphylococcus spp. do leite de vacas com mastite subclínica. Destes, 53 (65,0%) foram S. aureus, 16 (20,0%) estafilococos coagulase-positivo (SCP) e 12 (15,0%) estafilococos coagulase-negativo (SCN). O principal gene observado nos estafilococos foi o seg seguido pelo seh, sei e sej. Foi constatada distribuição regional dos genes dos estafilococos isolados dos animais nos municípios estudados. A presença dos genes das toxinas nas linhagens isoladas do leite de vacas representa risco potencial para a Saúde Pública.(AU)

Resumo

O diagnóstico rápido e eficiente da mastite subclínica é importante para reduzir a persistência da doença e os prejuízos decorrentes. O objetivo do estudo foi avaliar a técnica de espectrometria de massas (MS) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo-de-vôo (MALDI-TOF) para identificação de bactérias causadoras de mastite subclínica bovina por dois métodos: 1) a partir de bactérias isoladas por cultivo icrobiológico; 2) a partir da recuperação de bactérias diretamente do leite, visando eliminar completamente a necessidade de cultivo microbiológico para identificação dos patógenos. O estudo foi composto por dois experimentos (1 e 2), no experimento 1 foram utilizadas 33 amostras de leite provenientes de animais das raças Gir e Holandesa de quatro fazendas leiteiras para a identificação icrobiológica e MALDI-TOF MS. As amostras com resultados conflitantes foram confirmadas por sequenciamento do gene 16S rRNA. Os resultados de cultura microbiológica foram Staphylococcus aureus (n = 13), Streptococcus agalactiae (n = 10) e Estafilococos coagulase negativo (ECN) (n = 10). Para todas as amostras de Streptococcus agalactiae, resultados similares foram observados para a identificação microbiológica e por MALDI-TOF MS. De 13 isolados de Staphylococcus aureus, 11 foram igualmente identificados por MALDITOF, 1 isolado foi identificado como Staphylococcus haemolyticus por sequenciamento do gene 16S rRNA, e o outro isolado isolado com resultado conflitante foi caracterizado como cultura mista de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis. Em relação às amostras de ECN, todas as amostras do grupo foram identificadas por MALDI-TOF em nível de gênero (S. simulans, S. epidermidis, S. Haemolyticus, S. Chromogens e S. aureus coagulase negativa). No experimento 2 foi avaliado o método de recuperação de bactérias presentes em leite e sua identificação por MALDI-TOF MS utilizando o método de contaminação experimental de leite com Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus. A identificação de patógenos recuperados diretamente do leite foi possível quando a concentração de E. faecalis e S. aureus foi de 106 ufc/mL, e de 107 ufc/mL para E.coli. Concluímos que o uso de MALDI-TOF MS pode acelerar a identificação de patógenos causadores de mastite subclínica bovina podendo contribuir para a adoção de medidas de controle e tratamento mais adequado

Rapid and efficient diagnosis of subclinical mastitis is important to reduce the persistence of the disease and its losses. This study aimed to evaluate the technique of mass spectrometry (MS) and desorption ionization by matrix assisted laser time-offlight (MALDI-TOF) for identification of bacteria causing bovine subclinical mastitis by two methods: 1) from bacteria isolated by microbiological culture, 2) from bacteria recovered directly from milk, to eliminate completely the need for microbiological culture for identification of pathogens. The study consisted of two experiments (1 and 2).In experiment 1, 33 milk samples from Gir and Holstein animals collected in four dairy farms were used for microbiological identification and MALDI-TOF MS. The samples with different results were confirmed by sequencing the 16S rRNA. These samples were identified by microbiological culture as Staphylococcus aureus (n = 13), Streptococcus agalactiae (n = 10) and Staphylococcus coagulase negative (SCN) (n = 10). For all strains of Streptococcus agalactiae, similar results were observed for microbiological identification and MALDI-TOF MS. From 13 isolates of Staphylococcus aureus, 11 were also identified by MALDI-TOF, one isolate was identified as Staphylococcus haemolyticus by 16S rRNA sequencing , and the other discrepant sample was charactezided a mixed culture of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis. Regarding the SCN samples, all samples of this group were identified by MALDI-TOF at gender level (S. simulans, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. Chromogens and S. aureus coagulase negative). In experiment 2, we evaluated the method of recovery of bacteria present in milk and their identification by MALDI-TOF MS using experimental method of contamination of milk with Escherichia coli, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus. The identification of pathogens recovered directly from milk was possible when the concentration of E. faecalis and S. aureus was 106 ufc/mL and 107 ufc/mL for E.coli. We conclude that the use of MALDI-TOF MS can accelerate the identification of pathogens causing bovine subclinical mastitis may contribute to the adoption of control measures and appropriate treatment

Resumo

Milk samples from 45 halves were collected from lactating ewes to evaluate the effect of freezing and incubation of the whole milk on the qualitative results of bacteriologic culture. Thus, these milk samples were submitted to the following treatments: standard culture technique (T1), incubation for 18h at 37C (T2) and thawing at -20C for 24h (T3). After these periods, the milk samples from T2 and T3 were submitted to standard culture technique. The T2 showed an increase in the proportion of coagulase-negative staphylococci (CNS) recovery compared to T1, although the same cannot be predicted by T3. Conversely, the T2 allows the growth of some bacteria present in clinically healthy teats ducts as Bacillus spp.. The results of the present study indicated that the incubation of the whole milk can be applied to detection of CNS in ewes milk in attempt to reduce the false-negative culture milk samples that can lead to a more efficient use of laboratory resources and reduce costs to herd owners.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do congelamento e da incubação do leite de ovelhas da raça Santa Inês sobre os resultados da cultura bacteriológica. Desta forma, 45 amostras de leite ovino foram coletadas, e submetidas aos seguintes tratamentos: cultura bacteriológica (T1), e simultaneamente incubadas a 37C por 18 horas (T2) e congeladas a -20C por 24 horas (T3). Após esses períodos, as amostras dos T2 e T3 foram submetidas à cultura bacteriológica. O T2 possibilitou aumento no isolamento de estafilococos coagulase-negativo (ECN) comparadas ao T1, não ocorrendo o mesmo com o T3. No entanto, o T2 permitiu o desenvolvimento de bactérias normalmente presentes na microbiota dos ductos dos tetos em ovelhas sadias, como o Bacillus spp.. Os resultados do presente estudo indicam que a incubação pode ser aplicada para a detecção de ECN na tentativa de reduzir resultados falso-negativos na cultura bacteriológica do leite de ovelhas da raça Santa Inês, determinando o uso mais eficiente dos recursos laboratoriais e a redução dos custos para os proprietários.

Resumo

Foram realizadas caracterizações microbiológicas dos estafilococos coagulase-positivo - ECP (Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius e Staphylococcus hyicus), a pesquisa de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli pela multiplex-PCR, California Mastitis Test (CMT), a contagem de células somáticas (CCS) automática pelo Somacount 300® calibrado para o leite bovino e CCS microscópica padronizada por Prescott e Breed (1910) em amostras de leite de 257 cabras, 513 metades mamárias e 10 tanques de expansão, além da aplicação de questionário epidemiológico nas 10 propriedades estudadas do estado de São Paulo. A prevalência de mastite subclínica em nível de cabra pela lactocultura foi de 43,6% e de mastite clínica 5,84%. Das 178 metades mamárias positivas na lactocultura, os patógenos mais prevalentes foram: Estafilococos coagulase-negativo - ECN (70%), S. aureus (13,5%), S. intermedius (7,9%) e Enterobacteriaceae (4%). Nenhuma das amostras mostrou-se negativa ao CMT, sendo a distribuição dos escores nas metades mamárias: 1+ (42,69%), 2+ (29,63%) e 3+ (27,68%). As prevalências dos patógenos na multiplex-PCR das metades mamárias foram: S. aureus (9,7%), S. agalactiae (5,5%) e E. coli (16,6%) e nos tanques de expansão: S. aureus (60%), S. agalactiae (10%) e E. coli (40%). Os resultados encontrados indicam que o CMT apresenta baixa sensibilidade e especificidade nos escores 2+ e 3+ para o diagnóstico de mastite subclínica. O Somacount 300® calibrado para o leite bovino superestima em 2,1 vezes a CCS microscópica, sendo que ambas não apresentaram nenhum ponto de corte eficiente para maximização simultânea da sensibilidade e especificidade. A multiplex-PCR apresenta boa acurácia para detecção de S. areus, S. agalactiae e E. coli no leite caprino mastítico Houve algumas diferenças estatísticas significantes nas análises univariadas dos fatores de risco para mastite

Microbiological characterizations of the coagulase-positive staphylococci - CPS (Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius and Staphylococcus hyicus), the research of Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli by multiplex-PCR, California Mastits Test (CMT), the automatic somatic cell count (SCC) by Somacount 300® equipment calibrated for bovine milk and the microscopic SCC standardized by Prescott and Breed (1910) in milk samples from 257 goats, 513 half-udders and 10 bulk tanks were carried out beyond the application of the epidemiological questionnaire in 10 properties studied of São Paulo State. The prevalence of subclinical and clinical mastitis by microbiological culture was 43.6% and 5.84% respectively. 178 half-udders were positive by microbiological culture, and coagulase-negative staphylococci - CNS (70%), S. aureus (13.5%), S. intermedius (7.9%) e Enterobacteriaceae (4%) were the most prevalent pathogens. No sample was negative to CMT. The distribution of scores CMT in half-udders were: 1+ (42.69%), 2+ (29.63%) and 3+ (27.68%). The prevalence of pathogens in multiplex-PCR in half-udders were: S. aureus (9.7%), S. agalactiae (5.5%) and E. coli (16.6%) and in bulk tanks: S. aureus (60%), S. agalactiae (10%) and E. coli (40%). The results indicate that the CMT scores 2+ and 3+ showed low sensitivity and specificity for the diagnosis of subclinical mastitis. The Somacount 300® calibrated to bovine milk overestimated the microscopic SCC in 2.1 fold, being that both showed no efficient cut-off point for simultaneous maximization of the sensitivity and the specificity. The multiplex-PCR presented good accuracy for the detection of S. aureus, S. agalactiae and E. coli in the mastitic caprine milk. There were some significant differences in the univariate analysis of risk factors for subclinical mastitis, however, when the analysis was adjusted for property, the

Resumo

pt