Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.(AU)

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.(AU)

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.

Aplicações dos testes de integridade acrossômica e reação acrossômica induzida para touros da raça Nelore / Applications of acrosome integrity and induced acrosome reaction tests to Nelore bulls

O objetivo do trabalho foi avaliar o desempenho e a variabilidade de resultados das provas funcionais de integridade acrossômica (IA) e a reação acrossômica induzida (RAI) em touros jovens da raça Nelore, bem como verificar suas associações com outros parâmetros andrológicos. Foram avaliadas 16 amostras de sêmen congelado de touros jovens da raça Nelore utilizando-se esfregaços em lâminas pelo método de Azul Trypan / Giemsa. A média geral da integridade acrossômica pós-congelação foi de 85 ± 6%, com redução para 76 ± 8% após quatro horas de incubação em banho maria a 37º C com meio de TALP HEPES com albumina. Os testes de RAI tiveram diferenças acentuadas entre os touros do experimento, com média 18 ± 9 %, com números máximos e mínimos de 44% a 3%. Os resultados sugerem que ambos os indutores Heparina e Heparina + Lisofosfatidilcolina (LPC) foram eficientes e devem ser utilizados nas avaliações de RAI. Na comparação entre touros de alta a baixa RAI quanto a diversos parâmetros andrológicos, houve diferença (p<0,05) apenas para motilidade pré-congelação entre os grupos, com resultados superiores para os touros de baixa RAI (≤ 17%). Quanto as correlações dos parâmetros andrológicos e as provas funcionais da qualidade espermática (IA e RAI), somente a motilidade espermática esteve negativamente correlacionada a RAI (–0,51, p<0,05). Concluiu-se que os testes de integridade acrossômica e reação acrossômica induzida são importantes testes complementares para avaliação da qualidade funcional dos espermatozoides, uma vez que apresentam alta variabilidade entre touros e baixa associação com outros parâmetros andrológicos. Entretanto, os mesmos devem ser interpretados dentro dos limites de avaliação dos processos associados a qualidade espermática, e não como um indicador amplo e único da fertilidade ou capacidade fecundante de touros.

The aim of this study was to evaluate the performance and variability of the results of functional tests for assessing acrosome integrity and heparin-induced acrosome reaction (IAR) in young Nellore bulls, as well as to verify their associations with other andrological parameters. Smears were prepared from 16 frozen semen samples of young Nellore bulls and stained with Trypan blue/Giemsa. The overall average post-freezing acrosome integrity was 85 ± 6%, with a reduction to 76 ± 8% after 4 hours of incubation and no large variation between bulls. Marked differences between bulls of the experiment were observed for the heparin IAR tests, with an average of 18 ± 9% (range 44% to 3%). The results suggest that both heparin and heparin + lysophosphatidylcholine were efficient inducers that should be used together in IAR evaluations. Comparison of the different andrological parameters between bulls with high and low IAR showed a difference (p<0.05) only for pre-freezing motility, with superior results for low IAR bulls (≤ 17%). There were no correlations between the andrological parameters and functional tests of sperm quality (acrosome integrity and IAR). Only pre-freezing sperm motility was negatively correlated with IAR (–0.51, p<0.05). In conclusion, the acrosome integrity and IAR tests are important complementary tests to evaluate the functional quality of sperm since they exhibit high variability between bulls and low association with other andrological parameters. However, the tests should be interpreted within the limits of evaluation of the processes associated with sperm quality and not as a broad indicator of bull fertility or reproductive capacity.

Aplicações dos testes de integridade acrossômica e reação acrossômica induzida para touros da raça Nelore / Applications of acrosome integrity and induced acrosome reaction tests to Nelore bulls

O objetivo do trabalho foi avaliar o desempenho e a variabilidade de resultados das provas funcionais de integridade acrossômica (IA) e a reação acrossômica induzida (RAI) em touros jovens da raça Nelore, bem como verificar suas associações com outros parâmetros andrológicos. Foram avaliadas 16 amostras de sêmen congelado de touros jovens da raça Nelore utilizando-se esfregaços em lâminas pelo método de Azul Trypan / Giemsa. A média geral da integridade acrossômica pós-congelação foi de 85 ± 6%, com redução para 76 ± 8% após quatro horas de incubação em banho maria a 37º C com meio de TALP HEPES com albumina. Os testes de RAI tiveram diferenças acentuadas entre os touros do experimento, com média 18 ± 9 %, com números máximos e mínimos de 44% a 3%. Os resultados sugerem que ambos os indutores Heparina e Heparina + Lisofosfatidilcolina (LPC) foram eficientes e devem ser utilizados nas avaliações de RAI. Na comparação entre touros de alta a baixa RAI quanto a diversos parâmetros andrológicos, houve diferença (p<0,05) apenas para motilidade pré-congelação entre os grupos, com resultados superiores para os touros de baixa RAI (≤ 17%). Quanto as correlações dos parâmetros andrológicos e as provas funcionais da qualidade espermática (IA e RAI), somente a motilidade espermática esteve negativamente correlacionada a RAI (–0,51, p<0,05). Concluiu-se que os testes de integridade acrossômica e reação acrossômica induzida são importantes testes complementares para avaliação da qualidade funcional dos espermatozoides, uma vez que apresentam alta variabilidade entre touros e baixa associação com outros parâmetros andrológicos. Entretanto, os mesmos devem ser interpretados dentro dos limites de avaliação dos processos associados a qualidade espermática, e não como um indicador amplo e único da fertilidade ou capacidade fecundante de touros.(AU)

The aim of this study was to evaluate the performance and variability of the results of functional tests for assessing acrosome integrity and heparin-induced acrosome reaction (IAR) in young Nellore bulls, as well as to verify their associations with other andrological parameters. Smears were prepared from 16 frozen semen samples of young Nellore bulls and stained with Trypan blue/Giemsa. The overall average post-freezing acrosome integrity was 85 ± 6%, with a reduction to 76 ± 8% after 4 hours of incubation and no large variation between bulls. Marked differences between bulls of the experiment were observed for the heparin IAR tests, with an average of 18 ± 9% (range 44% to 3%). The results suggest that both heparin and heparin + lysophosphatidylcholine were efficient inducers that should be used together in IAR evaluations. Comparison of the different andrological parameters between bulls with high and low IAR showed a difference (p<0.05) only for pre-freezing motility, with superior results for low IAR bulls (≤ 17%). There were no correlations between the andrological parameters and functional tests of sperm quality (acrosome integrity and IAR). Only pre-freezing sperm motility was negatively correlated with IAR (–0.51, p<0.05). In conclusion, the acrosome integrity and IAR tests are important complementary tests to evaluate the functional quality of sperm since they exhibit high variability between bulls and low association with other andrological parameters. However, the tests should be interpreted within the limits of evaluation of the processes associated with sperm quality and not as a broad indicator of bull fertility or reproductive capacity.(AU)

Sodium bicarbonate and HEPES as buffer components for cooling the semen of pony stallions / Bicarbonato de sódio e HEPES como tampões para o resfrigeração de sêmen de pôneis

The composition of semen diluents can modify its viability during cooling. The buffering effects of HEPES and sodium bicarbonate were evaluated considering the pH and sperm viability. The semen of seven adult Brazilian ponies was evaluated before and after cooling at 5o C for 24 h and 48 h. A non-buffered skim milk powder extender (C) and the same extender buffered with sodium bicarbonate (SB) and HEPES (H) were used. After dilution, semen (three ejaculates/pony) was centrifuged and the seminal plasma discarded. Sperm was then diluted with SB, H or C and its concentration adjusted to 50 x 106 sptz/mL. Progressive motility evaluated after dilution showed similar results with all extenders (71.42% (SB), 74.28% (H), and 74.52% (C)). Sperm motility was evaluated 24 h and 48 h after cooling for SB (44.76% and 25.23%), H (51.42% and 38.09%) and C (54.05% and 41.66%, respectively). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders (62.71% (SB), 68.76% (H), and 69.23% (C)). Mitochondrial activity was higher in SB immediately after dilution (SB= 1.05nm, H= 0.81nm, C= 0.79nm), and after 24 h (0.83nm (SB), 0.73nm (H) and 0.64nm (C)). After 48 h, the mitochondrial activity decreased to 0.72nm (SB), 0.69nm (H), and 0.63nm (C) (P > 0.05). The pH, osmolarity and pH after 48 h of cooling of the diluted semen were higher in SB (8; 382; 7.9), intermediate in H (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA), and Duncan’s test was used to evaluate the significant differences (P < 0.05). Sodium bicarbonate reduced the progressive motility and increased the semen pH. The extender C was considered more appropriate for immediate use in artificial insemination. The non-buffered and HEPES-buffered extenders were considered appropriate for the cooling of equine semen for 48 h at 5°C.

A composição dos diluentes de sêmen pode modificar sua viabilidade durante o processo de resfriamento. O efeito de tamponamento do HEPES e Bicarbonato de Sódio foi avaliado considerando o pH e a viabilidade espermática. Sete pôneis brasileiros adultos tiveram seu sêmen avaliado antes e após a refrigeração a 5°C durante 24 h e 48 h. Um diluente de leite em pó desnatado não tamponado (C) e um diluente tamponado com bicarbonato de sódio (SB) ou HEPES (H) foram utilizados. Após a diluição, o sêmen (três ejaculados/ pônei) foi centrifugado e o sobrenadante foi descartado. O sêmen foi então diluído com SB, H ou C e a concentração ajustada para 50 x 106 espermatozoides/mL. A motilidade progressiva avaliada após a diluição apresentou resultados similares para todos os diluentes (71,42% (SB), 74,28% (H), 74,52% (C)). A motilidade espermática foi avaliada 24 h e 48 h após o resfriamento, respectivamente, para SB (44,76%, 25,23%), H (51,42%, 38,09%) e C (54,05%, 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi semelhante após a exposição aos três diluentes (62,71% (SB), 68,76% (H), 69,23% (C)). A atividade mitocondrial após a diluição foi maior em SB (SB = 1.05nm, H = 0.81nm, C = 0.79nm) e após 24 h foi 0.83nm (SB), 0.73nm (H) e 0.64nm (C). A atividade mitocondrial após 48 h diminuiu para 0.72nm (SB), 0.69nm (H) e 0.63nm (C) (P > 0.05). O pH, a osmolaridade e o pH do sêmen diluído após as 48 h de refrigeração foram maiores em SB (8; 382; 7,9), intermediário em H (7,5; 362; 7,32) e menor em C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e sua indução foram semelhantes em todos os grupos. As médias foram avaliadas através de análise de variância (ANOVA) e o Teste Duncan foi utilizado para analisar as diferenças significativas (P < 0.05). O bicarbonato de sódio reduziu a motilidade progressiva e aumentou o pH do sêmen. O diluente C foi considerado mais adequado para uso imediato na inseminação artificial...

Sodium bicarbonate and HEPES as buffer components for cooling the semen of pony stallions / Bicarbonato de sódio e HEPES como tampões para o resfrigeração de sêmen de pôneis

The composition of semen diluents can modify its viability during cooling. The buffering effects of HEPES and sodium bicarbonate were evaluated considering the pH and sperm viability. The semen of seven adult Brazilian ponies was evaluated before and after cooling at 5o C for 24 h and 48 h. A non-buffered skim milk powder extender (C) and the same extender buffered with sodium bicarbonate (SB) and HEPES (H) were used. After dilution, semen (three ejaculates/pony) was centrifuged and the seminal plasma discarded. Sperm was then diluted with SB, H or C and its concentration adjusted to 50 x 106 sptz/mL. Progressive motility evaluated after dilution showed similar results with all extenders (71.42% (SB), 74.28% (H), and 74.52% (C)). Sperm motility was evaluated 24 h and 48 h after cooling for SB (44.76% and 25.23%), H (51.42% and 38.09%) and C (54.05% and 41.66%, respectively). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders (62.71% (SB), 68.76% (H), and 69.23% (C)). Mitochondrial activity was higher in SB immediately after dilution (SB= 1.05nm, H= 0.81nm, C= 0.79nm), and after 24 h (0.83nm (SB), 0.73nm (H) and 0.64nm (C)). After 48 h, the mitochondrial activity decreased to 0.72nm (SB), 0.69nm (H), and 0.63nm (C) (P > 0.05). The pH, osmolarity and pH after 48 h of cooling of the diluted semen were higher in SB (8; 382; 7.9), intermediate in H (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA), and Duncans test was used to evaluate the significant differences (P < 0.05). Sodium bicarbonate reduced the progressive motility and increased the semen pH. The extender C was considered more appropriate for immediate use in artificial insemination. The non-buffered and HEPES-buffered extenders were considered appropriate for the cooling of equine semen for 48 h at 5°C.(AU)

A composição dos diluentes de sêmen pode modificar sua viabilidade durante o processo de resfriamento. O efeito de tamponamento do HEPES e Bicarbonato de Sódio foi avaliado considerando o pH e a viabilidade espermática. Sete pôneis brasileiros adultos tiveram seu sêmen avaliado antes e após a refrigeração a 5°C durante 24 h e 48 h. Um diluente de leite em pó desnatado não tamponado (C) e um diluente tamponado com bicarbonato de sódio (SB) ou HEPES (H) foram utilizados. Após a diluição, o sêmen (três ejaculados/ pônei) foi centrifugado e o sobrenadante foi descartado. O sêmen foi então diluído com SB, H ou C e a concentração ajustada para 50 x 106 espermatozoides/mL. A motilidade progressiva avaliada após a diluição apresentou resultados similares para todos os diluentes (71,42% (SB), 74,28% (H), 74,52% (C)). A motilidade espermática foi avaliada 24 h e 48 h após o resfriamento, respectivamente, para SB (44,76%, 25,23%), H (51,42%, 38,09%) e C (54,05%, 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi semelhante após a exposição aos três diluentes (62,71% (SB), 68,76% (H), 69,23% (C)). A atividade mitocondrial após a diluição foi maior em SB (SB = 1.05nm, H = 0.81nm, C = 0.79nm) e após 24 h foi 0.83nm (SB), 0.73nm (H) e 0.64nm (C). A atividade mitocondrial após 48 h diminuiu para 0.72nm (SB), 0.69nm (H) e 0.63nm (C) (P > 0.05). O pH, a osmolaridade e o pH do sêmen diluído após as 48 h de refrigeração foram maiores em SB (8; 382; 7,9), intermediário em H (7,5; 362; 7,32) e menor em C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e sua indução foram semelhantes em todos os grupos. As médias foram avaliadas através de análise de variância (ANOVA) e o Teste Duncan foi utilizado para analisar as diferenças significativas (P < 0.05). O bicarbonato de sódio reduziu a motilidade progressiva e aumentou o pH do sêmen. O diluente C foi considerado mais adequado para uso imediato na inseminação artificial...(AU)

Intracytoplasmic Sperm Injection after Vitrification of Immature Oocytes in Follicular Fluid Increases Bovine Embryo Production

Background: Despite the low efficiency caused by its harmful effects, vitrification is the technique of choice for oocyte cryopeservation, especially at the germinal vesicle (GV) stage. This enables the banking of female gametes without linkage to the male genotype. Follicular fluid (FF), in vivo, is known to provide an adequate environment to the immature oocyte. The intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI), by the other hand, can be used to bypass any sperm penetration disorder, including the ones caused by cryopreservation. This study aimed to evaluate oocyte vitrification in FF based solution, and to asses ICSI efficiency in the fertilization of vitrified/warmed bovine GV oocytes.Material, Methods & Results: Follicles of 2-8 mm in diameter were aspirated from bovine ovaries obtained from a slaughterhouse, selected and maintained into FF from aspiration, until their allocation in the experimental groups. The FF used to prepare the vitrification solution was centrifuged, heat inactivated, filtered through a 0.22 mm pore and stored at -20C. Oocyte vitrification was done into one of these three solutions: The standard solution TCM-Hepes (TH-Vitri) was compared to a totally FF based solution (FF-Vitri), and to a 50:50 (v/v) mix of both solutions (TH:FF-Vitri). Oocytes were submitted to in vitro embryo production in order to assess embryo production efficiency. A second set

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Intracytoplasmic sperm injection after vitrifcation of immature oocytes in follicular fluid increases bovine embryo production

Background: Despite the low efficiency caused by its harmful effects, vitrification is the technique of choice for oocyte cryopeservation, especially at the germinal vesicle (GV) stage. This enables the banking of female gametes without linkage to the male genotype. Follicular fluid (FF), in vivo, is known to provide an adequate environment to the immature oocyte. The intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI), by the other hand, can be used to bypass any sperm penetration disorder, including the ones caused by cryopreservation. This study aimed to evaluate oocyte vitrification in FF based solution, and to asses ICSI efficiency in the fertilization of vitrified/warmed bovine GV oocytes. Material, Methods & Results: Follicles of 2-8 mm in diameter were aspirated from bovine ovaries obtained from a slaughterhouse, selected and maintained into FF from aspiration, until their allocation in the experimental groups. The FF used to prepare the vitrification solution was centrifuged, heat inactivated, filtered through a 0.22 mm pore and stored at -20°C. Oocyte vitrification was done into one of these three solutions: The standard solution TCM-Hepes (TH-Vitri) was compared to a totally FF based solution (FF-Vitri), and to a 50:50 (v/v) mix of both solutions (TH:FF-Vitri). Oocytes were submitted to in vitroembryo production in order to assess embryo production efficiency. A second set of experiments using the FF-Vitri solution compared IVF versus ICSI. With basis on cleaved structures, the morula + blastocyst rate obtained in the Fresh Control (43.9%) was similar to FF-Vitri (31.1%). Conversely, the TH-Vitri (15.7%) and the TH:FF-Vitri (20.4%) rates were significantly lower than the Fresh Control. ICSI showed a positive effect in comparison with IVF. The embryo development rate of Vitri-IVF (18.8%) was the lowest, whereas Vitri-ICSI (37.3%) was similar to the Fresh-IVF (43.9%), but lower than the Fresh-ICSI (57.8%).[...]

Intracytoplasmic sperm injection after vitrifcation of immature oocytes in follicular fluid increases bovine embryo production

Background: Despite the low efficiency caused by its harmful effects, vitrification is the technique of choice for oocyte cryopeservation, especially at the germinal vesicle (GV) stage. This enables the banking of female gametes without linkage to the male genotype. Follicular fluid (FF), in vivo, is known to provide an adequate environment to the immature oocyte. The intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI), by the other hand, can be used to bypass any sperm penetration disorder, including the ones caused by cryopreservation. This study aimed to evaluate oocyte vitrification in FF based solution, and to asses ICSI efficiency in the fertilization of vitrified/warmed bovine GV oocytes. Material, Methods & Results: Follicles of 2-8 mm in diameter were aspirated from bovine ovaries obtained from a slaughterhouse, selected and maintained into FF from aspiration, until their allocation in the experimental groups. The FF used to prepare the vitrification solution was centrifuged, heat inactivated, filtered through a 0.22 mm pore and stored at -20°C. Oocyte vitrification was done into one of these three solutions: The standard solution TCM-Hepes (TH-Vitri) was compared to a totally FF based solution (FF-Vitri), and to a 50:50 (v/v) mix of both solutions (TH:FF-Vitri). Oocytes were submitted to in vitroembryo production in order to assess embryo production efficiency. A second set of experiments using the FF-Vitri solution compared IVF versus ICSI. With basis on cleaved structures, the morula + blastocyst rate obtained in the Fresh Control (43.9%) was similar to FF-Vitri (31.1%). Conversely, the TH-Vitri (15.7%) and the TH:FF-Vitri (20.4%) rates were significantly lower than the Fresh Control. ICSI showed a positive effect in comparison with IVF. The embryo development rate of Vitri-IVF (18.8%) was the lowest, whereas Vitri-ICSI (37.3%) was similar to the Fresh-IVF (43.9%), but lower than the Fresh-ICSI (57.8%).[...](AU)

Influence of anestrus and diestrus stages of oocyte on meiotic competence in bitches / Influência das fases de anestro e diestro na competência meiótica oocitária de cadelas

The bitch has reproductive peculiarities that differentiate it from other species. Several experiments have been conducted to establish efficient protocols for maturation; however, the results appear to be unsatisfactory. In this respect, the reproductive female donor should be considered, since it can be a factor of variability of findings in this species. The objective of this study was to evaluate the relationship between the estrous cycle phases phase diestrus and anestrus on canine oocyte in vitro maturation (IVM). The ovaries were transported in sodium chloride 0.9% solution, and were cut into phosphate-buffered saline (PBS) and the cumulus-oocyte complexes (COCs) selected in tissue culture medium (TCM), supplemented with 199 HEPES. A total of 469 grade 1 oocytes were collected from bitches in anestrus and diestrus. These selected oocytes were transferred to the maturation medium for a period of 72 hours, then subjected to hyaluronidase solution and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear configuration. The comparison of anestrus and diestrus phase showed no differences (p > 0.05) between the nuclear maturation stages. Thus, the phase of the estrous cycle did not influence the in vitro maturation of canine oocytes, increasing the rates of M-II in this species.(AU)

A cadela apresenta particularidades reprodutivas que a diferencia de outras espécies. Diversos experimentos têm sido realizados visando estabelecer protocolos eficientes para a maturação, entretanto os resultados mostram-se insatisfatórios. Nesse aspecto, a fase reprodutiva da fêmea doadora deve ser considerada, já que pode ser um fator de variabilidade dos achados ate então presenciados nessa espécie. O objetivo deste estudo foi avaliar a influencia das fases do ciclo estral (anestro e diestro) na maturação in vitro (MIV) de cadelas. Os ovários foram transportados em solução de cloreto de sódio 0,9% e seccionados em solução salina fosfato tamponado (PBS) e os complexos cumulus-oócito (COCs) selecionados em meio de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com HEPES. Foram obtidos 469 oócitos grau 1 de cadelas em anestro e diestro. Esses oócitos selecionados foram transferidos para o meio de maturação por um período de 72 horas, sendo posteriormente submetidos a solução de hialuronidase e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da configuração nuclear. A comparação das fases de anestro e diestro não revelou diferença (p > 0,05) entre os estágios de maturação nuclear. Dessa maneira, a fase do ciclo estral não influenciou na maturação in vitro de oócitos caninos, incrementando os índices de M-II nesta espécie.(AU)

Effect of transport temperature of ovaries on in vitro maturation of canine oocytes collected in different stages of the estrous cycle / Influência da temperatura de transporte de ovários na maturação in vitro de oócitos caninos coletados em diferentes estágios do ciclo estral

This study evaluated the influence of estrous cycle stage and transport temperature of ovaries on in vitro maturation of canine oocytes. The bitches were categorized into two groups based on stage of estrus cycle: diestrus or anestrus. One ovary of each pair collected was transported in saline solution at 4°C while the other was transported at 37°C. Thus, ovarian tissue was sliced in PBS to release cumulus oocyte complexes (COCs). A total of 345 COCs (n = 186 oocytes from ovaries of bitches in anestrus and 159 in diestrus) were cultivated in TCM 199 supplemented with HEPES, sodium pyruvate, cysteine, follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin (hCG), estrogen (E2) and epidermal growth factor (EGF). After 72h of maturation, the COCs were denuded, fixed and stained to assess nuclear maturation. The Fisher test was applied to examine the differences between the groups. The significance level adopted was 0.05. The oocytes obtained from the ovaries from bitches in diestrus transported at 4°C shown increased frequency of oocytes in metaphase II stage than those maintained at 37°C (p 0.01). Similarly, there was increased frequency of oocytes in metaphase II (11.1%) stage from the ovaries of bitches in anestrus and transported at 4°C, than those maintained at 37°C (p 0.05). It was concluded that transport temperature influences the results of canine oocyte viability and in vitro maturation, regardless of reproductive stage of the female.(AU)

Foi avaliada a influencia do ciclo estral e temperatura de transporte de ovários na maturação in vitro de oócitos caninos. As cadelas foram categorizadas em dois grupos baseados no estagio do ciclo estral anestro ou diestro. Um ovário por par coletado foi transportado em solução fisiológica 0,9% a 4°C enquanto o outro foi transportado a 37°C. Então, os ovários foram seccionados em PBS para a liberação dos complexos cumulus oocito (COCs). Um total de 345 COCs (n = 186 oocitos obtidos de cadelas em anestro e 159 em diestro) foi cultivado em TCM 199 suplementado com HEPES, piruvato de sódio, cisteina, hormônio folículo estimulante (FSH), gonadotrofina coriônica humana (hCG), estrógeno (E2) e fator de crescimento epidermal (EGF). Apos 72h de maturação, os COCs foram desnudados, fixados e corados para avaliação da maturação nuclear. O teste de Fisher foi utilizado para avaliar as diferenças entre os grupos. O nível de significância adotado foi de 0,05. Os oócitos obtidos de cadelas em diestro transportados a 4°C apresentaram maior frequência de oócitos no estagio de metáfase II (21,1%) que os mantidos na temperatura de 37°C (p 0,01). De forma similar, houve maior frequência de oócitos nos estágios de metáfase II (11,2%) nos ovários obtidos de cadelas em anestro e transportados a 4°C que nos ovários mantidos a 37°C (p 0,05). Concluiu-se que a temperatura de transporte influencia os resultados de viabilidade oocitária canina e a maturação in vitro, independentemente do estagio reprodutivo da fêmea.(AU)

Transfecção de anticorpos como terapia anti-viral para a raiva

A raiva é uma zoonose conhecida desde a Mesopotâmia, temida por milênios em todo omundo por seu rápido e progressivo número de casos fatais, e agora é endêmicaem países em desenvolvimento, com uma estimativa de 6.000.000 de mortes humanas por ano. O pequeno número de pacientes que sobreviveram a raiva ainda é motivo de debate, em meio a tentativas de estabelecer um tratamento eficaz para pacientes humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de tranfecção de anticorpos F (ab ') anti-RABV com uso de dois agentes de transfecção catiônicos (Pulsin / Bioporter) in vivo, bem como avaliar a eficácia deste método como terapia antiviral. Camundongos foram inoculados pela via intracerebral com 30 l de um isolado de RABV (AgV2), contendo 10 LD50%. Após 48h, dois tratamentos foram realizados: Para o Tratamento-1, 180 l de F (ab ') anti-RABV foram combinados com 360 l de Hepes 20 mM pH 7,4 e adicionados 60 l de Pulsin ® (Polyplus). Para otratamento 2, o reagente Bioporter ® foi ressuspendido com a F (ab ') anti-RABVna concentração final de 250 g / ml. Os grupos controles foram tratados com os agentes de transfecção sem anticorpos. As soluções foram então inoculadas por via intracerebral em volume de (30 l) em cada um dos quinze animais. No tratamento-1, comparando os grupos tratado e controle, não houve diferença significativa (p = 1). No tratamento-2, a taxa de sobrevivência foi de 70% para o grupo tratado, enquanto a mortalidade nos animais do grupo controle foi de 90% (p <0,0198). De modo a diferenciar entre o efeito antiviral pela transfecção da F (ab ') anti-RABV e um possível efeito antiviral do próprio agente de transfecção Bioporter ®, os camundongos foram sujeitos a infecção com 30 l do isolado RABV acima mencionado, contendo 10 LD50% . Após 48 horas, 30 L de reagente Bioporter ressuspenso em Hepes 20 mM, pH 7, foram inoculados pela via intracerebral em 10 camundongos, enquanto para o grupo controle (n = 10), foi utilizado somente Hepes 20 mM, pH 7,4. Houve uma taxa de sobrevivência de 50 e 20%, para os grupos Bioporter e controle, respectivamente, sem diferença significativa (p = 0,4949), mostrando que o efeito antiviral observado no primeiro experimento foi devido ao anticorpo transfectado. A inibição da replicação de RABV pode ser obtida pela técnica de transfecção de anticorpos, uma ferramenta valiosa a ser adicionada como uma terapia antiviral para o tratamento da raiva em humanos.

Rabies is a zoonosis known since Mesopotamia, which has been feared for millennia throughout the world for its rapid and progressive number of fatal cases, and now itss endemic in developing countries, with an estimated 6,000,000 human deaths per year. The small number of patients who survived the disease is still a subject of debate, amid attempts to establish an effective treatment for human patients. The objective of this study was to evaluate the transfection capacity of anti-RABV F (ab ') antibodies with the use of two cationic reagents (Pulsin / Bioporter) in vivo, as well as to evaluate the effectiveness of this method as an antiviral therapy. Mice were inoculated by the intracerebral route with 30 l of a dog RABV isolate (AgV2), containing 10 LD50%. After 48h, two treatments were performed: For Treatment 1, 180 l of anti-RABV F (ab ') were combined with 360 l of 20 mM Hepes pH 7.4 and added 60 l of Pulsin ® (Polyplus). For Treatment-2, the Bioporter ® reagent was resuspended with the anti-RABV F (ab ') in final concentration of 250 g / ml. Control groups were mock-treated with the transfection agents devoid of antibobies. The solutions were then inoculated (30 l) by intracerebral route into fifteen animals each. In treatment-1, comparing the treated and control groups, there was no significant difference (p = 1). In treatment-2, survival rate was 70% for the treated group, while mortality in animals of the control group was 90% ((p<0,0198).). In order to differentiate between the antiviral effect of transfected anti-RABV F (ab ') and a possible antiviral effect of the Bioporter ® transfection agent itself, mice were subjected to infection with 30 l of the abovementioned RABV isolate, containing 10 LD50%. After 48hr, 30 L Bioporter reagent resuspended in 20 mM Hepes,pH 7 were inoculated by the intracerebral route in 10 mice, while, for the control group (n=10), 20 mM Hepes, pH 7.4 was used instead. There was a 50 and 20% survival rate for the Bioporter and control groups, respectively, with no significant difference (p = 0.4949), showing that the antiviral effect observed in the first experiment was due to the transfected antibody. Inhibition of RABV replication can be achieved by the antibody transfection technique, a valuable tool to be added as an antiviral therapy for the treatment of rabies in humans.

Efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) na maturação in vitro de oócitos caninos / Effect of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocyte

Este trabalho leve o objetivo de avaliar a influência do EGF na maturação in vitro (MIV) de cadelas. Realizou-se o transporte dos ovários em solução de cloreto de sódio 0,9%, que foram seccionados em solução salina fosfato temponado (PBS) e os complexos cumulus oócitos (COCs) selecionados em meio de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com HEPES. Foram coletados 405 oócitos grau 1 de cadelas em anestro e diestro. Os oocitos provenientes das duas fases do ciclo estral foram submetidos a dois tratamentos: meio com adição de 10ng/mL do fator de crescimento epidermal (EGF) (T) e meio sem suplementação (C). Depois de 72 horas de maturação, os COCs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos dos ovários da fase de diestro do grupo T demonstraram maior porcentagem (18,8%) de oócitos no estágio de metáfase II (M-II), em relação ao grupo C (1,3%) (p < 0,01). Nos oócitos obtidos da fase de anestro houve diferença (p < 0,05) entre os grupos, observando-se menor parcela (4,1%) de oócitos no estágio de vesícula germinativa (VG) no grupo T, quando comparado ao grupo C (16,1%). Comparando-se as diferentes fases reprodutivas, em meios suplementados com EGF, foi observada diferença (p < 0,05) apenas nos oócitos obtidos da fase de diestro em relação ao estágio de M-II. Dessa maneira, a suplementação no meio de maturação na concentração de 10 ηg/mL, neste estudo, exerceu influência positiva apenas na MIV de oócitos caninos oriundos da fase de diestro, incrementando os índices de M-II nessa espécie.(AU)

This work aimed to evaluate the influence of EGF on canine oocyte in vitro maturation (IVM). We carried out the transport of the ovaries in sodium chloride 0.9% solution, which were cut into phosphate-buffered saline (PBS) and the cumulus oocyte complexes (COCs) selected in tissue culture medium (TCM), supplemented with 199 HEPES. A total of 405 grade 1 oocytes were collected from bitches in anestrus and diestrus. Oocytes from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium with addition of 10 ηg/mL epidermal growth factor (EGF) (T) and medium without supplementation (C). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the ovaries of the diestrus phase of the T group demonstrated higher percentage (18.8%) of oocytes at metaphase II stage (M-II) than C group (1.3%) (p < 0.01). The oocytes from anestrus phase demonstrated difference (p < 0.05) between the groups, observing smaller proportion (4.1%) of oocytes at the stage of germinal vesicle (GV) in group T compared to group C (16.1%). Comparing the different reproductive status in media supplemented with EGF difference (p < 0.05) was observed only in oocytes diestrus phase relative to the stage of M-II. Thus, supplementation on maturation medium at a concentration of 10 ηg/mL of EGF in this study had positive influence only on IVM of canine oocytes obtained from diestrus phase, increasing the levels of M-II in this species.(AU)

INSULINA AFETA O DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS CULTIVADOS IN SITU

A insulina pode desempenhar, no cultivo in vitro, efeitos sobre a foliculogênse os quais permitiram uma maior obtenção de folículos pré-antrais para posterior produção de embrião. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar o efeito do hormônio insulina sobre o cultivo in vitro de fragmentos ovarianos da espécie ovina, associando ou não com FSH. Para ovários foram coletados em matadouros e armazenados em meio MEM-HEPES a 4 °C e levados ao laboratório. Para o cultivo in vitro, foram obtidos fragmentos do córtex ovariano (3x3x2mm) e cultivados em meio -MEM+ por 8 dias a 39°C com 5% de CO2. Após os cultivos os fragmentos foram processado e analisados na histológica para avaliação morfológica do desenvolvimento folicular (ativação, manutenção da morfologia e diâmetro do oócito e folículo), análise imuno-histoquímica para localização do antígeno de proliferação nuclear e expressão gênica do RNA mensageiro mRNA para o gene apoptótico (caspase 3) e da esteroidogênese (CYP17 e CYP19). O fluxo de informação permitiu separar o estudo em dois experimentos. Experimento 1: Cultivo in vitro dos tecidos, avaliando os efeitos do hormônio insulina nas concentrações de (0, 1, 10, 100, 1.000 e 10.000 ng/mL), sobre a ativação, desenvolvimento e manutenção da morfologia. Experimento 2: Cultivo in vitro com hormônio insulina (0, 1, 100 ng/mL) associada com FSH sobre a ativação, desenvolvimento, manutenção da morfologia, antígeno de proliferação nuclear (PCNA) e expressão dos genes caspase 3, CYP17 e CYP19. No experimento 1 os resultados demonstraram que: Os maiores percentuais de ativação foram observados nas concentrações de 1 e 100 ng/mL do hormônio (P < 0,05), a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior (P< 0,05) para os tecidos cultivados em 1 e 10 ng/mL de insulina comparado aos tecidos cultivados apenas em -MEM+. Com relação ao crescimento não foi observada diferença do diâmetro do oócito e folículo após o cultivo in vitro em nenhuma das concentrações da insulina. Entretanto na concentração de 10,000 ng/mL houve uma redução significativa no diâmetro folicular quando comparado aos tecidos cultivados apenas em -MEM+ (P < 0,05). No experimento 2: Os resultados demonstraram que após 8 dias de cultivo com as concentrações de insulina (1, 10 e 100 ng/mL) associado com FSH, apresentaram uma maior ativação (P < 0,05). Do mesmo modo, a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior na concentração de 10 ng/mL com e sem FSH (P < 0,05). A marcação do PCNA pela imunohistoquímica demonstrou a presença do antígeno no oócito, em todos os grupos analisados, e nas células da granulosa, apenas no grupo que não foi submetido ao cultivo. A porcentagem de pixel para a marcação do PCNA em todas as concentrações de insulina associada ao FSH, foi maiores que os grupos sem FSH (P<0,05). A expressão dos genes CYP17 e CYP19 foram identificada em todos os grupos, entretanto sem diferença significativa. A expressão do gene caspase 3 no grupo IN1FSH (P < 0,05) do que nos grupos IN10, IN100, IN10FSH e IN100FSH. Em conclusão a insulina no cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de ovelhas, sozinha ou associada com FSH atua de forma dose-dependente na ativação folicular, preservando a morfologia, mas sem alterar o diâmetro folicular. Em alta concentração (10.000 ng/mL) a insulina possui efeito inibitório sobre o crescimento inicial dos folículos. Conclui-se, ainda, que a insulina pode reduzir a expressão do gene relacionado com a apoptose (caspase 3), quando em concentrações intermediárias (10 e 100 ng/mL) especialmente associados ao FSH.

Insulin may have effects on folliculogenesis in in vitro culture, which allowed a greater preantral follicles to be obtained for later embryo production. In this context, the objective of this work was to determine the effect of the hormone insulin on the in vitro culture of ovarian fragments of the ovine species, associated or not with FSH. For ovaries were collected in slaughterhouses and stored in MEM-HEPES medium at 4 ° C and taken to the laboratory. For in vitro culture, fragments of the ovarian cortex (3x3x2mm) and cultured in -MEM + medium were obtained for 8 days at 39 ° C with 5% CO2. After culture, the fragments were processed and histologically analyzed for morphological evaluation of follicular development (activation, maintenance of the morphology and diameter of the oocyte and follicle), immunohistochemical analysis for localization of the nuclear proliferation antigen and gene expression of mRNA messenger RNA for the apoptotic gene (caspase 3) and steroidogenesis (CYP17 and CYP19). The flow of information allowed to separate the study in two experiments. Experiment 1: In vitro culture of the tissues, evaluating the effects of the hormone insulin at the concentrations of (0, 1, 10, 100, 1.000 and 10.000 ng/mL) on the activation, development and maintenance of morphology. Experiment 2: In vitro culture with hormone insulin (0.1, 100 ng/mL) associated with FSH on the activation, development, maintenance of morphology, nuclear proliferation antigen (PCNA) and expression of caspase 3, CYP17 and CYP19 genes. In the experiment 1 the results showed that: The highest percentages of activation were observed at concentrations of 1 and 100 ng/mL of the hormone (P <0.05), the percentage of morphologically normal follicles was significantly higher (P <0.05) for tissues cultured in 1 and 10 ng / mL insulin compared to tissues cultured only in -MEM+. Regarding growth, no difference in oocyte and follicle diameter was observed after in vitro culture at any of the insulin concentrations. However, at the concentration of 10,000 ng / mL there was a significant reduction in follicular diameter when compared to tissues cultured only in -MEM+ (P <0.05). In the experiment 2, the results showed that after 8 days of culture with insulin concentrations (1, 10 and 100 ng / mL) associated with FSH, they presented a greater activation (P<0.05). Likewise, the percentage of morphologically normal follicles was significantly higher at 10 ng / mL concentration with and without FSH (P <0.05). The PCNA labeling by immunohistochemistry showed the presence of the antigen in the oocyte, in all the analyzed groups, and in the granulosa cells, only in the group that was not submitted to the culture. The percentage of pixel for PCNA labeling at all FSH associated insulin concentrations was higher than the non FSH groups (P <0.05). The expression of the CYP17 and CYP19 genes were identified in all groups, however without significant difference. The expression of the caspase 3 gene in the IN1FSH group (P <0.05) than in the IN10, IN100, IN10FSH and IN100FSH groups. In conclusion, insulin in the in vitro culture of ovarian sheep fragments alone or associated with FSH acts in a dosedependent manner on follicular activation, preserving the morphology, but without altering the follicular diameter. At high concentration (10,000 ng/mL) insulin has an inhibitory effect on the initial follicle growth. It is also concluded that insulin can reduce the expression of the gene related to apoptosis (caspase 3), when in intermediate concentrations (10 and 100 ng/mL) especially associated with FSH.

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

Os objetivos da presente tese foram: 1) Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia, crescimento folicular, viabilidade, maturação oocitaria, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados e cultivados por 18 dias (Fase I); 2) Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional na ausência (folículos primordiais isolados inclusos em Alginato - 0,8%) ou na presença de tecido ovariano (Fase II); 3) Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 7 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos babuínos (Fase III) inclusos em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou polyethyleneglycol-vinyl sulfone (PEG-VS) - 5%); 4) Investigar o efeito de diferentes concentrações de Cilostamida (10 e 20 M) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante a MIV de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV). Na Fase I, os ovários caprinos foram transportados individualmente em MEM-HEPES a 4 ou 33 °C. Posteriormente, os folículos foram cultivados in vitro por 18 dias e os complexos cumulus-oócito (CCO) maturados por 32 horas. Na Fase II, os folículos primordiais caprinos inclusos em Alginato (10 folículos/gota), ou envoltos em tecido ovariano (in situ) encapsulado ou não em Alginato, foram cultivados por 7 dias. Na Fase III, os folículos babuínos previamente criopreservados foram cultivados por 10 dias incluso em tecido ovariano (in situ), na presença ou ausência de matrizes extracelulares (PEG-VS vs Alginato) e de FSH. Por fim, na Fase IV, CCOs caprinos e bovinos foram cultivados por 30 horas, iniciando com a adição da Cilostamida (10 ou 20 M) e/ou parede folicular por 6 ou 12 horas durante a pré-maturação in vitro (PMIV) antes da MIV (24 ou 18h). O melhor resultado para produção de oócitos totalmente crescidos e retomada meiótica foi obtido utilizando baixa (4 °C) para folículos pré-antrais e alta (33 °C) para folículos antrais iniciais (Fase I). Folículos primordiais caprinos isolados e encapsulados em Alginato apresentaram maiores percentuais de ativação folicular quando comparado aos demais tratamentos (Fase II). Na Fase III, a adição de FSH ao meio de cultivo no tratamento com matrizes (PEG-VS e Alginato) promoveu uma melhora na sobrevivência dos folículos pré-antrais babuínos inclusos em tecido ovariano após 10 dias cultivo in vitro. Na Fase IV, a combinação da concentração/tempo de exposição à Cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas na espécie bovina após 6 e 12 horas de cultivo. Como conclusão, a temperatura de transporte afetou diferencialmente o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais caprinos (Fase I); cultivo de folículos primordiais caprinos isolados e inclusos em Alginato permitiu uma melhor taxa de ativação folicular (Fase II). Em babuínos, utilização de matrizes extracelulares na presença de FSH melhorou a sobrevivência folicular após 10 dias de cultivo in vitro (Fase III). Por fim, na Fase IV, a Cilostamida retardou de forma concentração dependente a retomada da meiose somente na espécie bovina.

The objectives of this thesis were: 1) To determine the effect of transport temperature (4 vs 33ºC) on morphology, follicular growth, viability and oocyte maturation, and production of reactive oxygen species (ROS) of preantral and early antral follicles goats for 18 days in vitro culture (Phase I); 2) to evaluate follicular survival and activation rates after 7 days of in vitro culture in a three-dimensional system in the absence (isolated primordial follicles and included in Alginate - 0.8%) or in the presence of ovarian tissue (Phase II); 3) To investigate the survival, activation and follicular growth after 7 days of in vitro culture of ovarian fragments of baboons (Phase III) included in different matrices (Alginate - 1% or poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG) - 5%); 4) Investigate the effect of different concentrations of Cilostamida (10 and 20 M) and exposure times (6 and 12 hours) during IVF of bovine and goat oocytes (Phase IV). In Phase I, goat ovaries were individually transported in MEM-HEPES at 4 or 33 ° C. Subsequently, the follicles were cultured in vitro for 18 days and cumulus-oocyte (CCO) complexes matured for 32 hours. In Phase II, the primordial goat follicles included in Alginate (10 follicles / drop), or wrapped in ovarian tissue (in situ) encapsulated or not in Alginate, were cultured for 7 days. In Phase III, pre-cryopreserved baboon follicles were cultured for 10 days in ovarian tissue (in situ), in the presence or absence of extracellular matrices (PEG-VS vs. Alginate) and FSH. Finally, in the Phase IV, the goat and cattle COCs were cultured for 30 hours, starting with in vitro pre-maturation (IVPM) for 6 or 12 hours before IVM (24 or 18h). The best result for the production of fully-grown oocytes and meiotic resumption was obtained using low (4 ° C) for preantral follicles and high (33 ° C) for initial antral follicles (Phase I). Phase II results showed that caprine primordial follicles isolated and encapsulated in Alginate presented satisfactory rates of survival and higher percentages of follicular activation when compared to the other treatments. In the Phase III, treatments containing medium supplemented with FSH associated and extracellular matrices (Alginate and PEG-VS) promoted an improvement in the survival of baboon preantral follicles included in the ovarian tissue after 10 days in vitro culture. In the Phase IV, the combination of concentration/exposure time to cilostamide during IVPM delayed the meiotic progression only in the bovine species after 6 and 12 hours of culture. In conclusion, the transport temperature differentially affected the in vitro development of preantral follicles and initial antral follicles (Phase I); the in vitro culture of isolated goat primordial follicles enclosed in Alginate allowed a better rate of follicular activation (Phase II); In baboons, the use of extracellular matrices in the presence of FSH improved follicular survival after 10 days of in vitro culture (Phase III). Finally, in the Phase IV, the cilostamide delayed in a concentration/dependent manner the meiotic resumption in bovine species only.

TAMPÕES E ANTIOXIDANTES NA QUALIDADE DO SÊMEN DE PÔNEIS

A inseminação artificial é utilizada como uma importante ferramenta para o melhoramento reprodutivo, tanto com sêmen resfriado ou congelado. O primeiro experimento teve como objetivo identificar um tampão de pH para resfriamento de sêmen de pôneis por 48 horas a 5°C e 15°C. O efeito de cinco tampões (TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfônico), PIPES (ácido piperaxín-N,N'-bis(2-etanosulfônico)), BES (ácido N,N-Bis(2-18hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MES (ácido 4-morfolinoetanosulfônico) e HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfônico)) foi avaliado em um diluente composto de leite em pó desnatado e glicose. Os testes do diluente com os tampões BES, MES e TES foram conduzidos com o sêmen fresco de oito pôneis e no sêmen resfriado por 48 h a 15°C. Uma amostra de cada grupo foi utilizada para análise da motilidade, pH, osmolaridade, teste hiposmótico, atividade mitocondrial (MTT) e integridade de membrana através das sondas fluorescentes. O pH e a osmolaridade dos diluentes sem o sêmen também foram avaliados. Os dados foram analisados por análise de variância e pelo teste de Tukey, quando P < 0.05 foi significante. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm e TES 350 ± 12.96 mOsm. O pH do sêmen após diluição nos respectivos diluentes variou entre as horas avaliadas (P < 0.05) e não variou com o passar do tempo o que evidencia o efeito tamponante dos diluentes. A osmolaridade dos dilue ntes foi similar entre os tampões BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) ou TES (371 ± 5.47 mOsm) a fresco e sem adição de sêmen. Já o pH variou (P < 0.05) de acordo com o tampão. No experimento a 5°C ocorreu decréscimo na porcentagem de motilidade t otal, progressiva e local do sêmen resfriado após 24 h e 48 h comparado a avaliação a fresco em todos os grupos. No entanto, a porcentagem de espermatozoides móveis a fresco, 24 h e 48 h a 5°C entre tratamentos foi similar. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, e com atividade mitocondrial não diferiu entre tratamentos. No experimento a 15°C o vigor e motilidade total, progressiva e local foram similares entre os tampões BES, MES e TES em cada período avaliado. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm e TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Devido as características individuais de cada tampão o pH do sêmen diluído variou entre os diluentes com os tampões utilizados. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, com atividade mitocondrial e membrana intacta observada com CFDA e PI não diferiu entre tratamentos. Evidenciou-se que tanto BES, MES ou TES podem ser utilizados no armazenamento e transporte do sêmen de pôneis durante 48 h a 5°C ou 15°C. O segundo experimento teve como objetivo foi avaliar a influência da suplementação de ácidos graxos poli-insaturados sobre a qualidade de sêmen de pôneis da raça Brasileira a fresco e após congelamento. Oito pôneis receberam sua dieta convencional não suplementada (grupo controle) ou dieta convencional e 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA (grupo PUFA). O efeito da Vitamina E (1 mM, DL--tocoferol ), adicionada ao diluente de congelamento para sêmen também foi avaliado sobre a qualidade seminal, antes e após o congelamento do sêmen. O sêmen foi coletado a cada 15 dias durante 60 dias. Os garanhões tratados passaram a controle e vice-versa após um intervalo de sessenta dias. O sêmen foi avaliado a fresco e após o congelamento. Motilidade e vigor foram avaliados a fresco. Após o descongelamento motilidade, funcionalidade de membrana, integridade de membrana e análise computadorizada da motilidade foram avaliados. Os valores médios para os parâmetros avaliados a fresco no grupo PUFA e controle foram similares. Os valores médios da motilidade total, progressiva e local, hiposmótico, CFDA/PI e análise computadorizada de sêmen suplementados com DHA e o grupo controle pós-descongelamento não diferiram. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente não potencializou a capacidade antioxidante do diluente durante o congelamento. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente resultou em diminuição da motilidade total e progressiva comparada ao grupo não suplementado (controle). A suplementação de 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA e ou a inclusão de 1 mM de vitamina E ao diluente de congelamento de sêmen em pôneis da raça Brasileira não foi eficiente para promover melhoria na viabilidade seminal após a coleta ou mesmo após o congelamento.

Artificial insemination with cooled and frozen semen is an important tool for breeding industry. The first experiment aimed to identify a pH buffer for cooling semen of ponies for 48 h at 5°C and 15°C. The effect of five buffers (TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), PIPES (piperaxin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), BES (N, N-Bis (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)) was evaluated in a extender composed of skimm milk powder and glucose. Analysis with the BES, MES and TES buffers were performed in fresh semen of eight ponies and in cooled semen for 48 h at 15°C. A sample from each group was used for analysis of motility, pH, osmolarity, hyposmotic test, mitochondrial activity (MTT) and membrane integrity through fluorescent probes. The pH and osmolarity of the extenders without semen were also evaluated. Data were assessed by analysis of variance and Tukey's test, when P <0.05 was considered significant. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm and TES 350 ± 12.96 mOsm. The pH of the semen after dilution in the respective extenders varied between the hours (P <0.05) and did not change over time as evidenced by the buffering effect of the extenders. Extender osmolarity was similar between BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) or TES (371 ± 5.47 mOsm) buffers after dilut ion and without addition of semen. The pH varied (P <0.05) according to the buffer. In the experiment at 5°C all treatments showed a decrease in the percentage of total, progressive and local motility of the cooled semen after 24 h and 48 h compared to the fresh. However, in the percentage of mot ile sperm to fresh, 24 h and 48 h at 5°C between treatments was similar. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, and with mitochondrial activity did not differ between treatments. In the experiment at 15°C total, progressive and local vigor and motility were similar between BES, MES and TES buffers in each period. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm and TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Due to the individual characteristics of each buffer , diluted semen pH varied between the extenders with the buffers used. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, with mitochondrial activity and intact membrane observed with CFDA and PI did not differ between treatments. We concluded that BES, MES or TES can be used in the storage and transport of ponies semen for 48 h at 5°C or 15°C. The second experiment aimed to evaluate the influence of polyunsatura ted fatty acid supplementation in the fresh and after freezing semen of Brazilian ponies. Eight ponies received their conventional diet (control group) or conventional diet and 70 g of DHA -rich Schizochytrium sp algae meal (PUFA group). The effect of Vitamin E (1 mM, DL--tocopherol) added to the freezing diluent for semen was also evaluated on seminal quality, before and after freezing. Semen was collected every 15 days during 60 days. Stallions were reversed in treatments after an interval of sixty days. Semen was evaluated fresh and after freezing. Motility and vigor were estimated in the fresh semen. After thawing motility, membrane functionality, membrane integrity and computed motility analysis were evaluated. Mean values for fresh parameters evaluated in the PUFA and control groups were similar. Mean values of total, progressive and local motility, hyposmotic, CFDA/PI and computerized analysis of semen supplemented with DHA and post -thaw control group did not differ. The combination of DHA and Vitamin E supplementation added to the diluent did not potentiate the antioxidant capacity of the diluent during freezing and resulted in decreased total and progressive motility compared to the non-supplemented group. Supplementation of 70 g of DHA-rich microalgae Schizochytrium sp and the addition of 1 mM vitamin E to the semen freezing diluent in Brazilian ponies was not efficient to promote improvement in seminal viability after collection or even after freezing.

EFFECTS OF ASCORBIC ACID, DITHIOTHREITOL AND THE INHIBITOR OF CASPASE-3 DURING CRYOPRESERVATION OF IN VITRO PRODUCED BOVINE EMBRYOS

Os experimentos descritos no presente trabalho foram realizados com o objetivo geral de avaliar se a adição dos antioxidantes ácido ascórbico (AA) e ditiotreitol (DTT), ou o inibidor da caspase-3 (z-DEVD-fmk), durante a criopreservação podem melhorar o criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados cinco experimentos representados assim: experimento 1, 2 e 3 no capitulo 1 e, experimento 4 e 5 no capitulo 2. Para todos os experimentos, os complexos cumulusoócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas de abatedouros. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados in vitro até o dia 7. Blastocistos e blastocistos expandidos foram aleatoriamente submetidos ao congelamento com taxa controlada seguindo o equilíbrio de 10 min em meio de congelamento (Hepes-TALP acrescido de 1,5 M de etilenoglicol e 0,1 M de sacarose) com os tratamentos tal como descrito abaixo. No experimento 1, os embriões foram equilibrados no meio de congelamento contendo 0,0; 0,1; 0,3 ou 0,5 mM de AA. Os embriões em palhetas foram então colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Em seguida, os embriões foram descongelados e cultivados durante 72 h em meio SOF-BE1 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino a 38,5 °C numa atmosfera umidificada de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2. Os embriões tratados com 0,1 mM de AA apresentaram maiores taxa de re-expansão às 24, 48 e 72 h e na taxa de eclosão às 72 h em comparação com os embriões do controle (P<0,05), assim, essa concentração foi considerada como ótima para os seguintes experimentos. Para o experimento 2 e 3, os embriões foram criopreservados em meio de congelamento contendo ou não 0,1 mM de AA, em seguida foram descongeladas e cultivadas durante 24 h. As concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio foram reduzidos (P<0,001) pelo antioxidante AA (30,3 ± 2,4) em comparação com o controle (49,3 ± 1,9). Não houve efeito sobre o número total de células de blastocisto (P>0,05). Contudo, o AA 0,1 mM reduziu (P<0,001) a percentagem de células apoptóticas e a fragmentação do DNA comparado ao grupo controle. Os experimentos 4 e 5 foram conduzidos para avaliar os efeitos do DTT ou z-DEVD-fmk durante a criopreservação. Blastocistos e blastocistos expandidos foram equilibrados em meio de congelamento contendo DTT (0, 50, 100 e 200 M) ou z-DEVD-fmk (0, 50, 100 e 200 M). Os embriões em palhetas foram colocados numa máquina de congelamento programável em -6,0 °C a -32 °C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 °C). Os embriões foram descongelados e cultivados em seguida durante 72 h. A taxas de re-expansão e eclosão foram registradas às 24, 48 e 72 h. Não houve efeito (P>0,05) do tratamento com DTT ou z-DEVD-fmk nas taxas de re-expansão e eclosão às 24, 48 ou 72 h pósdescongelamento. Este é o primeiro trabalho que utiliza os antioxidantes AA e DTT ou o inibidor específico da apoptose z-DEVD-fmk no meio de criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Em conclusão, a adição de AA (0,1 mM) no meio de congelamento lento melhora a crio-sobrevivência de embriões bovinos produzidos in vitro, reduz as concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigénio e a fragmentação do DNA. Os tratamentos DTT e z-DEVD-fmk não apresentaram nenhum efeito sobre a sobrevivência dos embriões pósdescongelamento.

Experiments described in this study were performed with the overall objective to evaluate whether the addition of antioxidants ascorbic acid (AA) and dithiothreitol (DTT), or inhibitor of caspase-3 (z-DEVD-fmk) during cryopreservation could improve the cryotolerance of in vitro produced bovine embryos. Five experiments were performed and represented as follows: experiment 1, 2 and 3 in Chapter 2 and experiment 4 and 5 in Chapter 3. For all experiments, cumulus oocyte complexes were obtained from ovaries of slaughterhouse cows. Oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured to day 7. Blastocysts and expanded blastocysts were randomly assigned to be subjected to controlled-rate freezing following equilibration for 10 min in freezing medium (Hepes-TALP plus 1.5 M ethylene glycol and 0.1 M Sucrose) with treatments as described below. For experiment 1, the embryos were equilibrated in freezing medium containing 0.0; 0.1; 0.3 or 0.5 mM of AA. The embryos into straws were then placed into programmable freezing machine at -6.0 °C to -32 °C prior to being plunged into liquid nitrogen (-196 °C). Then, embryos were thawed and cultured for 72 h in SOF-BE1 supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum at 38.5 ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2, 5% O2 and 90% N2. Embryos treated with 0.1 mM AA showed higher re-expansion at 24, 48 and 72 h and hatching rates at 72 h compared to control embryos (P<0.05), thus concentration was considered as the optimal for the sequential experiments. For experiment 2 and 3, embryos were cryopreserved in freezing medium containing or not 0.1 mM AA, then were thawed and cultured for 24 h. Intracellular reactive oxygen species levels were reduced (P<0.001) by AA treatment (30.3 ± 2.4) compared with control (49.3 ± 1.9). There was no effect of the total cells number of blastocyst (P>0.05). However, 0.1 mM AA reduced (P<0.001) the percentage of apoptotic cells and DNA fragmentation compared with the control group. Experiments 4 and 5 were conducted to assess the effects of DTT or z-DEVD-fmk during cryopreservation. Blastocyst and expanded blastocysts embryos were equilibrated in freezing medium containing DTT (0, 50, 100 and 200 M) or z-DEVD-fmk (0, 50, 100 and 200 M). The embryos into straws were then placed into programmable freezing machine at - 6.0 °C to -32 °C prior to being plunged into liquid nitrogen (-196 °C). Embryos were thawed and then cultured for 72 h. Re-expansion and hatching rates were recorded at 24, 48 and 72 h. There was no effect (P>0.05) of treatment with DTT or z-DEVDfmk on re-expansion or hatching rates at 24, 48 or 72 h post-thaw. This is the first report that used AA and DTT antioxidants or z-DEVD-fmk a specific inhibitor of the apoptosis in the cryopreservation medium of in vitro produced bovine embryos. In conclusion, addition of AA (0.1 mM) in slow-freezing medium improves the cryosurvival of in vitro produced bovine embryos, reduces intracellular reactive oxygen species levels and DNA fragmentation. DTT and z-DEVD-fmk treatments had no effect on post-thaw embryo survival.

Viabilidade de oócitos bovinos transportados por diferentes períodos em meio de maturação suplementado com análogo da Vitamina E

Oócitos com diminuída capacidade de desenvolvimento têm sido apontados como a principal causa para o potencial reduzido dos embriões produzidos in vitro. O transporte dos oócitos das propriedades até os laboratórios é um fator fundamental, pois a maturação inicia-se imediatamente após retirada do oócito de seu folículo, e o intervalo entre a recuperação e maturação em laboratório influenciam diretamente o desenvolvimento do oócito. O tempo do transporte pode se prolongar por várias horas, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário subsequente. Além disso, as condições in vitro resultam em maiores concentrações de oxigênio, levando a um aumento nos níveis de Espécies Reativas ao Oxigênio (EROs), sendo as membranas celulares muito sensíveis à lipoperoxidação ocasionada por esses agentes. O Trolox® é um análogo da Vitamina E, e atua como agente protetor contra a lipoperoxidação. Dessa forma, foi avaliada a viabilidade do transporte de oócitos com o controle da atmosfera gasosa, durante diferentes períodos de tempo, e os efeitos da adição de Trolox® ao meio utilizado no transporte. Foram utilizados 1107 oócitos provenientes de ovários de abatedouro, divididos em oito grupos, conforme o período de transporte simulado e a presença de Trolox®: zero (G0), seis (G6), doze (G12) e dezoito (G18) horas de transporte simulado sem antioxidante, e os mesmos períodos (GT0, GT6, GT12, GT18), com a adição de 0,1 mg/mL de Trolox® ao meio de transporte. Os oócitos foram acondicionados em tubos criogênicos de 1,5 mL, contendo 500µL de meio de transporte (TCM-199® suplementado com HEPES, glutamina, piruvato, antibiótico, estradiol, LH, FSH e SFB), recobertos por 350µL de óleo mineral, gaseificados com uma mistura de 5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 balanço, e lacrados. Os oócitos dos grupos G0 e GT0 foram colocados abertos na estufa e maturados por 24 horas, a 38,5°C com 5% de CO2 em ar. Os outros grupos foram colocados fechados dentro da estufa, e abertos conforme passado seu respectivo período de transporte, completando o tempo restante da maturação nas mesmas condições dos grupos controle. Esse sistema estaria mimetizando o transporte de oócitos em incubadoras portáteis, simulando o que ocorre do campo para o laboratório após a OPU. O período de fecundação foi de 18-22 horas em condições semelhantes de temperatura e atmosfera gasosa, em Talp-Stock acrescido de BSA, piruvato, gentamicina, heparina e PHE. Os prováveis zigotos foram cultivados durante sete dias em meio SOFaaci + 5% SFB, em estufa à 38,5ºC, com 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Foram avaliadas as taxas de clivagem, produção embrionária, contagem celular e o estresse oxidativo. Os dados paramétricos foram avaliados através da ANOVA e do teste de Tukey, já os não paramétricos através do teste de Wilcoxon. Todas as análises utilizaram 5% como nível de significância. As taxas de clivagem foram similares entre todos os grupos, sendo observada diferença (p<0,05) apenas entre G0 (87,05%) e o G12 (68,30%). Não foi encontrado diferença (p>0,05) entre os grupos para produção de blastocistos, o número total de células embrionárias e concentração de TBARS no meio de transporte. Estes resultados indicam que é possível o transporte de oócitos bovinos até 18 horas sem que haja prejuízos ao desenvolvimento embrionário subsequente e que a adição de Trolox® ao meio de transporte não influencia os índices de clivagem e de blastocistos.

Oocytes with decreased development capacity have been identified as the main cause for the reduced potential of embryos in vitro produced. The transport of the oocytes from properties to the laboratories is a fundamental factor, since the maturation begins immediately after the oocyte removal from its follicle, and the interval between the recovery and the laboratory maturation directly influence its development. The transport duration can last for several hours and can hinder subsequent embryonic development. Furthermore, the in vitro conditions results in higher oxygen concentrations, leading to an increase in the Reactive Oxygen Species (ROS) levels, and the cell membranes is very susceptible to lipid peroxidation caused by these agents. The Trolox® is a vitamin E analogue and acts as a protective agent against lipid peroxidation. Thus, it was assessed the viability of oocytes transported with a controlled gaseous atmosphere for different periods of time, and the effects of adding Trolox® the medium used on the transport. Were used 1107 oocytes from slaughterhouse ovaries, divided into eight groups according to the simulated transport period and the presence of Trolox®: zero (G0), six (G6), twelve (G12) and eighteen (G18) hours of simulated transport without antioxidant, and same periods (GT0, GT6, GT12, GT18), with the addition of 0.1 mg / ml Trolox® to the transport medium. Oocytes were placed in 1.5 ml cryogenic tubes containing 500L transport medium (TCM-199® supplemented with HEPES, glutamine, pyruvate, antibiotics, estradiol, LH, FSH and SFB), covered with 350L of mineral oil, gassed with a mixture of 5% CO2, 5% O2, 90% N2 balance and sealed. Oocytes of groups G0 and G10 were placed unclosed in the incubator and matured for 24 hours at 38.5 ° C with 5% CO2 in air. The other groups were placed closed inside the incubator and opened as pasted their respective transport period, completing the remaining time of maturation under the same conditions of the control group. This system would mimic the transport of oocytes in a portable incubator, simulating what occurs from the countryside to the laboratory after OPU. The fertilization period was 18-22 hours in similar conditions of temperature and gaseous atmosphere in medium Talp-Stock plus BSA, pyruvate, gentamicin, heparin and PHE. Presumptive zygotes were cultured for seven days in SOFaaci medium + 5% fetal calf serum, in an incubator at 38.5 ° C with 5% CO2, 5% O2 and 90% N2. The rates of cleavage, embryo production, cell count and oxidative stress were evaluated. Data were analyzed with SAS® version 9.2. Parametric data were analyzed using ANOVA and Tukey's test, as the nonparametric using the Wilcoxon test. All analyzes used 5% level of significance. Cleavage rates were similar among all groups, with difference (p <0.05) only between G0 (87.05%) and G12 (68.30%). The blastocyst production, total number of embryonic cells and TBARS concentration in the transport medium were not different (p> 0.05). These results indicate that transportation of bovine oocytes up to 18 hours can happen without any losses to the subsequent embryonic development and the addition of Trolox® in the transport medium does not influence the cleavage and blastocyst rates.