Função luteal e hipoluteoidismo em cadelas / Función lútea y hipoluteismo en perras / Luteal function and hypoluteoidism in dogs

O controle da função luteal é realizado por um balanço de fatores luteotróficos e luteolíticos, e nenhuma luteolisina de origem uterina está envolvida na regulação do corpo lúteo cíclico canino. Todavia, ao final da gestação, um pico de PGFM reflete a síntese e secreção de PGF2α envolvida na luteólise pré-parto. Em cadelas, a prolactina e o LH, mas também a PGE2, P4 e E2, e possivelmente citocinas e fatores de crescimento agem como fatores autócrinos e parácrinos para regular a função luteal. O hipoluteoidismo é definido como uma diminuição precoce da secreção de progesterona, com concentração insuficiente para a manutenção da gestação, causando perdas gestacionais. Entretanto, o valor de corte da concentração de progesterona para o diagnóstico ainda é controverso. A suplementação exógena com progestágenos é eficaz em manter a gestação, mas nas fases iniciais da gestação pode causar efeitos teratogênicos nos fetos.(AU)

El control de la función lútea se lleva a cabo por un equilibrio de factores luteotróficos y luteolíticos, y ninguna luteolisina de origen uterino está involucrada en la regulación del cuerpo lúteo cíclico canino. Sin embargo, al final del embarazo, un pico de PGFM refleja la síntesis y secreción de PGF2α involucrada en la luteólisis anteparto. En las perras, la prolactina y la LH, pero también la relaxina, PGE2, la P4 y la E2, y posiblemente citoquinas y factores de crecimiento, actúan como factores autocrinos y paracrinos para regular la función lútea. El hipoluteismo se define como una disminución precoz de la secreción de progesterona, con una concentración insuficiente para el mantenimiento del embarazo, provocando pérdidas gestacionales. Sin embargo, el valor de corte de la concentración de progesterona para el diagnóstico sigue siendo controvertido. La suplementación exógena con progestágenos es eficaz para mantener el embarazo, pero puede causar efectos teratogénicos en los fetos.(AU)

Structural plasticity and isolation of umbilical cord progenitor cells of agouti (Dasyprocta prymnolopha) raised in captivity / Plasticidade estrutural e isolamento de células progenitoras do cordão umbilical de cutias (Dasyprocta prymnolopha) criadas em cativeiro

The agouti has been used as an experimental model in several studies focused on reproductive biology. The umbilical cord, an embryonic attachment that connects the foetus to the placenta, has been reported as an important anatomical site for obtaining stem cells. The objective of this study was to describe macro- and microscopically the umbilical cord of agoutis at different stages of gestation, to expand and cultivate in vitro the progenitor cells and to report their morphological characteristics. Seven cutias were submitted to caesarean section to collect the umbilical cords: five were destined for studies of cord structure in different stages of gestation (30, 35, 50, 75 and 100 days postcoital), and two were collected in the third stage of gestation for isolation and cell culture. The umbilical cord of cutias assumes a spiral arrangement, with veins and arteries on it starting 50 days after coitus. The arteries present an outer layer of smooth muscle fibres in a longitudinal and circular arrangement and a medium layer of smooth muscle fibres with only longitudinal and intimate orientation and coated by the endothelium. The veins consist of longitudinal smooth muscle fibres with an extract of smooth muscle cells, and the endothelium, in all analysed gestational phases, is a structure bounded by simple pavement epithelial tissue originating from the amnion, adhered to Whartons Jelly and forming the umbilical vessels and allantoid duct. The proposed protocol allowed the collection of a high cellular concentration of umbilical cord progenitor cells from viable cutias.(AU)

A cutia vem sendo utilizada como modelo experimental em diversos estudos voltados à biologia reprodutiva. O cordão umbilical, anexo embrionário que une o feto à placenta, tem sido relatado como um importante sítio anatômico para obtenção de células-tronco. O objetivo deste estudo foi descrever macro e microscopicamente o cordão umbilical de cutias, em fases diferentes da gestação, expandir e cultivar in vitro as células progenitoras e relatar suas características morfológicas. Foram utilizadas sete cutias submetidas à cesariana para a coleta dos cordões umbilicais, cinco foram destinadas aos estudos da estrutura do cordão, em diferentes estágios de gestação (30, 35, 50, 75 e 100 dias pós-coito), e duas, no terço final da gestação, para isolamento e cultivo celular. O cordão umbilical de cutia assume disposição espiralada, com veias e artérias sobre ele a partir dos 50 dias após o coito. As artérias apresentam camada externa de fibras musculares lisas, disposição longitudinal e circular, camada média de fibras musculares lisas, apenas com disposição longitudinal e íntima revestida pelo endotélio. As veias constituídas por fibras musculares lisas longitudinais com um extrato de células musculares lisas e pelo endotélio. Em todas as fases gestacionais analisadas é uma estrutura delimitada por tecido epitelial simples pavimentoso, proveniente do âmnio, aderido a Geleia de Wharton e com formação de vasos umbilicais e ducto alantóide. O protocolo proposto permitiu a coleta de células progenitoras do cordão umbilical de cutias, viáveis com elevada concentração celular.(AU)

Avaliação ultrassonográfica e radiográfica das serpentes ilhoas ex-situ: aspectos clínicos e reprodutivos

As serpentes ilhoas Bothrops insularis e B. alcatraz são animais ameaçados de extinção encontrados apenas na Ilha da Queimada Grande e na Ilha de Alcatraz, respectivamente (litoral de São Paulo, Brasil). São serpentes peçonhentas da família Viperidae. As fêmeas são maiores que os machos. Elas são vivíparas, ou seja, todo o desenvolvimento embrionário ocorre dentro do oviduto. Há pouca informação sobre essas serpentes devido à dificuldade de localização e deslocamento para pesquisas científicas in situ. Dessa forma, os parâmetros biológicos clínicos normais dessas espécies são escassos. Como o exame físico para o diagnóstico clínico em répteis é limitado, o uso de métodos diagnósticos como a ultrassonografia e a radiografia permite uma avaliação precisa do tamanho, localização anatômica e padrões de normalidade de todos os órgãos em um determinado momento. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar aspectos clínicos e reprodutivos das serpentes Bothrops insularis e B. alcatraz por meio de ultrassonografia e radiografia. Entre 2014 e 2020, avaliamos 58 serpentes (46 B. insularis e 12 B. alcatraz) pertencentes ao Laboratório de Ecologia e Evolução do Instituto Butantan. Para o exame ultrassonográfico, as serpentes foram contidas em um tubo de acrílico e o transdutor foi posicionado no dorso (nos lados direito e esquerdo) e no ventre do animal. Para o exame radiográfico, as serpentes foram colocadas dentro de um tubo de acrílico e posicionadas sobre o chassi em posição látero-lateral e ventro-dorsal. Os animais foram avaliados ultrassonograficamente em cada estação do ano e radiograficamente uma única vez. Nas avaliações ultrassonográficas das fêmeas, diferenciamos as serpentes sexualmente maduras das imaturas, identificamos as fases foliculares (pré- vitelogênese e vitelogênese), caracterizamos três fases gestacionais e identificamos a contração da musculatura da junção útero-vaginal. Nos machos, caracterizamos os testículos e os hemipênis. Além disso, identificamos alterações no fígado no período gestacional e alterações nos órgãos das serpentes doentes. Na radiografia, observamos os folículos vitelogênicos no ovário, o final da gestação, os ovos atrésicos, o fígado, o crânio, as caudas (nas duas espécies) e avaliamos toda a coluna vertebral e suas alterações patológicas. Avaliamos também os hemipênis dos machos de ambas as espécies e os hemiclitóris das fêmeas de B. insularis. Também foi possível avaliar todo o processo reprodutivo nas duas espécies, determinando as épocas de vitelogênese, embriogênese, nascimentos e a duração da gestação. Nos machos, pudemos descrever as mudanças sazonais no tamanho dos testículos. Nossos resultados indicam que as duas espécies têm ciclo bienal, que B. insularis se acasala no fim do verão e no outono, com gestação de oito-nove meses, e que B. alcatraz se acasala no fim do outono e inverno, com gestação de sete-oito meses. Concluímos que a ultrassonografia e a radiografia foram eficazes na avaliação dos órgãos propostos e na caracterização dos padrões reprodutivos e das alterações patológicas que causam óbitos no plantel de serpentes.

The island snakes Bothrops insularis and B. alcatraz are endangered animals found only on the Queimada Grande Island and the Alcatraz Island, respectively (coast of São Paulo, Brazil. They are venomous snakes of the family Viperidae. Females are larger than males. They are viviparous, that is, embryonic development occurs entirely within the oviduct. There is little information about these snakes due to the difficulty in locating them and logistics for scientific research in situ. The normal clinical biological parameters of these species are scarce. As the physical examination for clinical diagnosis in reptiles is limited, the use of diagnostic methods such as ultrasound and radiography allow an accurate assessment of the size, anatomical location, and normal patterns of all organs at any given time. Therefore, this work aimed to evaluate the clinical and reproductive aspects of the snakes B. insularis and B. alcatraz using ultrasound and radiography. Between 2014 and 2020, we evaluated 58 snakes (46 B. insularis and 12 B. alcatraz) belonging to the Laboratory of Ecology and Evolution of the Butantan Institute. For ultrasound examination, snakes were restrained in an acrylic tube and the transducer was placed dorsally (on the right and left side) and ventrally. For the radiographic examination, snakes were placed inside an acrylic tube and positioned on the chassis in a laterolateral and ventrodorsal position. The animals were assessed ultrasonographically in each season and radiographically once. In the ultrasound evaluations of females, we distinguished between sexually mature and immature snakes, identified the follicular phases (pre-vitellogenesis and vitellogenesis), characterized three gestational phases, and identified the coiling of the utero-vaginal junction. In males, we characterized the testes and the hemipenis. Moreover, we identified changes in the liver during pregnancy and changes in the organs of sick snakes. On the radiograph, we observed the vitellogenic follicles in the ovaries, late pregnancy, atretic eggs, liver, skull, tails (in both species), and assessed the entire vertebral column and its pathological changes. We also evaluated the male hemipenis of both species and the female hemiclitoris of B. insularis. It was also possible to evaluate the entire reproductive process in both species, determining the timing of vitellogenesis, embryogenesis, birth, and gestation time. In males, we described seasonal changes in testis size. Our results indicate that the two species have a biennial cycle, B. insularis mates in late summer and autumn, gestation lasts eight-nine months, and that B. alcatraz mates in late autumn and winter and gestation lasts seven-eight months. We conclude that ultrasound and radiography were effective in evaluating the examined organs and in characterizing reproductive patterns and pathological changes that cause deaths in captive snakes.

Imunofenotipagem dos linfócitos positivos para indoleamina 2, 3 dioxigenase (IDO) em cultura de células de placenta bovina / Phenotyping of the indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) positive lymphocytes in bovine placental cell culture

A gestação é um estado fisiológico que exige adaptações imunológicas para que transcorra normalmente. Nesse período a mãe e o feto apresentam uma relação imunológica, ou seja, a interface materno fetal. A enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO) desempenha um papel importante na tolerância materno fetal, por ser responsável pela metabolização do triptofano, impedindo por diversas vias a proliferação principalmente de linfócitos TCD8. Diversos tipos celulares estão presentes na interface materno fetal e vários deles podem expressar a IDO. Os leucócitos com perfil Th1 produzem uma citocina conhecida: o interferon γ que estimula a expressão da IDO em vários tipos celulares. Os linfócitos são divididos em subpopulações de acordo com sua função e fenótipo. Seus tipos incluem linfócitos T, linfócitos B e as células natural killer (NK). Hormônios também atuam nesse processo a progesterona que exerce função determinante sobre a resposta imunológica materna podendo alterar o prognóstico gestacional e o estrógeno essencial para a tolerância materno fetal e manutenção da prenhez. Dessa maneira este trabalho tem por objetivo principal identificar os linfócitos presentes na placenta bovina em cultivo que expressam IDO (linfócitos T, linfócitos B e células NK), frente a estimulação por progesterona, estrógeno e interferon γ nas diversas fases gestacionais utilizando a citometria de fluxo. Segundo os resultados no período de 67,5 a 77, 5 dias com a adição de interferon γ a expressão da enzima IDO aumentou discretamente nos linfócitos TCD3, TCD4, e diferente dos linfócitos T CD8 apresentaram uma elevada expressão da enzima (4,48 ± 2,12 - 8,65± 4,91). No período de 92,5 a 172, 5 dias os linfócitos TCD4, TCD8 e TCD25 apresentaram uma diminuição da IDO. No período final de 195 a 222,5 dias, os linfócitos TCD3, TCD4 e os BCD25 aumentaram a expressão da IDO quando submetidos ao interferon γ, no entanto, os linfócitos T CD8 e as células NK não apresentaram alterações [...](AU)

Pregnancy is a physiological state that requires immune adaptation in order to be successfully carried on. During this period, mother and fetus establish an immune tolerance status at the maternal fetal interface. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) plays an important role in maternal-fetal tolerance by metabolizing tryptophan, impairs by several pathways, mainly T CD8 cells proliferation. Several cell types are present in the maternal fetal interface and several of them can express IDO. Leucocytes with Th1 produce a cytokine known as interferon γ that stimulates the expression of IDO in several cell types. Lymphocytes are divided into sub-populations according to their function and phenotype: T lymphocytes, B lymphocytes and natural killer cells (NK). Hormones also involved in this process where progesterone exerts decisive role on maternal immune response that may change gestational outcome and estrogen is essential for fetal maternal tolerance and maintenance of pregnancy. Therefore, the main objective of this study was to identify lymphocytes in the bovine placental cell culture that are sensitive to progesterone, estrogen and interferon γ, IDO expression in various gestational stages using flow cytometry. According to the results in the gestational period from 67.5 to 77.5 days with the addition of interferon γ expression IDO was slightly increased in TCD3 lymphocytes, CD4, and differently from the other T cells CD8 displayed an higher expression of the enzyme (4.48±2.12 to 8.65±4.91). In the period from 92.5 to 172. 5 days the CD4 lymphocytes, CD8 and TCD25 showed a significant decrease of IDO expression (p<0.05). At the final stages between 195 and 222, 5 days TCD3 lymphocytes, CD4 and BCD25 increased expression when subjected to interferon γ supplementation; however, CD8 T cells and NK cells showed no significant changes [...](AU)

Produção de IL-6 e IL-1 em cultivos ex vivo de endométrio bovino inoculados com Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno

Leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira spp. Existem relatos de isolamento desta bactéria no trato genital de fêmeas, relacionado à abortamento e infertilidade no rebanho bovino. Já se sabe que a Leptospira presente nos órgãos reprodutivos de bovinos causa danos teciduais principalmente pela vasculite. Além disso, a leptospirose aguda produz níveis altos de citocinas durante a fase inicial de infecção. Entretanto, faltam estudos sobre a patogênese desse microrganismo no endométrio de vacas. Objetivou-se avaliar o perfil das citocinas inflamatórias após o desafio com Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno e ao LPS de Escherichia coli produzidas pelo tecido uterino ex vivo coletados de vacas não gestantes e gestantes reativas sorologicamente ou não ao Teste de soroaglutinação microscópica (MAT). Foram utilizados 43 úteros com respectivas amostras de sangue coletadas de vacas mestiças, sendo 19 delas não gestantes (19/43) e 24 gestantes (24/43), todas sem evidência de doença clínica. Para determinação da fase gestacional foi realizada através das medidas dos fetos. Para análise de uma prévia infecção foram avaliados anticorpos antiLeptospira,por meio do teste de aglutinação microscópica (MAT). Após a exposição do endométrio,com auxílio de um punch de 8 mm foram retirados fragmentos de endométrio (explantes)foram retirados nas regiões intercarunculares. O processamento dos explantes endometriais ocorreu em placas de cultura celular de 24 poços. As soluções adicionadas sobre os explantes foram as seguintes: a) meio controle, contendo 2 mL de solução de RPMI; b) meio RPMI, contendo 1g/mL de LPS de Escherichia coli; c) meio EMJH com inóculo de Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno na concentração de 108 leptospiras por mL. Em seguida,as placas foram incubadas em estufa a 37ºC com 5% de CO2 permanecendo por 24 horas. Após esse período, os tecidos endometriais foram pesados e os sobrenadantes foram recolhidos e subsequentemente testados para determinação dos perfis de produção das interleucinas 1 e 6 pelo Kits de ELISA. Em relação ao desafio com 1g/mL de LPS, tanto explantes das vacas não gestantes como gestantes montaram uma resposta frente ao desafio, com aumento significativo da produção de IL-6 e IL-1 em relação aos controles. No desafio com Leptospira, os explantes de vacas não gestantes e gestantes, houve aumento na concentração de IL-1. Entretanto, somente explantes das vacas não gestantes houve aumento de IL-6 em relação aos controles. Na avaliação individual das fases de gestação, somente na fase inicial (primeiro trimestre) ocorreu produção de IL-6 significativa, diferente do observado com IL-1, sendo que ocorreu diferença significativa na produção desta citocina na fase final de gestação, no desafio com 1g/mL de LPS de E.coli. Já no desafio com Leptospira não houve diferença significativa entre as fases gestacionais. Conclui-se que ocorre maior estimulação da produção de citocinas do endometrio de vacas reagentes, nos desafios ao LPS e à Leptospira; menor estimulação da produção de IL-6 ao desafio com Leptospira em vacas gestantes; e maior estimulação na fase inicial e final de gestação no desafio com LPS de E.coli e nenhuma diferença significativa entre as fases gestacionais no desafio com Leptospira.

Leptospirosis is a zoonosis caused by a bacteria belonging to genus Leptospira spp. There are reports of this bacteria isolation in the female reproductive tract with are related to abortion and subfertility in bovine herds. It is known that Leptospira presence in reproductive organs of bovines promotes tissue damages especially by vasculitis. Moreover, acute leptospirosis produces high levels of cytokines during the onset of infection. However, few studies were performed about the pathogenesis of this microorganism in the endometrium of cows. The objective of this study was to evaluate the inflammatory cytokines profile after Leptospira interrogans serovars Hardjoprajitno and LPS of Escherichia coli challenges produced by uterine tissue ex vivo of non-pregnant and pregnant cows serologically reactive or not to Microscopic Agglutination Test (MAT). A total of 43 uterus with respective blood samples were collected from crossbred cows, from those 19 were non-pregnant and 24 pregnant, without any clinical disease evidence. To determine the pregnancy phase, the measurement of fetuses were performed. To analyze previous infection occurrence antibodies against Leptospira were evaluated by MAT. After endometrium exposure, fragments of endometrium tissue (explants) were collected using a punch of 8 mm in intercaruncular region. The processing of endometrial explants were done in a 24-well cell culture plates. The solutions added on explants were: a) Control medium (2 mL of RPMI solution); b) RPMI medium (1g/mL of LPS from Escherichia coli); c) EMJH medium with inoculum of Leptospira interrogans serovars Hardjoprajitno (108 leptospires/mL). The plates were incubated at 37°C with 5% of CO2 for 24 hours. After this period, uterine explants were weighed and collected and subsequently tested for interleukins (IL-1 and IL-6) production profile by ELISA kits. Considering the challenge with 1g/mL of LPS, both pregnant and non-pregnant cows build a response due to challenge with a significant increase in IL-1 and IL-6 production compared to control group. Considering the challenge with Leptospira, an increase of IL-6 concentration was verified in the explants of both pregnant and non-pregnant cows related to control. However, only the explants from non-pregnant cows showed an increase of IL-6 production related to control. In the individual evaluation of pregnancy phases, during the initial phase (first trimester) only occurred significant IL-6 production, differing from IL-1 which significant production increase occurred during late gestation phase in the challenge with 1g/mL of LPS from E.coli. There was no difference in cytokines production according to pregnancy phase after challenge with Leptospira. In conclusion, a higher stimulation of cytokines production was verified in endometrial tissues of reagent cows after LPS and Leptospira challenges; lower stimulation of IL-6 production in pregnant cows after Leptospira challenge; a higher stimulation during initial and late pregnancy phases after LPS from E.coli challenge, and no significant difference between pregnancy phases after Leptospira challenge.

Accuracy of abdominal radiography to determine fetus numbers in bitches at two gestational ages / Acurácia da radiografia abdominal na determinação do número de fetos de cadelas em duas idades gestacionais

Abdominal radiography is considered the most accurate technique for determining fetal numbers. Nevertheless, there is a disagreement in the literature concerning the optimal time to perform the examination to obtain the most accurate fetal count. The objective of this study was to compare the accuracy of fetal counting in bitches at two gestational stages, using digital radiographs, and to analyze the possible complicating factors. Fifty-eight abdominal radiographs of 38 bitches at two gestational stages were analyzed by two observers. The first stage (Group I) included bitches between 45 and 48 days of gestation, and the second (Group II) bitches between 54 and 57 days of gestation. The Kappa index of agreement for categorical data indicated agreement between observers. Agreement was lower for Group I than for Group II. The estimated value of Pearsons coefficient for Group I was positive but weak for correlation between observers 1 and 2 and the number of puppies born. There was significant correlation between counts and the number of puppies born in Group II. We conclude that radiographic examination is not an accurate method of determining fetal number between 45 and 48 days of gestation and that the optimal time to perform this examination is between 54 and 57 days of gestation, at which time the fetal skull is fully visible on radiographs.(AU)

A radiografia de abdome é considerada a técnica mais precisa para a contagem do número de fetos. No entanto, há discordância na literatura sobre o momento ideal para realizar o exame para obter a contagem fetal mais precisa. Os objetivos deste estudo foram comparar, em dois períodos de gestação, a precisão da contagem fetal em cadelas a partir de radiografias digitais e analisar os possíveis fatores complicadores. Foram realizadas 58 radiografias abdominais de 38 cadelas analisadas por dois observadores em duas fases da gestação. A primeira fase (Grupo I) incluiu cadelas entre 45 e 48 dias de gestação, e a segunda (Grupo II) cadelas entre 54 e 57 dias de gestação. O índice de concordância Kappa para dados categóricos indicaram concordância entre os observadores. Não obstante, o acordo entre os observadores foi menor no Grupo I do que no Grupo II. O valor estimado do coeficiente de Pearson para o Grupo I foi fraco e positivo para a correlação entre o observador 1 e 2 e o número de filhotes nascidos. No Grupo II, houve correlação significativa entre a contagem e o número de filhotes nascidos. Conclui-se que o exame radiográfico não é um método acurado para a determinação do número de fetos entre 45 e 48 dias de gestação e que o tempo ideal para realizar o exame é entre 54 e 57 dias de gestação, momento em que o crânio do feto é totalmente visível na radiografia.(AU)

Manejo alimentar de fêmeas suínas no período gestacional e pré-inseminação-impactos produtivos e reprodutivos

RESUMO O aumento na quantidade de ração na fase inicial de gestação, na fase final de gestação (bump feeding) e pré-inseminação (flushing) é um manejo tradicional utilizado com diferentes propósitos nas granjas. Os benefícios produtivos com o seu uso em fêmeas contemporâneas, sob condições comerciais, são controversos e por vezes escassos. Entretanto, todos possuem impacto econômico considerável. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar o impacto de diferentes manejos alimentares aplicados durante a fase gestacional e a eficiência do flushing pré-inseminação sobre o desempenho reprodutivo de leitoas. O primeiro estudo avaliou, em um modelo dose-resposta, o efeito do bump feeding sobre o peso ao nascimento (PN) e desempenho reprodutivo. Para isso, 977 leitoas foram alimentadas com 1,8, 2,3, 2,8 ou 3,3 kg/d a partir do dia 90 de gestação até o parto. O PN tendeu a aumentar quadraticamente (P=0,083), enquanto a produção de colostro e o consumo de ração das fêmeas durante a lactação reduziram linearmente (P0,016), à medida que a quantidade de ração fornecida foi aumentada. O desempenho reprodutivo subsequente não diferiu entre os tratamentos (P>0,135). Seguindo na tentativa de melhorar o PN, foi realizado um segundo estudo, onde foram avaliados os efeitos de duas quantidades de ração (1,8 ou 3,5 kg/d) ofertadas em duas fases gestacionais (fase 1 dia 22 até o dia 42; fase 2 dia 90 até o dia 110). Não foram encontradas diferenças no peso dos leitões ao nascimento (P0,153). No entanto, leitoas alimentadas com 3,5 kg/d na fase final de gestação apresentaram menor percentual de leitões com <1000g (P=0,031), e não foram encontrados efeitos dos tratamentos na eficiência placentária (P=0,320). O terceiro estudo avaliou os efeitos de diferentes quantidades de ração (1,8, 2,5 ou 3,2 kg/d) ofertadas na fase inicial de gestação (dia 6 até o dia 30) sobre o desempenho ao parto de primíparas (OP1) e secundíparas (OP2). O desempenho ao parto também foi avaliado de acordo com as reservas corporais das fêmeas ao desmame. A taxa de parto tendeu a ser afetada linearmente com o aumento na quantidade de ração em fêmeas OP1 (P=0,085). Leitões nascidos totais foram afetados quadraticamente em fêmeas OP1 (P=0,049), enquanto que para fêmeas OP2 houve uma tendência de redução linear com o aumento na quantidade de ração ofertada (P=0,082). Os leitões nascidos totais e a taxa de parto para ambas OP não foram afetados pela interação entre a classe de reserva corporal ao desmame e o tratamento aplicado (P>0,103). O quarto estudo verificou o efeito do flushing no período pré-inseminação sobre o desempenho reprodutivo de leitoas. Foram avaliados os efeitos de duas quantidades de ração (2,1 ou 3,6 kg/d) ofertadas durante dois ciclos estrais (ciclo1 entre o 1º e 2º estro, ciclo 2 entre o 2º e 3º estro). No 2º estro, leitoas alimentadas com 3,6 kg/d durante o ciclo 1 apresentaram 1,9 folículo a mais que fêmeas alimentadas com 2,1 kg/d (P=0,032). Já o número de ovulações no 3º estro foi influenciado pela quantidade de ração fornecida em ambos os ciclos (P<0,009). A sobrevivência embrionária foi afetada negativamente nas fêmeas que consumiram 3,6 kg/d no 2º ciclo (P=0,026), enquanto o número de embriões totais e viáveis foi influenciado apenas pela quantidade de ração consumida no 1º ciclo após a puberdade (P0,001).

ABSTRACT Increasing the feed amount earlier in gestation, late in gestation (bump feeding) and before breeding (flushing) is a strategy used with different purposes in breeding farms. The productive profits of using these strategies in modern females under commercial conditions are controversial and sometimes scarce, even though all of them have a considerable economic impact. Thus, the objectives of the present study were to evaluate the impact of different feeding strategies performed during the gestational phase and the efficiency of the flush feeding strategy before breeding on reproductive performance of gilts. The first study evaluated, in a dose-response model, the effect of bump feeding strategy on the piglets birth weight (PBW) and reproductive performance. A total of 977 gilts were fed 1.8, 2.3, 2.8, and 3.3 kg/d from day 90 of gestation until farrowing. The PBW tended to increase quadratically (P=0.083), whereas the colostrum yield and the voluntary feed intake during lactation reduced linearly (P0.016) as the feed amount offered during late gestation increased. Subsequent reproductive performance did not differ among treatments (P>0.135). Following the attempt to improve PBW, a second study was performed to evaluate the effects of two feed amounts (1.8 or 3.5 kg/d) offered during two gestational phases (phase 1 day 22 to 42; phase 2 day 90 to 110). No differences among treatments were observed on PBW (P0.153), although, gilts fed 3.5 kg/d in phase 2 had fewer piglets with <1000g (P=0.031). No differences were observed on the placental efficiency among treatments (P=0.320). The third study evaluated the effects of three different feed amounts (1.8, 2.5 and 3.2 kg/d) offered earlier in gestation (day 6 to day 30) on farrowing performance of parity 1 (PO1) and 2 (PO2) sows. The performance at farrowing was also evaluated according to the body reserves at the previous weaning. Farrowing rate tended to be affected by the increase in feed amount provided in PO1 females (P=0.085). Litter size was affected quadratically in PO1 females (P=0.049), whereas, in PO2, it tended to reduce linearly, as the feed amount was increased (P=0.082). The litter size and the farrowing rate were not affected by the interaction between the class of body reserve at weaning and feed amount provided (P>0.103). The fourth study verified the effects of the flush feeding strategy before breeding on reproductive performance of gilts. The effects of two feed amounts (2.1 or 3.6 kg/d) offered during two estrous cycles (cycle 1 between 1st and 2nd estrous; cycle 2 between 2nd and 3rd estrous) were evaluated. Gilts fed 3.6 kg/d during cycle 1 had 1.9 more follicles at 2nd estrous than gilts fed 2.1 kg/d (P=0.032). The ovulation rate at 3rd estrous was influenced by the feed amount provided in both estrous cycles (P<0.009). Embryo survival was negatively affected when gilts were fed 3.6 kg/d during cycle 2 (P=0.026), whereas the number of total embryos and vital embryos was affected only by the feed amount provided during cycle 1 (P0.001).

Influência do estresse térmico na produção de interferon tau e no estresse oxidativo de embriões bovinos produzidos in vitro

Perdas gestacionais acontecem nos diferentes estágios da gestação por uma variedade de causas, contudo ocorrem com maior frequência nos primeiros 30 dias. Este decréscimo se torna mais grave quando os animais estão sob condições ambientais desfavoráveis. Fatores como a hipertermia podem reduzir as taxas de concepção em torno de 20-30%, quando compararmos aos meses em que o animal se encontra em condições de conforto térmico. Portanto, o estresse térmico é um problema encontrado no manejo de vacas leiteiras nos trópicos e subtrópicos, causando reduções na produção e reprodução. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do estresse térmico no desenvolvimento embrionário, produção de interferon tau (IFNT) e estresse oxidativo em embriões produzidos in vitro (PIV). Para avaliar a influência do estresse térmico sobre a produção in vitro de embriões bovinos, foi proposto um modelo in vitro de estresse térmico. Esse modelo consiste em alterar a temperatura em fases distintas da PIV de embriões. Para induzir o estresse térmico, a temperatura foi gradualmente aumentada de 38,5ºC até chegar aos 40,5ºC, onde permaneceu por 6 horas. Após, a temperatura foi diminuída de forma gradativa, até retornar à 38,5ºC. Os grupos experimentais foram divididos em cinco: controle; oócitos submetidos ao estresse térmico durante a maturação in vitro (IVM HS); oócitos submetidos ao estresse térmico durante a fertilização in vitro (IVF HS); zigotos submetidos ao estresse térmico durante o primeiro dia de cultivo in vitro (IVC HS); e embriões submetidos ao estresse térmico durante os três primeiros dias de produção in vitro (IVM+IVF+IVC HS). Todos os grupos submetidos ao estresse térmico tiveram diminuição nas taxas de clivagem e blastocisto, diminuição da expressão gênica e proteica de IFNT e aumento do estresse oxidativo. O número de células por blastocisto, número de células do trofoblasto e expressão de genes de sobrevivência celular AKT e XIAP não tiveram diferença entre os grupos. Quanto aos genes de estresse celular, apenas a HSP70 teve diferença entre os grupos, mostrando-se aumentada em todos os grupos submetidos ao estresse térmico. Apesar do estresse térmico ser amplamente estudado como fator limitante na reprodução em função da diminuição de níveis hormonais, qualidade de gametas e viabilidade embrionária, foi demonstrado pela primeira vez a diminuição da produção de IFNT em embriões submetidos ao estresse térmico nos primeiros dias de desenvolvimento.

Pregnancy losses occur at different stages caused by several conditions, however it occurs more frequently in the first 30 days. This decrease becomes more severe when animals are under unfavorable environmental conditions. Factors such as hyperthermia can reduce conception rates around 20-30% when compared to months where animals are under thermal comfort conditions. Therefore, heat stress (HS) is a problem found in the management of dairy cows in the tropics and subtropics, causing production and reproduction losses. The aim of the present study was to evaluate the influence of HS on development, interferon tau production (IFNT) and oxidative stress of bovine embryos produced in vitro. To evaluate the influence of HS on the in vitro production of bovine embryos, an in vitro model of HS was proposed. This model consists of altering the temperature in some specific stages of the embryo production. To induce HS, the temperature was gradually increased from 38.5°C to 40.5°C, where remained for 6 hours. Then, the temperature was gradually decreased until it returned to 38.5°C. The experimental groups were: control; oocytes submitted to HS during in vitro maturation (IVM HS); oocytes submitted to HS during in vitro fertilization (IVF HS); zygotes submitted to HS during the first day of in vitro culture (IVC HS); and embryos submitted to HS during the first three days of in vitro production (IVM + IVF + IVC HS). All groups submitted to HS had cleavage and blastocyst rates decreased, gene and protein expression of IFNT diminished and oxidative stress increased. The number of embryonic cells per blastocyst, number of trophoblastic cells and cell survival genes expression did not differ among groups. Regarding to cellular stress genes, only HSP70 had a difference among groups, showing an increase in all groups submitted to HS. Although HS is widely studied as a limiting factor in reproduction due to the decrease of hormone levels, gametes quality and embryonic viability, it was demonstrated for the first time the decrease in the production of IFNT in embryos submitted to HS in the early days of development.

Comparação da composição bioquímica do líquido amniótico equino colhido em diferentes estágios gestacionais e no momento do parto / Comparison of the biochemical composition of equine amniotic fluid collected in different gestational phases and at delivery

A viabilidade e maturidade fetais podem ser estimadas através da avaliação dos fluídos fetais em muitas espécies, no entanto a composição bioquímica do líquido amniótico durante a gestação ainda não está bem definida para a espécie equina. O objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar o perfil bioquímico do liquido amniótico em diferentes momentos da gestação e no momento do parto para um melhor entendimento da fisiologia da gestação de equinos. Foram avaliados valores encontrados para pH, osmolaridade, glicose, uréia, creatinina, gamma-GT, sódio, potássio, cloretos e proteína total no liquido amniótico colhido de 122 éguas comparando-se os resultados encontrados entre as colheitas em terço inicial (TI), médio (TM) e final (TF) da gestação e no momento do parto (MP). [...] Valores para gamma GT diferiram apenas entre os grupos TF e MP e mais estudos devem ser conduzidos sobre sua função no liquido amniótico das espécies domésticas. Os valores de sódio e cloretos não diferiram significativamente entre os grupos estudados e as concentrações de potássio diferiram apenas entre os grupos TF e MP refletindo a manutenção do equilíbrio eletrolítico do líquido amniótico equino durante a gestação. As concentrações de proteínas totais variaram de maneira heterogênea entre os grupos, porém todos estes demonstraram baixas concentrações. Concluímos que a composição bioquímica do liquido amniótico equino varia de acordo com o desenvolvimento fetal e pode ser utilizada como mensuração da viabilidade e maturidade do feto no futuro, no entanto devido ao pequeno número de estudos conduzidos e diferenças encontradas em seus resultados, outros estudos devem ser realizados para a melhor definição do perfil bioquímico do líquido amniótico equino durante as fases gestacionais e no momento do parto.(AU)

The viability and fetal maturity can be estimated by biochemical evaluation of the fetal fluids of several species; however the biochemical composition of amniotic fluid during pregnancy is not fully defined for equine. The aim of this study was to establish and compare the biochemical profile of amniotic fluid in different moments of pregnancy and at delivery, in order to better explain the peculiarities of the physiology of pregnancy in mares. The values founded for pH, osmolarity, glucose, urea, creatinine, gamma-GT, Sodium, potassium, chloride and total protein were evaluated in amniotic fluid collected from 122 mares comparing the results between the initial-third (IT), mid-third (MT) and latter-third (FT) of gestation and at delivery (D). [...] Concentrations of urea tended to be statistically different in at least one of the groups. A significant increase in creatinine concentrations was observed during the initial-third, medium-third and the final-third of pregnancy and the value found at delivery remained equal to final-third. Values for Gamma GT differed only between FT and D groups and more studies should be conducted about its role in the amniotic fluid of domestic species. For the sodium and chloride ions, they were not significantly different between the studied stages, and the potassium ion was significantly different only between FT and D reflecting the maintenance of electrolyte balance of the amniotic fluid during equine pregnancy. Total protein concentrations were different between groups, but all the groups showed low concentrations. We conclude that the values of the parameters studied varied according with the fetal development and can be used for the evaluation of fetal viability and maturity in the future, but the scarce number of studies in this area and the difference between the results found in literature demonstrate the need of more works to establish the biochemical profile of equine amniotic fluid during pregnancy and at delivery.(AU)

Quantificação dos líquidos fetais, placentônios e peso do útero em vacas aneloradas ao longo da gestação / Quantification of fetal fluid, placentomes and uterine weight in zebu cows throughout gestation

Samples of pregnant uterus of 71 zebu cows were collected in a slaughterhouse. The fetuses were divided into three gestational stages: initial stage until 90 days (T1), an intermediate stage from 91 to 180 days (T2) and the fi nal stage after 181 days (T3) and the descriptive statistical analysis of the data was used SPSS Statistics 17.0. The volumes of the fetal fl uids have increased during the pregnancy, with T1 and T3 the volume of allantoic liquid was higher, was not the case in T2. Every stage of pregnancy was increased by an average of 20 placentomes and 1318.5g in weight of the uterus and pregnancy presented with greater frequency in the right horn.

Foram coletadas em frigoríficos 71 amostras de úteros gravídicos de vacas aneloradas. Os fetos foram distribuídos em três fases gestacionais: fase inicial até 90 dias (T1), fase intermediária de 91 a 180 dias (T2) e a fase final após 181 dias (T3) e para a análise estatística descritiva dos dados foi utilizado o programa SPSS Statistics 17.0. Os volumes dos líquidos fetais aumentaram no decorrer da gestação, sendo que em T1 e T3 o volume do líquido alantóide foi maior, não ocorrendo o mesmo em T2. A cada terço gestacional houve um aumento, em média, de 20 placentônios e de 1318,5 g no peso do útero e a gestação apresentou-se com maior frequência no corno direito.

Quantificação dos líquidos fetais, placentônios e peso do útero em vacas aneloradas ao longo da gestação / Quantification of fetal fluid, placentomes and uterine weight in zebu cows throughout gestation

Samples of pregnant uterus of 71 zebu cows were collected in a slaughterhouse. The fetuses were divided into three gestational stages: initial stage until 90 days (T1), an intermediate stage from 91 to 180 days (T2) and the fi nal stage after 181 days (T3) and the descriptive statistical analysis of the data was used SPSS Statistics 17.0. The volumes of the fetal fl uids have increased during the pregnancy, with T1 and T3 the volume of allantoic liquid was higher, was not the case in T2. Every stage of pregnancy was increased by an average of 20 placentomes and 1318.5g in weight of the uterus and pregnancy presented with greater frequency in the right horn. (AU)

Foram coletadas em frigoríficos 71 amostras de úteros gravídicos de vacas aneloradas. Os fetos foram distribuídos em três fases gestacionais: fase inicial até 90 dias (T1), fase intermediária de 91 a 180 dias (T2) e a fase final após 181 dias (T3) e para a análise estatística descritiva dos dados foi utilizado o programa SPSS Statistics 17.0. Os volumes dos líquidos fetais aumentaram no decorrer da gestação, sendo que em T1 e T3 o volume do líquido alantóide foi maior, não ocorrendo o mesmo em T2. A cada terço gestacional houve um aumento, em média, de 20 placentônios e de 1318,5 g no peso do útero e a gestação apresentou-se com maior frequência no corno direito.(AU)

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais / Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from different gestacional ages

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.(AU)

The interest in stem cells derived from fetal annexes of many species has exponentially increased during the last decades, because they are adult stem cell sources with potential of differentiation in several cell lineages; which present little or no immunogenicity and are an alternative with great importance for storage cell banks. Despite the rising interest, studies for the equine species are still rare. The aim of this study was to isolate, characterize and differentiate mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from initial, middle and late third of gestation (AF-MSCs), and compare their results. Twenty three samples from equine amniotic fluid were evaluated by morphological, immunocytochemical and immunophenotypical (Flow cytometer) assays and osteogenic, adipogenic and chondrogenic in vitro differentiation. All samples demonstrated plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The immunocytochemical assay demonstrated cells from all the studied groups were positive for CD44, PCNA and vimentin and negative for cytokeratin and Oct-4. Flow cytometry demonstrated expression of CD44 and CD90 and no expression of CD34, where CD44 and CD90 markers presented decreasing pattern of expression in relation to the gestational development. All samples collected from all gestational phases were capable to differentiate in osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages. Thus, cells obtained from equine amniotic fluid presented morphological and immunophenotypical characteristics and potential of differentiation typical of MSCs showing that the collection can be performed at any stage of pregnancy. However, more studies should be performed about the expression of pluripotent markers as Oct-4 and the differentiation potential for extra mesodermal lineages prior demonstrated in the literature.(AU)

Células-tronco localizadas na cinta placentária de carnívoros domésticos (Canis familiaris e Felis domesticus)

As células-tronco podem ser isoladas tanto de tecidos embrionários quanto de tecidos provenientes de um organismo adulto. Este projeto teve por objetivo caracterizar, descrever as células derivadas da região uterina e da cinta placentária - junção materno/fetal da placenta de carnívoros domésticos (cães e gatos), e verificar a sua capacidade de pluripotência. Os úteros gestantes e não gestantes foram obtidos em campanhas de castrações e de controle populacional de cães e gatos, na cidade de Pirassununga/SP. Foram coletados 24 úteros gravídicos de animais hígidos, em diferentes idades gestacionais. O material foi dividido em três fases distintas da gestação, ou seja inicio que compreende de 8 a 20 dias de gestação; meio de 21 a 30 dias de gestação e final de 31 a 60 dias de gestação. O material foi coletado de fêmeas caninas e felinas, quatro úteros de cada fase, totalizando 12 úteros de cães e 12 de felinos. Coletamos também 8 úteros de fêmeas nulíparas (4 de cadelas e 4 de gatas) e 8 úteros com um mês pós parto (4 de cadelas e 4 de gatas). As amostras foram fixadas em paraformoldeido tamponado a 4% para a análise histológica e de imunohistoquimica. Para a padronização da imunohistoquimica inúmeros testes de marcação e diluição dos anticorpos utilizados nesta pesquisa foram realizados, todo protocolo aqui descrito foi padronizado pela primeira vez. Nas análises de imunohistoquimica avaliamos a expressão de marcadores associados a células-tronco pluripotentes Nanog, Oct4 e Sox2. Nas cadelas, as marcações foram positivas em todas as fases, gestacionais e não gestacionais. A detecção dessas proteínas nesta espécie ficaram padronizadas, destacando algumas diferenças quantitativas durante alguns períodos da gestação. Foi observado que o Oct4 na cadela, mostra uma diferença significativa (p=0,0064), entre as fases de início e meio da gestação e entra o início e a fase de termo. Quando comparados os resultados das análises imunohistoquimicas utilizando os três anticorpos entre si, nos três períodos gestacionais ficou evidente uma diferença (p=0,0005) somente relativa a proteína Nanog com Oct4. Nas gatas apenas foi possível padronizar o protocolo do Nanog e do Sox2, sendo a marcação feita com Oct4 negativa. Nesta espécie foi possível observar uma diferença da proteína Nanog (p=0,0006) quando comparada na fase inicial para a fase do meio e início da gestação para a fase termo. No que se refere as fêmeas nulíparas e fêmeas pós-parto destaca-se a ausência de diferenças quando comparados os anticorpos na fase pós parto tanto em cadelas quanto em gatas. Na fase nulípara foram observadas diferenças somente na cadela (p=0,0018) para os três anticorpos. Desta forma, a caracterização de células de origem placentária com característica de células-tronco pode abrir um leque de possibilidades para obtenção destas células de forma mais ética, uma vez que este material é descartado na castrações. Foi possível a identificação das células que expressão proteinas pluripotentes em diferentes idades gestacionais, tanto na região de cinta placentária como no útero. Apesar de semelhantes, as espécies aqui estudadas apresentaram diferenças na realização do protocolo da imunihistoquímica.Pesquisas relacionadas com as células-tronco do endométrio vêm crescendo, principalmente porque estas células podem ser facilmente obtidas, a partir de fontes descartadas, sem entraves éticos. Desta forma tem o potencial de serem uma nova fonte para o desenvolvimento na terapêutica como terapia celular.

The stem cells can be isolated both embryonic tissues as much tissues from an adult organism. This project had from objective characterize and describe cells derived from uterine region and placental girdle - maternal junction / fetal placenta of domestics carnivores (dogs and cats), and check their capacity of pluripotency. The uterus pregnant and non-pregnants were obtained in castrations campaigns and population control of dogs and cats in the city of Pirassununga/SP. Were collected 24 uterus gravidic of healthy animals at different gestational ages. The material was split into three separate stages of pregnancy,that is, the Startconsist of 8 to 20 days of gestation;between21-30 days of gestation and end 31-60 days of gestation. The material was colleted from canine and feline females, four uterus each phase 12 uterus of dogs and 12 uterus of cats. We also collect 8 nulliparous female uterus (4 of dogs and 4 of cats) and 8 uterus with a postpartum month (4 of dogs and 4 of cats). The samples were fixed in paraformoldeido at 4% for histological analysis and immunohistochemical. For the standardization of immunohistochemical, were made numerous tests of marking and dilution of antibodies all the protocol described here has been standardized for the first time. In immunohistochemical analysis, we evaluated the expression of markers associated with pluripotent stem cells Nanog, Oct4 and Sox2. In cats, it was only possible to standardize the protocol of the Nanog and of the Sox2, and marking made with negative Oct4. This species was possible was possible to observe a difference in the Nanog protein (p = 0.0006) compared with the initial phase to the medium and early pregnancy to the term phase. As regards the nulliparous females and postpartum females there is the absence of differences when compared to the antibodies in postpartum stage, both in dogs and in cats. In nulliparous phase differences were only observed in dogs (p = 0.0018) for the three antibodies. Thus, the characterization of placental origin cells with stem cell characteristic can open up a range of possibilities for obtaining such cells more ethical, since this material is discarded in castration. The identification of pluripotent cells expressing proteins at different gestational ages was possible in both placental belt region as in utero. Although similar, the species studied here showed differences in the realization of immunohistochemical protocol. Searches related to the endometrial stem cells are growing, mainly because these cells can be easily obtained from sources discarded without ethical barriers. This way has the potential to be a new source for development in the therapeutic cell therapy.

Expressão de genes relacionados ao desenvolvimento, alongamento e apoptose celular em conceptos de porcas da raça Piau e de linhagem comercial

Objetivou-se neste estudo, avaliar os aspectos moleculares de conceptos de porcas gestantes da raça local Piau e linhagem Comercial, além de sua relação com o aproveitamento e perdas durante o período pré-natal. Os genes alvos foram: HHIP, SHH, IHH (desenvolvimento via hedgehog), WNT1, WNT4 (desenvolvimento), FGF4, SOX2 (alongamento), BAX, BCL2 (apoptose). Foram utilizadas 30 marrãs (15 de raça Piau e 15 de linhagem Comercial). Foi utilizado um delineamento inteiramente casualisado em esquema fatorial 2x5 (2 grupos genéticos x 5 idades) com três repetições, sendo 15, 30, 45, 60 e 90 dias, as idades gestacionais estudadas. A expressão gênica foi avaliada mediante a técnica de RT-PCR quantitativa. As análises estatísticas de expressão gênica foram realizadas no software SAS® 9.3 por meio da macro QPCR_MIXED. Os genes relacionados ao desenvolvimento dos conceptos suíno via hedgehog, HHIP, SHH e IHH, são mais expressos no terço médio e final da gestação em marrãs da raça Piau e de linhagem comercial. Além disso, há interação genótipo e idade gestacional na expressão desses genes. Relacionados também ao desenvolvimento, porém, pela via WNT, os genes WNT1 e WNT4 são expressos mais precocemente e com maiores valores no primeiro terço gestacional, principalmente em marrãs da raça Piau. Do mesmo modo, a expressão dos genes FGF4 e SOX2, envolvidos no alongamento dos conceptos, ocorre mais precocemente em marrãs da raça Piau. A expressão dos genes pré e pós-apoptótico, BAX e BCL2, respectivamente, apresentam variação entre as fases gestacionais, havendo maior expressão na fase inicial da gestação. Contudo não há interação da expressão desses genes com o genótipo dos animais. Em geral, o estudo das interações genótipo e idade gestacional auxiliam no entendimento dos eventos fisiológicos que ocorrem durante o desenvolvimento dos conceptos suíno.

In this study we have evaluated the molecular aspects of fetuses from local Piau breed and commercial lineage sows and its relation to the gain and loss during the prenatal period. The target genes were: HHIP, SHH, IHH (development throught hedgehog pathway), WNT1, WNT4 (development), FGF4, SOX2 (elongation), BAX, BCL2 (apoptosis). Were used 30 gilts (15 Local Piau breed and 15 commercial line). We have used completely randomized design in a factorial 2x5 scheme (2 genetic groups x 5 ages) 15, 30, 45, 60 and 90 days of gestational ages with three replications. Gene expression was assessed by quantitative RT-PCR. The statistical analysis of gene expression were performed in SAS® software 9.3 by QPCR_MIXED macro. The genes related to the development of pig fetuses hedgehog pathway HHIP, SHH and IHH are more expressed in the middle third and final of pregnancy in local Piau breed and Commercial line gilts. Furthermore, there were interaction beetwen genotype and gestational age on the expression of these genes. Also related to the development. However, on WNT pathway, the WNT1 and WNT4 genes are expressed earlier and with higher values in the first third of pregnancy, especially in gilts of local Piau Breed. Similarly, expression of SOX2 and FGF4 genes related to elongation of the conceptus have occured earlier in the local Piau breed sows. The expression of the genes BCL2 and BAX pre and post-apoptotic, respectively, have showed variation between the gestational stages with higher expression in early phase of gestation. However there is no interaction of the expression of these genes with the genotype of the animals. In general, the study of interactions between genetype and gestational age help us to clarify the physiological events that occur during the development of pig fetuses.

APOPTOSE EM PLACENTÔNIOS BOVINOS DE GESTAÇÕES DE CONCEPTOS NATURAIS E DE TRANSGÊNICOS CLONADOS

A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição entre os tecidos maternos e fetais, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre a mãe e o feto e pela síntese de hormônios fundamentais para a manutenção da gestação. Para o crescimento placentário e a nutrição fetal é necessário um delicado equilíbrio entre proliferação e morte das células placentárias. Essas células possuem propriedades específicas em relação a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas sendo fundamentais para o desenvolvimento adequado do concepto ao longo da prenhez e seu nascimento. Gestações de animais clonados frequentemente apresentam anormalidades como hidroâmnio, hidroalantoide, edema placentário, retenção de placenta e abortos. Neste estudo, foi avaliada a ocorrência de apoptose (morte celular) em placentônios provenientes de conceptos bovinos transgênicos clonados (n=5) e de gestações naturais (n=18), nos períodos de 60 e 90 dias de gestação, que tiveram seu desenvolvimento interrompido para remoção do útero gestante. As amostras de placentônio foram segmentadas e fixadas em solução aquosa de paraformoldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M e pH 7.4, para verificação da morfologia pela coloração HE e realização da técnica de imunoistoquímica. Os resultados obtidos foram comparados entre bovinos clonados transgênicos e de gestações naturais. Todos os grupos e idades gestacionais analisados apresentaram a mesma composição celular com epitélio uterino simples cúbico onde nota-se a presença de células trofoblásticas gigantes mononucleadas e células trofoblásticas gigantes binucleadas migradas do epitélio fetal, estroma endometrial bem desenvolvido, epitélio trofoblástico com células cuboides típicas de epitélio e quantidade acentuada de células trofoblásticas gigantes e gigantes binucleadas migrando para o epitélio materno e mesênquima. Em todos os grupos e períodos gestacionais, o epitélio materno apresentou maior marcação positiva para apoptose. Aos 60 dias a marcação positiva no epitélio uterino das gestações manipuladas foi menos evidente em relação às de gestações naturais, assim como aos 90 dias, que apresentou maior imunorreatividade em comparação aos 60 dias e dos animais de gestação natural sobre os manipulados. Na ultima idade gestacional foi possível observar reação em padrão de fileiras no epitélio uterino e para ambos os grupos não foram encontradas marcações nos tecidos fetais. Neste estudo foi demonstrado desequilíbrio nos padrões de apoptose nos conceptos bovinos clonados transgênicos, pois no início da gestação (60 dias) apresentaram menor atividade apoptóticas e aos 90 dias um aumento, podendo ser este fato um dos fatores que levam às anormalidades placentárias. Desse modo os resultados da verificação da apoptose, nas fases de gestação estudadas, e seu entendimento são importantes para a compreensão de possíveis falhas no desenvolvimento gestacional em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a produção de animais transgênicos e clonados.

The placenta in mammals is a transitional organ formed by the justaposition between maternal and fetal tissues, it is responsible for physiological exchanges between mother and fetus and the synthesis of hormones essential for maintaining gestation. For the fetal placental growth and nutrition are requires a delicate balance between proliferation and death cells of the placenta. These cells have specific properties in relation to its metabolic functions, endocrine and angiogenic and it is critical to the proper development of the fetus throughout pregnancy and birth. Cloned animals often have abnormal pregnancies as hidroamnion, hidroalantois, placental edema, retained placenta and abortion. In this study, placentomes the occurrence of apoptosis (death cells) was avaluate from fetuses cloned transgenic cattle (n = 5) and natural pregnancies (n = 18) in periods of 60 and 90 days of gestation that had their intermited development to remove the pregnant uterus. Placentome samples were segmented and fixed in aqueous 4% paraformaldehyde in sodium phosphate buffer (PBS) pH 7.4 and 0.1M, to check the morphology of HE staining and the immunohistochemistry. The results were compared between transgenic cloned cattle and natural gestations. In all groups and gestational ages analyzed showed the same cellular composition with simple cubic uterine epithelium, it is noted the presence of trophoblast giant cells mononuclear and giant trophoblast cells binucleated migrated from fetal epithelium, endometrial stroma well developed, trophoblastic epithelium with typical cuboid cell epithelium and severe amount of giants and giant binucleated trophoblastic cells migrating into maternal epithelium and mesenchyme. All groups and gestational periods, maternal epithelium showed higher positive staining for apoptosis. At 60 days the positive staining in the uterine epithelium is less evident manipulated pregnancies in relation to natural pregnancies as well as at 90 days, with the highest immunoreactivity when it is compared to 60 days and in the animals of natural pregnancy in ratio to manipulated animals. In the last gestational age was observed in response pattern rows in the uterine epithelium and both groups fetal side tags were not found either in or on the epithelium and mesenchyme. This study demonstrated an imbalance in apoptosis patterns in transgenic cloned cattle fetuses as early in pregnancy (60 days) showed less apoptotic activity and an increase at 90 days and may be this fact one of the factors leading to placental abnormalities. Thereby the results of the verification of apoptosis at the stages of pregnancy studied and comprehension are important for the understanding of possible failure in gestational development in advanced embryonic manipulation techniques, such as the production of transgenic and cloned animals.

Influência da Gestação, Parto e Puerpério nos Parâmetros Hematológicos e Metabólicos de Vacas da Raça Nelore

Objetivou-se com a realização deste experimento avaliar a influência da gestação, parto e do puerpério sobre os parâmetros hematológicos e na bioquímica sérica de vacas Nelore. O experimento foi conduzido, na Fazenda Escola, localizada no Município de Alvorada do Gurguéia-PI e no Laboratório de Patologia Clínica Veterinária do Hospital Veterinário (HVU-CPCE), pertencentes ao Campus Professora Cinobelina Elvas da Universidade Federal do Piauí.Foram utilizadas 15 fêmeas pluríparas da raça Nelore com idade média de 4,0±1 anos, com peso vivo de 400±50 kg e escore de condição corporal (ECC) 7,0± 1 inseminadas artificialmente, permanecendo durante a fase experimental em piquetes com pasto formado por Braquiáriabrizanthacvs. Marandu e Xaraés e de Panincummaximum cv. Mombaça, os animais foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado e os tratamentos consistiram nos períodos fisiológicos (não prenhe, terço inicial, terço médio, terço final, parto, 24 horas após o parto e os 2 meses do puerpério). Na avaliação dos parâmetros hematológicos, foi realizado o eritrograma consistindo da contagem total de hemácias, hematócrito, dosagem de hemoglobina e os índices hematimétricos absolutos, já no leucograma realizou-se a contagem total de leucócitos, acompanhadas das contagens diferenciais de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos. Onde no eritrograma a contagem total de hemácias foi crescente durante os períodos antecedentes ao parto (9,11x 106/uL) e no dia pós parto (9,21x 106/uL). O hematócrito foi crescente nos períodos anteriores ao parto reduzindo no pós-parto, elevando-se no puerpério, a hemoglobina no terço final da gestação apresentou (14,43 g/dL), com relação ao volume corpuscular médio (VCM) e a Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) os maiores índices foram encontrados no terço final da gestação (43,67 fL) e no parto (43,68 %) respectivamente. Quanto à avaliação da bioquímica sérica foram dosadas as concentrações séricas dos constituintes do metabolismo mineral, energético-proteico e enzimático.As concentrações séricas de cálcio foram menores no início da gestação (9,45 mg/dL), enquanto o fósforo sérico apresentou a maior concentração no parto (7,43 mg/dL). No perfil enzimático, a fosfatase alcalina apresentou as maiores atividades séricas no Parto e 01 dia após o parto (364,34 e 365,98 UI/L) respectivamente, já aspartato amino transferase (AST), evidenciou-se os maiores valores nas fases não prenhe, gestação e parto.No perfil proteico, a ureia sérica sofreu influencia (P <0,0001) da gestação e do puerpério, apresentando os maiores valores no parto (51,30 mg/dL) e 24 horas do pós parto (47,05 mg/dL). Em relação aos metabólitos energéticos, os triglicerídeos (P <0,0001), glicose (P <0,0001) e betahidroxibutirato (P <0,0001) foram influenciadas pelos estágios gestacionais reduzindo no terço final e no parto (15,98 e 16,11 mg/dL) respectivamente para os triglicerídeos, já a glicose sérica reduziu no terço final (49,44 mg/dL),elevando-se no puerpério(58,10 mg/dL), o betahidroxibutirato apresentou concentrações constantes até o terço médio da gestação, elevando-se no final do período gestacional (0,3760 mmol/L). Portanto, os parâmetros hematológicos e metabólicos sérico de vacas Nelore demonstraram sofrer variações quanto aos períodos fisiológicos, intensificando-as principalmente no terço final da gestação e início da lactação, que representam a etapas onde se tem as maiores sobrecargas do metabolismo.

The objective of this experiment was to evaluate the influence of gestation, delivery and puerperium on The hematological parameters and in the serum biochemistry of Nellore cows. The experiment was conducted at the Fazenda School, located in the Municipality of Alvorada of Gurguéia-PI and in the Laboratory of Veterinary Clinical Veterinary Hospital (HVU-CPCE), belonging to the Campus Professor Cinobelina Elvas of the Federal University Nellore pluriparous females with a mean age of 4.0 ± 1 years were used, with live weight Of 400 ± 50 kg and body condition score (ECC) 7.0 ± 1 artificially inseminated, remaining during The experimental stage in paddocks with pasture formed by Braquiáriabrizanthacvs. Marandu and Xaraés and Panincummaximum cv. Mombasa, the animals were distributed in a completely randomized design And treatments consisted of physiological periods (not pregnant, initial third, middle third, final third, childbirth, 24 hours postpartum and 2 months postpartum). In the evaluation of the hematological parameters, the Red blood cell count, hematocrit, hemoglobin Absolute leukocyte counts, the total leukocyte count was Differential counts of neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes and monocytes. Where in the erythrogram Total erythrocyte count was increasing during periods prior to childbirth (9.11 x 106 / uL) and on day Postpartum (9.21x106 l). The hematocrit was increasing in the periods prior to childbirth, reducing postpartum, Elevated in the puerperium, hemoglobin in the final third of gestation presented (14.43 g / dL), in relation to Mean corpuscular volume (MCV) and the highest mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) Indices were found in the final third of gestation (43.67 fL) and in delivery (43.68%), respectively. How Serum concentrations of the constituents of metabolism Mineral, energetic-protein and enzymatic. Serum calcium concentrations were lower at the beginning of the Gestation (9.45 mg / dL), while serum phosphorus had the highest concentration at delivery (7.43 mg / dL). No Enzymatic profile, alkaline phosphatase presented the highest serum activity in Childbirth and 01 day postpartum (364.34 and 365.98 IU / L), respectively, aspartate amino transferase (AST), the highest values Values in the non-pregnancy, gestation and delivery phases.In the protein profile, serum urea was influenced (P <0.0001) Gestation and puerperium, presenting the highest values at delivery (51.30 mg / dL) and 24 hours postpartum (47.05 mg / dL). In relation to energetic metabolites, triglycerides (P <0.0001), glucose (P <0.0001) and Beta-hydroxybutyrate (P <0.0001) were influenced by the gestational stages reducing in the final third and (15.98 and 16.11 mg / dL) respectively for triglycerides, whereas serum glucose reduced in the final third (49.44 mg / dL), rising in the puerperium (58.10 mg / dL), betahydroxybutyrate presented concentrations Up to the middle third of gestation, rising at the end of the gestational period (0.3760 mmol / L). Therefore, serum hematological and metabolic parameters of Nelore cows were For the physiological periods, intensifying them mainly in the final third of the gestation and beginning of the lactation, Which represent the stages where one has the greatest metabolic overloads.

ERROS NO DIAGNÓSTICO POR IMAGEM EM MEDICINA VETERINÁRIA .

As armadilhas e as causas de possíveis erros de uma técnica imaginológica devem ser conhecidas e salientadas. Poucos artigos citam as reais armadilhas e os possíveis erros na radiologia e na ultrassonografia abominal em cães e gatos. Acredita-se que as causas de erros devem ser expostas, para permitir um continuo aprendizado, assim os erros de diagnóstico podem ser reduzidos se forem conhecidos e salientados, evitando danos futuros aos pacientes. A presente tese de doutorado está dividida em três capítulos. O primeiro capítulo é um estudo interobservador que definiu os tipos de erros mais comuns na interpretação de 45 exames radiográficos abdominais de cães e gatos. Evidenciou-se que os radiologistas veterinários em treinamento tem maiores erros de percepção e que radiologistas treinados tem mais erros cognitivos de superinterpretação da imagem. Concluiu-se que os erros na radiologia abdominal veterinária são inevitáveis e vão continuar acontecendo independente do treinamento e/ou experiência do observador. O segundo capítulo trata-se de um artigo publicado no periódico Semina: Ciências Agrárias que discute sobre o exame radiográfico abdominal para a contagem de fetos. Neste capítulo comparou-se por meio de dois períodos gestacionais, a precisão da contagem fetal em cadelas a partir de radiografias digitais e analisou-se os possíveis fatores complicadores. Foram realizadas 58 radiografias abdominais analisadas por dois observadores experientes em duas fases da gestação, demonstrando que pode ocorrer até 30% de erro na contagem de fetos caninos. O terceiro capítulo refere-se a um artigo publicado no periódico Small Animal Practice que discute se há ou não necessidade da realização do jejum antes da realização do exame ultrassonográfico, pois a literatura cita que a presença de gás no trato gastrointestinal nos animais sem jejum pode interferir no diagnóstico ocasionando erros de diagnóstico. Neste capítulo comprova-se que o jejum em cães antes da ultrassonografia abdominal de rotina não é essencial, não devendo ser a ausência de jejum o fator limitante que poderiam gerar os erros de diagnóstico ultrassonográficos e sim a associação de diferentes fatores.

The pitfalls and possible causes of errors in imaging technique must be known and highlighted, and a few articles mention the real pitfalls and possible errors of radiology and abdominal ultrasonography in dogs or cats. It is believed that the causes of errors must be exposed, f allows a continuous learning. Diagnostic errors can be reduced if these are known and highlighted, thereby reducing future harm to patients. The present doctoral dissertation is divided into three chapters. The first chapter is an interobserver study defined the most common types of errors in the interpretation of 45 abdominal radiographs in dogs and cats. It became clear that the veterinary radiologists in training have the biggest mistakes of perception and trained radiologists have more cognitive errors superinterpretation. We conclude that the errors in veterinary abdominal radiology are inevitable and will keep going regardless of training and / or experience of the observer. The second chapter is an article published in the journal Semina: Agricultural Sciences discussing about abdominal radiographic examination for fetuses count. In this chapter we compared by two periods of gestation, fetal count accuracy in bitches from digital radiographs and analyzed to the potential complicating factors. It was performed 58 abdominal radiographs by two experienced observers in two stages of pregnancy, demonstrating that can occur up to 30% error in canine fetuses count. The third chapter deals with an article published in the journal Small Animal Practice discussing whether there is need to conduct fasting before performing the ultrasound examination, as there is literature mentions that when it is not the examination fasting there is a lot of gas in the gastrointestinal tract and that interference may impair diagnosis leading to misdiagnosis. This chapter shows that the fasted dogs prior to routine abdominal ultrasound is not essential. No fasting for abdominal ultrasonography exam is not the only influence that could cause diagnostic errors, but the combination of different factors. Keywords: The pitfalls and possible causes of errors in imaging technique must be known and highlighted, and a few articles mention the real pitfalls and possible errors of radiology and abdominal ultrasonography in dogs or cats. It is believed that the causes of errors must be exposed, f allows a continuous learning. Diagnostic errors can be reduced if these are known and highlighted, thereby reducing future harm to patients. The present doctoral dissertation is divided into three chapters. The first chapter is an interobserver study defined the most common types of errors in the interpretation of 45 abdominal radiographs in dogs and cats. It became clear that the veterinary radiologists in training have the biggest mistakes of perception and trained radiologists have more cognitive errors superinterpretation. We conclude that the errors in veterinary abdominal radiology are inevitable and will keep going regardless of training and / or experience of the observer. The second chapter is an article published in the journal Semina: Agricultural Sciences discussing about abdominal radiographic examination for fetuses count. In this chapter we compared by two periods of gestation, fetal count accuracy in bitches from digital radiographs and analyzed to the potential complicating factors. It was performed 58 abdominal radiographs by two experienced observers in two stages of pregnancy, demonstrating that can occur up to 30% error in canine fetuses count. The third chapter deals with an article published in the journal Small Animal Practice discussing whether there is need to conduct fasting before performing the ultrasound examination, as there is literature mentions that when it is not the examination fasting there is a lot of gas in the gastrointestinal tract and that interference may impair diagnosis leading to misdiagnosis. This chapter shows that the fasted dogs prior to routine abdominal ultrasound is not essential. No fasting for abdominal ultrasonography exam is not the only influence that could cause diagnostic errors, but the combination of different factors. Keywords: x-ray, interobserver, fetal count, fasting

Apoptose na maturação placentária de vacas em diferentes estágios de gestação: evidenciação imuno-histoquímica e bioquímica / Apoptosis in placental maturation of cows in different stages of pregnancy: Immunohistochemical and biochemical evidences

Apoptose tem um papel importante na manutenção da homeostase placentária, e o desequilíbrio desse processo pode comprometer a gestação. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrencia de apoptose em amostras de placenta de vacas em diferentes fases de gestação. Amostras de placentomos de 15 vacas saudáveis com 4 (n=5), 6 (n=5) e 9 (n=5) meses de gestação foram colhidas e processadas rotineiramente para a histologia, imuno-histoquímica e isolamento de DNA. As lâminas obtidas foram coradas em HE, ou submetidas à análise imuno-histoquímica das proteínas pró-apoptóticas caspase-3 e Bax, e da proteína anti-apoptótica Bcl-2. O DNA isolado foi submetido à eletroforese em gel de agarose para detecção da fragmentação internucleossômica do genoma. Os resultados de histomorfometria revelaram que as células apoptóticas aumentaram progressivamente com o avanço da gestação. Confirmou-se a apoptose pela fragmentação característica do DNA genômico, visualizada pelo clássico "padrão em escada" na eletroforese em gel de agarose. Adcionalmente, a imunoexpressão de caspase-3, Bax e Bcl-2 foram observadas em todas as amostras. Entretanto, a proteína caspase-3 apresentou marcação mais intensa em todos os tempos gestacionais, quando comparada com a marcação das proteínas Bcl-2 e Bax. Esses resultados confirmam e reforçam a importância da apoptose na maturação placentária. Além disto, indica que caspase-3, Bax e Bcl-2 estão envolvidas nos mecanismos de ativação da apoptose pela via intrínseca mitocondrial ao longo da gestação, contribuindo para o equilíbrio fisiológico da celularidade e renovação celular na placenta bovina.(AU)

Apoptosis is important for placental homeostasis maintenance, and a misbalance in this process may compromise the success of pregnancy. The aim of this study is to evaluate apoptosis in bovine placental samples at different stages of pregnancy. Placentome samples from 15 healthy cows, at gestational ages of 4 (n=5), 6 (n=5) and 9 (n=5) months were collected and routinely processed for histological and immunohistochemical analysis, and for DNA isolation. Histopathology sections were stained with HE. Others were submitted to immunohistochemistry, using pro-apoptotic caspase-3 and Bax protein, and anti-apoptotic Bcl-2 specific antibodies. Isolated DNAs were processed for electrophoresis in agarose gel, for detection of internucleosomal fragmentation. Histomorphometry results demonstrated that apoptotic cells gradually increase with the advance of the gestation. Also, the DNA ladder pattern was observed in all groups. In addition, caspase-3, Bax and Bcl-2 were all expressed in the three different gestation periods. However, caspase-3 presented a higher expression in all groups, in comparison to Bcl-2 and Bax. These results confirm the importance of the apoptosis in the placental maturation. Also, these results indicated that caspase-3, Bcl-2 and Bax are involved in apoptotic activation mechanisms by mitochondrial intrinsic pathway during placental maturation, contributing for physiological cellularity and cellular turn over balance in bovine placenta.(AU)

PERFIL DOS GLICOSAMINOGLICANOS, MORFOLOGIA DO SISTEMA REPRODUTOR FEMININO E DESENVOLVIMENTO PÓS-IMPLANTACIONAL EM CUTIAS (Dasyprocta leporina Linnaeus, 1758)

O conhecimento morfológico e os dados sobre a composição dos glicosaminoglicanos (GAGs) no sistema reprodutor feminino e tecido placentário de cutia são essenciais para a compreensão dos eventos reprodutivos. Soma-se a estes, o conhecimento sobre o desenvolvimento embrionário/fetal na espécie, que serve como base para aplicação do exame ultrassonográfico e biotécnicas reprodutivas, contribuindo diretamente para conservação da espécie e exploração comercial. Portanto, objetivou-se descrever as características anatomohistológicas do sistema reprodutor de cutias fêmeas, bem como identificar o perfil dos GAGs presentes nos órgãos reprodutivos e placenta ao longo da gestação. Para tanto, foram utilizadas 25 cutias, adultas em diferentes fases do ciclo estral e gestação, obtidas no Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (CEMAS/UFERSA). Após eutanasiados, as cavidades abdominal e pélvica foram abertas, os órgãos do sistema reprodutor e fetos quando presentes foram fotografados in situ e ex situ e realizado a análise morfométrica. Fragmentos de cada órgão foram fixados em solução de paraformaldeído 4% e glutaraldeído 2,5% e destinados à microscopia de luz e eletrônica de varredura. Fragmentos dos órgãos também foram colocados em acetona para realização do processo de delipidação e em seguida a amostra submetida à eletroforese em gel de agarose. Observou-se que o ovário da cutia é revestido por epitélio simples cúbico a pavimentoso que repousa sobre a túnica albugínea, evidenciando-se uma zona cortical e uma medular. A tuba uterina está organizada em três camadas, uma mucosa (epitélio colunar simples, ciliado e viloso), uma lâmina própria (conjuntivo frouxo) e uma camada serosa, estando o tamanho das vilosidades e a espessura da camada muscular variando entre as áreas de infundíbulo, ampola e istmo. Na gestação, este órgão teve perfil variável, com predomínio de DS e HS no início da gestação e DS e CS nos terços médio e final e redução acentuada a termo. O útero é classificado como duplo parcial, formado por dois cornos e uma cérvix com dois óstios distintos que se comunicam com o corpo e um único óstio que se abre na vagina. O corno uterino apresentou ao longo da gestação uma predominância de CS e DS, com pequena quantidade de HS. A vagina possui três camadas, adventícia externa (tecido conjuntivo), muscular e a mucosa composta por epitélio que varia de pavimentoso pouco estratificado sem queratinização (fase lútea) a estratificado pavimentoso queratinizado e cornificado (fase folicular) bastante pregueado e com presença de células leucocitárias. Na vagina, o principal GAG encontrado foi o DS, com pequena concentração de HS analisados ao longo da gestação. A vulva localiza-se entre o ânus (dorsal) e o óstio uretral, estando o vestíbulo ausente na espécie. O clitóris encontra-se externo a vagina, no qual em seu ápice projetam-se lateralmente duas espículas córneas e uma uretra centralizada, não existindo uma parte comum entre os tratos urinário e genital. Os embriões aos 30 dias pós cópula possuíam forma de C, com brotos dos membros em forma de remo, Crown-Rump de 10,75 ± 0,11 mm e peso de 0,17 ± 0,03; aos 40 dias a pele foi lisa e transparente e saliência hepática e curvatura do corpo reduzidas, CR de 19,5 ± 0,007 mm e peso 1,34 ± 0,01 g; aos 65 dias, o tubérculo genital já estava diferenciado e CR observado foi de 83 ± 0,08 mm e peso de 29,22 ± 0,46 g; aos 85 dias, presença de pelos curtos distribuídos pelo corpo, olhos parcialmente abertos, CR de 127,7 ± 0,6 mm e peso de 96,56 ± 7,37 g; aos 100 dias, feto maduro com pêlos longos e em todo o corpo, unhas e dentes completamente formados e conduto auditivo aberto, CR foi de 164,3 ± 10,4 mm e peso de 166,5 ± 7,79 g; os neonatos apresentaram pêlos eriçados e olhos abertos ao nascer, com CR de 179,1 ± 0,5 e peso de 201,88 ± 1,89 g. Conclui-se que o perfil e a concentração dos GAGs varia quanto ao órgão e período de gestação e que a idade do embrião/feto pode ser avaliada durante gestação, permitindo estimar idades gestacionais, e os dados podendo ser usados como parâmetros para exames ultrassonográficos, ajudando na identificação de patologias ao longo do desenvolvimento.

The morphological knowledge and data about the composition of glycosaminoglycans (GAGs) in the female reproductive system and placental of agouti are essential to the understanding of reproductive events. In addition to these, the knowledge of embryonic and fetal development in the specie, provides as the basis for application of ultrasound examination and reproductive biotech, contributing directly to conservation of the specie and commercial exploitation. Therefore, the objective describe the anatomohistological characteristics of the reproductive tract of agoutis females, as well as identify the profile of glycosaminoglycans in reproductive organs and placenta during the pregnancy. Were utilized agoutis 25 adult females at different stages of the estrous cycle and pregnancy, obtained in Centre of Multiplication of Wild Animals of the Universidade Federal Rural do Semi-Árido. After eutanasiados, abdominal and pelvic cavities were opened, the reproductive organs and fetuses when gifts were photographed in situ and ex situ and analysed to morphometric. Each body fragments were fixed in 4% paraformaldehyde solution and 2.5% glutaraldehyde and submitted to histological technique of light and scanning electron microscopy. Fragments of organs were also placed in acetone to remove the lipids and then the sample subjected to agarose gel electrophoresis. Blades for light microscopy, were stained with hematoxylin-eosin, Gomori stain, Alcian-Mallory and Periodic Acid Schiff (PAS). It was observed that he ovary of the Dasyprocta leporina is coated by simple cubic to squamous epithelium that rests on the tunica albuginea, showing a cortical and medular zone. The uterine tube is organized in three layers, a mucous membrane (simple ciliated columnar epithelium), the lamina propria (loose connective) and serosa. The villus height and muscle layer thickness varying between the areas of infundibulum, isthmus and ampulla. In pregnancy this organ has profile variable, with predominance of dermatan sulfate (DS) and heparan sulfate (HS) in early gestation and DS and chondrotin sulfate (CS) in the middle and final thirds with sharp reduction at term. The uterus is classified as partial double, consisting of two horns and a cervix with two distinct ostia that communicate with the body and a single ostium that opens into the vagina. The uterine horn presented throughout pregnancy a predominance of CS and DS, with small amount of HS. The vagina has three layers, the outer adventitia (connective tissue), muscular and mucous membrane composed of epithelium that varies from little pavimentoso storied without keratinization (luteal phase) the storied pavimentoso keratinized and cornified (follicular phase) enough frilled and with leukocytes cells. In the vagina, the main GAG found was the DS, with small concentration of HS analyzed throughout of the pregnancy. The vulva is located between the anus (dorsal) and the ostium and the vestibule urethral absent in the species. The clitoris is external to vagina, in which in its peak protrude sideways two spicules corneas and the urethra centered, in the absence of a common part between the urinary and genital tracts. Embryos at 30 days after copulation had form of "C" with limb buds paddle-shaped, Crown-Rump (CR) of 10.75 ± 0.11 mm and weight of 0.17 ± 0.03 g; 40 days the skin was smooth and transparent and liver boss and curvature of reduced body, CR 19.5 ± 0,007 mm and weight 1.34 ± 0.01 g; after 65 days, the genital tubercle was already differentiated and CR was 83 ± 0.08 mm and weight of 29.22 ± 0.46 g; 85 days, presence of stubble throughout the body, eyes partly open, CR of 127.7 ±0.6 mm and weight of 96.56 ± 7.37 g; 100 days, mature fetus with long hair and the whole body, fully formed tooth and nail and open auditory meatus, CR was 164.3 ± 10.4 mm and weight of 166.5 ± 7.79 g; the infants had the open eyes and bristling at birth, with CR 179.1 ± 0.5 and weight of 201.88 ± 1.89 g. Concluded that the profile and concentration of GAGs varies as to the organ and gestation period and that the age of the embryo/fetus can be evaluated during pregnancy, allowing to estimate gestational age and the data can be used as parameters to ultrasound examinations, helping in the identification of diseases throughout development.

Aspectos morfológicos, vasculares e endócrinos de prenhezes produzidas por técnicas de reprodução assistida em bovinos

Perdas embrionárias e alterações gestacionais são frequentemente observadas em prenhezes de embriões bovinos manipulados in vitro. Sabe-se que tais anormalidades são resultantes de alterações epigenéticas ocasionadas pela manipulação dos gametas e/ou do embrião durante as técnicas de reprodução assistida (ARTs), com destaque para as técnicas de fecundação in vitro (FIV) e da clonagem por transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Tais alterações resultam em distúrbios no desenvolvimento do concepto em algum momento crítico entre a fertilização e o parto, fornecendo bons modelos de estudos sobre a fisiopatologia de perdas embrionárias e dos distúrbios de desenvolvimento. Caracterizam-se como momentos críticos após a transferência do embrião (TE) o desenvolvimento embrionário no útero, o reconhecimento materno da gestação, a placentação e o desenvolvimento da placenta e do feto, os quais tem de ser transpassados sem nenhuma falha, permitindo um desenvolvimento normal do concepto até o termo. Sendo assim, o presente trabalho abordou três fases distintas do amplo período gestacional em prenhezes por ARTs. O Estudo 1 foi realizado durante o período peri-reconhecimento materno da gestação e objetivou descrever a abundância de expressão de genes estimulados pelo interferon tau (ISGs) de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) maternas em gestações oriundas de ARTs no primeiro mês de gestação; o Estudo 2 compreendeu os primeiros 35 dias de gestação e objetivou descrever as mudanças morfológicas e vasculares do complexo útero-concepto-ovário e o estímulo à expressão de ISGs em PBMCs em gestações de conceptos clonados por SCNT com diferentes fenótipos de desenvolvimento, sendo esses denominados gestação anembrionada e CL persistente; e o Estudo 3 foi conduzido durante o período pré-parto e objetivou descrever as alterações na produção de esteroides sexuais e corticosteroides em gestações produzidas por ARTs. Três hipóteses foram testadas: (1) Gestações de conceptos clonados por SCNT apresentam uma baixa e mais tardia estimulação de ISGs em PBMCs maternas quando comparadas com gestações de conceptos produzidos por FIV e IA; (2) O concepto clonado por SCNT apresenta um menor estímulo sobre mudanças morfológicas e vasculares do complexo útero-ovário e ISGs em PBMCs maternas durante os primeiros 35 dias de gestação, quando comparado com conceptos oriundos de IA; e (3) Gestações de embriões oriundos de ARTs apresentam alterações na dinâmica esteroidogênica no pré-parto quando comparados com gestações de IA. No estudo 1 foram coletadas amostras de sangue de gestações produzidas por inseminação artificial (IA), FIV e clonagem por SCNT, nos dias 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 pós-ovulação e foi realizada mensuração da abundância de transcritos de ISGs (OAS1 e ISG15) em PBMCs maternas. No estudo 2, gestações produzidas por IA e clonagem por SCNT, foram submetidas a escaneamentos ultrassonográficos dos ovários, útero e concepto a cada 3 dias do dia 14 ao 35 (dia 0 = ovulação) e amostras de sangue foram coletadas nos dias 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 para mensuração da abundância de transcritos de ISGs (OAS1 e ISG15) em PBMCs maternas. No estudo 3, foram coletadas amostras de sangue no último mês em gestações naturais, oriundas de FIV e de clonagem por SCNT para análise hormonal de 10 esteroides utilizando o método de espectrometria de massas multi-hormonal de alta resolução LC-MS/MS. O primeiro estudo mostrou semelhanças na expressão de genes estimulados pelo IFNT em gestações oriundas de ARTs e produzidas por IA. Entretanto, a estimulação nas gestações oriundas de ARTs aparentou ser quatro dias mais prolongada, sugerindo uma maior funcionalidade do trofectoderma em conceptos oriundos de ARTs. O segundo estudo demonstrou um aumento na expressão de ISGs em PBMCs maternas tanto em gestações de conceptos normais quanto em anormais, justificando a manutenção da função luteal mesmo na ausência de detecção do concepto por ultrasonografia. No terceiro estudo, demonstrou-se alterações na esteroidogênese nas gestações de embriões FIV e clonados no último mês de gestação, sendo essas compatíveis com a hiperativação da enzima aromatase durante todo o último mês de gestações oriundas de FIV e hiperativação das enzimas P450C11 e P450C21 trinta dias antes do parto em gestações oriundas de clonagem por SCNT. O presente estudo concluiu que conceptos oriundos de FIV e clonagem por SCNT apresentam um prolongamento no estímulo de ISGs pelo IFNT, conceptos clonados anormalos apresentam estímulo de ISGs, o que justifica a manutenção da função luteal, e, por fim, a cascata esteroidonênica que culmina com o parto apresenta-se alterada em gestações oriundas de FIV e clonagem por SCNT.

Pregnancy losses and gestational abnormalities are frequently observed in pregnancies from in vitro produced embryos in bovines. It is known that these abnormalities are due to epigenetic changes from the manipulation of gametes and/or embryo during the use of assisted reproduction techniques (ARTs), especially for the in vitro fertilization (IFV) and cloning by somatic cells nuclear transfer (SCNT). These changes results in disturbances of conceptus development in any critical stage between the fertilization and parturition, which provides good models for the study of physiopathology of embryo losses and disturbances of development. Critical stages after the embryo transfer (ET) to the uterus are characterized as the maternal recognition of pregnancy, placentation, and fetal-placental development, which needs to be surpassed without failures, in order to develop a normal conceptus until term. Therefore, the present work approached three distinct phases of the wide gestational period in pregnancies from ARTs. The Study 1 was conducted during the maternal peri-recongnition of pregnancy period and aimed to describe the expression of interferon stimulated genes (ISGs) in maternal peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in pregnancies derived of ARTs; the Study 2 comprise the first 35 days of pregnancy and aimed to describe morphological and vascular changes of the complex uterus-ovaries-conceptus, as well as the expression of ISGs in maternal PBMCs in pregnancies of conceptus cloned by SCNT with different phenotypes of development, denominated as anembryonic gestation and persistent CL; the Study 3 was conducted during the pre-partum period and aimed to describe changes in the production of sexual steroids and corticosteroids during the last month of pregnancies derived of ARTs. Three hypothesis were tested: (1) Pregnancies of conceptus cloned by SCNT presented a decrease and delay in the stimulation of ISGs in maternal PBMCs when compared with conceptuses produced by IFV and AI; (2) Stimulus from the conceptus for changes in the morphology and vasculature of the the uterus-ovarian complex, detected by ultrasonography in B and Doppler modes, and the stimulation of ISGs in maternal PBMCs during the first 35 days of pregnancy of conceptus cloned by SCNT are less intense when compared with conceptus derived from AI; and (3) Pregnancies derived of ARTs present changes in the steroidogenic dynamics in the pre-partum, when compared with pregnancies derived from AI. In Study 1 blood samples were collected from pregnancies produced by AI, IVF, and cloning by SCNT, at days 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, and 31 post-ovulation for the measurement of abundance of transcripts of ISGs (OAS1 and ISG15) in maternal PBMCs. In Study 2, pregnancies derived of AI and cloning by SCNT, were submitted to ultrasonographic scans for the evaluation and description of morphological and vascular changes in ovaries, uterus, and conceptus every 3 days from day 14 to 35 (day 0 = ovulation) and blood samples were collected on days 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 for the measurement of the abundance of transcripts of ISGs (OAS1 and ISG15) in maternal PBMCs. In Study 3, blood samples were collected during the last month of pregnancies naturally conceived, derived of IVF, and cloned by SCNT for the analysis of 10 steroids using the method of mass spectrometry high resolution LC-MS/MS. The first study showed similarities in the ISGs expression stimulation in pregnancies derived of ARTs and AI. However, the stimulation in the ART derived pregnancies was apparently 4 days longer, suggesting a greater placental function in conceptus derived of ARTs. The second study showed an increase in ISG expression in both normal and abnormal conceptus development, which justifies the maintenance of CL in the absence of a conceptus structure detected by ultrasonography. In the third study, was detected changes in the steroidogenesis of pregnancies derived of IFV and cloning by SCNT during the last month of pregnancy, which are compatible with the hyperactivation of the aromatase enzyme during the last month of IFV derived pregnancies, and hyperactivation of the enzymes P450C11 and P450C21 thirty days before parturition in pregnancies derived of cloning by SCNT. The present study concludes that conceptus derived of IFV and cloning by SCNT present a prolonged stimulus of ISGs, cloned conceptus with anomalous development presents a stimulus of ISGs, which justifies the CL function maintenance, and, ultimately, the steroidogenic cascade that culminates with the term is altered in pregnancies derived from IFV and cloning by SCNT.