Citometria de Fluxo em andrologia: da pesquisa básica para a rotina clínica / Flow citometry in andrology: from basic research to clinical routine

Os primeiros estudos de espermatozoides com citometria de fluxo com espermatozoides iniciaram no final da década de 1970. Com os avanços tecnológicos, hoje contamos com equipamentos com alta sensibilidade e eficiência que, em conjunto com amplo catálogo de sondas fluorescentes, podemos mensurar com alta precisão características celulares. Como exemplo, destacam-se dano em membrana plasmática, atividade mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio, dano ao DNA espermático e muito mais. Na presente revisão, as potencialidades e limitação para a implementação da citometria de fluxo na análise seminal de espécies domésticas são exploradas e comentadas.

The first flow cytometry studies with spermatozoa were published in the late 1970s. With the technological advances in the following years, today we have equipments with high sensitivity and efficiency that, together with a large number of commercially available fluorescent probes, allow us to measure different cell characteristics with high accuracy. Some of the most evaluated characteristics are plasma membrane damage, mitochondrial activity, production of reactive oxygen species, sperm DNA damage, and much more. In this review, the potentials and limitations for the implementation of flow cytometry in the seminal analysis of domestic species are explored and commented.

Correlação entre as contagens de reticulócitos manual e automática em amostras de felinos anêmicos / Correlation between manual and automatized values of reticulocyte count in anemic feline samples

O objetivo do presente estudo foi correlacionar os valores de reticulócitos pontilhados e agregados obtidos por metodologia manual com a metodologia automática de contagem de reticulócitos totais em amostras de sangue de gatos anêmicos, analisados em um contador hematológico com citometria de fluxo. Para isso, 40 amostras de sangue de pacientes felinos anêmicos, independentemente de idade e sexo, foram utilizadas para a determinação das contagens absolutas de reticulócitos totais pela metodologia automatizada por citometria de fluxo fluorescente e pela técnica manual com corante supravital, em duplicata. Na contagem manual, houve a discriminação entre reticulócitos pontilhados e agregados. Para a correlação entre os métodos, foi realizada a análise de regressão de Passing-Bablok. A média do hematócrito dos gatos foi de 15,25%, tendo a maioria dos gatos (32,5%) apresentado anemia moderada (hematócrito = 17,81%). Como resultados, a análise de regressão demonstrou que a correlação entre a contagem absoluta total automática foi superior à contagem manual de reticulócitos agregados (rho= 0,71; P<0,001) do que a contagem absoluta de reticulócitos pontilhados (rho= 0,68; P<0,001). Os resultados apresentados sugerem que a contagem de reticulócitos total absoluta realizada pelo analisador hematológico ProCyte Dx em gatos anêmicos se refere à contagem absoluta de reticulócitos. Dessa maneira, recomenda-se que os valores possam ser utilizados para a avaliação imediata da condição hematológica de gatos anêmicos.(AU)

The aim of this study was to correlate the punctate and aggregated reticulocytes values obtained by manual methodology and the automatic reticulocyte count in 40 blood samples from anemic cats. Total reticulocyte absolute counts were determined by automated fluorescence flow cytometry and manual methods in 40 blood samples obtained from anemic cats. The manual count was obtained by supravital stain in duplicate to each sample and the reticulocyte morphology were discriminated between punctate and aggregates reticulocytes. Passing-Bablok regression analysis was utilized to compare the methods. Most samples were from anemic cat (15,25%) and the hematocrit mean was 17,81%. Regression analysis showed that the correlation between the absolute total automatic counts is higher with aggregated reticulocytes (rho= 0,71; P< 0,001) than with absolute punctate reticulocytes counts (rho= 0, 68, P< 0.001). Results suggest that the ProCyte Dx reticulocytes count in anemic cats is correlated with aggregate reticulocyte count. Thus, the greater amount of RNA and organelles in aggregate reticulocytes generates a cellular complexity and, therefore, greater impregnation of the dye in an automatic count. Thus, the values obtained by the hematologic instrument can be used for the immediate evaluation of the hematological condition in anemic cats.(AU)

Correlação entre as contagens de reticulócitos manual e automática em amostras de felinos anêmicos / Correlation between manual and automatized values of reticulocyte count in anemic feline samples

O objetivo do presente estudo foi correlacionar os valores de reticulócitos pontilhados e agregados obtidos por metodologia manual com a metodologia automática de contagem de reticulócitos totais em amostras de sangue de gatos anêmicos, analisados em um contador hematológico com citometria de fluxo. Para isso, 40 amostras de sangue de pacientes felinos anêmicos, independentemente de idade e sexo, foram utilizadas para a determinação das contagens absolutas de reticulócitos totais pela metodologia automatizada por citometria de fluxo fluorescente e pela técnica manual com corante supravital, em duplicata. Na contagem manual, houve a discriminação entre reticulócitos pontilhados e agregados. Para a correlação entre os métodos, foi realizada a análise de regressão de Passing-Bablok. A média do hematócrito dos gatos foi de 15,25%, tendo a maioria dos gatos (32,5%) apresentado anemia moderada (hematócrito = 17,81%). Como resultados, a análise de regressão demonstrou que a correlação entre a contagem absoluta total automática foi superior à contagem manual de reticulócitos agregados (rho= 0,71; P<0,001) do que a contagem absoluta de reticulócitos pontilhados (rho= 0,68; P<0,001). Os resultados apresentados sugerem que a contagem de reticulócitos total absoluta realizada pelo analisador hematológico ProCyte Dx em gatos anêmicos se refere à contagem absoluta de reticulócitos. Dessa maneira, recomenda-se que os valores possam ser utilizados para a avaliação imediata da condição hematológica de gatos anêmicos.(AU)

The aim of this study was to correlate the punctate and aggregated reticulocytes values obtained by manual methodology and the automatic reticulocyte count in 40 blood samples from anemic cats. Total reticulocyte absolute counts were determined by automated fluorescence flow cytometry and manual methods in 40 blood samples obtained from anemic cats. The manual count was obtained by supravital stain in duplicate to each sample and the reticulocyte morphology were discriminated between punctate and aggregates reticulocytes. Passing-Bablok regression analysis was utilized to compare the methods. Most samples were from anemic cat (15,25%) and the hematocrit mean was 17,81%. Regression analysis showed that the correlation between the absolute total automatic counts is higher with aggregated reticulocytes (rho= 0,71; P< 0,001) than with absolute punctate reticulocytes counts (rho= 0, 68, P< 0.001). Results suggest that the ProCyte Dx reticulocytes count in anemic cats is correlated with aggregate reticulocyte count. Thus, the greater amount of RNA and organelles in aggregate reticulocytes generates a cellular complexity and, therefore, greater impregnation of the dye in an automatic count. Thus, the values obtained by the hematologic instrument can be used for the immediate evaluation of the hematological condition in anemic cats.(AU)

Stability in chromosome number and DNA content in synthetic tetraploids of Lolium multiflorum after two generations of selection

ABSTRACT: Chromosome doubling of Italian ryegrass genotypes ( Lolium multiflorum Lam.) adapted to the brazilian edaphoclimatic conditions is an important strategy used by breeders and aims to obtain more vigorous genotypes with better forage quality and disease resistance. The effectiveness of chromosome doubling can be measured by genetic stability and fertility rates of plants over generations. However, a common problem in the polyploidization process is the regeneration of mixoploid plants that have impaired fertility and genetic stability. The objective of this study was to verify if progenies of recently tetraploidized plants remain stable regarding DNA content and chromosome number, over two generations. Progenies of L. multiflorum plants artificially tetraploidized with colchicine treatment were evaluated. Chromosome counting and estimates of the DNA content were used to evaluate the genetic stability. The percentage of tetraploid plants (4X) increased over generations (18%, 34% and 91% in cycle 0, 1 and 2, respectively). All progenies identified as tetraploid by flow citometry showed variation in chromosome number (mixoploidy), but produced viable seeds. Results showed that stabilization in chromosome number and DNA content in tetraploidized plant progenies requires time and that the success of this procedure depends on a continuous and accurate screening and selection.

RESUMO: A duplicação cromossômica de genótipos de azevém anual ( Lolium multiflorum Lam.) adaptados às condições edafoclimáticas brasileira é uma estratégia importante usada pelos melhoristas e visa a obtenção de genótipos mais vigorosos com melhor qualidade de forragem e resistência a doenças. A eficiência da duplicação cromossômica pode ser medida pela estabilidade genética e taxas de fertilidade das plantas ao longo das gerações. No entanto, um dos problemas comumente encontrados no processo de poliploidização é a regeneração de plantas mixoploides que apresentam comprometimento na fertilidade e instabilidade genética. O objetivo deste estudo foi verificar se progênies oriundas de plantas tetraploidizadas recentemente se mantêm estáveis quanto ao conteúdo de DNA e ao número cromossômico, ao longo de duas gerações. Foram avaliadas progênies de plantas de L. multiflorum tetraploidizadas artificialmente com tratamento de colchicina. A estabilidade genética foi avaliada por meio de contagens cromossômicas e estimativa da quantidade de DNA. A porcentagem de plantas tetraploides (4X) aumentou ao longo das gerações (18%, 34% e 91% no ciclo de 0, 1 e 2, respectivamente). Todas as progênies identificadas como tetraploides por meio de citometria de fluxo apresentaram variação no número cromossômico (mixoploidia), entretanto, produziram sementes viáveis. Os resultados demonstraram que a estabilização no número cromossômico e no conteúdo de DNA em progênies de plantas tetraploidizadas requer tempo e que o sucesso desse procedimento depende de um contínuo e rigoroso monitoramento e seleção.

Quantificação de subpopulações linfocitárias no sangue periférico de cães sadios adultos / Lymphocyte subsets in peripheral blood of adult healthy dogs

A citometria de fluxo vem se firmando como uma ferramenta útil na prática médico-veterinária, particularmente na clínica de pequenos animais. Tal conhecimento tem ensejado o estabelecimento de valores fisiológicos para diferentes subpopulações linfocitárias, indispensáveis à compreensão da dinâmica da celularidade linfóide, em diversas situações patológicas. Assim sendo, o presente ensaio teve como objetivo imunomarcar, por intermédio da técnica citométrica, as subpopulações linfocitárias CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, em quatro diferentes raças de cães domésticos e sadios, de tal forma a agregar informações sobre o perfil imunológico das diferentes raças. Foram utilizados 40 cães adultos (2-7 anos), machos e fêmeas, das raças Beagle (G1, n=10), Golden Retriever (G2, n=10), Bulldog Inglês (G3, n=10) e sem raça definida (SRD) (G4, n=10). As colheitas de sangue foram realizadas por venipunção jugular, utilizando-se sistema de frascos a vácuo (K2-EDTA). O hemograma e o processamento das amostras para citometria de fluxo foram realizados num prazo máximo de 24 horas após a colheita do sangue. As amostras foram analisadas no citofluorômetro FACSCANTO (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Utilizou-se o programa FACSDiva (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), para identificar e quantificar as células CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, que forneceu o histograma e respectiva tabela com a quantidade de células detectadas pela imunofenotipagem. Os dados obtidos para contagem de linfócitos T auxiliares, T citotóxicos/supressores e linfócitos B foram tabulados e submetidos a Análise de Variância pelo teste F. O teste de Tukey a 5% de probabilidade foi utilizado para comparação das médias entre as diferentes raças de cães. Os valores médios de contagens de células CD5+CD8+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 155, 206, 544 e 503 células/µL, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD5+CD4+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 746, 642, 1101 e 855 células/µL, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD21+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 171, 299, 494 e 403 células/µL, respectivamente. Assim sendo, o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos T citotóxicos foi significativamente maior (p<0,05) nos Bulldogs Ingleses e cães SRD, comparativamente aqueles encontrados nos grupos de Beagles e Golden Retrievers. Ademais, observou-se que o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos B foi significavamente maior (p<0,05) nos Bulldogs Ingleses, quando comparado àquele dos Beagles.(AU)

Flow cytometry has established itself as a useful tool in veterinary practice, particularly for small animals practice. Such knowledge has made necessary the establishment of physiological values for different lymphocyte subpopulations, indispensable to understanding the dynamics of lymphoid cellularity in various pathological conditions. In this sense, the objective of this study was to determine, through cytometric technique, lymphocyte subsets of CD5+CD4+, CD5+CD8+ and CD21+ in four different breeds of domestic dogs, so to add information about the immunological profile of different breeds. A total of 40 adult dogs were used (2-7 years), being males and females of Beagles (G1, n=10), Golden Retrievers (G2, n=10), English Bulldogs (G3, n=10) and crossbreed dogs (G4, n=10). Blood samples were collected by jugular venipuncture, using vacuum flasks system (K2-EDTA). Hemogram and processing of samples for flow cytometry were performed within a maximum of 24 hours after blood collection. Samples were analyzed using FACSCanto device (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). FACSDiva software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) was used to identify and quantify the CD5+ CD4+, CD5+CD8+, and CD21+, which provided the histogram and the respective table with the number of cells identified by immunophenotyping. The data obtained for T helper lymphocyte count, T cytotoxic/suppressor lymphocyte count and B lymphocytes were tabulated and submitted to analysis of variance by F test. Tukey test at 5% probability was used to compare means between the different breeds of dogs. The average values for CD5+CD8+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 155, 206, 544 and 503 cells/uL, respectively. The average values for CD5+CD4+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 746, 642, 855 and 1101 cells/uL, respectively. The average values for CD21 + cell count in peripheral blood for G1, G2, G3 and G4 were of 171, 299, 494 and 403 cells/uL, respectively. Therefore, The average number of cells obtained for the subsets of cytotoxic T lymphocytes was significantly higher (p<0,05) in the British Bulldogs and crossbreed dogs compared to those found in Beagles and Golden Retrievers. Furthermore, it was observed that the average number of cells obtained for the subsets of B lymphocytes was significantly higher (p<0,05) in English Bulldogs compared to that of Beagles.(AU)

Quantificação de subpopulações linfocitárias no sangue periférico de cães sadios adultos / Lymphocyte subsets in peripheral blood of adult healthy dogs

A citometria de fluxo vem se firmando como uma ferramenta útil na prática médico-veterinária, particularmente na clínica de pequenos animais. Tal conhecimento tem ensejado o estabelecimento de valores fisiológicos para diferentes subpopulações linfocitárias, indispensáveis à compreensão da dinâmica da celularidade linfóide, em diversas situações patológicas. Assim sendo, o presente ensaio teve como objetivo imunomarcar, por intermédio da técnica citométrica, as subpopulações linfocitárias CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, em quatro diferentes raças de cães domésticos e sadios, de tal forma a agregar informações sobre o perfil imunológico das diferentes raças. Foram utilizados 40 cães adultos (2-7 anos), machos e fêmeas, das raças Beagle (G1, n=10), Golden Retriever (G2, n=10), Bulldog Inglês (G3, n=10) e sem raça definida (SRD) (G4, n=10). As colheitas de sangue foram realizadas por venipunção jugular, utilizando-se sistema de frascos a vácuo (K2-EDTA). O hemograma e o processamento das amostras para citometria de fluxo foram realizados num prazo máximo de 24 horas após a colheita do sangue. As amostras foram analisadas no citofluorômetro FACSCANTO (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Utilizou-se o programa FACSDiva (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), para identificar e quantificar as células CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, que forneceu o histograma e respectiva tabela com a quantidade de células detectadas pela imunofenotipagem. Os dados obtidos para contagem de linfócitos T auxiliares, T citotóxicos/supressores e linfócitos B foram tabulados e submetidos a Análise de Variância pelo teste F. O teste de Tukey a 5% de probabilidade foi utilizado para comparação das médias entre as diferentes raças de cães. Os valores médios de contagens de células CD5+CD8+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 155, 206, 544 e 503 células/µL, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD5+CD4+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 746, 642, 1101 e 855 células/µL, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD21+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 171, 299, 494 e 403 células/µL, respectivamente. Assim sendo, o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos T citotóxicos foi significativamente maior (p<0,05) nos Bulldogs Ingleses e cães SRD, comparativamente aqueles encontrados nos grupos de Beagles e Golden Retrievers. Ademais, observou-se que o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos B foi significavamente maior (p<0,05) nos Bulldogs Ingleses, quando comparado àquele dos Beagles.(AU)

Flow cytometry has established itself as a useful tool in veterinary practice, particularly for small animals practice. Such knowledge has made necessary the establishment of physiological values for different lymphocyte subpopulations, indispensable to understanding the dynamics of lymphoid cellularity in various pathological conditions. In this sense, the objective of this study was to determine, through cytometric technique, lymphocyte subsets of CD5+CD4+, CD5+CD8+ and CD21+ in four different breeds of domestic dogs, so to add information about the immunological profile of different breeds. A total of 40 adult dogs were used (2-7 years), being males and females of Beagles (G1, n=10), Golden Retrievers (G2, n=10), English Bulldogs (G3, n=10) and crossbreed dogs (G4, n=10). Blood samples were collected by jugular venipuncture, using vacuum flasks system (K2-EDTA). Hemogram and processing of samples for flow cytometry were performed within a maximum of 24 hours after blood collection. Samples were analyzed using FACSCanto device (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). FACSDiva software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) was used to identify and quantify the CD5+ CD4+, CD5+CD8+, and CD21+, which provided the histogram and the respective table with the number of cells identified by immunophenotyping. The data obtained for T helper lymphocyte count, T cytotoxic/suppressor lymphocyte count and B lymphocytes were tabulated and submitted to analysis of variance by F test. Tukey test at 5% probability was used to compare means between the different breeds of dogs. The average values for CD5+CD8+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 155, 206, 544 and 503 cells/uL, respectively. The average values for CD5+CD4+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 746, 642, 855 and 1101 cells/uL, respectively. The average values for CD21 + cell count in peripheral blood for G1, G2, G3 and G4 were of 171, 299, 494 and 403 cells/uL, respectively. Therefore, The average number of cells obtained for the subsets of cytotoxic T lymphocytes was significantly higher (p<0,05) in the British Bulldogs and crossbreed dogs compared to those found in Beagles and Golden Retrievers. Furthermore, it was observed that the average number of cells obtained for the subsets of B lymphocytes was significantly higher (p<0,05) in English Bulldogs compared to that of Beagles.(AU)

Stability in chromosome number and DNA content in synthetic tetraploids of Lolium multiflorum after two generations of selection / Estabilidade no número cromossômico e no conteúdo de DNA em tetraploides sintéticos de Lolium multiflorum após duas gerações de seleção

Chromosome doubling of Italian ryegrass genotypes ( Lolium multiflorum Lam.) adapted to the brazilian edaphoclimatic conditions is an important strategy used by breeders and aims to obtain more vigorous genotypes with better forage quality and disease resistance. The effectiveness of chromosome doubling can be measured by genetic stability and fertility rates of plants over generations. However, a common problem in the polyploidization process is the regeneration of mixoploid plants that have impaired fertility and genetic stability. The objective of this study was to verify if progenies of recently tetraploidized plants remain stable regarding DNA content and chromosome number, over two generations. Progenies of L. multiflorum plants artificially tetraploidized with colchicine treatment were evaluated. Chromosome counting and estimates of the DNA content were used to evaluate the genetic stability. The percentage of tetraploid plants (4X) increased over generations (18%, 34% and 91% in cycle 0, 1 and 2, respectively). All progenies identified as tetraploid by flow citometry showed variation in chromosome number (mixoploidy), but produced viable seeds. Results showed that stabilization in chromosome number and DNA content in tetraploidized plant progenies requires time and that the success of this procedure depends on a continuous and accurate screening and selection.

A duplicação cromossômica de genótipos de azevém anual ( Lolium multiflorum Lam.) adaptados às condições edafoclimáticas brasileira é uma estratégia importante usada pelos melhoristas e visa a obtenção de genótipos mais vigorosos com melhor qualidade de forragem e resistência a doenças. A eficiência da duplicação cromossômica pode ser medida pela estabilidade genética e taxas de fertilidade das plantas ao longo das gerações. No entanto, um dos problemas comumente encontrados no processo de poliploidização é a regeneração de plantas mixoploides que apresentam comprometimento na fertilidade e instabilidade genética. O objetivo deste estudo foi verificar se progênies oriundas de plantas tetraploidizadas recentemente se mantêm estáveis quanto ao conteúdo de DNA e ao número cromossômico, ao longo de duas gerações. Foram avaliadas progênies de plantas de L. multiflorum tetraploidizadas artificialmente com tratamento de colchicina. A estabilidade genética foi avaliada por meio de contagens cromossômicas e estimativa da quantidade de DNA. A porcentagem de plantas tetraploides (4X) aumentou ao longo das gerações (18%, 34% e 91% no ciclo de 0, 1 e 2, respectivamente). Todas as progênies identificadas como tetraploides por meio de citometria de fluxo apresentaram variação no número cromossômico (mixoploidia), entretanto, produziram sementes viáveis. Os resultados demonstraram que a estabilização no número cromossômico e no conteúdo de DNA em progênies de plantas tetraploidizadas requer tempo e que o sucesso desse procedimento depende de um contínuo e rigoroso monitoramento e seleção.

Stability in chromosome number and DNA content in synthetic tetraploids of Lolium multiflorum after two generations of selection / Estabilidade no número cromossômico e no conteúdo de DNA em tetraploides sintéticos de Lolium multiflorum após duas gerações de seleção

Chromosome doubling of Italian ryegrass genotypes ( Lolium multiflorum Lam.) adapted to the brazilian edaphoclimatic conditions is an important strategy used by breeders and aims to obtain more vigorous genotypes with better forage quality and disease resistance. The effectiveness of chromosome doubling can be measured by genetic stability and fertility rates of plants over generations. However, a common problem in the polyploidization process is the regeneration of mixoploid plants that have impaired fertility and genetic stability. The objective of this study was to verify if progenies of recently tetraploidized plants remain stable regarding DNA content and chromosome number, over two generations. Progenies of L. multiflorum plants artificially tetraploidized with colchicine treatment were evaluated. Chromosome counting and estimates of the DNA content were used to evaluate the genetic stability. The percentage of tetraploid plants (4X) increased over generations (18%, 34% and 91% in cycle 0, 1 and 2, respectively). All progenies identified as tetraploid by flow citometry showed variation in chromosome number (mixoploidy), but produced viable seeds. Results showed that stabilization in chromosome number and DNA content in tetraploidized plant progenies requires time and that the success of this procedure depends on a continuous and accurate screening and selection. (AU)

A duplicação cromossômica de genótipos de azevém anual ( Lolium multiflorum Lam.) adaptados às condições edafoclimáticas brasileira é uma estratégia importante usada pelos melhoristas e visa a obtenção de genótipos mais vigorosos com melhor qualidade de forragem e resistência a doenças. A eficiência da duplicação cromossômica pode ser medida pela estabilidade genética e taxas de fertilidade das plantas ao longo das gerações. No entanto, um dos problemas comumente encontrados no processo de poliploidização é a regeneração de plantas mixoploides que apresentam comprometimento na fertilidade e instabilidade genética. O objetivo deste estudo foi verificar se progênies oriundas de plantas tetraploidizadas recentemente se mantêm estáveis quanto ao conteúdo de DNA e ao número cromossômico, ao longo de duas gerações. Foram avaliadas progênies de plantas de L. multiflorum tetraploidizadas artificialmente com tratamento de colchicina. A estabilidade genética foi avaliada por meio de contagens cromossômicas e estimativa da quantidade de DNA. A porcentagem de plantas tetraploides (4X) aumentou ao longo das gerações (18%, 34% e 91% no ciclo de 0, 1 e 2, respectivamente). Todas as progênies identificadas como tetraploides por meio de citometria de fluxo apresentaram variação no número cromossômico (mixoploidia), entretanto, produziram sementes viáveis. Os resultados demonstraram que a estabilização no número cromossômico e no conteúdo de DNA em progênies de plantas tetraploidizadas requer tempo e que o sucesso desse procedimento depende de um contínuo e rigoroso monitoramento e seleção. (AU)

Quantificação de subpopulações linfocitárias no sangue periférico de cães sadios adultos

ABSTRACT: Flow cytometry has established itself as a useful tool in veterinary practice, particularly for small animals practice. Such knowledge has made necessary the establishment of physiological values for different lymphocyte subpopulations, indispensable to understanding the dynamics of lymphoid cellularity in various pathological conditions. In this sense, the objective of this study was to determine, through cytometric technique, lymphocyte subsets of CD5+CD4+, CD5+CD8+ and CD21+ in four different breeds of domestic dogs, so to add information about the immunological profile of different breeds. A total of 40 adult dogs were used (2-7 years), being males and females of Beagles (G1, n=10), Golden Retrievers (G2, n=10), English Bulldogs (G3, n=10) and crossbreed dogs (G4, n=10). Blood samples were collected by jugular venipuncture, using vacuum flasks system (K2-EDTA). Hemogram and processing of samples for flow cytometry were performed within a maximum of 24 hours after blood collection. Samples were analyzed using FACSCanto device (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). FACSDiva software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) was used to identify and quantify the CD5+ CD4+, CD5+CD8+, and CD21+, which provided the histogram and the respective table with the number of cells identified by immunophenotyping. The data obtained for T helper lymphocyte count, T cytotoxic/suppressor lymphocyte count and B lymphocytes were tabulated and submitted to analysis of variance by F test. Tukey test at 5% probability was used to compare means between the different breeds of dogs. The average values for CD5+CD8+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 155, 206, 544 and 503 cells/uL, respectively. The average values for CD5+CD4+ cell count in peripheral blood in G1, G2, G3 and G4 were of 746, 642, 855 and 1101 cells/uL, respectively. The average values for CD21 + cell count in peripheral blood for G1, G2, G3 and G4 were of 171, 299, 494 and 403 cells/uL, respectively. Therefore, The average number of cells obtained for the subsets of cytotoxic T lymphocytes was significantly higher (p 0,05) in the British Bulldogs and crossbreed dogs compared to those found in Beagles and Golden Retrievers. Furthermore, it was observed that the average number of cells obtained for the subsets of B lymphocytes was significantly higher (p 0,05) in English Bulldogs compared to that of Beagles.

RESUMO: A citometria de fluxo vem se firmando como uma ferramenta útil na prática médico-veterinária, particularmente na clínica de pequenos animais. Tal conhecimento tem ensejado o estabelecimento de valores fisiológicos para diferentes subpopulações linfocitárias, indispensáveis à compreensão da dinâmica da celularidade linfóide, em diversas situações patológicas. Assim sendo, o presente ensaio teve como objetivo imunomarcar, por intermédio da técnica citométrica, as subpopulações linfocitárias CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, em quatro diferentes raças de cães domésticos e sadios, de tal forma a agregar informações sobre o perfil imunológico das diferentes raças. Foram utilizados 40 cães adultos (2-7 anos), machos e fêmeas, das raças Beagle (G1, n=10), Golden Retriever (G2, n=10), Bulldog Inglês (G3, n=10) e sem raça definida (SRD) (G4, n=10). As colheitas de sangue foram realizadas por venipunção jugular, utilizando-se sistema de frascos a vácuo (K2-EDTA). O hemograma e o processamento das amostras para citometria de fluxo foram realizados num prazo máximo de 24 horas após a colheita do sangue. As amostras foram analisadas no citofluorômetro FACSCANTO (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Utilizou-se o programa FACSDiva (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), para identificar e quantificar as células CD5+CD4+, CD5+CD8+ e CD21+, que forneceu o histograma e respectiva tabela com a quantidade de células detectadas pela imunofenotipagem. Os dados obtidos para contagem de linfócitos T auxiliares, T citotóxicos/supressores e linfócitos B foram tabulados e submetidos a Análise de Variância pelo teste F. O teste de Tukey a 5% de probabilidade foi utilizado para comparação das médias entre as diferentes raças de cães. Os valores médios de contagens de células CD5+CD8+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 155, 206, 544 e 503 células/L, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD5+CD4+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 746, 642, 1101 e 855 células/L, respectivamente. Os valores médios de contagens de células CD21+ no sangue periférico do G1, G2, G3 e G4 foram de 171, 299, 494 e 403 células/L, respectivamente. Assim sendo, o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos T citotóxicos foi significativamente maior (p 0,05) nos Bulldogs Ingleses e cães SRD, comparativamente aqueles encontrados nos grupos de Beagles e Golden Retrievers. Ademais, observou-se que o número médio de células obtido para a subpopulação de linfócitos B foi significavamente maior (p 0,05) nos Bulldogs Ingleses, quando comparado àquele dos Beagles.

Colchicine and oryzalin effects on tetraploid induction and leaf anatomy of Solanum commersonii ssp / Colchicina e orizalina na indução de tetraploides e na anatomia foliar de Solanum commersonii ssp

The aim of the present study was to evaluate the effect of the colchicine and oryzalin anti-mitotic substances on the induction of tetraploid plants and foliar anatomy of two diploids clones of Solanum commersonii ssp. Nodal segments of Solanum commersonii subsp. commersonii Dun. and Solanum commersonii subsp. malmeanum Bitt. were treated with colchicine (3.5, 5.0, and 6.5mM; 72h) or oryzalin (10, 30, and 50µM; 24h). After the treatment with anti-mitotic substances, nodal segments were inoculated in the MS culture medium and cultivated in vitro (60 days). After in vitro cultivation, the plants were transferred to vases with the substrate Plantmax® and kept in the greenhouse (45 days). Plant ploidy level was assessed by flow cytometry and leaf anatomy was assessed by anatomic cuts. An increase was observed in the polar and equatorial diameter of stomata ("gigas effect") of the Solanum commersonii subsp. commersonii (SCC) and Solanum commersonii subsp. malmeanum (SCM) clones, which was due to the use of the anti-mitotic substances. Treatments with colchicine (6.5mM; 72h) and oryzalin (50µM; 24h) caused death of the SCC plants cultured in vitro. In the others treatments of the SCC clone, the use of oryzalin and colchicine caused production of chimeric plants. The treatment of nodal segments of SCM with oryzalin (10-50µM; 24h) was effective on induction of tetraploid plants, which can be employed in genetic breeding programs in crossbreeding with cultured potato.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das substâncias antimitóticas colchicina e orizalina na indução de plantas tetraploides e na anatomia foliar de dois clones diploides de Solanum commersonii ssp. Segmentos nodais de Solanum commersonii subsp. commersonii Dun. e Solanum commersonii subsp. malmeanum Bitt. foram tratados com colchicina (3,5, 5,0 e 6,5mM; 72h) ou orizalina (10, 30 e 50µM; 24h). Após o tratamento com as substâncias antimitóticas, os segmentos nodais foram inoculados em meio de cultura MS e cultivados in vitro (60 dias). Após o cultivo in vitro, as plantas foram transferidas para vasos contendo o substrato Plantmax® e mantidas em casa de vegetação (45 dias). O nível de ploidia das plantas foi avaliado por citometria de fluxo e a anatomia foliar foi avaliada através de cortes anatômicos. Foi observado um aumento no diâmetro equatorial e polar dos estômatos ("efeito gigas") dos clones de Solanum commersonii subsp. commersonii (SCC) e Solanum commersonii subsp. malmeanum (SCM), que foi produzido pelo uso de substâncias antimitóticas. O tratamento com colchicina (6,5mM; 72h) e orizalina (50µM; 24h) causou morte nas plantas de SCC cultivadas in vitro. Nos demais tratamentos do clone de SCC, o uso de orizalina ou colchicina causou a produção de plantas quiméricas. O emprego de orizalina (10-50µM; 24h), nos segmentos nodais de SCM, resultou na obtenção de plantas tetraploides consistentes, as quais podem ser usadas nos programas para melhoramento genético em cruzamentos com a batata cultivada.(AU)

Protocolos de temperatura na poliploidia para tambaqui Colossoma macropomum

Este estudo avaliou técnicas de indução a triploidia por meio do choque térmico em tambaqui (Colossoma macropomum) e comparou a taxa de fertilização e variáveis de desempenho de peixes diploides e triploides. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro tratamentos e três repetições. Após a reprodução artificial, ovócitos recém-fertilizados foram divididos em quatro tratamentos: choque térmico quente (42°) por dois minutos, choque térmico frio(4°C) por 30 min, choque térmico duplo (4°/42° ) C e o controle não submetido ao tratamento térmico. Foram avaliados peso inicial, peso final, comprimento padrão e comprimento total. O nível de ploidia foi avaliado por meio da citometria de fluxo. Os histogramas de fluorescência relativa foram analisados utilizando o software FloMax 2.3. Os dados qualitativos foram analisados pelo programa estatístico SAS, no qual a avaliação da normalidade de residual foi realizada pelo teste de Shapiro-wilk (p< 0,05). Em seguida foi realizado a análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. A taxa de fertilização apresentou menores valores percentuais nos grupos submetidos aos tratamentos térmicos. Para taxa de fertilização, o grupo controle apresentou maior valor médio (84,0%), quando comparado aos térmicos quente (82,7%), frio (77,4%) e duplo (58%). As larvas do grupo frio apresentaram maior peso após eclosão (0.003524g). Não houve diferença significativa para os padrões metabólitos e hematologia. O tratamento térmico por frio induziu 33,33% de peixes triploides, enquanto, a temperatura quente e duplo teve 11,11% de triploides. Concluiu-se com esse estudo que a técnica de choque térmico pelo frio promove uma maior taxa de animais poliploides e pode ser usada para induzir a triploidia (3n) em tambaqui, exibindo efeito positivo neste grupo com animais com maior peso inicial e final.

This study evaluated techniques for inducing triploidy through thermal shock in tambaqui (Colossoma macropomum) and compared the fertilization rate and performance variables of diploid and triploid fish. The experimental design was completely randomized with four treatments and three replications. After artificial reproduction, newly fertilized oocytes were divided into four treatments: hot thermal shock (42°) for two minutes, cold thermal shock (4° C) for 30 min, double thermal shock (4° / 42°) C and control not subjected to heat treatment. Initial weight, final weight, standard length and total length were evaluated. The ploidy level was assessed using flow cytometry. The relative fluorescence histograms were analyzed using the FloMax 2.3 software. Qualitative data were analyzed using the SAS statistical program, in which the assessment of residual normality was performed using the Shapiro-Wilk test (p <0.05). Then the analysis of variance was performed and the averages were compared using the Duncan test at 5% probability. The fertilization rate showed lower percentage values in the groups submitted to heat treatments. For fertilization rate, the control group had a higher average value (84.0%), when compared to the hot (82.7%), cold (77.4%) and double (58%) thermals. The larvae of the cold group had higher weight after hatching (0.0035g). There was no significant difference for metabolic patterns and hematology. The cold thermal treatment induced 33.33% of triploid fish, while the hot and double temperature had 11.11% of triploids. It was concluded with this study that the cold thermal shock technique promotes a higher rate of polyploid animals and can be used to induce triploidy (3n) in tambaqui, showing a positive effect in this group with animals with higher initial and final weight. Key-words: Flow citometry. Growth. Heat shock. Induction of triploidy.

FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA E RETICULOCITOMETRIA EM CÃES ACOMETIDOS POR DOENÇA RENAL CRÔNICA

A anemia é considerada um dos fatores para avaliar progressão da doença renal e diminuição da qualidade de vida do paciente. Conforme a doença renal progride, ocorre aumento gradativo na produção de toxinas urêmicas que reduz a meia vida dos eritrócitos circulantes por interferir na estabilidade da membrana eritrocitária. Para tanto, utiliza-se a contagem de reticulócitos para classificar a anemia como regenerativa ou não regenerativa. Objetivou-se neste estudo avaliar a resistência da membrana das hemácias, utilizando-se do teste de Fragilidade Osmótica Eritrocitária (FOE) em cães com doença renal crônica (DRC) e avaliação de reticulócitos. Foram avaliados 43 cães provenientes da rotina do Serviço de Nefrologia e Urologia do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - campus Jaboticabal. As referidas unidades experimentais foram distribuídas em três grupos, quais sejam, G0 (n=13), composto por cães hígidos e G1, DRC estádios 1 e 2 (n=14) e G2, DRC estádios 3 e 4 (n=16), classificados de acordo com o recomendado pela International Renal Interest Society. A fim de definir os critérios de inclusão dos cães foram feitos, além do exame físico, a avaliação de pressão arterial, hemograma, contagem de reticulócitos, exames bioquímicos, urinálise e relação proteína/creatinina urinária (UP/C). Para execução do teste de FOE as hemácias foram diluídas em concentrações decrescentes de cloreto de sódio e analisadas por citometria de fluxo. As concentrações de creatinina sérica (sCr), ureia sérica (sUreia), fosfato sérico (sP) e UP/C foram superiores no grupo G2 quando comparado ao G0 (p<0,05). Com relação às variáveis hematológicas, foram observadas diferença estatística entre o número de hemácias (p<0,009), hematócrito (p<007) e hemoglobina (p<0,007), que decresceu conforme a doença renal avançava. A FOE e os reticulócitos apesar de terem variado individualmente, dependendo do estádio da DRC de cada paciente, não apresentaram diferença estatística quando comparado aos animais controle e doentes, e tampouco quando foram confrontados os diferentes estádios de cães com DRC (p>0,05).Os resultados obtidos neste estudo demonstram, portanto que, embora a reticulocitometria seja fiadora da contagem de reticulócitos, a contabilização manual de reticulócitos ainda é uma opção segura e somente com a FOE não é possível predizer alterações na membrana do eritrócito em cães com DRC.

Anemia is considered one of the factors to assess the kidney disease progress and the decrease in patient's quality of life. As kidney disease progresses, there is a gradual increase in urinary toxin production that shortens the circulating erythrocyte half-life by interfering with erythrocyte membrane stability. To do this, use a reticulocyte count to classify anemia as regenerative or non-regenerative. The objectives of this study were to evaluate the resistance of the red blood cells, using the Erythrocyte Osmotic Fragility test in dogs with chronic kidney disease (CKD) and to evaluate reticulocytes. Forty-three dogs were charged, followed by the routine of the Nephrology and Urology Service of the Governor Laudo Natel Veterinary Hospital of the Faculty of Agricultural and Veterinary Sciences - UNESP - Campus Jaboticabal. The experimental units were divided into three groups, namely, G0 (n = 13), consisting of healthy dogs and G1, CKD stages 1 and 2 (n = 14) and G2, CKD stages 3 and 4 (n = 16), classification proposed by the International Renal Interest Society. In order to define the inclusion criteria of dogs made, in addition to physical examination, an assessment of blood pressure, blood count, reticulocyte count, biochemical tests, urinalysis, and urinary protein/creatinine ratio. To perform the erythrocyte osmotic fragility test, red blood cells were diluted in decreasing sodium chloride filters (0.9 to 0.0%) and analyzed by flow cytometry. As creatinine serum concentration (sCr), serum urea (sUL), serum phosphorus (sP) and urinary protein/creatinine ratio. were higher in group G2 when compared to G0 (p <0.05). Regarding hematological variables, statistical differences were observed between the number of red blood cells (p <0.009), hematocrit (p <007) and hemoglobin (p <0.007), which decreased according to the advanced kidney disease. A cross-referenced FOE despite varying the number of participants, depending on each patient's CKD stage, shows no statistical difference when it shows control animals and damage, and shows when it is confronted with different cases of dogs with CKD (p> 0, 05) The results obtained in this study demonstrate, therefore, that although reticulocytometry is a guarantor of reticulocyte counting, manual reticulocyte counting is still a safe option and only with FOE it is not possible to predict changes in the erythrocyte membrane in dogs with CKD.

Associação entre a Na+, K+-ATPase e a fertilidade de amostras seminais descongeladas de touros Angus

Na atualidade, um dos desafios da reprodução bovina é identificar de maneira eficiente touros que apresentam elevada fertilidade, uma vez que a avaliação andrológica tradicional pode não diferenciar de forma precisa o potencial fertilizante de um reprodutor, levando a redução nas taxas de prenhez e prejuízos financeiros. Desta maneira, a Na+, K+-ATPase tem sido um biomarcador potencial da fertilidade, devido a suas atribuições específicas na célula espermática e relatos de correlação com a fertilidade de touros Holandeses. No entanto devido a peculiaridades de manejo reprodutivo da pecuária brasileira de corte e pela ausência de pesquisas envolvendo a Na+, K+-ATPase em bovinos com esta aptidão, o presente estudo foi desenvolvido a fim de determinar a associação entre a atividade da Na+, K+-ATPase em espermatozoides descongelados de touros Angus classificados como de fertilidade superior (FS) e normal (FN) após inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Foram utilizadas três diferentes partidas de amostras comerciais de touros de FS (n = 4) e FN (n = 4). Realizou-se a avaliação da cinemática através do sistema CASA, da viabilidade espermática através da microscopia de fluorescência e da expressão de Na+, K+-ATPase através da citometria de fluxo, imediatamente após a descongelação (0h) e após 2h de incubação (37 °C), enquanto a atividade da Na+, K+-ATPase foi determinada mensurando-se a liberação de fosfato inorgânico (iP) nas amostras tratadas ou não com inibidor específico (ouabaína, 4×10-4 M), sendo normalizada em função da proteína total de cada amostra. Dentro do mesmo tempo de incubação não houve diferença (P > 0,05) na viabilidade, cinemática e na expressão da Na+, K+-ATPase entre touros FS e FN. Os parâmetros cinemáticos de LIN e VCL não foram influenciados pela incubação nas amostras de FS e FN, respectivamente. Houve uma tendência (P = 0,06) de maior atividade enzimática da Na+, K+-ATPase em amostras de touros de FS. Em conclusão, diferenças na cinemática e viabilidade espermática não são detectadas entre touros Angus de FS e FN imediatamente após o descongelamento. Diferentes respostas nos parâmetros de velocidade pós-incubação são detectadas em touros de FS e FN que podem estar relacionadas a atividade da Na+, K+-ATPase, sem influência na sua expressão.

Currently, one of the challenges on bovine reproduction is to efficiently identify high fertility bulls, since traditional andrological evaluation may not precisely differ the fertilizing potential of a sire, leading to reduced pregnancy rates and economic losses. Therefore, the Na+, K+-ATPase has been considered a potential fertility marker, due to its sperm specific properties and reports o correlation with Holstein bull fertility. However, specificities on reproductive management of Brazilian beef herds associated to the lack of information regarding Na+, K+-ATPase in beef bulls, the present study was performed aiming to determine association between Na+, K+-ATPase activity in thawed Angus bull sperm scored as being a high fertility (HF) or normal fertility (NF) after fixed time artificial insemination (FTAI). Samples from three different commercial batches of bulls of HF (n=4) or NF (n=4) were used. Sperm kinematics was evaluated with CASA system, sperm viability was assessed by fluorescent microscopy, and expression of Na+, K+-ATPase on the sperm surface by flow citometry, immediately post-thaw (0 h) and after 2 h of incubation (37 °C). Na+, K+-ATPase activity was determined measuring the releasing of inorganic phosphate (iP) in the samples treated or not with a specific inhibitor (ouabain, 4×10-4 M), normalized by total protein of each sample. Within the same incubation time, there was no difference (P > 0.05) on sperm viability, kinematic parameters, and the expression of Na+, K+-ATPase between HF and NF bulls. Kinematic parameters of LIN and VCL were not influenced (P > 0.05) by incubation time in samples from HF and NF, respectively. There was a tendency (P = 0.06) of higher Na+, K+-ATPase enzymatic activity in HF bull samples. In conclusion, differences on kinematic and sperm viability are not detected between HF and NF Angus bulls immediately post-thaw. Different responses on velocity parameters post-incubation were detected in HF and NF bulls that might be related to Na+, K+-ATPase activity, without influence of Na+, K+-ATPase expression.

CRIOPRESERVAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES DE FELÍDEOS DOMÉSTICOS E SILVESTRES

As informações obtidas sobre a biologia e biotecnologia reprodutiva do gato doméstico permitem uma correlação e aplicação em espécies silvestres. O estudo das características físicas e a sua associação com parâmetros reprodutivos permite ampliar os critérios de seleção de indivíduos para reprodução de espécies em risco de extinção. A criopreservação do sêmen é etapa fundamental para os programas de reprodução assistida em felídeos silvestres. O objetivo desse trabalho foi avaliar a correlação das mensurações biométricas com as características morfocinéticas pré e pós-congelação do sêmen do Felis catus e de felídeos silvestres, obtido pela cateterização uretral meio de dois diferentes fármacos e processados com três crioprotetores seminais. Para este estudo foram utilizados 13 machos felinos (Felis catus), selecionados e separados em grupos, de acordo com o indutor químico da ejaculação testado (Experimento 1). No primeiro grupo experimental (G1D), foi utilizada a associação de cloridrato de medetomidina (0,1mg/kg) e cetamina (5mg/kg) IM e no segundo grupo (G2D) foi utilizada a associação de cloridrato de dexmedetomidina (0,1mg/kg) e cetamina (5mg/kg). Depois de alcançada a anestesia satisfatória, os animais foram submetidos à sondagem com um cateter uretral sem janela lateral, tendo o sêmen colhido e transportado ao laboratório para análise. Foram avaliadas as características de qualidade do sêmen fresco e depois do processo de congelação-descongelação: volume, motilidade e progressiva subjetiva, porcentagem de espermatozoides com integridade funcional (choque osmótico) e estrutural da membrana plasmática (com corante eosina), concentração espermática e patologias espermáticas. Não foi encontrada diferença nos parâmetros espermáticos (P>0.05). As amostras foram criopreservadas em três grupos de crioprotetores (Experimento 2), GC1 com de 6% de glicerol (GLI), GC2 com 3% de dimetilacetamida (DMA) e GC3 com 3% de dimetilformamida (DMF). Para o sêmen congelado-descongelado foram avaliados adicionalmente os parâmetros cinéticos em equipamento de análise seminal automatizado (CASA) e fluorescência em citometria de fluxo, quando também não se verificaram diferenças (P>0,05) para os parâmetros avaliados, entre os grupos estudados. O estudo de subpopulações espermáticas, identificou quatro subpopulacões com comportamentos definidos independentes do crioprotetor. Posteriormente às mensurações e colheita do sêmen, os animais foram submetidos à orquiectomia. Nos animais foram realizadas as mensurações corporais e testiculares de: comprimento de cabeça, circunferência da cabeça, comprimento de cabeça mais xi corpo, diâmetros torácicos, comprimento de cauda e comprimento total, largura, comprimento, espessura de cada testículo, e peso corporal (Experimento 3). Além disso, os testículos dos animais foram mensurados com ultrassonografia. Os testículos pós-orquiectomia também foram mensurados e pesados. Os parâmetros testiculares estimados foram área testicular, volume testicular, peso testicular e índice gonadossomático. Foram comparados os métodos de mensurações testiculares e estimadas correlações lineares de Pearson e Spearman entre a biometria corporal, testicular e parâmetros espermáticos. Não houve diferenças entre as medidas obtidas com os dois métodos de mensuração dos testículos (P>0.05). Foram observadas correlações positivas (P<0,05) entre o comprimento total e os parâmetros testiculares, assim como entre a concentração espermática e os parâmetros testiculares. Para o estudo com os felídeos silvestres foram utilizados um Leopardus wiedii, um Puma yagouaroundi e uma Panthera onca. Os animais foram submetidos à ejaculação química com a associação de cloridrato de medetomidina (0,1mg/kg) e cetamina (5mg/kg) IM. As amostras seminais colhidas por cateterização uretral foram cripreservadas com os mesmos crioprotetores e concentrações do Experimento 2. As avaliações do sêmen fresco e pós-descongelação foram às mesmas descritas para o Experimento 1 e 2, cuja comparação entre os diferentes grupos resultou no Experimento 4. Para este último estudo também não foram encontradas diferenças para o tipo de crioprotetor utilizado (P>0,05). Conclui-se que não existiram diferenças entre a qualidade espermática do sêmen fresco e entre os grupos pós-descongelação, para as duas associações de fármacos testadas, nem entre os crioprotetores testados. Entretanto, a biometria testicular exerce importante influência sobre a concentração espermática de reprodutores, sendo um adequado parâmetro a ser considerado em reprodutores felídeos.

Information obtained on the biology and reproductive biotechnology of the domestic cat allows a correlation and application in feline wild species. The study of the physical characteristics and their association with reproductive parameters allows increasing the selection criteria of individuals for reproduction of endangered species. Semen cryopreservation is a fundamental component for assisted reproduction programs in wild felids. Objective of this study was to evaluate the association between the biometric measurements and the previous and post freezing morphokinetic characteristics of feline domestic and wild species sperm, obtained by urethral catheterization using two different drugs and processed with three seminal extenders. For this study, 13 feline males (Felis catus), selected and separated into groups, according to the drug tested (Experiment 1). In the first experimental group (GD1), the combination of medetomidine hydrochloride (0.1mg/kg) and ketamine (5mg/kg) was used and in the second group (GD2) the combination of dexmedetomidine hydrochloride (0.025mg/kg) and ketamine (5mg/kg). After the required anesthetic level was reached, the animals were submitted to probing with urethral catheter, and the semen was collected and transported to the laboratory for analysis. We evaluated the semen quality characteristics of fresh and frozen-thawed sperm with conventional microscopy: volume, total motility and progressive motility, percentage of spermatozoa with membrane functional integrity (osmotic shock) and membrane structural integrity (eosin stain), sperm concentration and sperm morphology. There was no difference in sperm parameters (P> 0.05) into groups GD1 and GD2. The samples were cryopreserved in three groups of cryoprotectants (Experiment 2), GC1 with 6% glycerol (GLI), GC2 with 3% dimethylacetamide (DMA) GC3 with 3% dimethylformamide (DMF). For frozen-thawed semen, kinetic parameters in computerized analysis equipment (CASA) and fluorescence in flow cytometry were also evaluated, when there were also no differences (P> 0.05) for the parameters evaluated between the groups studied. The study of spermatic subpopulations identified four subpopulations with independent behaviors defined between them. After the semen collection and obtainment of its parameters, the animals were submitted to orchidectomy. In the animals, corporal and testicular measurements were performed: head length, head circumference, head +body length, thoracic diameters, tail length and total length, width, length, thickness of each testicle, and body weight (Experiment 3). In addition, the testicles of the animals were measured with ultrasonography. Post-orchiectomy testicles were also measured and weighed. The estimated testicular parameters were testicular area, testicular volume, testicular weight and gonadosomatic index. We compared the methods of testicular measurements and estimated linear Pearson correlations between body biometry, testicular and sperm parameters. There were no differences between the measurements obtained with the two measurement methods of the testicles (P> 0.05). Positive correlations xiii (P <0.05) were observed between total length and testicular parameters, as well as between sperm concentration and testicular parameters. For the study with the wild felids, a Leopardus wiedii, a Puma yagouaroundi and a Panthera onca ounce were included. The animals were submitted to chemical ejaculation with the combination of medetomidine hydrochloride (0.1mg/kg) and ketamine (5mg/kg) IM. Seminal samples were collected by urethral catheterization were frozen with the same cryoprotectants and concentrations of Experiment 2. For the latter study, no differences were found for the extender used (P> 0.05). It was concluded that there are no differences in sperm quality in fresh and post-thawing. However, testicular biometry exerts an important influence on the sperm concentration of the breeders, being an adequate parameter to be considered in felid breeding.

A Influência da Hiperplasia Prostática Benigna e do tratamento com finasterida nos principais parâmetros de congelabilidade de espermatozoides caninos

Resumo: O objetivo do presente estudo é verificar a influência da Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) nos principais parâmetros de congelabilidade do sêmen de cães. Para tanto, foram selecionados 20 cães, alocados em 3 grupos experimentais de acordo com a presença, tratamento com finasterida e ausência da afecção: Grupo Controle (n=9), Grupo HPB (n=5) e Grupo HPB+FIN (n=6). De forma complementar, o experimento foi subdividido em Sêmen Fresco e Sêmen Criopreservado. Para a seleção dos cães, foi considerada idade superior a 6 anos, diagnóstico presuntivo da HPB por constatação dos sinais clínicos, toque retal e ultrassonografia modo B. As amostras seminais in natura foram avaliadas quanto ao volume, cor, aspecto, concentração, cinética espermática, atividade mitocondrial espermática, estresse oxidativo, integridade de membrana plasmática, acrossomal, DNA espermático por citometria de fluxo e teste de ligação espermática em membrana perivitelínica em gema de ovo de galinha. Sequencialmente, o sêmen foi criopreservado em etapa única, posteriormente descongelado a 37ºC por 30 segundos e foram avaliado conforme anteriormente. Como resultados, nas avaliações seminais realizadas no sêmen fresco, o Grupo HPB+Finasterida apresentou menor escore para o aspecto do ejaculado, em comparação aos demais grupos. Ademais, o grupo HPB+Finasterida apresentou maior frequência de batimento flagelar dos espermatozóides em relação ao grupo Controle e menor porcentagem de motilidade em velocidade média, em comparação aos demais grupos. O grupo Controle apresentou maior porcentagem de espermatozóides com média atividade mitocondrial, em relação aos demais grupos. Ainda, o grupo Controle apresentou maior porcentagem de integridade do DNA espermático. Por outro lado, o grupo HPB apresentou menor porcentagem de integridade do DNA espermático. Nas avaliações seminais realizadas no sêmen descongelado, o Grupo Controle apresentou maior porcentagem de espermatozóides com alta atividade mitocondrial, em comparação aos demais grupos. Já o Grupo HPB+Finasterida apresentou maior número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica de gema de ovo de galinha, em comparação ao grupo HPB. O grupo HPB apresentou maior porcentagem de espermatozoides com lesão de membrana acrossomal (sem lesão de membrana plasmática), em comparação ao grupo Controle. Com relação ao estresse oxidativo, o Grupo Controle apresentou maior peroxidação lipídica em comparação ao grupo HPB+Finasterida. Por outro lado, o Grupo Controle mostrou maior integridade de DNA espermático em comparação aos demais grupos, sendo o grupo HPB com menor integridade de DNA espermático. Em conclusão, os espermatozoides oriundos de cães afetados pela HPB apresentam maior sensibilidade às injúrias da criopreservação seminal. Por outro lado, o tratamento com finasterida é capaz de minimizar os efeitos deletérios da congelação do sêmen de cães portadores de HPB, permitindo o emprego de tais animais em programas reprodutivos.

Abstract: The objective of the present study is to analyze the influence of Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) on the main freezing parameters of canine sperm. For such purpose, 20 dogs were previously selected and composed 3 experimental groups, according to the presence or absence of BPH diagnosis and treatment with finasteride: control group (n=9), BPH group (n=5) and BPH+FIN (n=6). Complementarily, the experiment was subdivided in fresh or post-thaw sperm. Dogs had more than 6 years and a presumptive diagnosis of BPH through the verification of clinical signs, rectal examination and B mode ultrasonography. The fresh seminal samples were evaluated for volume, color, aspect, sperm concentration, sperm motility, sperm mitochondrial activity, oxidative stress, plasmatic and acrosomal membrane integrity, sperm DNA fragmentation by flow citometry and sperm binding test on perivitelic membrane of chicken egg yolk. Subsequently, semen was cryopreserved in one step, thawed at 37ºC for 30 seconds and evaluated according to previously described. For the fresh semen results, the BPH+Finasteride group had lower score of ejaculate aspect compared to the other groups. Additionally, BPH+Finasteride group had a higher frequency of sperm flagellar beating in relation to the control group and a lower percentage of sperm with medium velocity in relation to the other groups. The control group had higher percentage of medium sperm mitochondrial activity in relation to the other groups. Also, the control group had higher percentage of sperm DNA integrity. Conversely, BPH group showed the lowest percentage of DNA integrity. For the post-thaw analysis, the control group presented a higher percentage of high mitochondrial activity compared to the other groups. However, the BPH+Finasteride group showed a higher number of spermatozoa bound to the perivitelinic membrane of chicken egg yolk, compared to the BPH group. The BPH group presented a higher percentage of spermatozoa with acrossomal membrane lesion (without lesion of plasmatic membrane) compared to the control group. Regarding the oxidative stress, the control group presented higher lipid peroxidation compared to the BPH+Finasteride group. On the other hand, the control group had higher sperm DNA integrity compared to the other groups, and the BPH group had the lowest percentage of sperm DNA integrity. In conclusion, sperm of BPH dogs presented higher susceptibility to cryoinjury. However, finasteride treatment was able to minimize the deleterious effects of sperm cryopreservation, allowing for the use of HPB dogs for reproductive purposes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais / Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from different gestacional ages

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.(AU)

The interest in stem cells derived from fetal annexes of many species has exponentially increased during the last decades, because they are adult stem cell sources with potential of differentiation in several cell lineages; which present little or no immunogenicity and are an alternative with great importance for storage cell banks. Despite the rising interest, studies for the equine species are still rare. The aim of this study was to isolate, characterize and differentiate mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from initial, middle and late third of gestation (AF-MSCs), and compare their results. Twenty three samples from equine amniotic fluid were evaluated by morphological, immunocytochemical and immunophenotypical (Flow cytometer) assays and osteogenic, adipogenic and chondrogenic in vitro differentiation. All samples demonstrated plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The immunocytochemical assay demonstrated cells from all the studied groups were positive for CD44, PCNA and vimentin and negative for cytokeratin and Oct-4. Flow cytometry demonstrated expression of CD44 and CD90 and no expression of CD34, where CD44 and CD90 markers presented decreasing pattern of expression in relation to the gestational development. All samples collected from all gestational phases were capable to differentiate in osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages. Thus, cells obtained from equine amniotic fluid presented morphological and immunophenotypical characteristics and potential of differentiation typical of MSCs showing that the collection can be performed at any stage of pregnancy. However, more studies should be performed about the expression of pluripotent markers as Oct-4 and the differentiation potential for extra mesodermal lineages prior demonstrated in the literature.(AU)

Correlação das proteínas do plasma seminal com a congelabilidade do sêmen de cães

- Os objetivos deste estudo foram validar a sonda fluorescente (MitoStatus Red) para análise de potencial mitocondrial em espermatozoide de cães por citometria de fluxo, associada a análise de integridade de membrana plasmática e do acrossomo (experimento I). Além disso, foi conduzida análise proteômica (abordagem shotgun) do plasma seminal de cães, sua correlação com a congelabilidade do sêmen e capacidade de ligação das células espermáticas em membrana perivitelina da gema de ovo (TL) (experimento II). No experimento I foram utilizado 10 ejaculados, com motilidade espermática >75% e as concentrações de 20 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM da sonda MitoStatus Red foram comparadas na citometria de fluxo. Concluiu-se que 20 nM foi a concentração ideal da sonda fluorescente, sem danos as estruturas celulares. No experimento II foram utilizados 10 animais, 2 ejaculados/animal (n = 20). Os ejaculados foram avaliados por cinética espermática, citometria de fluxo (potencial mitocondrial, integridade de membrana plasmática e de acrossomo) e TL. A análise proteômica do plasma seminal foi avaliada por espectrometria de massas. Os ejaculados foram divididos em 3 clusters (cluster Low, cluster Medium, cluster Hight) de acordo com os parâmetros espermáticos pré e pós-descongelação. Os grupos foram correlacionados com as proteínas encontradas no plasma seminal. Concluiu-se que existe relação entre presença ou ausência de proteínas do plasma seminal de acordo com a qualidade espermática e duas proteínas se destacaram no cluster High, que podem estar relacionadas aos melhores resultados de congelabilidade.

Canine reproduction studies are important because of it closeness with human reproductive physiology, and it´s the main experimental model for wild species. The lack of studies in canine reproduction of stray animals, is an important tool for the alternative birth control methods researches, is another relevant reason to study reproduction in this species. In order to find fertility or infertility markers, seminal plasma and/or sperm proteins have already been the subject of studies in many other species with different approaches and applications. In farm animals, these proteins have been studied in order to elucidate spermatogenesis physiological events, sperm maturation, fertilization and cell changes when subjected to cryopreservation. Thus, those studies have produced results that can be used to identify animals with higher or lower fertility and freezability. In this sense, and in view of the importance of the dog as experimental model, and because seminal plasma proteins can increase the resistence of sperm cell in front of the cryopreservation process is believed that the identification of the freezability markers, in this species, can generate results applicable to other canids contributing to the formation of germplasm banks. In this way, the aim of this study was to correlate the semen quality and sperm cells binding capacity to the perivitelline egg yolk membrane, pre and post-freezing, with the seminal plasma protein analysis using shotgun approach.

Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep / Protocolos para obtenção e isolamento de células tronco mesenquimais de duas fontes em ovinos

PURPOSE: To evaluate different protocols to isolate stem cells from ovine umbilical cord blood and adipose tissue. METHODS: There were used 5 samples of umbilical blood and 5 samples of perirenal adipose tissue from 10 female sheep. All the samples were obtained through surgery, to harvest aseptic samples. There were used 3 protocols for obtainment and culture of umbilical cord blood stem cells and 4 protocols for ovine adipose tissue stem cells. RESULTS: It was possible to observe only one successful protocol for the obtainment of umbilical cord blood stem cells. When analyzing the techniques used to obtain adipose tissue stem cells, only one of the methods was effective as well. Through colony forming unit assay, there were obtained 58 colonies of cells after seven days in culture. Flow citometry tests revealed the cells were positive to CD44 and exhibited negative reaction to CD38, CD45, CD41/61. These cells showed a growth curve with very well defined phases LOG, LAG and PLATEAU. This phases are typically seem in mesenchymal stem cells growth curves. CONCLUSIONS: The isolation and culture of mesenchymal stem cells from ovine umbilical cord blood are complex and request more detailed assays. Stem cells from fat tissue sheep showed mesenchymal characteristics, according to their cell growth curve, ability to origin colonies of fibroblastoid cells and positive reactivity with the antibody CD44 by flow citometry.(AU)

OBJETIVO: Testar diferentes protocolos para o isolamento de células tronco a partir de sangue de cordão umbilical e tecido adiposo de ovinos. MÉTODOS: Foram utilizadas cinco amostras de sangue de cordão umbilical e cinco amostras de tecido adiposo perirrenal de 10 fêmeas de ovelha. A coleta das amostras foi realizada através de procedimento cirúrgico para coleta do material de forma mais asséptica possível. Foram realizados três protocolos de isolamento e cultivo das células-tronco do cordão umbilical e quatro protocolos para o isolamento e cultivo das células-tronco de gordura de ovinos RESULTADOS: Somente um dos protocolos utilizados para o isolamento das células-tronco de cordão umbilical foi efetivo. Dos quatro protocolos utilizados para isolamento das células-tronco de gordura, da mesma forma, apenas um obteve sucesso. Foi realizado o ensaio de unidades formadoras de colônias destas células, sendo contadas 58 colônias ao final de sete dias. Na citometria de fluxo essas células mostraram-se positivas para CD44 e negativas para CD38, CD45, CD41/61. Estas células apresentaram curva de crescimento com fases de LOG, LAG e PLATEAU bem definidas, características das curvas de crescimento das células-tronco de origem mesenquimal. CONCLUSÕES: O isolamento e cultivo das células-tronco mesenquimais do cordão umbilical de ovinos é de difícil realização, exigindo maiores ensaios e estudos profundos. Células tronco do tecido adiposo de ovelhas demonstraram características mesenquimais, de acordo com a curva de crescimento, habilidade de formação de colônias, células com morfologia fibroblastóide e reação positiva ao anticorpo CD44.(AU)

Influência do resveratrol na qualidade e na fertilidade do espermatozoide suíno refrigerado entre 15-17ºC por 72 horas para inseminação artificial intrauterina

A preservação do sêmen suíno refrigerado para fins de inseminação artificial é a forma mais utilizada no mundo. Para tal, os espermatozoides são diluídos em meios que forneçam substratos para nutrir e proteger estas células. Porém, a faixa de temperatura de armazenamento do sêmen suíno refrigerado não é capaz de cessar completamente os mecanismos metabólicos dos espermatozoides, que em ambiente aeróbico da dose inseminante, produzem e liberam continuamente produtos do metabolismo do oxigênio. A ação das espécies reativas de oxigênio sobre o espermatozoide é uma das razões do declínio na população de células espermaticas estrutural e funcionalmente aptas à fertilizarem os gametas femininos. Portanto, a adição de um composto antioxidante ao meio diluidor poderia melhorar ou manter constante o número de espermatozoides viáveis ao longo do período de conservação da dose inseminante. Neste contexto, este trabalho objetivou verificar se a adição do antioxidante resveratrol geraria modificações positivas em parâmetros celulares relacionados à qualidade do sêmen suíno refrigerado à 15-17°C avaliados por sistema computadorizado da motilidade espermática e citometria de fluxo (experimento in vitro), e se este antioxidante melhoraria os índices de fertilidade na inseminação artificial intrauterina (IAIU) através da recuperação, contagem e identificação dos embriões (experimento in vivo). As concentrações testadas no experimento in vitro não superaram os resultados do tratamento controle (p<0,05), sendo a concentração de 1,0 mM prejudicial ao espermatozoide suíno (p<0,05). A utilização da concentração de 0,01 mM de resveratrol para inseminação das fêmeas suínas no experimento in vivo não apresentou efeito positivo nos índices de taxa de prenhez e fertilidade ajustada total (p>0,05), além de ter resultado em uma baixa taxa de embriões viáveis (p<0,05), quando comparados ao tratamento controle. Deste modo, pode concluir que não é indicado a adição do antioxidante resveratrol ao meio diluidor para inseminação artificial, uma vez que compromete a qualidade das células espermáticas do reprodutor suíno e impacta negativamente na fertilidade das fêmeas.

The preservation of chilled boar semen for artificial insemination is the most performed worldwide. For this, the sperm are extended in medium that provides substrates to nourish and protect these cells. However, the storage temperature range of chilled semen is not able to completely stop the metabolic mechanisms of sperm, which keeps producting and releasing oxygen reactive products in aerobic environment of insemination doses. The action of reactive oxygen species on the sperm is one of the reasons for decreasing sperm population with structural and functional capacity to fertilize the female gamete. Therefore, the addition of antioxidant compound to the extender medium could improve or maintain the number of viable spermatozoa throughout the conservation time of insemination doses. In this context, this work aimed to determine whether addition of antioxidant resveratrol would generate positive changes in cell parameters related to the quality of boar semen cooled to 15-17 °C assessed by computered analysis of sperm motility and flow citometry (in vitro experiment) and whether this antioxidant would improve fertility rates using intrauterine insemination (IUI) by the recovery, counting and embryos identification (in vivo experiment). The concentrations tested in vitro experiment have not exceed control treatment results (p <0.05), with the concentration of 1.0 mM being detrimental to the boar spermatozoa (p <0.05). The concentration of 0.01 mM of resveratrol used for gilts insemination in experiment in vivo has not shown positive effect on pregnancy rate and the total adjusted fertility (p> 0.05) and have resulted in a low rate viable embryos (p <0.05) compared to control. Thus, we conclued that the addition of resveratrol antioxidant in boar extender medium is not suitable for artificial insemination, once it compromises the quality of boar sperm cells and impairs on female fertility.

Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro.

Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency.